CN111019947A - 从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017 - Google Patents

Abstract

从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017，属于植物生理与分子生物学技术领域，其特征在于：所述的长链非编码RNAlncR3017的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。该长链非编码RNAlncR3017连接到过表达载体pCambia230035Su后，能够通过农杆菌侵染植物将lncR3017整合到植物基因组上，在植物体内lncR3017通过吸附miR408增加其对寒冷的耐受性，重组质粒有助于提高植物在黑龙江省这种高寒地区过冬的存活率，并有助于改善植物品质。本发明制作简单，可操作性强，成本低廉，效果明显。

Description

从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码 RNAlncR3017

技术领域

本发明涉及一种从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017，属于植物生理与分子生物学技术领域。

背景技术

目前，在植物中已经发现大量的lncRNAs，一开始lncRNAs被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能或少数具有功能(Louro等，2009；Mercer等，2009)，是转录的“噪音”。因为与可以编码蛋白质的mRNA相比，lncRNA的表达水平普遍较低，序列保守性差(Qin等，2017)。然而，越来越多的证据表明，一些lncRNAs可以作为基因表达的顺式或反式调节器来执行功能(Yan等，2017)。一般而言，lncRNA生物合成与编码mRNA非常相似(Dieci等，2007)。lncRNA可以来源于内含子、外显子、基因间区段、基因内区段、启动子区域、3/5′-UTRs、增强子序列并且可以双向转录(Nie等，2012)。LncRNA也经历了转录后修饰。大多lncRNA行使功能通过以下五个方面：①一些lncRNA可以作为ceRNA，通过模拟靶基因作为特定的miRNA靶标，从而阻断miRNA与其靶基因之间的相互作用。例如，在拟南芥中，IPS1的表达在缺乏磷酸盐(Pi)条件下受诱导，可作为ath-miR399的靶基因模拟物，从而保护miR399所作用的编码PHO2(PHOSPHATE2)的靶基因，PHO2可通过与PHO1相互作用参与磷稳态调节(Franco-Zorrilla等，2007)。②某些植物lncRNA可以作为sRNA的前体来合成sRNA，如miRNA和siRNA。最近的一项研究中，预测了13个lncRNA可以作为响应抗甘蓝型油菜菌核病菌感染的96个miRNA的前体(Joshi等，2016)。在硬粒小麦中Iw1形成类似miRNA前体的长发夹，产生miRW1抑制小麦β-二酮蜡。(Huang 2017)。③植物反义lncRNA通过与有义mRNA相互作用从而响应胁迫。在以前的研究中，PlantNATsDB库涵盖了来自70个植物基因组的植物天然反义转录物(NAT)(Chen等，2012a)，在水稻中，反义链转录的lncRNA(LAIR)可以通过上调多个LRK基因的表达,从而提高水稻的籽粒产量。(Wang等2018)。④一些植物的lncRNA可参与lncRNA介导的染色质修饰(lncR2Epi)调节途径(Wang等，2016)。FLOWERING LOCUS C(FLC)是一种转录阻遏物，可阻止花转变所需的一组基因的激活。春化作用下FLC的抑制是由三个lncRNA的转录介导的。COOLAIR(一个包含整个FLC基因座的天然反义转录物)(Swiezewski等，2009)、COLDAIR(一个在FLC的第一个内含子中编码的有义lncRNA)(Heo和Sung，2011)，COLDWRAP(一个在FLC的启动子中编码的lncRNA)(Kim等，2017)。⑤lncRNA在RNA指导的DNA甲基化(RdDM)途径中对胁迫响应具有关键作用。24-nt siRNA和lncRNA都通过RdDM过程，参与了从头合成的胞嘧啶甲基化的过程。RdDM复合物由依赖RNAPIV的转录物产生的siRNA导向。然后这些siRNA结合到Argonaute 4(AGO4)以形成沉默复合物。随后，RNAPII依赖性的lncRNA通过与AGO4相关的siRNAs相互作用而结合AGO4。最终，AGO4-siRNA-lncRNA复合体结合DNA甲基转移酶——domains rearranged methyltransferase 2(DRM2)，导致胞嘧啶的从头甲基化(Matzke和Mosher，2014；Wierzbicki，2012；Movahedi等，2015)。冬小麦隶属于被子植物门单子叶植物纲禾本目禾本科小麦属，种植于稍暖的地方，比如华北及其以南地区种植的是冬小麦。冬小麦一般在9月中下旬至10月上旬播种，翌年5月底至月中下旬成熟。小麦产区在中国有三大产区，一是北方冬小麦区，主要分布在秦岭、淮河以北，长城以南，这里冬小麦产量约占全国小麦总产量的56％左右。其中主要分布于河南、河北、山东、陕西、山西诸省区。二是南方冬小麦区，主要分布在秦岭、淮河以南。这里是我国水稻主产区，种植冬小麦有利提高复种指数，增加粮食产量。其特点是商品率高。主产区集中在江苏、四川、安徽、湖北各省。三是春小麦区，主要分布在长城以北。该区气温普遍较低，生产季节短，故以一年一熟为主，主要产区有黑龙江、新疆、甘肃和内蒙古。冬小麦是仅次于水稻的粮食作物，其加工产品为白面，是很多人喜食的主粮，因此很多人对冬小麦进行着深入的研究。冬小麦亩产一般在650公斤左右。东农冬麦1号是东北农业大学小麦育种专家佟明耀教授和郑家兰教授夫妻二人退休后从1994年开始，经过14年的艰苦努力育成的首个寒地冬小麦品种，结束了高寒地区不能种植冬小麦的历史，并从2007年开始在黑龙江省东北部(北纬45°北纬47°)正式推广。在对东农冬麦1号研究的过程中，东农冬麦1号体内有没有lncRNAs？如果有的话，有哪些lncRNAs？它们又是怎样发挥功能的？有没有具有潜在ceRNA功能的lncRNAs？所有这些都是人们非常关心的研究热点。因此如何在东农冬麦1号体内找到作为吸附miR408来行使功能的具有潜在ceRNA功能的lncRNAs成为急需解决的一大难题，所以发明一种从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017是必要的。

发明内容

为了克服如何在东农冬麦1号体内找到作为吸附miR408来行使功能的具有潜在ceRNA功能的lncRNAs的难题，本发明提供了从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017，该种从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017连接到过表达载体pCambia230035Su后，能够通过农杆菌侵染植物将lncR3017整合到植物基因组上，在植物体内lncR3017通过吸附miR408增加其对寒冷的耐受性，重组质粒有助于提高植物在黑龙江省这种高寒地区过冬的存活率，并有助于改善植物品质。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017，其相关实验过程如下：

一、RNA的提取及cDNA的合成：使用康为世纪生物科技有限公司的RNA提取试剂盒提取RNA，具体方法如下：①取东农冬麦1号(Dn1)分蘖节0.1g，在液氮中充分研磨后转移到1.5ml Ep管中，每30-50mg组织加入1ml TRlzon Reagent，混匀。②样品中加入TRlzonReagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。③以每1ml TRlzon Reagent加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置2分钟。④4℃12000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。⑤在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。⑥将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑦向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑧向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复该步骤一次。⑨12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。⑩将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。使用超微量分光光度计P330测得RNA浓度后，逆转录成cDNA，方法如下：加入试剂1μg RNA、加ddH₂O至9.5μl，混匀，置于72℃金属浴5min，随后迅速置于冰上，按下表继续加入试剂：2μl dNTP Mix 10mMeach、0.5μl RNase Inhibitor、0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase、4μl 5×M-MLVbuffer、3.5μl OligdT(18)，将小Ep管放入PCR仪中设置程序如：42℃，60min；72℃，10min。

二、LncR3017的克隆：根据lncR3017序列设计引物，引物如下：lncR3017 F：5’CAGCGTCTCCCAAATTCCG 3’；lncR3017 R：5’GTCCCAATGGCTGTCCACC 3’。于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司合成引物。PCR反应扩增lncR3017，PCR反应体系：10μl 2×PhantaMax Master Mix、1.4μl cDNA、0.8μl lncR3017 F(10μmol/l)、0.8μl lncR3017 R(10μmol/l)、加ddH₂O up to 20μl。PCR反应条件：先95℃3min，之后95℃15s-60℃30s-72℃30s 35个循环、72℃5min、4℃保存，随后将PCR产物∶ddH₂O∶2×Taq MasterMix＝1∶1∶1混合，72℃20min。

三、LncR3017的PCR产物胶回收：使用Gene Mark公司胶回收试剂盒。①称取2g琼脂糖溶于50mL TAE溶液中，制得4％琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，将目的片段凝胶切下；②将胶切片转移到1.5mL离心管中，加入2倍体积的Binding Solution，在60℃环境下保温5～15min，至胶体完全溶解，加热时2～3min可上下颠倒离心管，帮助其溶解；③将反应溶液转移至吸附柱中，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；④加入500μL BindingSolution，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；⑤在吸附柱中加入700μL WashSolution，等待1min，使缓冲液和膜进行平衡，在14000～16000rpm离心1min；⑥重复第5步；⑦空离3～5min，除去残余酒精；⑧将吸附柱转移到新的离心管，并加入30～100μL的60℃预热的Elution Solution(滴加时缓慢加入至中央部位)，静置1～3min；⑨以14000～16000rpm离心2min，回收DNA，-20℃保存。

四、LncR3017与T载体连接：使用全式金生物技术有限公司试剂盒，加入1μlpEASY-Blunt Zero Cloning Vector(10ng/μl)、8ng回收的lncR3017于Ep管中，加ddH₂O至5μl，轻轻混匀，室温(20℃-37℃)反应5分钟，反应结束后，将离心管置于冰上。

五、重组质粒的转化与筛选：①将保存于-80℃的DH5α大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰浴中，使其融化。②往融化了的感受态细胞悬液中加入上步得到的重组质粒，并用移液器轻轻吸打混匀，冰浴30min。③将离心管置于42℃水中热击，之后迅速转移至冰浴中，静置2-3min。④取890μl不含抗生素LB液体培养基至离心管，移液器吸打混匀后摇床37℃150rpm震荡45min复苏菌体。⑤从离心管中吸取100μl菌液，均匀涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，至液体被吸收，37℃于恒温箱中倒置培养12-16h。⑥挑取几个培养基上生长的单菌落，一半进行菌落PCR，将PCR验证成阳性菌株的另一半摇菌，送于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司进行测序验证。⑦鉴定后存菌。

六、重组质粒的提取：使用天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒。①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)。②取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1分钟，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。③向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。④向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。⑤向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60秒钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。⑦向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30-60秒钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。⑧重复操作步骤(7)。⑨将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。⑩将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。

七、ULncR3017的克隆：根据lncR3017两条引物两端加上USER酶识别位点，引物如下：UlncR3017 F：5’ggcttaaUCAGCGTCTCCCAAATTCCG 3’；UlncR3017 R：5’ggtttaaUGTCCCAATGGCTGTCCACC 3’。于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司合成引物。PCR反应扩增lncR3017，PCR反应体系：10μl 5×Super Pfx HF Buffer、1μl dNTP Mix10mM each、0.8μl cDNA、2.5μl UlncR3017 F(10μmol/l)、2.5μl UlncR3017 R(10μmol/l)、0.5μl Super Pfx DNA Polymerase，加ddH₂O至50μl。PCR反应条件：首先98℃2min，之后98℃10s-60℃30s-72℃30s 35个循环，接着72℃10min，最后4℃保存。

八、ULncR3017的PCR产物胶回收：使用Gene Mark公司胶回收试剂盒。①称取2g琼脂糖溶于50mL TAE溶液中，制得4％琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，将目的片段凝胶切下；②将胶切片转移到1.5mL离心管中，加入2倍体积的Binding Solution，在60℃环境下保温5～15min，至胶体完全溶解，加热时2～3min可上下颠倒离心管，帮助其溶解；③将反应溶液转移至吸附柱中，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；④加入500μL BindingSolution，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；⑤在吸附柱中加入700μL WashSolution，等待1min，使缓冲液和膜进行平衡，在14000～16000rpm离心1min；⑥重复第5步；⑦空离3～5min，除去残余酒精；⑧将吸附柱转移到新的离心管，并加入30～100μL的60℃预热的Elution Solution(滴加时缓慢加入至中央部位)，静置1～3min；⑨以14000～16000rpm离心2min，回收DNA，-20℃保存。

九、ULncR3017与pCambia230035Su载体连接：①pCambia230035Su载体的制备，pCambia230035Su质粒酶切体系：10.0μl NEB4、10.0μl 10×BSA、20.0μlpCambia230035Su、58.0μl ddH₂O、2.0μl PacI。37℃酶切过夜(12-13h)，加入PacI酶1μl，反应1h，使酶切更充分，然后加入Nt.BbvCI酶1μl，37℃反应1h后，4％琼脂糖凝胶电泳查看酶切情况(条件允许的可进行胶回收)，剩余的至于-20℃保存备用。②pCambia230035Su载体与目的片段连接，连接体系：40ng酶切好的pCambia230035Su载体、200ng回收的UlncR3017、2μl 10×User Ligase Buffer、1U USER(5U/μl，Thermo)、加去离子水至20μl。

十、重组质粒的转化与筛选：①将保存于-80℃的DH5α大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰浴中，使其融化。②往融化了的感受态细胞悬液中加入1-1.5μl重组质粒，并用移液器轻轻吸打混匀，冰浴30min。③将离心管置于42℃水中热击，之后迅速转移至冰浴中，静置2-3min。④取890μl不含抗生素LB液体培养基至离心管，移液器吸打混匀后摇床37℃150rpm震荡45min复苏菌体。⑤从离心管中吸取100μl菌液，均匀涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，至液体被吸收，37℃于恒温箱中倒置培养12-16h。⑥挑取几个培养基上生长的单菌落，一半进行菌落PCR，将PCR验证成阳性菌株的另一半摇菌，送于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司进行测序验证。⑦鉴定后存菌。农杆菌感受态的转化：①取1.0～1.5μl质粒DNA加入100μl EHA105农杆菌感受态中，轻轻混合，冰浴5min。迅速投入液氮中，冷冻5min。②37℃水与融合，加800μl不加抗生素的YEB液体培养基，28℃，150rpm，震荡培养4-5h。③4000rpm，离心5min，倒去大部分上清，余100μl左右悬浮菌。④涂布在含链霉素，利福平，卡那霉素的YEB固体培养基的平板上，28℃暗培养48～96h。

本发明的有益效果为，从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017连接到过表达载体pCambia230035Su后，能够通过农杆菌侵染植物将lncR3017整合到植物基因组上，在植物体内lncR3017通过吸附miR408增加其对寒冷的耐受性，重组质粒有助于提高植物在黑龙江省这种高寒地区过冬的存活率，并有助于改善植物品质。本发明制作简单，可操作性强，成本低廉，效果明显。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1是从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017的碱基序列图。

图2是从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017的lncR3017的克隆结果电泳图。图中：M：maker(bp)。

图3是从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017的质粒双酶切电泳图。图中：M：maker(bp)。

图4是从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017的lncR3017胶回收电泳图。图中：M：maker(bp)。

图5是从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017的UlncR3017胶回收电泳图。图中：M：maker(bp)。

具体实施方式

实施例一：

如图所示，本发明从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017相关实验过程如下：

一、RNA的提取及cDNA的合成

使用康为世纪生物科技有限公司的RNA提取试剂盒提取RNA，具体方法如下：

(1)取东农冬麦1号(Dn1)分蘖节0.1g，在液氮中充分研磨后转移到1.5ml Ep管中，每30-50mg组织加入1ml TRlzon Reagent，混匀。

(2)样品中加入TRlzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

(3)以每1ml TRlzon Reagent加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置2分钟。

(4)4℃12000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。

(5)在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。

(6)将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复该步骤一次。

(9)12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。

(10)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μlRNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

使用超微量分光光度计P330测得RNA浓度后，逆转录成cDNA，方法如下：

按下表加入：

混匀，置于72℃金属浴5min，随后迅速置于冰上，按下表继续加入：

将小Ep管放入PCR仪中设置程序如：42℃，60min；72℃，10min。

二、LncR3017的克隆

根据lncR3017序列设计引物，引物如下：

于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司合成引物。

PCR反应扩增lncR3017，PCR反应体系：

PCR反应条件：

随后将PCR产物∶ddH₂O∶2×Taq MasterMix＝1∶1∶1混合，72℃20min

三、LncR3017的PCR产物胶回收

使用Gene Mark公司胶回收试剂盒。

(1)称取2g琼脂糖溶于50mL TAE溶液中，制得4％琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，将目的片段凝胶切下；

(2)将胶切片转移到1.5mL离心管中，加入2倍体积的Binding Solution，在60℃环境下保温5～15min，至胶体完全溶解，加热时2～3min可上下颠倒离心管，帮助其溶解；

(3)将反应溶液转移至吸附柱中，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；

(4)加入500μL Binding Solution，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；

(5)在吸附柱中加入700μL Wash Solution，等待1min，使缓冲液和膜进行平衡，在14000～16000rpm离心1min；

(6)重复第5步；

(7)空离3～5min，除去残余酒精；

(8)将吸附柱转移到新的离心管，并加入30～100μL的60℃预热的ElutionSolution(滴加时缓慢加入至中央部位)，静置1～3min；

(9)以14000～16000rpm离心2min，回收DNA，-20℃保存。

四、LncR3017与T载体连接

使用全式金生物技术有限公司试剂盒，按照下表加入Ep管中：

轻轻混匀，室温(20℃-37℃)反应5分钟，反应结束后，将离心管置于冰上。

五、重组质粒的转化与筛选

(1)将保存于-80℃的DH5α大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰浴中，使其融化。

(2)往融化了的感受态细胞悬液中加入上步得到的重组质粒，并用移液器轻轻吸打混匀，冰浴30min。

(3)将离心管置于42℃水中热击，之后迅速转移至冰浴中，静置2-3min。

(4)取890μl不含抗生素LB液体培养基至离心管，移液器吸打混匀后摇床37℃150rpm震荡45min复苏菌体。

(5)从离心管中吸取100μl菌液，均匀涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，至液体被吸收，37℃于恒温箱中倒置培养12-16h。

(6)挑取几个培养基上生长的单菌落，一半进行菌落PCR，将PCR验证成阳性菌株的另一半摇菌，送于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司进行测序验证。

(7)鉴定后存菌。

六、重组质粒的提取

使用天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒。

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

(2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1分钟，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60秒钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(7向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30-60秒钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)重复操作步骤(7)。

(9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。

七、ULncR3017的克隆

根据lncR3017两条引物两端加上USER酶识别位点，引物如下：

于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司合成引物。

PCR反应扩增lncR3017，PCR反应体系：

PCR反应条件：

八、ULncR3017的PCR产物胶回收

使用Gene Mark公司胶回收试剂盒。

(1)称取2g琼脂糖溶于50mL TAE溶液中，制得4％琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，将目的片段凝胶切下；

(2)将胶切片转移到1.5mL离心管中，加入2倍体积的Binding Solution，在60℃环境下保温5～15min，至胶体完全溶解，加热时2～3min可上下颠倒离心管，帮助其溶解；

(3)将反应溶液转移至吸附柱中，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；

(4)加入500μL Binding Solution，并以14000～16000rpm离心1min，丢弃滤液；

(5)在吸附柱中加入700μL Wash Solution，等待1min，使缓冲液和膜进行平衡，在14000～16000rpm离心1min；

(6)重复第5步；

(7)空离3～5min，除去残余酒精；

(8)将吸附柱转移到新的离心管，并加入30～100μL的60℃预热的ElutionSolution(滴加时缓慢加入至中央部位)，静置1～3min；

(9)以14000～16000rpm离心2min，回收DNA，-20℃保存。

九、ULncR3017与pCambia230035Su载体连接

(1)pCambia230035Su载体的制备，pCambia230035Su质粒酶切体系：

37℃酶切过夜(12-13h)，加入PacI酶1μl，反应1h，使酶切更充分，然后加入Nt.BbvCI酶1μl，37℃反应1h后，4％琼脂糖凝胶电泳查看酶切情况(条件允许的可进行胶回收)，剩余的至于-20℃保存备用。

(2)pCambia230035Su载体与目的片段连接，连接体系：

十、重组质粒的转化与筛选

(1)将保存于-80℃的DH5α大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰浴中，使其融化。

(2)往融化了的感受态细胞悬液中加入1-1.5μl重组质粒，并用移液器轻轻吸打混匀，冰浴30min。

(3)将离心管置于42℃水中热击，之后迅速转移至冰浴中，静置2-3min。

(4)取890μl不含抗生素LB液体培养基至离心管，移液器吸打混匀后摇床37℃150rpm震荡45min复苏菌体。

(5)从离心管中吸取100μl菌液，均匀涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，至液体被吸收，37℃于恒温箱中倒置培养12-16h。

(6)挑取几个培养基上生长的单菌落，一半进行菌落PCR，将PCR验证成阳性菌株的另一半摇菌，送于哈尔滨市睿博兴科(东北)生物技术有限公司进行测序验证。

(7)鉴定后存菌。

农杆菌感受态的转化

(1)取1.0～1.5μl质粒DNA加入100μl EHA105农杆菌感受态中，轻轻混合，冰浴5min。迅速投入液氮中，冷冻5min。

(2)37℃水与融合，加800μl不加抗生素的YEB液体培养基，28℃，150rpm，震荡培养4-5h。

(3)4000rpm，离心5min，倒去大部分上清，余100μl左右悬浮菌。

(4)涂布在含链霉素，利福平，卡那霉素的YEB固体培养基的平板上，28℃暗培养48～96h。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

核苷酸和/或氨基酸序列表

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 从东农冬麦一号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 377

<212> DNA

<213> 东农冬麦1号(Dongnongdongmai1)

<400> 1

gtcccaatgg ctgtccacct ccatggggcg agccggatag gttagccagc agtgaaaatt 60

ggccacctcc cgccgcgcgc atagtctgtt gccggccaag tgcggcccta tctggaacga 120

aggcaaaaaa agaaaaatcg taagaggata gaaaggcatc aggaagagcc gagtaaggcc 180

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gaatttggga gacgctg 377

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 东农冬麦1号(Dongnongdongmai1)

<400> 2

cagcgtctcc caaattccg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 东农冬麦1号(Dongnongdongmai1)

<400> 3

gtcccaatgg ctgtccacc 19

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 东农冬麦1号(Dongnongdongmai1)

<400> 4

ggcttaacag cgtctcccaa attccg 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 东农冬麦1号(Dongnongdongmai1)

<400> 5

ggtttaagtc ccaatggctg tccacc 26

Claims (1)

1.从东农冬麦1号发现的具有潜在ceRNA功能的长链非编码RNAlncR3017，其特征在于：所述长链非编码RNAlncR3017的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。

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