CN113583888A - 一种贝雷斯芽孢杆菌及其在枸杞炭疽病防治中的应用 - Google Patents

一种贝雷斯芽孢杆菌及其在枸杞炭疽病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)F3A及其在枸杞炭疽病生物防治中的应用，该菌株保藏编号为CGMCC21518，于2020年12月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。该菌株对枸杞炭疽病菌（Colletotrichum acutatum）具有较好的防治作用，对黄芪根腐病、茄子菌核病、番茄叶霉病、番茄早疫病和番茄灰霉病等病菌表现出广谱的抑菌活性，同时菌株产IAA、蛋白酶和葡聚糖酶的活性较高，且具溶解有机磷和无机磷的能力。利用该菌株开发新的生物农药、微生物菌剂均具有很好的应用前景。

Description

一种贝雷斯芽孢杆菌及其在枸杞炭疽病防治中的应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体地说，涉及一种贝雷斯芽孢杆菌及其在枸杞炭疽病防治中的应用。
背景技术
枸杞(Lycium chinense)是一种药食同源的重要经济作物，全国种植面积已超过300万亩。枸杞炭疽病又称黑果病，是枸杞生产上的一种常见病害，主要危害枸杞青果，一旦流行会给种植户造成严重的经济损失，每年造成的产量损失超过30％以上，重者达70％以上。采果期化学农药大量使用，严重制约枸杞的安全生产，因此，寻找安全有效的枸杞炭疽病生物防控措施是枸杞生产急需解决的问题。
芽胞杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌的总称，其抗逆性强，繁殖力强，抑菌谱广，而且高效杀菌，防治效果好，安全评价好，易于制剂化且成本较低，具有诱导抗病性及促生增产的作用，是理想的生防菌筛选对象。目前关于筛选芽胞杆菌作为梨树、辣椒等植物炭疽病生防菌的报道较多，如钱鑫磊等(2017)筛选出的甲基营养型芽胞杆菌菌株RT-30防治梨树胶孢炭疽病菌，韩长志和霍超(2015)筛选出的阿克拉奎斯芽胞杆菌菌株yb33防治核桃炭疽病菌，程欢欢等(2019)筛选出的枯草芽胞杆菌菌株MT332防治辣椒炭疽病，但未见筛选芽胞杆菌作为枸杞炭疽病生防菌的报道。因此，寻找安全有效的枸杞炭疽病防治方法和防治药剂，解决枸杞采摘期农药残留的瓶颈问题，使用芽孢杆菌开发生物农药潜力巨大。
发明内容
为了克服上述现有技术防治枸杞炭疽病上的不足，本发明的首要目的在于提供一株以枸杞炭疽病菌为筛选对象，对枸杞炭疽病菌具有较好抑制效果的芽孢杆菌，命名为F3A，为枸杞炭疽病的生物防治奠定基础。
本发明对F3A通过培养观察期菌落和菌体形态，进行生理生化试验，及16SrDNA和gyrA分子生物学鉴定，确定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。菌株F3A现已保藏于国家微生物资源平台——中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号邮政编码：100081,保藏编号CGMCC21518，保藏日期2020年12月23日。
本发明还提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A在防治枸杞炭疽病中的应用。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A将其喷施到枸杞表面用于病害的防治，对枸杞的食用及其加工产品来说更加安全可靠，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A不限于防治枸杞炭疽病，也可用于黄芪根腐病、茄子菌核病、番茄叶霉病、番茄早疫病和番茄灰霉病的防治。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点：
1、本发明的贝莱斯芽孢杆菌及其发酵液均对枸杞炭疽病句具有强烈的抑制作用，具有优异的防治枸杞炭疽病的生防作用，环保无残留；
2、本发明得到的贝莱斯芽孢杆菌，生产条件和成本要求低，具有较好的市场开发应用前景。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A在LB培养基上的单菌落图，a为革兰氏染色，b为单菌落。
图2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A对枸杞炭疽病菌的抑制作用效果图。
图3贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A对植物病原真菌的广谱性抑菌试验，其中1黄瓜枯萎病菌，2棉花枯萎病菌，3番茄早疫病菌，4番茄灰霉病菌，5茄子菌核病菌，6番茄叶霉病菌，7黄芪根腐病菌。
图4是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A系统发育树图，A为16S rDNA基因序列系统发育树图，B为gyrA基因序列系统发育树图。
图5为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A发酵液对枸杞炭疽病的室内离体防治效果图，其中，a1为对照处理，a2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A发酵液处理。
图6为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A发酵液对枸杞炭疽病的田间防治效果图，其中，A为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F3A发酵液处理，B为对照处理。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1：生防菌株的筛选
将从原始森林土壤中分离的菌株F3A、YG、421、921、Z9A、XF等分别进行活化培养。采用平板对峙法进行生防菌株筛选。筛选出菌株F3A对枸杞炭疽病菌的抑菌率最好，达62.13％(表1、图2)。
表1F3A对枸杞炭疽病菌的拮抗作用
Figure BDA0002860332280000031
Figure BDA0002860332280000041
实施例2：生防菌株F3A的形态学和分子生物学鉴定
形态学鉴定：观察生防菌株的形态特征并进行革兰氏染色和芽孢染色镜检。在LB培养基上28℃培养3d后，生防菌株F3A单菌落直径约为3mm，乳白色，边缘不整齐，表面有褶皱且向上突起；菌体杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性(见图1)。
分子生物学鉴定：生防菌株于LB培养基上活化培养24h后，直接挑取单菌落分别采用16S rDNA和gyrA基因序列进行PCR鉴定(见图4)。
综合形态特征、16S rDNA基因序列分析以及gyrA基因序列分析结果，最终将生防菌株F3A鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。菌株F3A现已保藏于国家微生物资源平台——中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC21518。
实施例3：生防菌株F3A对孢子萌发的影响
将枸杞炭疽病菌置于PDA平板上，于25℃恒温箱中培养10d，用10mL无菌水冲洗平板，制备孢子悬浮液。将筛选的生防菌株接种于100mL LB液体培养基中，于28℃、180r/min下培养60h后得到发酵液，将发酵液分别稀释1倍、10倍和100倍。分别取等体积不同稀释倍数的生防菌株发酵液与等体积枸杞炭疽病菌孢子悬浮液混合，分别吸取100μL混合液置于凹玻片上，25℃条件下保湿培养24h后，于显微镜下检查孢子萌发的数量，其中1倍稀释液的抑制率最高达100％，10倍和100倍稀释液的抑制率分别为69.6％和35.2％(表2)。
表2F3A对枸杞炭疽病菌孢子萌发的影响
Figure BDA0002860332280000042
Figure BDA0002860332280000051
实施例4：生防菌株F3A的生物学功能测定
蛋白酶活性定性测定：将生防菌株F3A活化后点接于脱脂牛奶琼脂培养基上，28℃培养2d，生防菌株F3A菌落周围有明显的透明圈产生，表明生防菌株F3A有产蛋白酶的能力。
葡聚糖酶活性定性测定：将生防菌株F3A活化后点接到Avicel培养基上，28℃培养2d后，生防菌株F3A菌落周围产生明显的透明圈，表明生防菌株F3A有产葡聚糖酶的能力。葡聚糖酶活性水平最高，为++++，蛋白酶活性水平次之，为+++(表3)。
溶磷能力定性测定：将生防菌株F3A分别接种到有机磷固体培养基和无机磷固体培养基上，每个培养皿接5个点，于28℃培养8d后，生防菌株F3A均能产生溶磷圈，溶磷圈与菌落直径的比值分别为1.15和1.17，表明生防菌株F3A有同时消溶有机磷和无机磷的能力。
吲哚乙酸能力测定：采用Salkowski比色法测定生防菌株F3A的产吲哚乙酸能力。根据标准曲线计算得，菌株F3A在含色氨酸的金氏培养液中分泌IAA的质量浓度为5.76mg/L，在不含色氨酸的金氏培养液中分泌IAA的质量浓度为5.74mg/L，证明生防菌株F3A合成吲哚乙酸不依赖外源色氨酸。
表3菌株F3A蛋白酶和葡聚糖酶活性测定
Figure BDA0002860332280000052
注：++++.D≥2cm；+++.D﹦1～2cm；++.D﹦0.5～1cm；+.D﹤0.5cm。
实施例5：生防菌株F3A的稳定性和抑菌谱测定
将生防菌株F3A活化培养后转接到LB培养基上，每隔2d转接1次，将转接后的生防菌株置于28℃恒温箱中培养，转接培养20次后获得继代培养20代的生防菌株。将活化培养的第1代生防菌株与继代培样20代的生防菌株与枸杞炭疽病菌对峙培养，生防菌株F3A继代培养1代和20代后对枸杞炭疽病菌的抑菌率分别62.13％和61.21％，两者之间差异不显著，表明生防菌株F3A的抑菌效果稳定(表4)。
将生防菌株F3A与7株供试病原真菌进行对峙培养，25℃恒温箱中培养7d后测量菌落直径，其中对黄芪根腐病菌、茄子菌核病菌以及番茄叶霉病菌的抑菌效果较好，抑菌率分别达到66.08％、71.13％和79.27％，对番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的抑菌效果次之，抑菌率分别为53.58％和53.00％，对棉花枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌的抑菌效果最差，抑菌率分别为40.71％和32.00％(图3、表5)。
表4继代培养菌株F3A对枸杞炭疽病菌的抑菌效果
Figure BDA0002860332280000061
表5生防菌株F3A对7种病原菌的抑菌率
Figure BDA0002860332280000062
Figure BDA0002860332280000071
表中数据为平均数±标准差。同列不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。
实施例6：生防菌株的室内防治效果试验
生防菌株的预防作用：选取健康的枸杞青果，75％乙醇表面消毒30s，用无菌水冲洗3次后晾干。用无菌接种针在每个枸杞上均匀针刺10个伤口，分别取生防菌株F3A发酵液1倍、10倍和100倍稀释液100μL用无菌枪头涂抹接种到每个枸杞青果表面，以接种等量清水为对照，每个处理接种10个枸杞青果，待表面晾干后，再用无菌枪头涂抹接种浓度为1×107个/mL的枸杞炭疽病菌孢子悬浮液100μL，25℃保湿培养3d后调查发病情况，参照枸杞炭疽病分级标准对枸杞果实发病情况进行分级。
枸杞炭疽病分级标准：0级，果实表面无病斑；1级，0＜果实表面发病面积占比≤25％；2级，25％＜果实表面发病面积占比≤50％；3级，50％＜果实表面发病面积占比≤75％；4级，果实表面发病面积＞75％(张晓煜等，2007)。
根据分级结果计算病情指数，病情指数＝(∑各级病果数×该病级数)/(调查总果数×最高级数)×100；根据病情指数计算防治效果，防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
生防菌株F3A发酵液1倍、10倍和100倍稀释液对枸杞炭疽病的预防作用较好，防治效果分别为90.32％、54.84％和32.26％，三者之间差异显著(P<0.05)(图5、表6)。
表6生防菌株F3A发酵液对枸杞炭疽病的室内防治效果
Figure BDA0002860332280000072
Figure BDA0002860332280000081
表中数据为平均数±标准差。同列不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。
实施例7：生防菌株F3A的田间防治效果试验
田间试验在扦插繁殖的枸杞育苗圃中进行，根据上述室内离体试验结果较好的生防菌株发酵液稀释液浓度进行田间试验。选择20cm左右的健康枝条，枝条上有枸杞青果约20粒，用无菌针刺伤果面，先喷施生防菌株F3A发酵液10mL，24h后喷施浓度为1×107个/mL的枸杞炭疽病菌孢子悬浮液10mL，套上保鲜袋保湿24h，并设置450g/L咪鲜胺1000倍和清水对照2个处理，每个处理随机选取5个枝条，分别于喷施后第3天和第7天调查发病情况，并计算防治效果，方法同上。喷药3d后，生防菌株F3A发酵液对枸杞炭疽病的防治效果为78.26％，喷药7d后，生防菌株F3A发酵液对枸杞炭疽病的防治效果为63.19％(图6、表7)。
表7菌株F3A发酵液对枸杞炭疽病的田间防治效果
Figure BDA0002860332280000082
表中数据为平均数±标准差。同列不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，其他的任何未背离本发明的改变、修饰、替代、组合、简化，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）F3A，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号CGMCC21518。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）F3A具有产蛋白酶、产葡聚糖酶、溶磷、合成吲哚乙酸的功能。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）F3A在防治枸杞炭疽病菌引起的枸杞炭疽病病害中的应用。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）F3A发酵液防治枸杞炭疽病，在发病初期，间隔7-10天喷雾。
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