CN102499244A

CN102499244A - 一种赤霉素混合物及其生产方法

Info

Publication number: CN102499244A
Application number: CN2011103110495A
Authority: CN
Inventors: 攸德伟; 周金龙; 周圣骄; 张文宣; 刘燕; 游玲玉; 毛玉华; 谷田; 刘斌
Original assignee: JIANGXI XINRUIFENG BIOCHEMICAL CO Ltd
Current assignee: Jiangxi New Reyphon Biochemical Co ltd
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: CN102499244B

Abstract

一种赤霉素混合物及其生产方法，涉及赤霉素以及通过发酵培养而生产赤霉素GA₄₊₇的方法。混合物中包含至少50%的GA₄₊₇；GA₄/GA₇约为2∶1；混合物的效价至少为900mg/L。生产方法包含以下步骤：制备好变异菌株GibberellafujikuroiNRF-0802种子，然后接种到高碳源和相对低氮源的灭菌后的复合发酵培养基中；培养上述培养基4-15天后将菌丝体同发酵液分离；从发酵液中提取GA混合物后得到至少含有50%GA₄₊₇的赤霉素混合物。本发明的有益效果是：本发明产生很少的GA₃,得到的赤霉素混合物中含有高单位的GA₄/GA₇，发酵生产出的GA₄₊₇效价高于900mg/L，发酵总效价可以达到1100mg/L。

Description

一种赤霉素混合物及其生产方法

技术领域

本发明涉及赤霉素（Gibberella fujikuroi）以及通过发酵培养而生产赤霉素GA₄₊₇的方法，具体涉及一种赤霉素混合物，以及以新的变异菌株为对象发酵培养生产赤霉素GA₄₊₇的方法。

背景技术

赤霉素是指种类众多的一族密切相关的四环三萜系化合物，是一族很重要的具有生物活性的内源植物生长调节剂。不同的赤霉素可促进植物不同部位的生长，GA₃主要是促进植物干和叶子生长，而GA₄和GA₇则主要是促进开花和拉伸果实，GA₄₊₇最重要的应用是可以减轻某些苹果锈病的严重程度和发生率，但如果制剂中含有GA₃的话，GA₃可以导致果树花蕾形成减少。在现有的合成赤霉素的技术中，GA₃是主要的赤霉素组分，而GA₄和GA₇的含量则较低，因此，人们希望能有一种GA₄₊₇为主要赤霉素组分的赤霉素生产方法。

发明内容

本发明的目的是针对上面所述缺陷，提供一种赤霉素混合物中主要成分是GA₄和GA₇的赤霉素混合物。

本发明的另一目的是提供一种赤霉素混合物的生产方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种赤霉素混合物，其特征在于：混合物中包含至少50%的GA₄₊₇；GA₄/GA₇约为2∶1；混合物的效价至少为900mg/L。

一种赤霉素混合物，其特征是，混合物中优选包含70-90%的GA₄₊₇；GA₄/GA₇优选为5-6∶1；混合物的效价优选为1100mg/L以上。

一种赤霉素混合物的生产方法，其特征是包含以下步骤：制备好变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802（“变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802”已于2011年8月4日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称“CGMCC”进行生物保藏；保藏编号为：CGMCC No.5112；分类命名：藤仓赤霉菌；拉丁文学名：Gibberella fujikuroi）种子，然后接种到高碳源和相对低氮源的灭菌后的复合发酵培养基中；培养上述培养基4-15天后将菌丝体同发酵液分离；从发酵液中提取GA混合物后得到至少含有50%GA₄₊₇的赤霉素混合物。

上述含有50%GA₄₊₇的赤霉素混合物经过将GA₃从GA₄/GA₇混合物中分离出来后可得到含有70-90%GA₄₊₇的赤霉素混合物。

所述变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802生长在土豆葡萄糖琼脂（Potato-Dextrose Agar）上的气生菌丝形成高0.2-0.7厘米、直径0.3-0.9厘米，白色或淡红色的菌落，还可能产生桔色/浅红色/浅黄色的色素。

所述变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802的发酵温度为20-40℃，优选温度为25-34℃，最优温度为28-32℃；发酵时pH值为3.0-7.0，优选pH值为5.0-7.0，最优pH值为5.5-7.0；发酵时间为4-15天。

变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802发酵可以在一系列的液体和固体培养基上进行，适合次级代谢产物如抗生素发酵的培养基对该菌株也适合。总体而言，这些培养基含有各种不同的可以被真菌利用的碳源、氮源以及各种浓度的无机盐，还可能含有各种对发酵产物产生至关重要的微量元素等。

合适的碳源包括各种糖，如葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖以及糊精、玉米粉、燕麦粉、淀粉、植物油、糖蜜、脱脂乳等都是培养基中可吸收碳的来源。培养基中确切地碳源的量部分取决于培养基中的其他成分，但浓度一般为培养基总重量的5-20%（w/w）。这些碳源可以单独使用或者作为复合碳源用在培养基中。

合适的氮源有硫酸铵、氯化铵、赖氨酸、酒石酸铵、酵母水解物、酵母自水解物、酵母提取物、酵母细胞、酪蛋白水解物、玉米浆、燕麦粉、黄豆粉、花生粉以及棉籽饼粉等，这些氮源可以单独使用或作为复合氮源使用，浓度为培养基总重量的1-5%（w/w）。

无机盐和微量元素包括可以提供钠、钾、钙、镁、氨、锌、锰、钴、磷、硫、氯、碳以及硼酸盐等，还包括钼和铜等。

随着发酵过程的进行，可以每天进行一次GA₃、GA₄和GA₇的效价检测以判断发酵的正常与否。常用的HPLC分析方法如下说明。

树脂柱：Kromasil C18（0.46×10cm，5微米颗粒，Hichrom KR100-5C18-100A）或其他合适的树脂柱。

溶剂：甲醇：1%乙酸；30/70（v/v），2分钟，线性梯度到70/30（v/v）超过10分钟，保持在70/30（v/v）5分钟。

流速：1ml/min。

检测器：Sedex 55 ELS 检测器。

保留时间：GA₃ 6.0分钟，GA₇ 13.4分钟，GA₄ 13.9分钟。

建立量化发酵样品中的GA₃，GA₄，GA₇需要的校准曲线，标准品来自Sigma化学公司。

提取赤霉素混合物的方法包括以下两种。

第一种方法的步骤是：a）板框分离发酵液和菌丝体；和/或；b）超滤膜法分离发酵液和发酵液中的大分子物质；c）纳滤膜或反渗透膜浓缩发酵液；d）活性炭吸附色素等大分子物质；e）乙酸乙酯/丁酸乙酯/丁酮/甲基异丁基酮/丁醇/戊醇/二乙醚萃取赤霉素。提取过程中需要调节合适pH来实现赤霉素盐和分子两种状态。

第二种方法是离子交换树脂法。首先，通过添加碱性金属氢氧化物如Ba(OH)₂等沉淀并过滤除去有机酸、蛋白和色素等不纯物质；其次，含有赤霉素的过滤液分别流过一种弱阳离子（Amberline IEC 50, H-form）和弱阴离子交换树脂（Ambolite IR 4B, acetate or formate form）；然后，赤霉素被氨水或铵盐碱性缓冲液洗脱。该赤霉素产品还可以通过乙酸乙酯萃取和结晶达到再纯化。

将GA₃从GA₄/GA₇混合物中分离出来的方法包括以下三种。第一种的过程如下：首先将过滤液用乙酸乙酯在pH4.0-8.5萃取，GA₄/GA₇富集在有机溶剂中，而GA₃则主要留在了水相中。第二种方法是在有机溶剂萃取后，加入N-甲基-苄胺以生成GA₄/GA₇的胺盐，可以将该胺盐选择性的沉淀并过滤而将GA₃留在溶液中。第三种方法是将上述胺盐同有机酸反应并过滤。

本发明的有益效果是：本发明通过使用变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802发酵生产赤霉素混合物，该菌株产生很少的GA₃,得到的赤霉素混合物中含有高单位的GA₄/GA₇，发酵生产出的GA₄₊₇效价高于900mg/L，发酵总效价可以达到1100mg/L。

变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802的生物材料保存存活性报告书。

保藏日期：2011年8月4日。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC。

保藏编号：CGMCC No.5112。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步描述。

实施例1：摇瓶发酵。

A.种子制备。

种子培养基：葡萄糖10g/L；可溶淀粉10g/L；黄豆粉10g/L；花生粉5g/L；(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L；KH₂PO₄ 1.2g/L；MgSO₄ 0.8g/L。

种子培养基成分浓度按照上述以去离子水配制，每个250ml摇瓶放入50ml培养基，使用多层纱布绑缚瓶口，在121℃消毒20分钟。摇瓶放置在偏心矩为2英寸、rpm220的摇床上，摇床间温度28℃、相对湿度85%，培养48小时。

B.发酵。

发酵培养基：可溶淀粉65g/L；葡萄糖10g/L；黄豆粉10g/L；花生粉5g/L；KH₂PO₄ 1.2g/L；MgSO₄ 0.8g/L；ZnCl₂ 0.01g/L；CaCO₃ 3.0g/L。在加入CaCO₃前调节pH到6.0。

发酵培养条件同A部分。发酵结束后用离心机分离菌丝体和发酵液，GA₃、GA₄和GA₇的分析方法见“发明内容”中的HPLC检测。效价检测结果如下。

发酵时间（天）	GA₃（mg/L）	GA₄（mg/L）	GA₇（mg/L）
				4	140	280	160
5	140	320	195
				6	150	390	240
7	150	520	285
				8	160	610	315

实施例2：100L自动发酵罐发酵。

A.种子制备：同实施例1。

B.发酵。

按照实施例1中的发酵培养基浓度配好60升培养基，转移入100L全自动发酵罐（上海国强），加入约50ml消泡剂，121℃消毒30分钟，冷却到室温后将制备好的约7升种子接种到培养基中。控制发酵温度32℃，初始通气量0.7VVM，初始搅拌速度200rpm。在发酵过程中通过控制通气量和搅拌速度保持溶解氧30%以上。每天取样检测糖、氮及GA₃、GA₄和GA₇（从第三天开始）。效价检测结果如下。

发酵时间（天）	GA₃（mg/L）	GA₄（mg/L）	GA₇（mg/L）
				3	90	350	75
4	130	460	85
				5	150	580	105
6	170	710	120
				7	150	820	150

实施例3：生产罐发酵。

A.种子制备：培养基配方同实施例1，种子罐体积为5吨，接种后料液体积为2.7吨。

B.发酵：按照实施例1中的发酵培养基浓度配好16吨培养基，转移入20吨（实际体积约22吨）发酵罐中，加入约4.3公斤消泡剂，121℃消毒约35分钟，冷却到室温后将培养好的约2.5吨种子接种到培养基中。控制发酵温度28℃，初始通气量0.7VVM，初始搅拌速度200rpm。在发酵过程中通过控制通气量和搅拌速度保持溶解氧30%以上。每天取样检测糖、氮及GA₃、GA₄和GA₇（从第三天开始）。效价检测结果如下。

发酵时间（天）	GA₃（mg/L）	GA₄（mg/L）	GA₇（mg/L）
				3	120	250	150
4	140	300	200
				5	150	380	240
6	170	505	280
				7	150	590	325

Claims

1.一种赤霉素混合物，其特征在于：混合物中包含至少50%的GA₄₊₇；GA₄/GA₇约为2∶1；混合物的效价至少为900mg/L。

2. 根据权利要求1所述的一种赤霉素混合物，其特征在于：混合物中包含70-90%的GA₄₊₇；GA₄/GA₇为5-6∶1；混合物的效价为1100mg/L以上。

3. 权利要求1所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征是包含以下步骤：制备好变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802种子，然后接种到高碳源和相对低氮源的灭菌后的复合发酵培养基中；培养上述培养基4-15天后将菌丝体同发酵液分离；从发酵液中提取GA混合物后得到至少含有50%GA₄₊₇的赤霉素混合物。

4. 根据权利要求3所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述含有50%GA₄₊₇的赤霉素混合物经过将GA₃从GA₄/GA₇混合物中分离出来后可得到含有70-90%GA₄₊₇的赤霉素混合物。

5.根据权利要求3所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802生长在土豆葡萄糖琼脂上的气生菌丝形成高0.2-0.7厘米、直径0.3-0.9厘米，白色或淡红色的菌落。

6.根据权利要求3所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802的发酵温度为20-40℃，优选温度为25-34℃，最优温度为28-32℃；发酵时pH值为3.0-7.0，优选pH值为5.0-7.0，最优pH值为5.5-7.0；发酵时间为4-15天。

7.根据权利要求3所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述变异菌株Gibberella fujikuroi NRF-0802发酵可以在液体或固体培养基上进行；所述碳源包括有葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖以及糊精、玉米粉、燕麦粉、淀粉、植物油、糖蜜、脱脂乳；培养基中碳源的量为培养基总重量的5-20%（w/w）；所述氮源包括有硫酸铵、氯化铵、赖氨酸、酒石酸铵、酵母水解物、酵母自水解物、酵母提取物、酵母细胞、酪蛋白水解物、玉米浆、燕麦粉、黄豆粉、花生粉以及棉籽饼粉，氮源浓度为培养基总重量的1-5%（w/w）；所述无机盐和微量元素包括可以提供钠、钾、钙、镁、氨、锌、锰、钴、磷、硫、氯、碳以及硼酸盐、钼和铜。

8.根据权利要求3所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述提取赤霉素混合物的方法的步骤是：a）板框分离发酵液和菌丝体；和/或；b）超滤膜法分离发酵液和发酵液中的大分子物质；c）纳滤膜或反渗透膜浓缩发酵液；d）活性炭吸附色素等大分子物质；e）乙酸乙酯/丁酸乙酯/丁酮/甲基异丁基酮/丁醇/戊醇/二乙醚萃取赤霉素。

9.根据权利要求3或8所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述提取赤霉素混合物的方法是离子交换树脂法，首先，通过添加碱性金属氢氧化物如Ba(OH)₂等沉淀并过滤除去有机酸、蛋白和色素等不纯物质；其次，含有赤霉素的过滤液分别流过一种弱阳离子和弱阴离子交换树脂；然后，赤霉素被氨水或铵盐碱性缓冲液洗脱。

10.根据权利要求4所述的一种赤霉素混合物的生产方法，其特征在于：所述将GA₃从GA₄/GA₇混合物中分离出来的方法包括以下三种：第一种的过程如下：首先将过滤液用乙酸乙酯在pH4.0-8.5萃取，GA₄/GA₇富集在有机溶剂中，而GA₃则主要留在了水相中；第二种方法是在有机溶剂萃取后，加入N-甲基-苄胺以生成GA₄/GA₇的胺盐，可以将该胺盐选择性的沉淀并过滤而将GA₃留在溶液中；第三种方法是将上述胺盐同有机酸反应并过滤。