KR20110130306A

KR20110130306A - 발리다마이신의 생산 배지 및 그 배양 방법

Info

Publication number: KR20110130306A
Application number: KR1020100049885A
Authority: KR
Inventors: 서주원; 양승환; 고중환; 김영우; 주영광
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2010-05-27
Publication date: 2011-12-05
Also published as: KR101262820B1

Abstract

본 발명은 발리다마이신의 고생산 발효 배양을 위한 생산 배지 및 그 배양 방법에 관한 것으로, 최적의 배양 및 배지 조건을 확립하여 8g/L의 고농도의 발리다마이신을 생산할 수 있다.

Description

발리다마이신의 생산 배지 및 그 배양 방법{Culture medium for production of validamycin and process for culturing thereof}

본 발명은 발리다마이신의 고생산 발효 배양을 위한 생산 배지 및 그 배양 방법에 관한 것이다.

발리다마이신 (validamycin A)은 벼잎집무늬마름병의 방제에 널리 이용되고 있는 농용 항진균제로서 1972년에 개발된 이후 현재까지 그 내성이나 약해가 보고된 바 없는 저독성 농업소재이다. 명확히 말해 발리다마이신은 약물 전구체로서 곰팡이 세포 내에서 β-글리코시다아제에 의하여 발리독실아민(validoxylamine A)로 전환된 후 트레할라아제(trehalase)의 작용을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 측면에서 해충의 활동성을 저해하는 효과가 있음도 확인된 바 있다. 따라서 정책적으로 발리다마이신과 같은 친환경 천연물 농약의 활용 범위를 증가시킨다면 발리다마이신 수요를 충족시키는 과정에서 국내 발효 산업의 확대를 도모할 수 있어 녹색 성장의 좋은 예가 될 수 있을 것으로 기대된다.

또한 발리다마이신은 상기와 같이 벼의 잎집무늬마름병 방제를 위한 농용 항진균제로서 널리 사용되고 있을 뿐 아니라 발리다마이신을 생물학적으로 분해하여 얻어지는 발리엔아민은 당뇨병 치료제인 보글리보즈(상품명: 베이슨)생산의 원재료로 사용되고 있는 산업적 가치가 매우 우수한 천연 생리활성물질이다.

이와 같이, 다양한 산업 분야에서 발리다마이신의 수요가 증가하고 있으므로, 발리다마이신의 효율적이고 우수한 고생산 배양 배지 조성과 배양 조건의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 예의 연구를 진행한 결과 안출한 것으로, 특히 발리다마이신의 고생산 발효 배양을 위한 생산 배지 및 그 배양 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 발리다마이신의 대량생산을 위한 최적화 배지 및 배양 조건을 결정하고 최적 발리다마이신 생산 균주에서 발리다마이신 생산성 증대 효과를 정량 검정함으로써 달성하였다.

본 발명은 발리다마이신을 효과적으로 대량 생산할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 발리다마이신 생산균주의 배양 공정도이다.
도 2는 생산균주의 발리다마이신 생물검정을 위해 발효액 상등액을 100배 희석한 시료를 나타낸 것이다.
도 3은 발리다마이신 생산균주의 발효 과정 중 pH, SV 및 TS, 및 역가변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 발리다마이신 A의 HPLC 분석법에 의한 측정 결과를 나타낸 것이다.

실시예 1. 발리다마이신 생산균주의 대량배양을 위한 배지 조건 및 배양 조건

사면(Slant) 배지를 글루코스 2.0%, 아스파르트산 0.1%, NaCl 0.1%, 아가 1.5%, pH는 6.4 ~ 6.7으로 조성하며, 아스파르트산을 제외한 성분을 120℃에서 30분 감압멸균 후 아스파르트산을 첨가하여 균일하게 교반 후 각각의 플라스크에 분주하여 115℃에 20분간 재차 멸균하여 냉각한 후 사용한다. 배양 공정도는 도 1에 나타난 바와 같다. 사면 튜브(Slant tube), 튜브 사면(tube slant) 및 둥근바닥 플라스크(round flask slant)에서 동일한 배지를 사용하고, 배양시간은 약 7일 정도이며 배양온도는 37℃이다. 표면에 회백색 포자가 자라고 흡수반이 있고 콜로니 주변에 동그란 원을 형성하면서 포만하면 우수한 사면 종균(slant seed)이 형성된 것이다.

실시예 2. 발리다마이신 생산균주에서 발리다마이신 생산성 증대 효과의 정량 검정

생산균주의 발리다마이신 생물검정 방법확립

발리다마이신 생산 미생물 배양액의 상등액을 멸균수로 10 및 100배 희석시킨 후, 상기 희석액에 침지한 paper disc를 미리 Thanatephorus cucumeris DMS1907의 포자 현탁액(1x10⁷~10⁸세포/㎖)을 0.1 ㎖씩 도포하여 미세한 콜로니가 생성된 Potato dextrose 한천배지 위에 올린다. 25℃에서 2일간 추가 배양하여Thanatephorus cucumeris DMS1907의 생장을 저해한 holo zone을 확인하였다.

생산균주의 발리다마이신 A 생산성 HPLC 에 의한 정량적 분석

- 이동상 조제:0.71g 무수 Na₂HPO₄을 1000㎖ 2차 증류수에 녹여 H₃PO₄으로 pH=7.0으로 조정하였다. 30㎖ 메탄올을 첨가하여 균일하게 혼합한 후 0.45um 필터로 여과시켰다. Column:4.6mm, 150mm, 5umODS; 유속:1.0㎖/min；Column 온도:25~30℃；측정파장:210nm；Injection volume:10ul；Retention time: 발리다마이신 A의 retention time 는 5min 정도이다.

- 측정절차

㉮ 표준품 standard 만들기

발리다마이신 A 표준품 0.1g 을 50ml짜리 volumetric flask 에 물로 녹여 정용하여 균일하게 혼합하였다. 파이펫으로 2㎖을 취하여 50㎖ volumetric flask에 옮겨 물로 희석하여 정용하였다.

㉯ 시료 만들기

발효액이나 농축된 가루 적당한 양을 취하여, 물로 녹인 후 여과하였다. 그리고 최종 함유량이 1000 unit 정도까지 희석하였다.

㉰ 측정

위와 같은 조건으로 baseline이 안정되면, 시료를 주입하여 측정하였다.

㉱ 발리다마이신의 역가를 계산하였다

실시예 3. 발효 배지조건 최적화

발리다마이신 생산균주의 탄소원 대체 실험을 통해 글루코스 이외의 다른 탄소원을 이용하면 발리다마이신 생산이 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 하지만 가용성 녹말을 탄소원으로 사용할 경우 배양액의 고점도 현상이 나타나 산소 공급을 유지하기 위해 더 높은 교반속도가 필요하다. 따라서 쌀가루 또는 쌀가루와 대두박과 같은 탄소원을 혼용하여 같은 발효조건에서 가용성 글루코스보다 더 많은 발리다마이신을 생산하는 것을 확인하였다. 그래서 전배양에서 쌀가루만을 사용하고 본배양에서는 쌀가루와 대두박을 혼용하여 사용했다. 질소원으로는 전배양에서는 효모 추출물과 땅콩 분말을 사용하였고, 본배양에서는 효모 추출물과 땅콩 분말뿐만 아니라 면실 분말(cotton seed powder)을 이용했다. 그 외에 K₂HPO₄, NaCl, CaCO₃, 소포제 등에 의한 발리다마이신의 발효조건 최적화를 수행하였다. 2%이상의 글루코스를 탄소원으로 포함된 배지에서는 대사저해에 의해 발리다마이신 생산이 억제된 것을 확인하였다. 또한 본배양시 적합한 탄소원, 질소원이 들어간 배지에 K₂HPO₄를 첨가하여 실험한 결과, 발리다마이신 생산을 대조구보다 30% 정도 증가시켰다.

전배양 발효 조건

전배양 발효조건을 하기 표 1에 나타냈다.

전배양 배지 조성

쌀가루	6%
NaCl	0.2%
효모 추출물	0.3%
땅콩 분말	3.0%
K₂HPO₄	0.1%

상기 표 1과 같은 조성의 배지를 5000ℓ jar에 넣고 물 2500ℓ를 첨가한다. 소포제 소량 첨가 후 121℃에서 45분간 멸균하였다. 50℃까지 냉각시킨 후 사면 종균을 접종하였다. 예를 들어, 3000L 배양액에 둥근바닥 플라스크 사면 한 개 정도 접종한다. 화염접종 혹은 미공접종 (둥근바닥 플라스크 사면을 멸균수로 현탁한 후, needle을 정착하여 압력 차이를 이용하여 접종)으로 접종하였다. 접종된 배양 배지를 최적 배양온도는 36 ~ 40℃이고 압력은 0.05Mpa, 통기량은 1：0.5로 25 ~ 40시간 주기로 교반 배양하였다. 배양시간 및 접종시기를 결정하기 위해서는 종균이 형태학적으로 확인해 보았을 때 상태가 양호한 정도로 PMV 35%이상이야 한다. 대략 시간은 20 ~ 25시간 정도 걸리며, 이때 온도를 적정온도보다 낮춰 사용하였다. 형태학적인 확인은 현미경으로 관찰하는데 균사체가 전체적으로 시야에 퍼져있고 PMV 35% 이상 (3000 rpm), pH 최저로 떨어졌다가 다시 약간 올라올 때(6.0~6.4)가 최적 접종시기이다. 일반적으로 pH 6.8 이상이 바람직하다.

본배양 발효 조건

본배양 배지 조성을 하기 표 2에 나타냈다.

본배양 배지 조성:

쌀가루	13%
대두박	0.8%
효모 추출물	0.8%
땅콩 분말	1.0%
K₂HPO₄	0.1%
면실 분말	0.3%
NaCl	0.15%
CaCO₃	0.25%
소포제	0.03%

배양 방법 및 접종방법:상기 배지조성 원료(CaCO₃제외)를 발효 jar에 첨가하고 NaOH로 pH 7.2로 조절하여, CaCO₃를 첨가 한 다음 38 ton까지 정용하였다. 121-125℃에서 45분 멸균 후 40℃까지 냉각시킨 후 10-15%로 종균을 접종하였다. 그런 다음 최적 배양온도는 40 ~ 41℃이고 압력은 0.05Mpa, 통기량은 0 ~ 10시간 1：0.5로 25 ~ 40시간 교반 배양하였다. 발효 과정 중 8시간 간격으로 pH, 총 당, 질소 및 pMV를 측정하여 기록하였다. 발효 45시간 경과 후에 최종 회수하고 역가를 측정한다. 균사체가 용해되며, pH가 올라가고 발효주기는 약 65시간 정도가 되면 발효를 종료한다.

실시예 4. 액체배양 조건 확립

종균배양을 위해 100㎖ 삼각 플라스크에 종균배양 배지(글루코스 1.0%, 가용성 녹말 1.0%, 효모 추출물 1%, 옥수수 침출 분말 0.5%, CaCO₃ 0.1%, pH 6.6) 25㎖를 첨가하여 121℃, 20분 동안 살균하였다. 상기 제조된 포자 현탁액을 효모-맥아 한천배지에 접종하여 28℃로, 4~5일간 단일 콜로니(monocolony)가 생길 때까지 배양하였다. 그 후, 색소나 콜로니 형태를 관찰하여 경험적으로 선택한 하나의 콜로니를 화염 살균한 루프(loop)로 따서 종균배양 배지에 식균하여 37℃에서 220rpm으로 48시간 동안 배양하여 종균 배양액을 제조하였다. 본배양을 위해 250㎖ 삼각 플라스크에 본배양 배지(글루코스 1.0%, 덱스트린 10%, 건조 효모 1%, 땅콩 분말 0.5%, K₂HPO₄ 2%, CaCO₃ 0.1%, pH 6.8) 50㎖를 첨가하여 121℃, 20분 동안 살균하였다. 상기 제조된 종균 배양액(2%(v/v))을 본 배양 배지에 식균하여 37℃에서 220rpm으로 6~9일 동안 배양하여 본 배양 배양액을 제조하였다. 산업성을 고려하여 주로 저가의 공업용 원료를 사용하였다. 배양액에 합성 고분자인 Neorin 같은 소포제를 첨가하면(농도는 0.1%(v/v)) 발효가 상대적으로 안정화되었다.

실시예 5. 발리다마이신 고생산 발효조 조건 최적화

2ℓ의 둥근 Baffle 플라스크에 500㎖의 전배양 배지를 가하여 121℃에서 40분 동안 살균한 다음, 포자 현탁액을 1%(v/v)되게 식균하였다. 그 후, 식균된 균주를 37℃, 120회 왕복으로 48시간 동안 배양하여, 1단 전배양액(gemination culture)을 수득하였다. 상기 1단 전배양액을 1.0%(v/v)되게 전배양액이 27ℓ 들어있는 50ℓ 발효조에 식균하였다. 그 후, 24시간 동안 37℃, 400rpm, 1vvm의 조건으로 2단 전배양(seed culture)한 다음, 220ℓ의 본배양액이 들어있는 300ℓ발효 조에 2단 전배양액을 10%(v/v)가 되도록 식균하여 37℃, 300~500rpm, 1vvm의 조건으로 3~4일 동안 배양하였다. 이렇게 얻은 배양액을 상기 서술한 방법을 이용하여 HPLC법에 의한 분석결과, 8g/L의 고농도의 발리다마이신이 생산됨을 확인하였다 (도 3 및 도 4 참조).

Claims

쌀가루 13%, 대두박 0.8%, 효모 추출물 0.8%, 땅콩 분말 1.0%, K₂HPO₄ 0.1%, 면실 분말 0.3%, NaCl 0.15%, CaCO₃ 0.25% 및 소포제를 0.03%를 포함하는 발리다마이신 생산균주의 생산 배지.
2ℓ의 둥근 Baffle 플라스크에 500㎖의 전배양 배지를 가하여 121℃에서 40분 동안 살균한 다음, 포자 현탁액을 1%(v/v)되도록 식균하는 단계;
식균된 균주를 37℃, 120회 왕복으로 48시간 동안 배양하여, 1단 전배양액(gemination culture)을 수득하는 단계;
상기 1단 전배양액을 1.0%(v/v)되게 전배양액이 27ℓ 들어있는 50ℓ 발효조에 식균하는 단계;
24시간 동안 37℃, 400rpm, 1vvm의 조건으로 2단 전배양(seed culture)하는 단계;
220ℓ의 본배양액이 들어있는 300ℓ발효 조에 2단 전배양액을 10%(v/v)가 되도록 식균하여 37℃, 300~500rpm, 1vvm의 조건으로 3~4일 동안 배양하는 단계
를 포함하는 발리다마이신 생산 방법.
제2항에 있어서, 상기 전배양액이 쌀가루 6%, 효모 추출물 0.3%, 땅콩 분말 3.0%, K₂HPO₄ 0.1% 및 NaCl 0.2%를 포함함을 특징으로 하는 발리다마이신 생산 방법