CN106332905A - 一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂及其制备方法。该复合微生物制剂的原料由达勒姆链霉菌发酵液，鲁萨链霉菌发酵液，泥地芽孢杆菌发酵液，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液，侵占木霉发酵液组成；本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，以及通过次级代谢产物诱导木薯产生抗病性，能产生多种抗菌素如达勒霉素，一种抗真菌的五烯抗菌素和产生四烯抗真菌的抗菌素，鲁萨霉素来抑制木薯褐斑病病原菌，增强其防病效果；本发明微生物制剂对人、畜安全，属于环境友好型，利用本发明的制剂防治木薯褐斑病不易产生抗药性，本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

Description

一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂及其制备方法。

背景技术

褐斑病是木薯生产中的一种世界性病害，广泛发生于亚洲、非洲和美洲的木薯产区，严重影响木薯的产量和品质。

引起木薯褐斑病的病原菌是木薯尾孢菌，属半知菌亚门，丝抱纲，丝抱目，暗色菌科，尾孢属。该菌寄生于叶片的胞间道中，形成的子座有2-6层细胞深，直径20-45μm，分生孢子梗成簇长于子座上。分生孢子梗淡褐色(大多数接近淡黑色)，颜色和宽度都一致，无分枝，中间有0-2个膝状，末端圆形有一小至中等的孢子痕，直或稍弯，分生孢子，单个长于分生孢子梗顶端，圆柱形，一直或稍弯，两头有点圆，通常2-8个隔，淡橄榄色，大小4-7 ×30-85μ m。子囊壳黑色，直径100 μm偶尔发现在叶片病斑上的坏死组织中，木薯褐斑病主要为害成长叶片，发病初期为退的圆形斑痕，以后病斑扩大变成灰褐色，病斑边缘及中央色泽较深并有同心轮纹。潮湿时，病斑中央长出霉状物，此即病原菌的孢子梗和孢子。成熟的病斑直径一般为3-12m m，有时病斑扩展，汇合成不规则大斑块。后期病斑中央破裂、穿孔。

随着木薯褐斑病的危害日益严重，人们越来越重视对它的研究。传统的化学药剂防治，化学防治虽有见效快、效率高等优点，但不仅危害环境和人类的身心健康，还造成病原菌抗性的增强，病原物生理小种的变化。利用抗病虫育种，用作物自身的抗性来控制病虫害，也是一个重点研究方向，但是其选育周期长，效率低，无法适应病害变化快的发展；其次是生物防治，由于生物防治药效高、持效期长、不易产生抗药性、环境友好等优点日益受到人们的青睐。但针对于木薯褐斑病的生物制剂还未有相关的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂。该复合微生物制剂的原料配比为：达勒姆链霉菌发酵液10-30份，鲁萨链霉菌发酵液20-40份，泥地芽孢杆菌发酵液10-30份，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液10-30份，侵占木霉发酵液10-30份。在所述微生物制剂中的达勒姆链霉菌，鲁萨链霉菌，泥地芽孢杆菌，巴塞罗那类芽孢杆菌，侵占木霉等5种菌是发明人经过十多年从450多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能产生多种抗菌素如达勒霉素，一种抗真菌的五烯抗菌素和产生四烯抗真菌的抗菌素，鲁萨霉素，能对木薯褐斑病病原菌--木薯尾孢菌产生超强抑制效果，从而达到防治木薯褐斑病的作用；另一方面，本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，以及通过次级代谢产物诱导木薯产生抗病性，增强其防病效果；再次，本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，具有固氮，解磷，解钾，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果。

本发明的第二目的在于提供一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂的制备方法，该方法步骤简单，确保微生物制剂的药肥效果突出。

为了达到上述目的，该防治木薯褐斑病的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：达勒姆链霉菌发酵液的制备

取出达勒姆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为达勒姆链霉菌种子液；

发酵：将上述制备的达勒姆链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的达勒姆链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养40-48小时，待菌体含量达到40g/L，即可停罐，即得到达勒姆链霉菌发酵液；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；

其中，所述的达勒姆链霉菌发酵培养基：芝麻粕粉2%，木薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜2%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤二：鲁萨链霉菌发酵液的制备

取出鲁萨链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为鲁萨链霉菌种子液；

发酵：将上述制备的鲁萨链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的鲁萨链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，开搅拌200r/min，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到鲁萨链霉菌发酵液；

其中，所述的高氏一号固体培养基与步骤一中的高氏一号固体培养基相同；

其中，所述的鲁萨链霉菌发酵培养基：菜粕粉2%，棉粕粉2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤三，泥地芽孢杆菌发酵液的制备

取出泥地芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L泥地芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min ，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可作为泥地芽孢杆菌发酵液；

其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 , NaCl10.0 g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述泥地芽孢杆菌发酵培养基：大豆糖蜜20g/L，玉米淀粉20 g/L， 豆粕粉40 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤四，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液的制备

取出巴塞罗那类芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L巴塞罗那类芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min ，24小时后通气量为300L/min ，30℃培养32-48小时，待总芽孢含量不低于30亿cfu/ml，即可作为巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

其中，所述巴塞罗那类芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10 g/L， 菜粕粉40g/L，鱼粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6 g/L，碳酸钙10 g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤五，侵占木霉发酵液的制备

取出侵占木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为侵占木霉种子液；

发酵：将上述制备的侵占木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L侵占木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即可作为侵占木霉发酵液；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的侵占木霉发酵培养基：豆粕粉2%，棉粕粉2%，木薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤六，混合发酵液

将前五个步骤制备的菌液按达勒姆链霉菌发酵液10-30份，鲁萨链霉菌发酵液20-40份，泥地芽孢杆菌发酵液10-30份，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液10-30份，侵占木霉发酵液10-30份，混匀，即得到防治木薯褐斑病的复合微生物制剂。

其中，该微生物制剂在防治木薯褐斑病的方法为叶面喷施每次1-5L复合微生物制剂/亩，连续使用2-3次，叶面喷施的稀释的倍数为100-200倍。

本发明具有的优点和有益效果：、本发明中包含的达勒姆链霉菌，鲁萨链霉菌，泥地芽孢杆菌，巴塞罗那类芽孢杆菌，侵占木霉等5种菌是从450多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能在植株的根，茎，叶以及土壤中能够生长繁殖，能产生多种抗菌素如达勒霉素，一种抗真菌的五烯抗菌素和产生四烯抗真菌的抗菌素，鲁萨霉素；它们对木薯褐斑病病原菌--木薯尾孢菌产生超强抑制效果，从而达到超强防治木薯褐斑病的效果，其对木薯褐斑病的药效高，平均防效可达到82.61%，且针对性强；、本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过次级代谢产物诱导木薯产生抗病性，增强其防病效果；、本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，具有解磷、解钾，固氮的菌效，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果；(4)、 本发明复合微生物制剂对人、畜安全，属于环境友好型，利用本发明方法防治木薯褐斑病不易产生抗药性，本发明制备方法稳定、菌种多，相对于单一拮抗菌，产生的拮抗物质广泛，效果显著，成本低、使用简单。

具体实施方式

实施例1

一种防治木薯褐斑病的微生物制剂，该微生物制剂的原料配比为：达勒姆链霉菌发酵液20份，鲁萨链霉菌发酵液30份，泥地芽孢杆菌发酵液20份，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液20份，侵占木霉发酵液20份。

该防治木薯褐斑病的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：达勒姆链霉菌发酵液的制备

取出达勒姆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为达勒姆链霉菌种子液；

发酵：将上述制备的达勒姆链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的达勒姆链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养42小时，检测菌体含量为44g/L，停罐，即得到达勒姆链霉菌发酵液；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的达勒姆链霉菌发酵培养基：芝麻粕粉2%，木薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜2%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤二：鲁萨链霉菌发酵液的制备

取出鲁萨链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为鲁萨链霉菌种子液；

发酵：将上述制备的鲁萨链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的鲁萨链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，开搅拌200r/min，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养44小时，检测菌体含量为83g/L，停罐，即得到鲁萨链霉菌发酵液；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的鲁萨链霉菌发酵培养基：菜粕粉2%，棉粕粉2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤三，泥地芽孢杆菌发酵液的制备

取出泥地芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L泥地芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min ，30℃培养30小时，检测总芽孢含量为65亿cfu/ml，即作为泥地芽孢杆菌发酵液；

其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 , NaCl10.0 g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述泥地芽孢杆菌发酵培养基：大豆糖蜜20g/L，玉米淀粉20 g/L， 豆粕粉40 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤四，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液的制备

取出巴塞罗那类芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L巴塞罗那类芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min ，24小时后通气量为300L/min ，30℃培养36小时，检测总芽孢含量为38亿cfu/ml，即可作为巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

其中，所述巴塞罗那类芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10 g/L， 菜粕粉40g/L，鱼粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6 g/L，碳酸钙10 g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤五，侵占木霉发酵液的制备

取出侵占木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为侵占木霉种子液；

发酵：将上述制备的侵占木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L侵占木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养36小时，检测菌体含量为86g/L，即可停罐，即可作为侵占木霉发酵液；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的侵占木霉发酵培养基：豆粕粉2%，棉粕粉2%，木薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤六，混合发酵液

将前五个步骤制备的菌液按达勒姆链霉菌发酵液20份，鲁萨链霉菌发酵液30份，泥地芽孢杆菌发酵液20份，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液20份，侵占木霉发酵液20份，混匀，即得到防治木薯褐斑病的复合微生物制剂。

实施例2 复合微生物制剂在木薯大田中的应用效果

1、试验选择在木薯高产区中进行；

2、试验地址选择在广西自治区南宁市武鸣县；在同一块有明显的木薯褐斑病的土地，

3、药剂用法与用量：

试验组：出现褐斑病后，叶面喷施每次2L该复合微生物制剂/亩，其稀释的倍数为100-200倍，连续使用2次，每15天使用一次；

化学药剂组：出现褐斑病后，以多菌灵为对照药剂进行喷施，每组使用面积为2亩；

清水对照组：以清水喷施；

喷施器械选用农民通用手动背负式喷雾器，其它管理措施相同；

4、试验结果：从表1可以看出，本发明的复合微生物制剂相对于化学药剂与清水对照组在大田试验中具有明显的优势，使用本发明的复合微生物制剂的平均亩产可以达到2132kg/亩，褐斑病指只有5.12，而使用清水对照组的产量只有1681kg，褐斑病指高达29.45；而使用化学药剂的产量也只有1804kg，褐斑病指高达16.21，本发明的复合微生物制剂相对于清水对照组能够在大田上增产26.95%，相对清水对照组对褐斑病的防效高达82.61%，具有显著的效果。

表1复合微生物制剂在木薯大田中的应用效果

	平均亩产（kg）	增产率(%)	褐斑病病指	相对防效（%）
					试验组	2132	26.95	5.12	82.61
化学药剂组	1804	7.32	16.21	44.96
					清水对照组	1681		29.45

Claims (4)

1.一种防治木薯褐斑病的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂的原料配比为：达勒姆链霉菌发酵液10-30份，鲁萨链霉菌发酵液20-40份，泥地芽孢杆菌发酵液10-30份，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液10-30份，侵占木霉发酵液10-30份。

2.根据权利要求1所述的一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：

步骤一：达勒姆链霉菌发酵液的制备

取出达勒姆链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为达勒姆链霉菌种子液；

发酵：将上述制备的达勒姆链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的达勒姆链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养40-48小时，待菌体含量达到40g/L，即可停罐，即得到达勒姆链霉菌发酵液；

其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；

其中，所述的达勒姆链霉菌发酵培养基：芝麻粕粉2%，木薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜2%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤二：鲁萨链霉菌发酵液的制备

取出鲁萨链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为鲁萨链霉菌种子液；

发酵：将上述制备的鲁萨链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的鲁萨链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，开搅拌200r/min，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到鲁萨链霉菌发酵液；

其中，所述的高氏一号固体培养基与步骤一的高氏一号固体培养基相同；

其中，所述的鲁萨链霉菌发酵培养基：菜粕粉2%，棉粕粉2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤三，泥地芽孢杆菌发酵液的制备

取出泥地芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L泥地芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min ，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可作为泥地芽孢杆菌发酵液；

其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 , NaCl10.0 g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述泥地芽孢杆菌发酵培养基：大豆糖蜜20g/L，玉米淀粉20 g/L， 豆粕粉40 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L， pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤四，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液的制备

取出巴塞罗那类芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L巴塞罗那类芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min ，24小时后通气量为300L/min ，30℃培养32-48小时，待总芽孢含量不低于30亿cfu/ml，即可作为巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

其中，所述巴塞罗那类芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10 g/L， 菜粕粉40g/L，鱼粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6 g/L，碳酸钙10 g/L，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤五，侵占木霉发酵液的制备

取出侵占木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为侵占木霉种子液；

发酵：将上述制备的侵占木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L侵占木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即可作为侵占木霉发酵液；

其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；

其中，所述的侵占木霉发酵培养基：豆粕粉2%，棉粕粉2%，木薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤六，混合发酵液

将前五个步骤制备的菌液按达勒姆链霉菌发酵液10-30份，鲁萨链霉菌发酵液20-40份，泥地芽孢杆菌发酵液10-30份，巴塞罗那类芽孢杆菌发酵液10-30份，侵占木霉发酵液10-30份，混匀，即得到防治木薯褐斑病的复合微生物制剂。

3.根据权利要求1所述的一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂在防治木薯褐斑病的方法为叶面喷施每次1-5L复合微生物制剂/亩，连续使用2-3次。

4.根据权利要求3所述的一种防治木薯褐斑病的复合微生物制剂的使用方法，其特征在于，叶面喷施的稀释的倍数为100-200倍。