CN111471620A - 一种生防细菌bv03、应用及其菌剂和菌剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物植物保护应用技术领域，具体涉及一种生防细菌BV03、应用及其菌剂和菌剂制备方法，所述生防细菌BV03为贝莱斯芽孢杆菌BV03，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18936，保藏日期为2019年11月11日，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。本发明菌剂对茄科植物和/或蔷薇科植物的黄萎病具有明显生物防治作用，种子消毒时防效接近85％，灌根处理的防效达到75％以上，喷施茎叶的防效达到70％以上，节约大量成本，对经济植物的栽培具有重大应用价值。

Description

一种生防细菌BV03、应用及其菌剂和菌剂制备方法

技术领域

本发明涉及微生物植物保护应用技术领域，具体涉及一种生防细菌BV03、应用及其菌剂和菌剂制备方法。

背景技术

近年来，绿色生态农业不断发展，取得不小成果。另外，随着人们对食品健康的日益关注，蔬菜水果需求量大大增加。

黄萎病是一种危害严重的世界性病害，因其发病范围广、流行性强、发病率高的特点，是果蔬生产过程中最具毁灭性的病害之一，该病主要由黑白轮枝菌和大丽轮枝菌引起。黑白轮枝菌和大丽轮枝菌不但通过种子传播，还存在并长期存活于带病土壤及秸秆还田土壤中，能够从植物根系入侵，随维管束向上繁殖蔓延。另外，黄萎病作为一种土传累积性病害，病害会随土壤中病菌积累而逐年加重。目前对于黄萎病没有有效的防治方法，主要以选育抗病或耐病的品种为主，一旦病菌的致病性超越抗、耐病的品种的抗性水平，将严重影响产量，而现行栽培制度(长期连作、秸秆还田、滴灌等)也十分利于黄萎病的发生。常见的植物病害控制方法有培育抗性品种﹑施加化学保护等，培育抗性品种耗时长，而施加化学保护易出现化学药品的不规范使用或超过使用标准的现象，带来食品安全隐患。

为解决该问题，探寻新的功能微生物替代或部分替代化学保护用于农业生产的研究备受关注。广泛存在于自然界的芽孢杆菌属多数为有益微生物，是一种能产生芽孢，需氧或兼性厌氧细菌。芽孢杆菌属在不利的环境下也可以产生孢子抵抗不利环境因素，比其它生防细菌具有明显抗逆优势。芽孢杆菌属产生的次生代谢产物对病原菌、蚜虫和线虫产生广谱抗性，可以在植物根部定殖，对抑制病原菌起着重要作用，因此，它在抗菌素、杀虫剂等方面逐渐得到开发利用。

为解决培育抗性品种耗时长，施加化学保护易出现化学药品的不规范使用或超过使用标准的技术问题，提供一种果蔬黄萎病防治效果良好的生防细菌BV03、应用及其菌剂和菌剂制备方法十分重要。

发明内容

针对防治黄萎病中存在的化学农药过量施用带来的食品安全隐患问题，本发明提供一种生防细菌BV03、应用及其菌剂和菌剂制备方法，本发明菌剂对茄科植物(辣椒和番茄)和/或蔷薇科植物(草莓)的黄萎病具有明显生物防治作用，尤其能够有效对辣椒、番茄、草莓种子进行消毒，防治果蔬黄萎病病原菌的繁殖，从而节约大量成本，使果蔬生产效益最大化，对经济植物的栽培具有重大应用价值。

第一方面，本发明提供一种生防细菌BV03，所述生防细菌BV03为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BV03，所述贝莱斯芽孢杆菌BV03已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18936，保藏日期为2019年11月11日，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis。

第二方面，本发明提供一种上述生防细菌BV03在黄萎病防治中的应用，优选为在茄科植物和/或蔷薇科植物黄萎病防治中的应用。

进一步的，所述应用为采用含有上述生防细菌BV03的菌剂或菌剂的稀释液浸种、灌根和喷施茎叶。

第三方面，本发明提供一种含有上述生防细菌BV03的菌剂，所述菌剂的剂型为悬浮剂。

进一步的，所述菌剂的活菌浓度不低于5.5×10⁹cfu/mL，室温条件下半年后菌剂中活菌数目不低于5.0×10⁹cfu/mL。

第四方面，本发明提供一种上述菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将-80℃保存的贝莱斯芽孢杆菌BV03菌株接种至固体LB培养基，30℃±1℃条件下倒置培养16h或过夜培养，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，30℃±1℃条件下培养至对数生长期，获得供接种用使用的种子液，作为种子液浓度达到1.0×10⁸cfu/mL；

(2)将种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度不低于1.0×10⁷cfu/mL；

(3)按质量百分比向发酵液中依次加入0.1～0.2％表面活性剂﹑2～3％防腐剂﹑6～8％悬浮助剂﹑0.4～0.5％增稠剂，待每个添加剂完全溶解后加入下一种添加剂，获得贝莱斯芽孢杆菌BV03菌剂。

进一步的，所述步骤(2)的培养条件为：在30℃±2℃条件下，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量25％～30％，转速180～220r/min，发酵过程中保持发酵液pH7.0～7.5，培养48h后测量活菌总量，产孢率达到90％，活菌计数浓度达到6.3×10⁹cfu/mL，发酵结束。

进一步的，所述步骤(2)的发酵培养基包括玉米粉2％，豆粕粉1％，酵母粉0.3％，CaCl₂ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，KH₂PO₄ 0.15％，FeSO₄·7H₂O0.001％(皆为质量体积比)，余量为水；

所述发酵培养基pH为7.0～7.5，0.1MPa连同发酵罐一起115℃灭菌60min，自然冷却到常温。

进一步的，所述步骤(3)的表面活性剂为有机硅BD-3077，防腐剂为山梨酸钾，悬浮助剂为D91，增稠剂为羧甲基纤维素钠。

本发明的有益效果在于，

本发明提供的生防细菌BV03、及含有生防细菌BV03的菌剂与市场常规化学农药(如多菌灵)相比，对大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起的黄萎病防治效果良好，为微生物源农药的研发提供新的思路。使用100倍稀释液进行浸种处理对土传病原大丽轮枝菌和黑白轮枝菌的防效接近85％；使用50倍稀释液进行灌根处理对土传病原大丽轮枝菌和黑白轮枝菌的防效达到75％以上；使用100倍稀释液进行茎叶喷施处理对土传病原大丽轮枝菌和黑白轮枝菌的防效达到70％以上。同时，本发明菌剂制备方法简单，田间施用方便。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1一种含有生防细菌BV03的菌剂

一种含有生防细菌BV03的菌剂，所述生防细菌BV03为贝莱斯芽孢杆菌BV03，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18936，保藏日期2019年11月11日，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌剂的剂型为悬浮剂；

菌剂的制备方法包括如下步骤：

(1)将-80℃保存的贝莱斯芽孢杆菌BV03菌株接种至固体LB培养基，30℃±1℃条件下倒置培养16h或过夜培养，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，30℃±1℃条件下培养至对数生长期，获得供接种用使用的种子液，作为种子液浓度达到1.0×10⁸cfu/mL；

(2)将种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度不低于1.0×10⁷cfu/mL，其中，

发酵培养基包括玉米粉2％，豆粕粉1％，酵母粉0.3％，CaCl₂ 0.2％，MgSO₄·7H₂O0.15％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，KH₂PO₄ 0.15％，FeSO₄·7H₂O 0.001％(皆为质量体积比)，余量为水；

发酵培养基pH为7.0～7.5，0.1MPa连同发酵罐一起115℃灭菌60min，自然冷却到常温；

培养条件为在30℃±2℃条件下，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量25％～30％，转速180～220r/min，发酵过程中保持发酵液pH7.0～7.5，培养48h后测量活菌总量，产孢率达到90％，活菌计数浓度达到6.3×10⁹cfu/mL，发酵结束；

(3)按质量百分比向发酵液中依次加入0.1～0.2％表面活性剂有机硅BD-3077﹑2～3％防腐剂山梨酸钾﹑6～8％悬浮助剂D91﹑0.4～0.5％增稠剂羧甲基纤维素钠，获得贝莱斯芽孢杆菌BV03悬浮剂，悬浮剂活菌浓度不低于5.5×10⁹cfu/mL，室温条件下半年后活菌数目不低于5.0×10⁹cfu/mL。

实施例2菌剂在工厂化育苗中的浸种应用

试验分为生防细菌BV03处理组和对照组，试验方法为将每升灭菌处理的营养土混合0.5g大丽轮枝菌菌体和0.5g黑白轮枝菌菌体，充分混匀后获得栽培基质，按照常规方法播种上述处理组和对照组种子并常规管理果蔬植物，每组处理33株，重复3遍，28d后观察统计感染大丽轮枝菌/黑白轮枝菌引发的辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病的发病率和病级。其中，

生防细菌BV03处理组：将浓度为5.5×10⁹cfu/mL的实施例1菌剂分别配制成50倍稀释液、100倍稀释液和200倍稀释液(体积比)，充分混匀后，对辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑草莓“星都2号”种子进行12h浸泡处理；

对照组：未经实施例1菌剂浸种处理的辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑草莓“星都2号”种子。

各供试作物发病现象如下：

辣椒黄萎病发病时，近地面的叶片首先下垂，叶缘或叶尖逐渐变黄，发干或变褐，脉间的叶肉组织变黄，茎基部导管变褐，且沿主茎向上扩展达到数个侧枝，最后致全株萎蔫、叶片枯死脱落，该病扩展较慢，一般多造成病株矮化、节间缩短、生长停滞，造成不同程度的减产；

番茄黄萎病发病时主要是病叶由下至上逐渐变黄，黄色斑驳首先出现在侧脉之间，上部较幼嫩的叶片以叶脉为中心变黄，形成明显的楔形黄斑，逐渐扩大到整个叶片，最后病叶变褐枯死；

草莓黄萎病发病时，初侵染外围叶片、叶柄产生黑褐色长条形病斑，叶片失去生气和光泽，从叶缘和叶脉间变成黄褐色萎蔫，干燥时枯死；新嫩叶片感病表现无生气，变灰绿或淡褐色下垂，继而从下部叶片开始变成黄枯状萎蔫直至整株枯死；被害株叶柄、果梗和根茎横切面可见维管束的部分或全部变褐，根在发病初期无异常。

各供试作物的病级分级标准参考“E.K.Ligoxigakis.and D.J.Vaiounakis的分级标准”，如下：0级：全株未发病；1级：子叶发黄﹑枯萎﹑干燥﹑第一片真叶发黄；2级：第一﹑第二片真叶发黄﹑枯萎﹑干燥；3级：第三片以上真叶发黄﹑枯萎，植株矮化；4级：植株死亡。

发病率、病情指数、相对防效的计算公式如下：

发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％；

病情指数＝100×Σ(各级病叶数×相对病级)/(调查总叶数×最高病级)；

相对防效(％)＝[(对照区病指-处理区病指)/对照区病指]×100％。

利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表1所示。

表1菌剂浸种处理对辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病防治效果

结果显示，相较对照组，使用实施例1菌剂的果树植物的发病均明显下降。50倍稀释液时，对辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病的相对防效分别为81.46％、80.99％和81.52％；100倍稀释液时，对辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病的相对防效分别为84.77％、84.51％和83.70％；200倍稀释液时，对辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病的相对防效分别为68.87％、71.23％和72.83％；因此，本发明菌剂能够明显抑制大丽轮枝菌和/或黑白轮枝菌引起的辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病病害发病。

实施例3菌剂的灌根应用

试验按农业部药检所田间试验准则设计，试验地点为济南市孙家村设施田地，试验地土壤为黄褐土，土壤肥力中等，具有灌溉条件，该地区于常年种植辣椒﹑番茄﹑草莓，并于2018年种植过程中爆发过大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起的辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病；供试作物分别为辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑草莓“星都2号”；试验时间分别为2019年5月、2019年6月和2019年2月，试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行；

辣椒种植、番茄种植和草莓种植各设置5个处理，浓度为5.5×10⁹cfu/mL的实施例1菌剂50倍稀释液、100倍稀释液或200倍稀释液(体积比)分别作为处理组I、II、III，50％多菌灵500倍稀释液以及清水对照；

各处理以灌根形式伴随移苗期进行，每处理0.04亩，各3次重复，共15个小区面积0.6亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取15d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。病级分级标准及发病率、病情指数和相对防效的计算方法与实施例2相同，利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表2-4所示。

表2菌剂灌根处理辣椒对辣椒黄萎病防效影响

表3菌剂灌根处理番茄对番茄黄萎病防效影响

表4菌剂灌根处理草莓对草莓黄萎病防效影响

表2～4结果显示，相较对照组，使用实施例1菌剂的果蔬植物的发病均明显下降，施用50倍稀释液时，对辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病的防治效果最佳，相对防效能够达到或优于化学保护剂多菌灵的相对防效，能够明显抑制大丽轮枝菌和/或黑白轮枝菌引起的辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病病害发病，保护辣椒﹑番茄﹑草莓移苗后的健康生长。

实施例4菌剂的喷施叶面应用

试验按农业部药检所田间试验准则设计，试验地点为济南市孙家村设施田地，试验地土壤为黄褐土，土壤肥力中等，具有灌溉条件，该地区于常年种植辣椒﹑番茄﹑草莓，并于2018年种植过程中爆发过大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起的辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病；供试作物分别为辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑草莓“星都2号”；试验时间分别为2019年5月、2019年6月和2019年2月，试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行；

辣椒种植、番茄种植和草莓种植各设置5个处理，浓度为5.5×10⁹cfu/mL的实施例1菌剂50倍稀释液、100倍稀释液或200倍稀释液(体积比)分别作为处理组I、II、III，50％多菌灵500倍稀释液以及清水对照；

各处理以叶面喷施形式伴随花期进行，每间隔7天喷施一次，连续施用3次。每处理0.04亩，各3次重复，共15个小区面积0.6亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取15d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。病级分级标准及发病率、病情指数和相对防效的计算方法与实施例2相同，利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表5-7所示。

表5菌剂喷施辣椒叶面对辣椒黄萎病防效影响

表6菌剂喷施番茄叶面对番茄黄萎病防效影响

表7菌剂喷施草莓叶面对草莓黄萎病防效影响

表5～7结果显示，相较对照组，叶面喷施实施例1菌剂的果蔬植物的发病均明显下降，施用100倍稀释液喷施时，对辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病的防治效果最佳，相对防效优于化学保护剂多菌灵的相对防效。这说明本发明菌剂能够明显抑制大丽轮枝菌和/或黑白轮枝菌引起的辣椒黄萎病﹑番茄黄萎病﹑草莓黄萎病病害发病，为辣椒﹑番茄﹑草莓花果期的生长提供保护，保障其结实。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种生防细菌BV03，其特征在于，所述生防细菌BV03为贝莱斯芽孢杆菌BV03，所述贝莱斯芽孢杆菌BV03已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18936，保藏日期为2019年11月11日，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。

2.一种如权利要求1所述生防细菌BV03在黄萎病防治中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为在茄科植物和/或蔷薇科植物黄萎病防治中的应用。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为采用含有生防细菌BV03的菌剂或菌剂的稀释液浸种、灌根和喷施茎叶。

5.一种含有如权利要求1所述生防细菌BV03的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为悬浮剂。

6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活菌浓度不低于5.5×10⁹cfu/mL，室温条件下半年后菌剂中活菌数目不低于5.0×10⁹cfu/mL。

7.一种如权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将-80℃保存的贝莱斯芽孢杆菌BV03菌株接种至固体LB培养基，30℃±1℃条件下倒置培养16h或过夜培养，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，30℃±1℃条件下培养至对数生长期，获得供接种用使用的种子液，作为种子液浓度达到1.0×10⁸cfu/mL；

(2)将种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度不低于1.0×10⁷cfu/mL；

(3)按质量百分比向发酵液中依次加入0.1～0.2％表面活性剂﹑2～3％防腐剂﹑6～8％悬浮助剂﹑0.4～0.5％增稠剂，待每个添加剂完全溶解后加入下一种添加剂，获得贝莱斯芽孢杆菌BV03菌剂。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的培养条件为：在30℃±2℃条件下，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量25％～30％，转速180～220r/min，发酵过程中保持发酵液pH7.0～7.5，培养48h后测量活菌总量，产孢率达到90％，活菌计数浓度达到6.3×10⁹cfu/mL，发酵结束。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的发酵培养基包括玉米粉2％，豆粕粉1％，酵母粉0.3％，CaCl₂ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，KH₂PO₄ 0.15％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，余量为水；

所述发酵培养基pH为7.0～7.5，0.1MPa连同发酵罐一起115℃灭菌60min，自然冷却到常温。

10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的表面活性剂为有机硅BD-3077，防腐剂为山梨酸钾，悬浮助剂为D91，增稠剂为羧甲基纤维素钠。