CN110656068A - 一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：1)采用LB固体平板活化吡咯伯克霍尔德氏菌JK‑SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得菌悬液；2)配置供试培养基TMG，在TSB培养基中加入1％v/v甘油和25mM MgSO4，pH 5‑7；3)将菌悬液1％v/v接种至TMG液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4‑6天，形成生物膜。本发明配置了一种可诱导JK‑SH007形成生物膜的培养基TMG，JK‑SH007经过该培养基培养后，可形成肉眼可见的生物膜，使得其在营养匮乏的环境下更好的存活。

Description

一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法。
背景技术
吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007是杨树的一株高效革兰氏阴性生防菌，隶属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia complex，Bcc)基因型Ⅸ。通过采用BCESM和cblA毒力基因的特异性PCR，洋葱(Allium cepa)、烟草(Nicotiana sp.)及苜蓿(Medicago sp.)模型等Bcc常用安全性检测技术对其毒性进行了初步检测，表明Burkholderia pyrrocinia JK-SH007是一株有潜力的安全生防菌株，前期的研究结果表明该菌对杨树溃疡病的三种病原菌：拟茎点霉(Phomopsis macrospora)、金黄克囊孢(Cytospora chrysosperm)、七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)具有强拮抗作用，也可以通过分泌一些生长激素如IAA，嗜铁素以及解磷等来促进植物生长(Ren et al.,2010；任嘉红等,2010；Yang et al.,2017)，所以，B.pyrrocinia JK-SH007被认为是一株有巨大潜力能应对杨树溃疡病的生防菌株。然而，在实际生产中，由于环境的复杂性和JK-SH007本身的生活史是浮游菌状态，它的生防效果将随时间增长显著大量的减少。
细菌生物膜(Bacterial biofilm，BF)是一个有组织且具有明显三维结构生命群体。细菌在该状态下的抗逆性远比浮游状态下的抗逆性强，且具有感知周围环境变化及快速摄取营养物质等优点，在自然界里寄主植物和细菌互作定殖过程中，细菌可以在其表面形成生物膜，这些生物膜被描述为微菌落、聚集体、细胞簇等，生物膜对有益生防菌在植物周围环境进行定殖具有明显的促进作用。
关于B.pyrrocinia JK-SH007形成生物膜形成的研究，有学者猜测B.pyrrociniaJK-SH007在自然条件下生长，控制生物膜形成的基因表达量遭到了抑制。目前，近几年关于B.pyrrocinia JK-SH007形成生物膜形成的研究较少。其中产生物膜难，培养基组成较复杂，耗时较长，很难同时保证JK-SH007有强大生命力和形成生物膜，若能解决该问题，这将为JK-SH007作为生防菌剂商业化进一步提供理论技术指导。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，培养基配置成分简单，形成生物膜容易，耗时较短，同时具有强大的生命力，抗逆性强，有助于提高生防效果。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：
1)采用LB固体平板活化吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得菌悬液；
2)配置供试培养基TMG，在TSB培养基中加入1％v/v甘油和25mM MgSO4，pH 5-7；
3)将菌悬液1％v/v接种至TMG液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4-6天，形成生物膜。
生物膜的形成量采用采用结晶紫染色法进行半定量测定，结晶紫溶液的质量体积浓度为0.5g/L，染色时间为30min；结晶紫脱色剂为甲醇。
生物膜的形成量OD570为1.21。
上述方法在促进吡咯伯克霍尔德氏菌生长中的应用。
一种促进吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的培养基，由TSB培养基中加入1％v/v碳源和25mM金属离子营养素，调整pH为5-7配置而成，TSB培养基每升含有15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、5g NaCl，余量为水，碳源为甘油，金属离子营养素为镁离子。
上述培养基在促进吡咯伯克霍尔德氏菌生长中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明以TSB培养基为基础，向其中添加两种营养添加剂：甘油、MgSO4，配置成一种可诱导吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007形成生物膜的培养基，JK-SH007经过该培养基培养后，可形成肉眼可见的生物膜。本发明提供的方法由传统培养即可实现在保证其生命力条件下形成生物膜，培养基成分简单，形成生物膜容易，耗时较短，同时具有强大的生命力，抗逆性强，为JK-SH007作为生防菌剂商业化进一步提供理论技术指导。
附图说明
图1是Burkholderia pyrrocinia JK-SH007在锥形瓶中静置4-6天后的表型图，左图为JK-SH007在TSB培养基中不形成生物膜的表型图；右图为JK-SH007在TMG培养基中形成乳白色生物膜的表型图；
图2是Burkholderia pyrrocinia JK-SH007细菌在供试培养基静置6天后的活菌数量图；左图为JK-SH007在TSB培养基静置6天后的活性菌数量图；右图为JK-SH007在TMG培养基下静置6天形成生物膜后的活性菌数量图；
图3是Burkholderia pyrrocinia JK-SH007在试管中被结晶紫固定在试管壁上的表型图，左图为LB培养基培养JK-SH007的试管；中间图为TSB培养基培养JK-SH007的试管；右图为TMG培养基培养JK-SH007的试管；
图4是Burkholderia pyrrocinia JK-SH007在供试培养基中，采用结晶紫染色法半定量测定生物膜量的柱状统计图；
图5是Burkholderia pyrrocinia JK-SH007在12孔细胞板中静置4-6天后的表型图，左图为JK-SH007在葡萄糖培养基中不形成生物膜的表型图；右图为JK-SH007在TMG培养基中形成乳白色生物膜的表型图；
图6是供试培养基中碳源、金属离子营养素的不同对Burkholderia pyrrociniaJK-SH007生物模量的影响图；
图7是Burkholderia pyrrocinia JK-SH007在12孔细胞板中静置4-6天后的表型图，左图为JK-SH007在铁离子培养基中不形成生物膜的表型图；右图为JK-SH007在TMG培养基中形成乳白色生物膜的表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：
1)将保存于-80℃冰箱内的JK-SH007甘油菌取出，用接种环蘸取少量甘油菌，移入固体平板LB中进行活化，置于28℃黑暗培养箱培养2天，产生单菌落，呈黄色，然后使用挑针挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得浑浊菌悬液；
2)配置LB培养基(10g/L tryptone胰蛋白胨，5g/L yeast extract酵母粉，10g/LNaCl)、TSB培养基(15g/L tryptone胰蛋白胨，5g/L soya peptone大豆蛋白胨，5g/LNaCl)、供试培养基TMG(TSB培养基+1％甘油+25mM MgSO4)；
其中TMG培养基的配置方法为：在500mL蒸馏水中加入15g tryptone、5g soyapeptone、5g NaCL，搅拌均匀后定容至1L，然后加入100uL甘油、6.16g MgSO4·7H2O，搅拌均匀，进行121℃灭菌30分钟，制成供试培养基，调节pH范围至5-7；
3)将菌悬液1％v/v接种进TMG液体培养基或TSB液体培养基，容器为玻璃试管和锥形瓶。180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4-6天，TSB培养基不形成生物膜；TMG液体培养基中JK-SH007形成肉眼可见的生物膜(图1)。
形成生物膜后，取培养基中部分菌悬液稀释后，进行LB固体平板涂布实验验证活菌数及总菌体个数，测定JK-SH007生物膜下的抗逆性。
活菌数及总菌体数的测定：将TMG培养基和TSB培养基中的菌悬液进行浓度梯度稀释，使用移液枪吸取100uL稀释菌悬液，使用涂布器均匀涂抹在LB固体平板培养基上，放入28℃细菌培养箱中培养48h，对单菌落进行计数，获得活菌数。测得生物膜组TMG的活菌数约4.1×1010CFU/mL，远高于浮游菌组TSB的活菌数9×105CFU/mL(图2)。这表明生物膜的形成极大的提高JK-SH007的生长活性。
在形成生物膜后，使用移液枪，吸取TMG培养基和TSB培养基中各1mL菌悬液，在紫外分光光度计下，选用TMG培养基和TSB培养基600nm处的吸光值为空白对照，测定菌悬液的OD600值，使用标准曲线公式(1)得出总菌体个数
总菌体个数＝1.6303x+0.0514 R2＝0.9948 (1)
其中：
X表示菌悬液的在紫外分光光度计600nm处的吸光值。
生物膜TMG的总菌体个数远高于浮游菌组TSB，其平均总菌体个数约为2.1417×1012CFU/mL。
使用结晶紫固定生物膜，进行定性检测生物膜和半定量测定生物膜量。
定性检测生物膜：JK-SH007在玻璃试管中形成生物膜后，快速去除试管中菌悬液，用蒸馏水冲洗2-3遍，待风干后，加入0.5％质量浓度体积的结晶紫溶液10mL，静置30分钟后用蒸馏水冲洗2-3次。待自然风干后，生物膜如图3所示。
结晶紫染色法：在上述的试管中加入乙醇10mL，充分溶解生物膜上的染料，稀释合适倍数，用酶标仪在570nm处检测OD值。当OD570＜0.1时，表示没有形成生物膜。结果测得TMG组的结晶紫半定量测定OD570约为1.21，表示形成致密生物膜；LB组的结晶紫半定量测定OD570约为0.0522，表明不形成生物膜；TSB组的结晶紫半定量测定OD570约为0.0524，表示不形成生物膜(图4)。
实施例2
一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：
1)采用LB培养基在固体平板上活化JK-SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得菌悬液；
2)配置TSB培养基(15g/L tryptone，5g/L soya peptone，5g/L NaCl)、供试培养基TMG(TSB培养基+1％甘油+25mM MgSO4)。葡萄糖培养基(TSB培养基+1％葡萄糖+25mMMgSO4)。
3)将菌悬液1％v/v接种进TMG液体培养基和葡萄糖培养基，每孔3mL添加量至12孔细胞培养板中，180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4-6天。结果：葡萄糖培养基中不形成生物膜；TMG液体培养基中JK-SH007形成肉眼可见的生物膜(图5)。
使用结晶紫固定生物膜，进行半定量测定生物膜量。
结晶紫染色法：待生物膜成熟稳定后，吸取出培养液，使用无菌水清洗2-3次残留在生物膜上的浮游菌，待自然风干后加入3mL体积的0.5％结晶紫溶液使其充分浸没生物膜，染色30min后移除染液，继续使用无菌水清洗2-3次，留下被染色黏在细胞培养板的生物膜，倒置，自然风干，加入乙醇3mL，充分溶解生物膜上的染料，稀释合适倍数，用酶标仪在570nm处检测OD值。当OD570＜0.1时，表示没有形成生物膜。结果测得TMG组的结晶紫半定量测定OD570约为1.21，表示形成致密是生物膜；葡萄糖培养基的结晶紫半定量测定OD570约为0.0523，表明不形成生物膜(图6)这说明，碳源物质中，甘油是一种有利于JK-SH007生物膜的形成的营养添加素。
实施例3
一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：
1)采用LB培养基在固体平板上活化JK-SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min,28℃纯培养24h，获得菌悬液；
2)配置TSB培养基(15g/L tryptone，5g/L soya peptone，5g/L NaCl)、供试培养基TMG(TSB培养基+1％甘油+25mM MgSO4)。铁离子培养基(TSB培养基+1％甘油+25mMFeCl3·6H2O)。
3)将菌悬液1％v/v接种进TMG液体培养基和铁离子培养基，每孔3mL添加量至12孔细胞培养板中，180r/min,28℃纯培养24h取出后静置4-6天。得到静置菌悬液，结果：铁离子培养基不形成生物膜；TMG液体培养基中JK-SH007形成肉眼可见的生物膜(图7)。
使用结晶紫固定生物膜，进行半定量测定生物膜量。
结晶紫染色法：待生物膜成熟稳定后，吸取出培养液，使用无菌水清洗2-3次残留在生物膜上的浮游菌，待自然风干后加入3mL体积的0.5％结晶紫溶液使其充分浸没生物膜，染色30min后移除染液，继续使用无菌水清洗2-3次，留下被染色黏在细胞培养板的生物膜，倒置，自然风干，加入乙醇3mL，充分溶解生物膜上的染料，稀释合适倍数，用酶标仪在570nm处检测OD值。当OD570＜0.1时，表示没有形成生物膜。结果测得TMG组的结晶紫半定量测定OD570约为1.21，表示形成致密是生物膜；铁离子培养基的结晶紫半定量测定OD570约为0.05225。表明不形成生物膜(图6)这说明，金属离子中，Mg2+有利于JK-SH007生物膜的形成。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用LB固体平板活化吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得菌悬液；
2)配置供试培养基TMG，在TSB培养基中加入1％v/v甘油和25mM MgSO4，pH 5-7；
3)将菌悬液1％v/v接种至TMG液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4-6天，形成生物膜。
2.根据权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，其特征在于，所述生物膜的形成量采用结晶紫染色法进行半定量测定；所述结晶紫溶液的质量体积浓度为0.5g/L，染色时间为30min；所述结晶紫脱色剂为甲醇。
3.根据权利要求2所述的吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，其特征在于，所述生物膜的形成量OD570为1.21。
4.权利要求1所述的方法在促进吡咯伯克霍尔德氏菌生长中的应用。
5.一种促进吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的培养基，其特征在于，所述培养基由TSB培养基中加入1％v/v碳源和25mM金属离子营养素，调整pH为5-7配置而成，所述TSB培养基每升含有15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、5g NaCl，余量为水，所述碳源为甘油，所述金属离子营养素为镁离子。
6.权利要求5所述的培养基在促进吡咯伯克霍尔德氏菌生长中的应用。
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