CN106755213B - 一种井冈霉素发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种井冈霉素发酵工艺，包括向发酵液中补加葡萄糖和酵母膏的工艺，本发明通过以微生物生理参数OUR，CER作为发酵控制指标并结合代谢过程进行变温培养，从而显著提高了发酵液中的井冈霉素A含量，降低了其它井冈霉素杂质的含量，对水稻纹枯病、水稻稻曲病、小麦纹枯病、葡萄斑点病、葡萄灰霉病、玉米小斑病、玉米大斑病具有更好的防效。
Description
技术领域
本发明涉及井冈霉素的发酵工艺。
背景技术
井冈霉素是一种高效、安全的农用抗生素，主要用于防治植物真菌类病害，也可作为治疗糖尿病药物的合成前体。由于其高效的抗病特性且对人畜无害，因此受到市场的广泛关注。井冈霉素由A、B、C、D、E、F等组分组成，其中A组分活性最强，而其它组分几乎无作用，且其它组分的存在会影响病原菌对井冈霉素由A的吸收，影响杀菌效果。
目前，井冈霉素A制造领域普遍存在如下问题：(1)成品有效成分A含量低，杂质含量高，无法满足高端产品质量需求；(2)发酵过程中工艺控制指标简单，难以反映微生物生理代谢特性，因此导致水平低，周期长生产成本高。
CN 105543125A公开了一株产井冈霉素的黄麻链霉菌和利用该菌生产井冈霉素的方法，采用该方法生产的发酵液中井冈霉素A的含量可达3.065％，该方法没有在发酵过程中进行补料。
发明内容
本发明的目的是提供一种井冈霉素发酵工艺，该工艺通过在发酵过程中进行补料，进一步提高了冈霉素A的含量。
本发明提供的井冈霉素发酵工艺，包括向发酵液中补料的工艺，其步骤如下：1)在发酵的第18-30小时，通过补糖速率实时调整，将摄氧率控制在15-30mM/kg·h，二氧化碳释放率控制在20-40mM/kg·h；2)在发酵的第36-54小时，摄氧率、二氧化碳释放率出现明显上升趋势，当增幅分别达到20-50％后，停止补糖，并进行低温发酵；3)当摄氧率、二氧化碳释放率上升趋势停止后，继续通过补糖将摄氧率控制在15-30mM/kg·h，二氧化碳释放率控制在20-40mM/kg·h，并恢复常温发酵；4)在发酵的第54-66h，在补糖的基础上向发酵液中补加酵母膏，当摄氧率、二氧化碳释放率出现明显上升趋势并分别达到20-50％增幅后，停止补料并继续发酵至85-90小时。
优选地，步骤1)和步骤3)中的摄氧率为20-25mM/kg·h，二氧化碳释放率为30-35mM/kg·h。
优选地，所述低温发酵的温度为33-38℃。
优选地，所述常温发酵的温度为37-42℃。
优选地，所述补糖是补加葡萄糖。
优选地，所述发酵液中的培养基配方如下：玉米粉3％；豆粕2.2％；酵母浸粉1％；氯化钠0.2％；磷酸二氢钾0.08％，余量为水。均为质量体积比，如玉米粉3％指的是每100ml培养基中含玉米粉3g。
本发明的有益效果是：
1)采用本发明的发酵工艺能显著提高发酵液中的井冈霉素A含量，降低其它井冈霉素杂质的含量。
2)本发明制备的井冈霉素对水稻纹枯病、水稻稻曲病、小麦纹枯病、葡萄斑点病、葡萄灰霉病、玉米小斑病、玉米大斑病具有更好的防效。
3)本发明以在线参数为指标，便于操作控制，产品质量更有保障。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
一种井冈霉素发酵工艺，其步骤如下：
以黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)KN-1625(已在CN 105543125A中公开)为生产菌株，将菌株活化和二级种子培养后，种子发酵液移入发酵罐中培养，发酵培养基配方如下：玉米粉3％；豆粕2.2％；酵母浸粉1％；氯化钠0.2％；磷酸二氢钾0.08％，余量为水。
发酵通气比1：1，搅拌速度420rpm，温度为37-42℃，在发酵的第18-30小时，通过对补葡萄糖的速率实时调整，将摄氧率控制在20-25mM/kg·h，二氧化碳释放率控制在30-35mM/kg·h；2)在发酵的第36-54小时，摄氧率、二氧化碳释放率出现明显上升趋势，当增幅分别达到35％后，停止补糖，并将温度降低到33-38℃继续发酵；3)当摄氧率、二氧化碳释放率上升趋势停止后，继续通过补糖将摄氧率控制在20-25mM/kg·h，二氧化碳释放率控制在30-35mM/kg·h，并恢复温度为37-42℃继续发酵；4)在发酵的第54-66h，在补糖的基础上向发酵液中补加酵母膏(质量浓度5％，添加速率0.01vvm)，当摄氧率、二氧化碳释放率出现明显上升趋势并分别达到35％增幅后，停止补加葡萄糖和酵母膏并继续发酵至88小时。
井冈霉素合成的次级代谢前体，均来自于以微生物主代谢途径中的7-磷酸景天庚酮糖和UDP-葡萄糖，而上述两者均来自于葡萄糖-6磷酸。因此，葡萄糖是井冈霉素的关键合成前体。但培养基中起始糖已被细胞体合成消耗，且剩余淀粉类物质水解效率有限。故在井冈霉素A产素期补加葡萄糖糖是实现其高产的重要手段。另外，井冈霉素是一类氨基糖苷类抗生素，其分子中的氮元素主要来自于发酵液中的游离氨基酸。但是在起始培养基中，氮源主要被用于发酵过程的菌丝体扩增，在发酵中后期氮源含量减少会导致井冈霉素单位时间产率下降或合成停止。所以，有必要在井冈霉素A发酵过程中补加氮源以维持其生物合成过程。
在补料过程中，糖、氮的添加量需严格控制：太多会引起细胞重新回到初级代谢阶段做菌体合成，停止产素；太少会导致井冈霉素产量偏低，故补糖补氮指标成为工艺控制关键。有文献报道以残糖或是生长时间作为补糖依据，但微生物生长过程批与批之间存在差异，以胞外过程参数作为胞内生理代谢指标易导致发酵过程以及产量不稳定。因此，本发明首次将细胞生理代谢参数OUR(摄氧率)，CER(二氧化碳释放率)作为补料控制指标，并依此解决了补加不足或过量的问题，使整个补料发酵过程可顺利平稳进行。
本发明以微生物生理参数OUR，CER作为发酵控制指标并结合代谢过程进行变温培养。当微生物处于初级代谢期时，细胞呼吸强度随细胞量增加而增加，反应到生理代谢参数上即为OUR，CER值均上升。当初级代谢期结束，进入次级代谢期时，井冈霉素产素开始，此时细胞量合成趋于平衡，各好氧代谢途径通量趋于平稳，OUR，CER也保持稳定。当葡萄糖添加开始后，若添加速率过大，PP途径和UDP-葡萄糖途径增强的同时，EMP途径和TCA途径也会增强，此时反应为OUR，CER值增大，细胞将趋于初级代谢；若添加速率过小，此时反应为OUR，CER值增大，则井冈霉素缺乏合成底物而造成产率降低。故OUR，CER值可作为补糖速率的有效控制参数。
在因补糖速率过快而导致次级代谢向初级代谢迁移时，除降低补糖速率外，还需将发酵温度降低4-6℃，以降低初级代谢通量，避免碳源过多流失，并促使其向次级代谢途径回归。
作为结构类似物，井冈霉素B等其它杂质对于井冈霉素A的作用靶点存在竞争，会抑制井冈霉素A的抗菌作用。本实施例获得的发酵产物具有较高的有效成分含量和较低的杂质含量，发酵液中井冈霉素A含量为4.5％(g/g)，其它井冈霉素杂质总含量为1.2％，与CN105543125A相比得到了很大的提高。
发酵液经提取后制得的水剂产品中，井冈霉素A浓度为24％，其它杂质总含量为10％，该水剂不仅对水稻纹枯病有特效，而且对水稻稻曲病、小麦纹枯病、葡萄斑点病、葡萄灰霉病、玉米小斑病、玉米大斑病具有优异防治效果。
实施例2
将实施例1制备的24％井冈霉素水剂进行田间试验，考察制剂对水稻纹枯病、水稻稻曲病、小麦纹枯病、葡萄斑点病、葡萄灰霉病、玉米小斑病、玉米大斑病的防效。试验中的CK为对照，采用CN 105543125A的方法制备的含8％井冈霉素A的水剂。
表1 24％井冈霉素水剂防治水稻纹枯病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 9 | 32.4 | 75.41 |
| 2 | 15 | 54 | 80.03 |
| 3 | 21 | 75.6 | 83.39 |
| CK | 45 | 54 | 60.31 |
表2 24％井冈霉素A水剂防治水稻稻曲病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 20 | 72 | 70.55 |
| 2 | 30 | 108 | 77.34 |
| 3 | 40 | 144 | 80.85 |
| CK | 90 | 108 | 71.60 |
表3 24％井冈霉素A水剂防治小麦纹枯病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 37.5 | 135 | 66.75 |
| 2 | 43.75 | 157.5 | 72.92 |
| 3 | 50 | 180 | 75.03 |
| CK | 131 | 157.5 | 58.17 |
表4 24％井冈霉素A水剂防治葡萄斑点病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 33.3 | 120 | 87.02 |
| 2 | 44.4 | 160 | 88.92 |
| 3 | 66.7 | 240 | 90.87 |
| CK | 133.3 | 160 | 80.49 |
表5 24％井冈霉素A水剂防治葡萄灰霉病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 33.3 | 120 | 94.48 |
| 2 | 44.4 | 160 | 95.91 |
| 3 | 66.7 | 240 | 96.61 |
| CK | 133.3 | 160 | 85.11 |
表6 24％井冈霉素A水剂防治玉米小斑病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 20 | 72 | 78.70 |
| 2 | 30 | 108 | 82.18 |
| 3 | 40 | 144 | 84.18 |
| CK | 90 | 108 | 71.64 |
表7 24％井冈霉素A水剂防治玉米大斑病田间药效试验
| 处理编号 | 亩施药剂量(毫升) | 有效成分量(克/公顷) | 平均防效％ |
| 1 | 20 | 72 | 79.50 |
| 2 | 30 | 108 | 81.78 |
| 3 | 40 | 144 | 83.11 |
| CK | 90 | 108 | 70.55 |
从表1-表7的数据可以看出，本发明制备的井冈霉素对7中作物病害的防治效果均明显优于CN 105543125A。
Claims (1)
1.一种井冈霉素发酵工艺，其特征在于：包括向发酵液中补料的工艺，其步骤如下：以黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)KN-1625为生产菌株，将菌株活化和二级种子培养后，种子发酵液移入发酵罐中培养，发酵培养基配方如下：玉米粉3％；豆粕2.2％；酵母浸粉1％；氯化钠0.2％；磷酸二氢钾0.08％，余量为水，
1)发酵通气比1：1，搅拌速度420rpm，温度为37-42℃，在发酵的第18-30小时，通过对补葡萄糖的速率实时调整，将摄氧率控制在20-25mM/kg·h，二氧化碳释放率控制在30-35mM/kg·h；2)在发酵的第36-54小时，摄氧率、二氧化碳释放率出现明显上升趋势，当增幅分别达到35％后，停止补糖，并将温度降低到33-38℃继续发酵；3)当摄氧率、二氧化碳释放率上升趋势停止后，继续通过补糖将摄氧率控制在20-25mM/kg·h，二氧化碳释放率控制在30-35mM/kg·h，并恢复温度为37-42℃继续发酵；4)在发酵的第54-66h，在补糖的基础上向发酵液中补加酵母膏，当摄氧率、二氧化碳释放率出现明显上升趋势并分别达到35％增幅后，停止补加葡萄糖和酵母膏并继续发酵至88小时。
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