CN117866966A - 一种槟榔u6启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种槟榔U6启动子及其应用，具体涉及一种基于原生质体瞬时转化检测槟榔RNA聚合酶III型启动子AcU6‑2的方法，该启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次在槟榔基因组中克隆获得RNA聚合酶III型启动子AcU6‑2，槟榔原生质体瞬时转化结果表明，该启动子具有高效转录活性，可驱动下游荧光蛋白的表达。该方法可用于检测候选槟榔内源U6启动子，也可进一步用于截短筛选U6核心启动子。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种槟榔U6启动子及其应用，具体涉及一种基于原生质体瞬时转化检测槟榔RNA聚合酶III型启动子AcU6-2的方法。
背景技术
槟榔（学名：Areca catechu L.）是重要的热带经济棕榈作物，目前我国槟榔新品种的选育仍然是以传统的杂交育种为主，存在效率低、周期长的问题，严重地阻碍了槟榔抗病育种的进程。随着生物技术的发展，以基因编辑技术为代表的分子育种技术在多种作物中的应用加快了新品种的培育。
基因组编辑技术是一种研究基因功能的重要工具，它能精确修饰受体细胞染色体特定位点的基因，可以高效产生特定基因的功能失活突变体，能为生物功能基因组研究提供优质的遗传材料。sgRNA和Cas9是该技术系统的两个必要元件，其中sgRNA在CRISPR/Cas9基因组编辑过程中起到靶向结合目的基因位点的功能。研究显示，在CRISPR/Cas9基因编辑体系中，受体细胞中sgRNA的含量水平是影响编辑效率的重要因素之一，因此，可精确启动sgRNA体内转录的聚合酶III型启动子得到了广泛的关注。U6RNA是一种参与mRNA前体剪接的非编码RNA，其对应的U6启动子是一类RNA聚合酶III型启动子，并已经在许多物种的CRISPR/Cas9系统中得到了大量的应用。
虽然CRISPR/Cas9基因组编辑技术目前已在多个物种中得到广泛地应用，但是针对槟榔的基因编辑技术尚且未见报道。这主要是由于虽然在许多物种中U6启动子已有大量的报道，但外源的的U6启动子通常并不适用。可见，缺少适用的U6启动子已成为目前槟榔CRISPR/Cas9基因编辑体系的限制因子。因此，筛选出在槟榔中有功能活性的U6启动子对于槟榔的基因育种技术发展具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于原生质体的槟榔U6基因启动子及其重组质粒、表达载体和应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种槟榔U6基因启动子AcU6-2，所述启动子AcU6-2包括如SEQ ID No.1所示的DNA核苷酸序列。上述槟榔U6基因启动子AcU6-2属于槟榔U 6 s n R N A基因的R N A聚合酶I I I型启动子，来源于槟榔（Areca catechu L.）。
具体的，所述启动子AcU6-2的DNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种重组质粒AcU6-2-mNeonGreen，含有所述的槟榔U6启动子AcU6-2。
进一步的，本发明提供一种槟榔瞬时转化载体，是通过将重组质粒AcU6-2-mNeonGreen克隆至植物表达载体制备得到。
本发明还公开了一种克隆所述的槟榔U6基因启动子AcU6-2的方法，包括如下步骤：
（1）以槟榔品种热研1号叶片基因组DNA为模板，设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）AcU6-2序列的特异引物：
AcU6-2-F：
TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTCAAGCATCGAATAATTATTTATC；
AcU-2-R：
gctcaccatcGACCCTCCTGACCAAGATTTAT；
（2）使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；
（3）将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有444bp槟榔U6基因启动子DNA片段AcU6-2。
具体的，所述步骤（2）中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环，72℃终延伸7min。
本发明还公开了一种构建所述的橡胶树瞬时转化载体的方法，包括如下步骤：
（a）用上述方法准备AcU6-2片段。
（b）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）mNeonGreen荧光蛋白序列的特异引物：
AcU6-2-Neon F：
CAGGAGGGTCgatggtgagcaagggcgagga；
AcU6-2-Neon R：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatgcc；
使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增mNeonGreen片段；
将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有711bp的nNeonGreen基因片段。
具体的， PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，72℃终延伸7min。
（c）用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段。
（d）采用无缝克隆方法将步骤（a）（b）（c）中片段AcU6-2、mNeonGreen、pUN1301连接获得含有槟榔AcU6-2启动子驱动荧光蛋白的表达载体pAcU6-2-mNeonGreen。
将上述载体转化至大肠杆菌DH5α中扩繁获得高浓度质粒用于槟榔原生质体转化。
本发明首次在槟榔中克隆获得槟榔RNA聚合酶III型启动子即槟榔内源U6启动子AcU6-2。
本发明首次将克隆的槟榔内源RNA聚合酶III型启动子连接驱动mNeonGreen荧光蛋白，通过瞬时转化槟榔叶片原生质体验证了该启动子的驱动荧光蛋白表达的可行性，为后续筛选、验证其它槟榔内源U6启动子提供一种快速有效的方法。
附图说明
图1 pAcU6-2-mNeonGreen表达载体结构简图；
图2 槟榔幼苗叶片原生质体分离与镜检；（A：槟榔幼苗，B：含幼嫩叶片的茎段，C：幼嫩叶片，D：叶片酶解，E：原生质体镜检）
图3 槟榔原生质体瞬时转化结果（对照）；
图4 槟榔原生质体瞬时转化结果（AcU6-1表达载体）；
图5 槟榔原生质体瞬时转化结果（AcU6-2表达载体）；
图6 槟榔原生质体瞬时转化结果（AcU6-3表达载体）；
图7 槟榔原生质体瞬时转化结果（35s-GFP表达载体）。
具体实施方式
本发明下述实施例中，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的载体pUN1301由西北农林科技大学李文强课题组惠赠，pmNeonGreen载体购自淼灵质粒平台，上述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。
实施例1槟榔U6基因启动子AcU6-1、AcU6-2、AcU6-3的获得
以拟南芥AtU6-26基因(Genebank登录号：X52528 .1)和棉花GhU6-9基因（Genebank登录号：XR_001680717.1）的DN A序列为参考，搜索槟榔基因组数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CM038038.1），通过同源比对的方式找到3个槟榔候选AcU6基因，获得此基因上游参考序列。
以槟榔品种热研一号 （中国热带农业科学院椰子研究所培育）叶片基因组DNA为模板，设计如下AcU6-1（381bp）、AcU6-2（444bp）、AcU6-3（537bp）特异引物，以克隆该启动子区DNA片段：
AcU6-1 F：
TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTCAAACTCAATCGCATAAAAC；
AcU6-1 R：
gctcaccatcGGTAGATGCCCTTGCCGGTA；
AcU6-2 F：
TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTCAAGCATCGAATAATTATTTATC；
AcU6-2 R：
gctcaccatcGACCCTCCTGACCAAGATTTAT；
AcU6-3 F：
AAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTGTGATCATTGGTTTTTTTCCCC；
AcU6-3 R：
gctcaccatcGAGTAGTCAAAGTTAACATGGT；
使用KOD 酶（TOYOBO）在20μl反应体系中进行PCR扩增，具体反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，72℃终延伸7min。经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
以含有mNeonGreen基因的质粒为模板，设计用于构建AcU6-1-Neon、AcU6-2-Neon、AcU6-3-Neon表达盒的特异引物，以克隆荧光蛋白基因片段：
AcU6-1-Neon F：
GGCATCTACCgatggtgagcaagggcgagga；
AcU6-1-Neon R：
ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatg；
AcU6-2-Neon F：
CAGGAGGGTCgatggtgagcaagggcgagga；
AcU6-2-Neon R：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatgcc；
AcU6-3-Neon F：
TTGACTACTCgatggtgagcaagggcgaggagg；
AcU6-3-Neon R：
ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtcca；
使用KOD 酶（TOYOBO）在20μl反应体系中进行PCR扩增，具体反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，72℃终延伸7min。经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段，经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
分别采用无缝克隆方法将制备好的片段AcU6、mNeonGreen、pUN1301连接获得含有槟榔AcU6启动子驱动荧光蛋白的表达载体pAcU6-1-mNeonGreen、pAcU6-2-mNeonGreen和pAcU6-3-mNeonGreen，载体表达结构见图1。
将上述载体转化至大肠杆菌DH5α中扩繁获得高浓度质粒用于槟榔原生质体转化。
槟榔幼嫩叶片的原生质体分离简要过程见图2。
荧光检测结果见图3至图7，其中图3表示未转化对照；图4表示AcU6-1没有检测到荧光；图5表示AcU6-2检测到荧光，表明AcU6-2具有转录活性；图6表示AcU6-3没有检测到荧光；图7是35s启动子驱动GFP表达作为阳性对照。因此，本发明所述可用于检测槟榔内源U6启动子，从而为后续建立槟榔基因编辑技术体系提供支撑。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种槟榔U6启动子AcU6-2，其特征在于，该启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的槟榔U6启动子AcU6-2在驱动mNeonGreen绿色荧光蛋白在槟榔原生质体中表达的应用。
3.一种重组质粒AcU6-2-mNeonGreen，其特征在于，含有权利要求1所述的槟榔U6启动子AcU6-2。
4.一种槟榔瞬时转化载体，其特征在于，将重组质粒AcU6-2-mNeonGreen克隆至植物表达载体制备得到。
5.根据权利要求4所述的槟榔瞬时转化载体，其特征在于，植物表达载体为pUN1301。
6.一种克隆权利要求1所述的槟榔U6启动子AcU6-2的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以槟榔品种热研1号叶片基因组DNA为模板，设计用于无缝克隆片段AcU6-2序列的特异引物：
AcU6-2-F：
TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTCAAGCATCGAATAATTATTTATC；
AcU-2-R：
gctcaccatcGACCCTCCTGACCAAGATTTAT；
（2）使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；
（3）将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有444bp槟榔U6基因启动子DNA片段AcU6-2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环，72℃终延伸7min。
8.一种构建槟榔树瞬时转化载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）利用权利要求7所述的方法制备AcU6-2片段；
（b）设计用于无缝克隆片段mNeonGreen荧光蛋白序列的特异引物：
AcU6-2-Neon F：
CAGGAGGGTCgatggtgagcaagggcgagga；
AcU6-2-Neon R：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatgcc；
使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增mNeonGreen片段；
将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有711bp的nNeonGreen基因片段；
（c）用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段；
（d）采用无缝克隆方法将步骤（a）（b）（c）中片段AcU6-2、mNeonGreen、pUN1301连接获得含有槟榔AcU6-2启动子驱动荧光蛋白的表达载体pAcU6-2-mNeonGreen；将上述载体转化至大肠杆菌DH5α中扩繁获得高浓度质粒用于槟榔原生质体转化。
9.根据权利要求8所述的构建槟榔树瞬时转化载体的方法，其特征在于，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，72℃终延伸7min。
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- 2024-03-13 CN CN202410283876.5A patent/CN117866966B/zh active Active
Patent Citations (7)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117866966B (zh) | 2024-05-24 |
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