CN104513845A - 一种四环素发酵补料培养基及补料方法 - Google Patents

一种四环素发酵补料培养基及补料方法 Download PDF

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本发明涉及一种四环素发酵补料培养基及补料方法，本发明根据菌体不同生长代谢阶段对速效氮源和磷量需求的不同，通过改善菌体不同生长阶段补入糖水中速效氮源及磷的量，从而达到提高四环素发酵的发酵水平的目的。实验证明，发酵到60-100小时开始补入低磷的糖水，可有效控制初级代谢速度，减少溶氧需求，同时利于次级代谢产物的生成，四环素产量明显提高。本发明提高的方法简单易行，对类似方式控制的发酵均有借鉴意义。

Description

一种四环素发酵补料培养基及补料方法
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种四环素发酵补料培养基及补料方法。
背景技术
四环素是以金色链霉菌为发酵菌株，发酵生产出来的抗菌物质。四环素对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次氏体、滤过性病毒、螺旋体以及原虫类都有很好的抑制作用，是一种光谱抗生素。
现有技术中，以金色链霉菌做出发菌株发酵过程中，全程补入含大量碳氮源、磷元素的混合糖水，会存在中后期因磷量过高，初级代谢速度过快，次级代谢产物合成受阻的问题，同时因初级代谢快，菌丝量过大，造成溶氧的缺乏，造成发酵液发酸转红情况。
发明内容
本发明的目的在于客服上述现有技术的缺陷，提供一种可满足生长期菌体生长繁殖速效氮源及磷量的需求，同时平衡合成期初次级代谢关系，充分改善溶氧状况，提高发酵单位的四环素发酵补料培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述补料培养基的补料方法。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
一种四环素发酵补料培养基，其特征在于是由混合糖水A和混合糖水B组成，其中
所述混合糖水A的组成为：淀粉250-500g/l,玉米浆25-30g/l，溴化钠1.25-3.75g/l，轻质碳酸钙3.75g-12.5g/l，M-促进剂0.0125-0.025g/l，硫酸铵0g-2.5g/l，淀粉酶：0.25g/l；
所述混合糖水B的组成为：淀粉250-500g/l,玉米浆10-15g/l，溴化钠1.25-3.75g/l，碳酸钙3.75-12.5g/l，M-促进剂0.0125-0.025g/l，硫酸铵0-2.5g/l，淀粉酶：0.25g/l。
利用上述四环素发酵补料培养基的补料方法，其特征是：在以金色链霉菌为生产菌种发酵生产四环素的发酵过程中，
1)在发酵15-25hr，当总糖低于5.0％时补入混合糖水A；
2)在发酵60hr后，总糖低于5.0％时补入混合糖水B；
从开始补糖至发酵70小时控制总糖在4.8％-4.0％，70小时后控制总糖4.0％-2.0％至放罐。
在发酵过程的前20小时，发酵液pH控制在6.1-5.8，在发酵过程的20小时后，发酵液pH控制在5.8-5.6，过程中用氨水调节pH。
研究表明，四环素发酵过程中，前期要有较快的初级代谢速度以产生足够量的菌丝，中后期随着补料增加，体积增大，需氧量较大，同时进入产物合成期要控制初级代谢速度以利于次级代谢进行，所以控制好这两阶段磷量，就可以即改善溶氧状况，同时加速产物合成。
本发明正是在上述研究结果的基础上，根据菌体不同生长代谢阶段对速效氮源和磷量需求的不同，通过改善菌体不同生长阶段补入糖水中速效氮源及磷的量，从而达到提高四环素发酵的发酵水平的目的。实验证明，发酵到60-100小时开始补入低磷的糖水，可有效控制初级代谢速度，减少溶氧需求，同时利于次级代谢产物的生成，四环素产量明显提高。实验证明：四环素发酵到60小时后补入速效氮源中磷含量是60小时前补入糖水磷量1/2的糖水，发酵单位可以提高10％。本发明提高的方法简单易行，对类似方式控制的发酵均有借鉴意义。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明作进行一步说明，但所举实施例并不限制本发明的保护范围。
下述实施例中，固体培养基、种子培养基和发酵培养基按照现有技术以金色链霉菌为生产菌种发酵生产四环素的方法所选，可以选择如下：
固体培养基组成：麸皮2.5-4.0％，琼脂1.5-2.0％，磷酸氢二胺0.01-0.02％，磷酸氢二钾0.005-0.010％，硫酸镁0-0.01％。
种子培养基组成：淀粉15-30g/l，豆粉15-20g/l，玉米浆0.1-1.0g/l，硫酸铵1.5-6.0g/l，轻质碳酸钙1.0-2.5g/l，溴化钠1.0-2.0g/l。
发酵培养基组成：淀粉80-100g/l，豆粉30-50g/l，玉米浆20-40g/l，硫酸铵2.5-6.5g/l，轻质碳酸钙4-6g/l，溴化钠1.0-2.0g/l，磷酸二氢钾0.05-0.1g/l，淀粉酶0.2-0.4g/l。
实施例1
1、斜面孢子制备：将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35℃恒温培养4-5天，后接种于种子培养基中。
2、种子培养：将步骤1生长好的斜面孢子无菌方式接种于种子培养基中，接种量为500ml茄形瓶装量的15％，32℃恒温培养，通气比为0.6-0.8v/v/min,搅拌转速为400-600r/min,培养20-26小时。
3、发酵培养：将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为10-20％，控制培养温度0-40hr:33℃,41-80hr：32℃,80hr-放罐31℃,过程通气比：0.8-1.5v/min,保证过程溶氧不低于20％，培养6-8天。
4、糖水配制：
4.1混合糖水A组成：淀粉250g/l,玉米浆30g/l，溴化钠1.25g/l，碳酸钙3.75g/l，M-促进剂0.0125g/l，硫酸铵0g/l，淀粉酶0.25g/l。
4.2混合糖水B组成：淀粉250g/l,玉米浆15g/l，溴化钠1.25g/l，碳酸钙3.75g/l，M-促进剂0.0125g/l，硫酸铵0g/l，淀粉酶0.25g/l。
4.3以上物料分别以培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。
5、过程补糖水控制：
发酵液总糖低于5.0％，生长20小时左右时，补入混合糖水A；发酵液总糖低于5.0％，生长60小时后换补比以上糖水中速效磷减半的混合糖水B，控制至放罐；从开始补糖至70小时控制总糖在4.8％-4.0％，70小时后4.0％-2.0％至放罐。整个发酵过程中用氨水调节pH，在发酵前20小时，发酵液pH控制在6.1-5.8，2在发酵20小时后，发酵液pH控制在5.8-5.6，过程中用氨水调节pH。发酵过程中利用流加消沫剂或油方式进行消沫。
6、对照实例：
6.1以上1.2.3条相同。
6.2混合糖水采用组成为：淀粉250g/l,玉米浆30g/l，溴化钠1.25g/l，碳酸钙3.75g/l，M-促进剂0.0125g/l，硫酸铵0g/l，淀粉酶0.25g/l。按重量体积比配制成20L，后湿热蒸汽灭菌。
6.3发酵过程总糖低于5.0％开始补入，开始补糖至70小时总糖控制在4.8％-4.0％,70小时后在4.0％-2.0％,过程用氨水调节pH。
7、试验结果数据：
发酵周期 发酵单位
实验例 175 31562
对照例 175 27978
实验例2
1、斜面孢子制备：将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35℃恒温培养4-5天，接种于种子培养基中。
2、种子培养：将步骤1生长好的斜面孢子无菌方式接种于种子培养基中，接种量为500ml茄形瓶装量的15％，32℃恒温培养，通气比为0.6-0.8v/v/min,搅拌转速为400-600r/min,培养20-26小时。
3、发酵培养：将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为10-20％，控制培养温度0-40hr:32℃,41-80hr：31℃,80hr-放罐30℃,过程通气比：0.8-1.5v/min,保证过程溶氧不低于20％，培养6-8天。
4、糖水配制：
4.1混合糖水A组成：淀粉375g/l,玉米浆25g/l，溴化钠2.5g/l，碳酸钙7.5g/l，M-促进剂0.019g/l，硫酸铵1.25g/l，淀粉酶0.25g/l。
4.2混合糖水B组成：淀粉375g/l,玉米浆10g/l，溴化钠2.5g/l，碳酸钙7.5g/l，M-促进剂0.019g/l，硫酸铵1.25g/l，淀粉酶0.25g/l。
4.3以上物料分别以培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。
5、过程补糖水控制：
发酵液总糖低于5.0％，生长15小时时，补入混合糖水A；发酵液总糖低于5.0％，生长60小时后换补比以上糖水中速效磷减半的混合糖水B；开始补糖至70小时控制总糖在4.8％-4.0％，70小时后4.0％-2.0％至放罐。整个发酵过程中用氨水调节pH，在发酵前20小时，发酵液pH控制在6.1-5.8，2在发酵20小时后，发酵液pH控制在5.8-5.6，过程中用氨水调节pH。发酵过程中利用流加消沫剂或油方式进行消沫。
6、对照实例：
6.1以上1.2.3条相同。
6.2混合糖水采用组成为：淀粉375g/l,玉米浆30g/l，溴化钠2.5g/l，碳酸钙7.5g/l，M-促进剂0.019g/l，硫酸铵1.25g/l，淀粉酶0.25g/l。按重量体积比配制成20L，后湿热蒸汽灭菌。
6.3发酵过程总糖低于5.0％开始补入，开始补糖至70小时总糖控制在4.8％-4.0％,70小时后在4.0-2.0,过程用氨水调节pH。
7、试验结果数据：
发酵周期 发酵单位
实验例 180 33572
对照例 180 29880
实验例3
1、斜面孢子制备：将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35℃恒温培养4-5天，接种于种子培养基中。
2、种子培养：将步骤1生长好的斜面孢子无菌方式接种于种子培养基中，接种量为500ml茄形瓶装量的15％，32℃恒温培养，通气比为0.6-0.8v/v/min,搅拌转速为400-600r/min,培养20-26小时。
3、发酵培养：将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为10-20％，控制培养温度0-40hr:32℃,41-80hr：31℃,80hr-放罐30℃,过程通气比：0.8-1.5v/min,保证过程溶氧不低于20％，培养6-8天。
4、糖水配制：
4.1混合糖水1组成：淀粉500g/l,玉米浆28g/l，溴化钠3.75g/l，碳酸钙12.5g/l，M-促进剂0.025g/l，硫酸铵2.5g/l，淀粉酶0.25g/l。
4.2混合糖水2组成：淀粉500g/l,玉米浆12g/l，溴化钠3.75g/l，碳酸钙12.5g/l，M-促进剂0.025g/l，硫酸铵2.5g/l，淀粉酶0.25g/l。
4.3以上物料分别以培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。
5、过程补糖水控制：
5.1发酵20小时左右，总糖在5.0％以下开始补入混合糖水A，生长60小时后开始补入混合糖水B。
5.2发酵液总糖低于5.0％，生长20小时左右时，补入混合糖水A；发酵液总糖低于5.0％，生长60小时后换补比以上糖水中速效磷减半的混合糖水B；从开始补糖至70小时控制总糖在4.8％-4.0％，70小时后4.0％-2.0％至放罐。整个发酵过程中用氨水调节pH，在发酵前20小时，发酵液pH控制在6.1-5.8，2在发酵20小时后，发酵液pH控制在5.8-5.6，过程中用氨水调节pH。发酵过程中利用流加消沫剂或油方式进行消沫。
6、对照实例：
6.1以上1.2.3条相同。
6.2混合糖水组成为：淀粉500g/l,玉米浆30g/l，溴化钠3.75g/l，碳酸钙12.5g/l，M-促进剂0.25g/l，硫酸铵2.5g/l,淀粉酶0.25g/l，按重量体积比配制成20L，后湿热蒸汽灭菌。
6.3发酵过程总糖低于5.0％开始补入以上糖水，开始补糖至70小时总糖控制在4.8％-4.0％,70小时后在4.0-2.0,过程用氨水调节pH。
7、试验结果数据：
发酵周期 发酵单位
实验例 180 31932
对照例 180 28730

Claims (3)

1.一种四环素发酵补料培养基，其特征在于是由混合糖水A和混合糖水B组成，其中
所述混合糖水A的组成为：淀粉250-500g/l,玉米浆25-30g/l，溴化钠1.25-3.75g/l，轻质碳酸钙3.75g-12.5g/l，M-促进剂0.0125-0.025g/l，硫酸铵0g-2.5g/l，淀粉酶：0.25g/l；
所述混合糖水B的组成为：淀粉250-500g/l,玉米浆10-15g/l，溴化钠1.25-3.75g/l，碳酸钙3.75-12.5g/l，M-促进剂0.0125-0.025g/l，硫酸铵0-2.5g/l，淀粉酶：0.25g/l。
2.一种利用权利要求1所述的四环素发酵补料培养基的补料方法，其特征是：在以金色链霉菌为生产菌种发酵生产四环素的发酵过程中，
1）在发酵15-25hr，当总糖低于5.0%时补入混合糖水A；
2）在发酵60hr后，总糖低于5.0%时补入混合糖水B；
从开始补糖至发酵70小时控制总糖在4.8%-4.0%，70小时后控制总糖4.0%-2.0%至放罐。
3.按照权利要求2所述的补料方法，其特征是：在发酵过程的前20小时，发酵液pH控制在6.1-5.8，在发酵过程的20小时后，发酵液pH控制在5.8-5.6，过程中用氨水调节pH。
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