CN114085844A - 大豆耐盐基因GmERD15B的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物耐盐相关基因GmERD15B的应用。该基因在培育耐盐大豆品种中的应用。本发明提供的基因GmERD15B在耐盐极端材料中的差异表达分析，表明该基因在大豆对盐胁迫的响应中起到重要的作用。通过发根农杆菌K599介导对大豆子叶节进行遗传转化，获得不同启动子启动的GmERD15B基因表达的大豆发状根。在受到NaCl胁迫处理后，转ProHap2:GmERD15B‑GFP的大豆发状根的根鲜重和主根长显著高于转空载、35S:GmERD15B‑GFP、或ProHap1:GmERD15B‑GFP表达载体的大豆发状根，说明GmERD15B基因的Hap2型启动子对调控大豆耐盐性具有重要作用。

Description

大豆耐盐基因GmERD15B的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及大豆耐盐基因GmERD15B的应用。

背景技术

土壤盐渍化会导致严重的叶片萎蔫、黄化、脱水、坏死，最终限制植物的生长发育，严重的造成整株植株死亡(Xie et al,2008)。盐碱胁迫降低了作物质量和产量，是影响粮食安全的主要环境因素之一。目前，盐渍土占灌溉土地的19.6％，非灌溉土地的2.1％以上(世界粮农组织，2018年)。与此同时，预计到2050年，由于低效的肥料使用、海水入侵和使用劣质灌溉用水等(Canedo-Arguelles et al,2013；Rengasamy,2006)，受盐渍影响的农业用地面积将增加一倍。

ERD15为拟南芥中响应早期脱水胁迫诱导的基因(Kiyosue et al,1994)。ERD15在植物基因组中编码小的酸性蛋白，并且是植物中几种应激反应的重要组成部分(Aalto etal,2012)。早期的研究表明，ERDs基因可由多种非生物胁迫诱导，如干旱(Rai et al,2012)、低温(Kiyosue et al,1998)、脱落酸(ABA)(Aalto et al,2012)、盐(Jian et al,2016)。近年来，ERD基因已经在拟南芥(Kiyosue et al,1994)、烟草(Ziaf et al,2011)、野葡萄(Yu et al,2017)、桑树(Saeed et al，2017)、大豆(Alves et al,2011)等多种作物中被报道。对ERD基因功能鉴定表明，ERD基因具有多种生化功能(Alves et al,2011)。ERD15家族在N端均具有一个PAM2和PAE1的结构域，在C端中有一个保守的QPR结构域(Aalto etal,2012)。PAM2结构域已被证明与PAB蛋白互作(Belostotsky et al,1996；Xie et al,2014)，保守的PAM2结构域在ERD15转录后调控中起关键作用(Aalto et al,2012)。通过软件预测GmERD15B(http://smart.embl-heidelberg.de/)中存在保守结构域PAM2。通过序列比对，发现GmERD15B与GmERD15A具有94％的同源性，功能注释为早期脱水诱导蛋白15(https://www.soybase.org/)，因此命名为GmERD15B(Aalto et al,2012)。低温处理后VaERD15的表达量增加，过表达VaERD15表现出较高的耐冷性，而且VaERD15位于细胞核中，能够激活酵母AH109报告基因的表达并在四缺培养基正常生长(Yu et al,2017)，也就是说，VaERD15可以作为酵母中的转录激活因子。桑椹ERD15可能作为转录因子在酵母系统中调控报告基因高水平表达(Saeed et al,2017)。

发明内容

本发明的目的是提供了大豆耐盐相关蛋白GmERD15B及其编码基因、不同单倍型启动子与应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

大豆GmERD15B基因在培育耐盐大豆品种中的应用，所述的GmERD15B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的GmERD15B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.4所示的GmERD15B的Hap2型启动子在培育耐盐大豆品种中的应用。

大豆GmERD15B基因及其Hap2型启动子在培育耐盐大豆品种中的应用，所述的GmERD15B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GmERD15B基因的Hap2型启动子核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。

含有GmERD15B基因的重组表达载体在培育耐盐的大豆品种中的应用，所述的GmERD15B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，且所述的重组表达载体中GmERD15B基因由SEQ ID NO.4所示的GmERD15B的Hap2型启动子启动。

有益效果：本发明提供的大豆耐盐性相关基因GmERD15B在耐盐极端材料中的差异表达分析，表明该基因在大豆对盐胁迫的响应中起到重要的作用。通过发根农杆菌K599介导对大豆子叶节进行遗传转化，获得不同启动子(CaMV 35S、ProHap1、ProHap2)启动的GmERD15B基因表达的大豆发状根。在受到NaCl胁迫处理后，转ProHap2:GmERD15B-GFP的大豆发状根的根鲜重和主根长显著高于转空载、35S:GmERD15B-GFP、或ProHap1:GmERD15B-GFP表达载体的大豆发状根，说明GmERD15B基因的Hap2型启动子对调控大豆耐盐性具有重要作用。在转化ProHap2:GmERD15B-GFP株系中，GmERD15B、GmABI1、GmABI2、GmbZIP1、GmP5CS、GmCAT4、GmPIP1:6、GmMYB84和GmSOS1基因在盐胁迫下表达量上调，说明过表达GmERD15B可能通过增加与已知盐胁迫相关基因(如ABA信号转导、脱水反应和离子转运)的表达水平来增强大豆的耐盐性。

附图说明

图1 GmERD15B基因在NaCl处理下的相对表达量。

图2不同耐盐大豆材料中GmERD15B基因上游2-Kb区域序列变异。

图3 GmERD15B启动子上游启动子区域的Indels变异以及两种单倍型的示意图。

图4不同GmERD15B单倍型启动子在大豆发根中响应盐胁迫的功能分析。

A:重组质粒的载体示意图，从上到下依次是空载体(pBinGFP4)，35S:GmERD15B，ProHap1:GmERD15B，ProHap2:GmERD15B；B：从上到下依次是空载体(pBinGFP4)，35S:GmERD15B，ProHap1:GmERD15B，ProHap2:GmERD15B转基因大豆发根的荧光信号；C：空载pBinGFP4及过表达GmERD15B在0mM和100mM盐胁迫下的大豆子叶节发根表型，处理两周后进行照片拍摄。从上而下依次是空载(pBinGFP4)，35S:GmERD15B，ProHap1:GmERD15B，ProHap2:GmERD15B；D：处理14天后的大豆发根根鲜重。受体材料是天隆1号，以上数据均为三次重复(每次重复包括三个转基因株系)的平均值，柱上方字母相同表示在0.05水平差异不显著(Dunan’s多重比较)。

图5不同GmERD15B单倍型启动子在继代大豆发根中响应盐胁迫的功能分析。

A图为空载pBinGFP4及过表达GmERD15B在0mM和100mM盐胁迫下的子叶节发根表型，处理两周后进行照片拍摄。每皿从左到右依次是空载(pBinGFP4)，35S:GmERD15B，ProHap1:GmERD15B，ProHap2:GmERD15B，每个处理组三根。

B图为处理后14d的主根长。

C图为空载体(pBinGFP4)和转化GmERD15B寄代发根在0mM，100mM NaCl胁迫下相对表达量，GmUKN1为内参基因，受体材料为天隆1号；以上数据均为三次重复的平均值，柱上方字母相同表示在0.05水平差异不显著(Dunan’s多重比较)。

图6 GmERD15B与其他ERD15蛋白的系统发生分析。

图7 GmERD15B的亚细胞定位。

图8 GmERD15B互作基因的预测、和相对表达量分析。

图9耐盐相关基因在过表达GmERD15B大豆发状根中的表达模式。

图10 GmERD15B过表达对已知耐盐相关基因表达水平的影响

具体实施方法

实施例1大豆GmERD15B基因编码区的克隆

参照离心柱型植物总RNA提取试剂盒(大连TaKaRa公司)说明书提取大豆品种“天隆1号”根的总RNA，使用RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒进行反转录合成cDNA。根据基因的ORF序列，使用Primer Premier 5.0软件设计特异引物(正向引物：5’GGAAATCCAAAAGTATCTCAATCAT 3’(SEQ ID NO.5)，反向引物：5’TTTCTTTGTGTATTTACAGTGTCCC3’(SEQ ID NO.6))，以cDNA为模板，使用TKs Gflex DNAPolymerase试剂盒扩增基因的CDS区全长。

50μL PCR反应体系为：2μL cDNA(0.05μg)，上、下游引物各0.25μL(10μM)、25μLTKs Gflex缓冲液和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足50μL。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；然后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经回收、测序后，进行序列分析，结果表明该GmERD15B的开放阅读框具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，全长为513bp，编码SEQID NO.2所示的170个氨基酸。

实施例2 GmERD15B在NaCl胁迫处理下的相对表达量分析

提取大豆品种“LY01-10”，“LY05-06”，“LY03-05”，“LY01-06”，萌发14天后进行180mM NaCl胁迫，胁迫12h后提取根尖组织的RNA，反转录为cDNA，稀释10倍后为模板，参照SYBR Premix Ex Taq II(Perfect Real-time)的操作说明书采用两步法，以GmUKN1基因作为内参基因，利用荧光定量PCR对GmERD15B基因在0、100mM NaCl胁迫下的表达进行分析。

通过对两份耐盐材料(“LY01-10”，“LY05-06”)和两份敏感材料(“LY03-05”，“LY01-06”)在180mM NaCl胁迫后12h进行定量分析，研究了GmERD15B在盐胁迫下的表达模式，耐盐极端材料中受盐诱导上调表达倍数显著高于盐敏感材料(图1)。

实施例3大豆GmERD15B基因启动子区的克隆及测序分析

参照离心柱型植物总DNA提取试剂盒说明书提取大豆材料根的总DNA，根据基因的启动子序列，使用Primer Premier 5.0软件设计特异引物(正向引物：5’CTTCTTACTGGGTCTGACTTTGATT 3’(SEQ ID NO.7)，反向引物：5’GCAACTTCTTCAAATTCTTCCTCCT 3’(SEQ ID NO.8))，以DNA为模板，使用TKs Gflex DNAPolymerase试剂盒扩增基因的启动子区。

PCR产物经回收、测序后，进行序列分析，10份耐盐材料和10份敏盐材料的启动子区序列分析结果(图2)表明在基因启动子区域起始密码子ATG上游-525～-519bp处，耐盐极端材料与盐敏感材料相存在7bp序列的差异。在比较了48个耐盐材料和54个盐敏感材料中的GmERD15B启动子序列后(图3)，发现了两种单倍型：单倍型1(Hap1)具有完整的碱基序列，碱基序列如SEQ ID NO.3；单倍型2(Hap2)在-525～-519bp处具有7bp的碱基缺失，碱基序列如SEQ ID NO.4。

实施例4 GmERD15B不同单倍型启动子对大豆子叶节发根耐盐性的影响

为了研究GmERD15B不同启动子驱动GmERD15B对耐盐性的影响，采用一步克隆试剂盒(Vazyme，中国)构建植物表达载体。将从大豆品种天隆1号中克隆的GmERD15B编码序列经Kpn I和BamH I(TaKaRa，Japan)双酶切后连接到pBinGFP4载体中，形成35S:GmERD15B融合载体(pBinGFP4为骨架载体，GmERD15B与GFP融合表达)。利用特异引物分别扩增两种GmERD15B的启动子，分别为来自大豆品种天隆1号的Hap1型启动子(ProHap1)和大豆品种中豆8号的Hap2型启动子(ProHap2)。利用Sac I和Xho I对35S:GmERD15B载体进行双酶切，将载体中的35S启动子分别替换为ProHap1或ProHap2，形成重组载体ProHap1:GmERD15B，ProHap2:GmERD15B(图4A)。载体ProHap1:GmERD15B，ProHap2:GmERD15B，35S:GmERD15B和骨架载体pBinGFP4分别转化到发根农杆菌K599中，并以天隆1号为受体材料，通过发根农杆菌介导转化大豆子叶节发状根，通过GFP标记基因筛选阳性发根(图4B)，并将100％阳性的子叶节分别放置于含有0mM，100mM NaCl的White培养基上继续培养14天后，调查表型。在含有0mM NaCl的White培养基上，所有的子叶节发状根生长良好，无明显的差异(图4C)；100mMNaCl胁迫下，含空载pBinGFP4和含过表达载体35S:GmERD15B-GFP的阳性复合体发状根生长显著抑制，与0mM NaCl下相比，根数也减少，但是，转化pBinGFP4的发状根数量最少，转35S:GmERD15B-GFP和ProHap1:GmERD15B-GFP的发状根数量其次，转ProHap2:GmERD15B-GFP的发状根数量最多。在0mM NaCl下，转空载体和转GmERD15B子叶节发状根的鲜重均无明显差异(图4D)；100mM NaCl胁迫下，转pBinGFP4发状根鲜重最小，转35S:GmERD15B-GFP和ProHap1:GmERD15B-GFP的发状根鲜重次之，转ProHap2:GmERD15B-GFP发状根鲜重最大。

实施例5 GmERD15B不同单倍型启动子对子叶节继代发根耐盐性的影响

为了进一步验证GmERD15B不同单倍型启动子对耐盐性的作用，我们利用继代发状根系统进行了功能分析。转化空载株系和过表达GmERD15B株系的阳性发状根在正常生长条件下没有明显的差异(图5A)，在NaCl处理14天后，所有的根长生长均受到不同程度的抑制。转化空载发状根的主根长度显著(P＜0.05)小于转化ProHap2:GmERD15B-GFP株系，但转化空载发状根的主根长度与转化35S:GmERD15B-GFP或转化ProHap1:GmERD15B-GFP株系发状根的主根长度相比没有显著的差别(图5B)。荧光定量分析表明在NaCl处理3h后转化ProHap2:GmERD15B-GFP大豆发根中GmERD15B表达量大幅度上调(图5C)。综上所述，Hap2型启动子受盐胁迫后通过提高GmERD15B的表达量来提高大豆耐盐性。

实施例6启动子-LUC活性在烟叶中的测定

利用烟草瞬时表达系统分析烟草叶片中的LUC启动子活性，在烟草叶片中的瞬时表达分析显示，在盐胁迫下，Hap2型启动子的LUC活性明显强于Hap1型(图6)，说明Hap2型启动子对盐胁迫的响应强于Hap1型。

实施例7 GmERD15B蛋白的保守结构域和进化分析

以GmERD15B的氨基酸序列为探针，利用NCBI的BLASTp工具，获得了Caricapapaya，Arabidopsis thaliana，Solanum lycopersicum，Capsicum annuum，Brassicanapus，Glycine max，Medicago truncatua，Cucumis sativus，Zea mays，Oryza sativa，Vitis amurensis中的同源蛋白：supercontig_197.11，AT4G14270，NP_001234461，ABB89735.1，AT2G41430，ADP37978.1，Glyma.04G138600，Glyma.11G149900，Medtr3g023110，Cucsa.335550，GRMZM2G181551，GRMZM2G045178，Q7XXS2，Q7EZY8，GRMZM2G327692，GRMZM2G037189，Q7EZY8，Glyma02g42860，Glyma14g05980，JQ687321，Q5W6M4，GRMZM2G093325，Medtr5g091120。ERD15家族在N端均具有一个PAM2结构域和一个PAM1结构域，在C端均具有一个保守的QPR结构域。将GmERD15B和其它物种中已报道的同源基因利用ClustalX软件进行多序列比对，多重比对发现，这些ERD15s蛋白N端都包含一个PAM2结构域，一个PAE1结构域，在C端均有一个高度保守的IqQRP结构域。前人的报道中指出PAM2结构域可以与PAB蛋白中的PABC/MLLE结构域互作(Belostotsky et al,1996；Xie etal，2014)。在ERD15中保守结构域PAM2对下游基因的转录调节起到关键作用。利用MEGA 6软件，1000次bootstrap，对GmERD15B和其他ERD15s氨基酸的系统进化分析，发现GmERD15B与GmERD15A(Glyma04g28560)的同源性达到94％，在系统发育树中，GmERD15B与其他ERD15s被分为三个亚群，GmERD15B与GmERD15A和MtERD15A的亲缘关系最近(图7)。

实施例8 GmERD15B的亚细胞定位

载体pBinGFP4-35S:GmERD15B和空载体pBinGFP4转入农杆菌EHA105中，浸染本氏烟草叶片细胞，通过35S启动子完成表达融合蛋白35S:GmERD15B和35S:GFP的瞬时表达，使用荧光共聚焦显微镜观察绿色荧光的定位情况(图8)。空载体35S:GFP在烟草叶片细胞的细胞核、细胞质、细胞膜中均产生绿色荧光信号，而pBinGFP4-35S:GmERD15B的绿色荧光信号在细胞核、细胞膜中产生。

实施例9蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

为了识别潜在的GmERD15B相互作用蛋白，我们使用检索蛋白与蛋白互作的搜索工具(STRING，https://string-db.org/)，使用score>0.9预测蛋白-蛋白相互作用网络。基于蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，我们发现，在与GmERD15B潜在的互作蛋白中，有5个蛋白为PAB蛋白(图9A)。这五个GmPAB蛋白具有与PAB2、PAB4、PAB8相同的保守结构域，其中两个GmPAB基因GmPAB-14g和GmPAB-17g具有与盐胁迫相关的GO注释。接着，用q-RT-PCR法测定了这两个基因的相对表达量。盐处理3h后，这两个GmPAB基因在转ProHap2:GmERD15B发状根根中的相对表达水平显著高于转ProHap1:GmERD15B，35S:GmERD15B和空载体的发状根(图9B)。这些结果表明，GmERD15B可能与PAB蛋白相互作用以应对盐胁迫。

实施例10过表达GmERD15B提高了盐胁迫相关基因的表达水平

为了研究GmERD15B介导耐盐的可能的机制，我们研究了GmERD15B过表达对已知耐盐相关基因表达水平的影响(图10)。10个耐盐相关基因根据功能可以分为5类：3个ABA相关基因：GmABI1、GmABI2和GmbZIP1(Gao et al.,2011；Liang et al.,1994；Meyer et al.,1994)；1个脯氨酸合成相关基因：GmP5CS(Zegaoui et al.,2017)；1个编码过氧化氢酶过氧化物酶的基因(GmCAT4)(Sun et al.,2016)；2个失水相关基因：GmMYB84和GmPIP1:6(Wanget al.,2017；Zhou et al.,2014)；以及三个离子转运相关基因(GmSOS1，GmSALT3，GmNHX1)(Guan et al.,2014；Zhang et al.,2019)。盐处理后3h后，转ProHap2:GmERD15B的大豆发状根中GmABI2、GmbZIP1、GmP5CS、GmCAT4、GmPIP1:6、GmMYB84、GmSOS1的相对表达量明显高于转ProHap1:GmERD15B或空载体的发状根(图10A)。然后我们选择相对表达量最高的前3个基因(GmABI2、GmP5CS和GmbZIP1)进行进一步研究。在启动子LUC活性检测中，我们发现GmERD15B的过表达增强了这三个基因的启动子活性(图10B-G)。因此，GmERD15B的过表达可能是通过增加ABA和脱水反应、脯氨酸含量、过氧化氢酶过氧化物酶和离子转运相关基因的表达水平来增强耐盐性。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆耐盐基因GmERD15B的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine soja)

<400> 1

atggcattgg tctctggaag aagttctgct ctgaacccaa atgcacctat gttcatacct 60

gctgcacttc gtcaggtgga ggatttttca cctcaatggt gggatcttgt gaaatcttca 120

acatggtttc gtgattattg gttgagccaa cataaggagg aagaatttga agaagttgcc 180

aatgactcta ctaatgatga tatggagaat atgctctcgg aaacttttga tctaggcatg 240

gaagaagact tcaatgttct agaaaacgag tttgagcagt tggtgatgtt ctctgaagct 300

ctagatcatt ctgttcagga tgatcctaat actggaaaag ggtctcctca gagtcttaac 360

aaggatgtta aagcttttct tattaacttg acaccaaaat caccgaggga aaggggtccc 420

aagtctcctt cagggcttgc aaagcacctt gagaagccag cacagcacgt gaatgtgaag 480

tgtgcctctc tccgaattca ccaacctcgt tga 513

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine soja)

<400> 2

Met Ala Leu Val Ser Gly Arg Ser Ser Ala Leu Asn Pro Asn Ala Pro

1 5 10 15

Met Phe Ile Pro Ala Ala Leu Arg Gln Val Glu Asp Phe Ser Pro Gln

20 25 30

Trp Trp Asp Leu Val Lys Ser Ser Thr Trp Phe Arg Asp Tyr Trp Leu

35 40 45

Ser Gln His Lys Glu Glu Glu Phe Glu Glu Val Ala Asn Asp Ser Thr

50 55 60

Asn Asp Asp Met Glu Asn Met Leu Ser Glu Thr Phe Asp Leu Gly Met

65 70 75 80

Glu Glu Asp Phe Asn Val Leu Glu Asn Glu Phe Glu Gln Leu Val Met

85 90 95

Phe Ser Glu Ala Leu Asp His Ser Val Gln Asp Asp Pro Asn Thr Gly

100 105 110

Lys Gly Ser Pro Gln Ser Leu Asn Lys Asp Val Lys Ala Phe Leu Ile

115 120 125

Asn Leu Thr Pro Lys Ser Pro Arg Glu Arg Gly Pro Lys Ser Pro Ser

130 135 140

Gly Leu Ala Lys His Leu Glu Lys Pro Ala Gln His Val Asn Val Lys

145 150 155 160

Cys Ala Ser Leu Arg Ile His Gln Pro Arg

165 170

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine soja)

<400> 3

ttaaaaaata ctccaggtcc aagtcccaag acctttcatt tcctaacttg actcaagtga 60

gatttacttt taaaatattg attaccgtgc aaccgcccac agacaatttt tccaaagcca 120

caacccttat cctgttatta tagcctagaa ggttacgagt cacgattgac cattatccaa 180

aaaatctgtt ccacctgttc cttttccaac cgtctgatca agatcaaccc tctctctctc 240

caccatcgat cactctcatc attttcatgc cacgtgtaac gtccactcta ttaagtgtgt 300

gtttgatatt aaagaaataa gagattaatc cagaaaaaaa atttaaaatt ttatgtggtt 360

tccatcattt tttttctatc aaatattttt ttacattttt ttttattttt ttctttcaca 420

caattaaatt caccttaacc gtgtgtttgg tagtgaaaaa aaaaagaaaa tttgaaaatt 480

ttgtataagc cccacgtcta ttgttttttt attttaattc aaatatctct tggataattg 540

ttttttctat tttttctctt ccatctaatc aaattcatct taaaagatcc gttcttaatc 600

ttaggttcgg gagtcccgaa gctggaggct gctgtccctt ttcctttatc cacttttttt 660

tttccattgc gttatttatt tgcccgtgtc tctcactcag tcactcactc attctctctg 720

caaattctaa tcttcgcaaa tcaacaacgt ctctctctgt tactctgaaa gtaggtgacc 780

atggatcatc attatcatcg tcatgttttc ttcatatatg tgcccatcat catttgttgg 840

gtgcaatttt tttgttcagt tttgatcctg tggcctatct ttaatattat tattatttta 900

aatgctagta agttgatctt attcttggca gttagatcgt ggtttttgta cggatattga 960

tataaagttg gattttttat atatttattt tggggtcttt gatttagtta gtgcaaccac 1020

cttatttttt ttatatgatt gaagctgtaa cccatttttt tttaatgttt tttaatgcta 1080

atatagtgat ccaattgtga gtagtagatt tttttttgtc tgtgtggata gtactttaag 1140

attgtatttt ttttcttctt actgggtctg actttgattt agttagtgac atagtgcaac 1200

aactttaaat ttctgatttg tttaattgtt ttatttcttt ttaatgatct tgttagtgat 1260

gtagttttgg ttgttttgat ttctgggttt aattggataa agggtttgtt ttcattgtga 1320

tggttgtata cttgtatgtt agaatcatga aggtggtgct gttgctattt gctaaaccat 1380

gagtggatca tgtatttgtt agcttaattg aatgaatctc ttagttcact gggttgattt 1440

gattctgaga tctgtttttt aattttttat tttttatttt ttgaaatgct ctgggatctg 1500

tctgttactc tgttctcttg tataaattaa aattcctaaa actatagatc tttactacaa 1560

agtgcaaatt ataggttttt aggaatctaa aaaaaggtga agcctcgaag ggctatttct 1620

ttgttttttt ttgggggttt gaggctaatg ctttttgatg tatttaagtt tataaatcaa 1680

aaagcatgtc taaaaatttt cataattgaa aaaaggaaaa aacttcgatg ttttagtgtt 1740

ttattttttt aatttgaaaa tggtaattta tgaaaataat tctaaaagaa tgttaaaatg 1800

ctattgttat tgaaatggtg tcattttttt tatcagcatt gatatgatat gggtagtgtt 1860

aaatggtgtc attgatatgg tgggtagtgt tctatgttaa attaaaattt tctaatacat 1920

gacatcatgt aaattgatat tttgttttgt tgtattgtgt agactgactt caagttagtg 1980

taactagctg ccaagttgtg 2000

<210> 4

<211> 1993

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine soja)

<400> 4

ttaaaaaata ctccaggtcc aagtcccaag acctttcatt tcctaacttg actcaagtga 60

gatttacttt taaaatattg attaccgtgc aaccgcccac agacaatttt tccaaagcca 120

caacccttat cctgttatta tagcctagaa ggttacgagt cacgattgac cattatccaa 180

aaaatctgtt ccacctgttc cttttccaac cgtctgatca agatcaaccc tctctctctc 240

caccatcgat cactctcatc attttcatgc cacgtgtaac gtccactcta ttaagtgtgt 300

gtttgatatt aaagaaataa gagattaatc cagaaaaaaa atttaaaatt ttatgtggtt 360

tccatcattt tttttctatc aaatattttt ttacattttt ttttattttt ttctttcaca 420

caattaaatt caccttaacc gtgtgtttgg tagtgaaaaa aaaaagaaaa tttgaaaatt 480

ttgtataagc cccacgtcta ttgttttttt attttaattc aaatatctct tggataattg 540

ttttttctat tttttctctt ccatctaatc aaattcatct taaaagatcc gttcttaatc 600

ttaggttcgg gagtcccgaa gctggaggct gctgtccctt ttcctttatc cacttttttt 660

tttccattgc gttatttatt tgcccgtgtc tctcactcag tcactcactc attctctctg 720

caaattctaa tcttcgcaaa tcaacaacgt ctctctctgt tactctgaaa gtaggtgacc 780

atggatcatc attatcatcg tcatgttttc ttcatatatg tgcccatcat catttgttgg 840

gtgcaatttt tttgttcagt tttgatcctg tggcctatct ttaatattat tattatttta 900

aatgctagta agttgatctt attcttggca gttagatcgt ggtttttgta cggatattga 960

tataaagttg gattttttat atatttattt tggggtcttt gatttagtta gtgcaaccac 1020

cttatttttt ttatatgatt gaagctgtaa cccatttttt tttaatgttt tttaatgcta 1080

atatagtgat ccaattgtga gtagtagatt tttttttgtc tgtgtggata gtactttaag 1140

attgtatttt ttttcttctt actgggtctg actttgattt agttagtgac atagtgcaac 1200

aactttaaat ttctgatttg tttaattgtt ttatttcttt ttaatgatct tgttagtgat 1260

gtagttttgg ttgttttgat ttctgggttt aattggataa agggtttgtt ttcattgtga 1320

tggttgtata cttgtatgtt agaatcatga aggtggtgct gttgctattt gctaaaccat 1380

gagtggatca tgtatttgtt agcttaattg aatgaatctc ttagttcact gggttgattt 1440

gattctgaga tctgtttttt aattttttat tttttgaaat gctctgggat ctgtctgtta 1500

ctctgttctc ttgtataaat taaaattcct aaaactatag atctttacta caaagtgcaa 1560

attataggtt tttaggaatc taaaaaaagg tgaagcctcg aagggctatt tctttgtttt 1620

tttttggggg tttgaggcta atgctttttg atgtatttaa gtttataaat caaaaagcat 1680

gtctaaaaat tttcataatt gaaaaaagga aaaaacttcg atgttttagt gttttatttt 1740

tttaatttga aaatggtaat ttatgaaaat aattctaaaa gaatgttaaa atgctattgt 1800

tattgaaatg gtgtcatttt ttttatcagc attgatatga tatgggtagt gttaaatggt 1860

gtcattgata tggtgggtag tgttctatgt taaattaaaa ttttctaata catgacatca 1920

tgtaaattga tattttgttt tgttgtattg tgtagactga cttcaagtta gtgtaactag 1980

ctgccaagtt gtg 1993

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaaatccaa aagtatctca atcat 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttctttgtg tatttacagt gtccc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttcttactg ggtctgactt tgatt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaacttctt caaattcttc ctcct 25

Claims (4)

1.大豆GmERD15B基因在培育耐盐大豆品种中的应用，所述的GmERD15B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.SEQ ID NO.4所示的GmERD15B的Hap2型启动子在培育耐盐大豆品种中的应用。

3.大豆GmERD15B基因及其Hap2型启动子在培育耐盐大豆品种中的应用，所述的GmERD15B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GmERD15B基因的Hap2型启动子核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。

4.含有GmERD15B基因的重组表达载体在培育耐盐的大豆品种中的应用，其特征在于所述的GmERD15B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，且在所述的重组表达载体中GmERD15B基因由SEQ ID NO.4所示的GmERD15B的Hap2型启动子启动。

Images