RU2679051C1 - Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности - Google Patents
Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679051C1 RU2679051C1 RU2018105983A RU2018105983A RU2679051C1 RU 2679051 C1 RU2679051 C1 RU 2679051C1 RU 2018105983 A RU2018105983 A RU 2018105983A RU 2018105983 A RU2018105983 A RU 2018105983A RU 2679051 C1 RU2679051 C1 RU 2679051C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- rapamycin
- vkm
- hygroscopicus
- glucose
- Prior art date
Links
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 28
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 27
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 7
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 50
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 22
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 18
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 18
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 14
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 4
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 2
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001480043 Arthrodermataceae Species 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 241000893976 Nannizzia gypsea Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000037304 dermatophytes Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010056489 Coronary artery restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001532 anti-fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 potassium disubstituted phosphate Chemical class 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
- C12R2001/55—Streptomyces hygroscopicus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для производства макролидного антибиотика рапамицина - лекарственного средства, широко используемого в трансплантологии и терапии опухолевых процессов. Предложен штамм Streptomyces hygroscopicus ВКМ Ac-2737D и способ получения антибиотика рапамицина, предусматривающий внесение штамма Streptomyces hygroscopicus ВКМ Ac-2737D в питательную среду, содержащую соевую муку, лизин, дрожжевой экстракт, соевый пептон, глюкозу, хлорид натрия, сульфат магния, сульфат аммония, 30% кислорода и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов и его культивирование при температуре 29±1°С и рН среды 6,8-7,0 в течение 216±24 ч. При этом глюкозу вносят в питательную среду начиная с 72-го часа биосинтеза. Группа изобретений позволяет повысить выход рапамицина. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа получения биологически активного соединения - рапамицина для использования в качестве иммуносупрессора.
Рапамицин, также известный как Сиролимус, является продуктом метаболизма актиномицета Streptomyces hygroscopicus и представляет собой азотсодержащий макролид с эмпирической формулой C51H79NO13, имеющий в своем составе 31-членное лактонное кольцо (рис. 1).
Рапамицин был впервые выделен в 1972 году и показана его антифунгицидная активность в отношении патогенных дрожжей Candida albicans и некоторых дерматофитов {Microsporum gypseum и Trichophyton granulosum) (Vezina G., Kudelski A., Sehgal S.N., 1975. Rapamycin (AY-22, 989), Journal of Antibiotics 10(XXVIII), 721-726), US 3929992 (Surendra Sehgal 1975). Дальнейшее изучение препарата позволило установить, что он является мощным иммуносупрессором и с 2001 года его стали применять в трансплантологии для предотвращения отторжения трансплантатов. Рапамицин успешно применяют в ангиопластике в качестве лекарственного покрытия стентов для предотвращения рестеноза коронарных артерий. (Marks S.O. and Marks A.R., 2001, 104: 852-855). Также он используется для лечения системной красной волчанки, аутоиммунных кишечных [US 5286731] и кожных заболеваний, таких как псориаз [US 5286730].
Помимо вышеописанных способов применения, рапамицин используют в качестве антипролиферанивного агента, а также в биологических исследованиях в качестве агента для химически индуцированной димеризации.
Производится рапамицин фирмами Pfizer (Пфайзер) США и ее филиалами, а также индийской фирмой Biocon Ltd. В России рапамицин не производится.
Несмотря на широкий спектр возможностей применения рапамицина в медицине, его использование в значительной мере ограничивается тем, что существующие природные штаммы-продуценты не отличаются высокой продуктивностью, что увеличивает себестоимость субстанции и снижает возможные объемы ее промышленного производства.
В первых работах по биосинтезу рапамицина с использованием актиномицета S. hygroscopicus, продуктивность штаммов не превышала 110-130 мг/л (Lee M.S., Kojima I., Demain A.L. Microbiology and Biotechnology. 1995. V. 43, P. 1096-1098).
Продуктивность существующих в настоящее время промышленных штаммов остается в основном в пределах 700-900 мг/л [Zhu et al. (2010), Zou and Li (2013)]. Таким образом, проблема разработки высокопродуктивных штаммов и технологий биосинтеза рапамицина остается актуальной.
В существующих публикациях, касающихся способов получения высокопродуктивных штаммов, описаны различные методы, такие как слияние протопластов близкородственных штаммов, классический мутагенез с последующей селекцией, селекция с использованием антибиотиков в качестве селективного агента, оптимизация питательных сред и их совместные комбинации.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения рапамицина описанный в патенте US 2015/0079642 А1. Штамм - МТСС 5681, продуцент рапамицина, получен в результате совместного применения физического (УФ-облучение) и химического (NTG) мутагенов. Продуцирующая способность данного штамма при глубинном культивировании составляет 900 мг/л рапамицина.
Однако, для обеспечения достаточного объема производства рапамицина этой продуктивности недостаточно. Необходимы не только эффективные технологии его промышленного производства, выделения и очистки, но и высокопродуктивные штаммы-продуценты.
Задачей данного изобретения было получение нового высокопродуктивного штамма продуцента рапамицина, способного обеспечить необходимые объемы его промышленного производства, а также дальнейшее повышение его продуктивности за счет оптимизации состава питательной среды и условий культивирования.
Задача была решена в три этапа:
1. Применением метода ненаправленного индуцированного многоступенчатого УФ-мутагенеза и последующей селекции исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253 с продуктивностью (43±5) мг/л был получен штамм S. hygroscopicus (R 33-41) с продуктивностью (655±5) мг/л рапамицина, что более чем в 15 раз превышает продуцирующую способность исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253. Штамм S.hygroscopicus (R 33-41) депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина 30.05.2016 с регистрационным номером ВКМ Ac-2737D.
2. Оптимизацией состава питательной среды, в том числе подбором альтернативных источников углерода, органического и минерального азота, а также макроэлементов и их соотношений, максимально стимулирующих биосинтез рапамицина обеспечено дополнительное значительное (в 1.89 раза) повышение продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D при глубинном культивировании в колбах до (1215±5) мг/л рапамицина.
3. Усовершенствованием условий культивирования штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D с применением оптимизированной ферментационной среды в опытно-промышленных условиях удалось повысить продуктивность штамма с (1215±5) мг/л до 1275±10 мг/л рапамицина.
На первом этапе был получен новый штамм - продуцент рапамицина S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D.
Штамм получен путем ненаправленного индуцированного многоступенчатого УФ-мутагенеза и последующей селекции с применением мутагенных факторов, и направленных методов отбора изолятов исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253. В качестве мутагенного фактора были использованы УФ - лучи с длиной волны 250-280 нм (лампа Mineralight, мощность 12,5 Вт). Облучение проводили в водной суспензии спор на расстояние 40 см от лампы, при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см2.
Далее суспензию переносили на поверхность агаризованной среды и равномерно распределяли по поверхности. Культивирование на твердой агаризованной среде проводили в течение 12-14 суток при температуре 29°С. По окончанию культивирования из выросших на агаризованной среде колоний отбирали от 20 до 50 морфологически измененных колоний и повторно пересевали на агаризованную среду, а затем культивировали в колбах с использованием ферментационной среды и определяли их продуктивность хроматографическим методом (ВЭЖХ). Изоляты, обладающие максимальной продуктивностью, использовали в следующем цикле УФ-мутагенеза и отбора.
Продуктивность полученного таким образом нового штамма S. hygroscopicus (R 33-41) определялась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Полученный новый штамм S. hygroscopicus (33-41) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Ac-2737D.
Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D обладает повышенной продуктивностью рапамицина в колбах (655±5) мг/л.
Культурально-морфологические признаки штамма ВКМ Ac-2737D.
Морфологические признаки. Размер 3-4 мм; форма округлая со светлым валиком по краю; воздушный мицелий белого цвета; споры светло-серые; профиль колонии выпуклый, вросший в агар; структура однородная.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 29°С и в диапазоне значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 6,8. Глюкозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет.
Использование источников углерода. В отличие от исходного штамма, хорошо утилизирует в высоких концентрациях такие источники углерода как, глюкозу и глицерин.
Антагонистические свойства Штамм S. hygroscopicus (R 33-41) ВКМ Ас-2737D при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост патогенных дрожжей Candida albicans и некоторых дерматофитов (Microsporum gypseum и Trichophyton granulosum).
Отношение к антибиотикам В отличие от исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253, штамм ВКМ Ac-2737D устойчив к повышенным концентрациям собственного антибиотика (МИК>1000 мкг/мл), к циклогексимиду (МИК>200 мг/мл) и амфотерицину (МИК 1.0 мкг/мл). По отношению к другим видам антибиотиков чувствительность штаммов оказалась одинаковой.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Агаризованная питательная среда
Для поддержания, хранения и приготовления посевного материала культуры используется агаризованная среда состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 6.8±0.1.
Вегетативная питательная среда
Приготовление посевного материала осуществляется на вегетативной среде следующего состава: соевая мука (г/л): соевая мука -21.0, L-лизин-6.0, дрожжевой экстракт - 6.0, глюкоза - 20.0, дистиллированная вода - до 1 л. рН 6.6±0.1.
Ферментационная питательная среда
В качестве исходной ферментационной среды использовали питательную среду следующего состава (г/л): хлопковая мука - 21.0, L-лизин - 15.0, NaCl - 5.0, глицерин - 10.0, глюкоза - 80.0, вода дистиллированная до 1 л. рН 6.8±0.1.
Хранение культуры
Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D хранят на агаризованной среде состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1, рН - 6.8±0.1 не более трех месяцев при температуре около 5°С в холодильной камере. Для длительного хранения культуру лиофилизируют или хранят в жидком глицерине при -70°С.
Поддержание культуры
Культуру продуцента рапамицина поддерживают на агаризованной среде состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1. рН- -6.8±0.1. Для поддержания уровня продуктивности культуры, перед каждым пересевом ее на свежие питательные среды, проводят моноспоровый рассев на чашки Петри.
Выращивание культуры продуцента в чашках Петри проводят в течение 10-12 суток при температуре 29°С.
Таким образом, создан новый штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D, отличающийся от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (глюкоза, глицерин), по отношению к антибиотикам и по продуктивности, которая во много раз превосходит продуктивность исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253. Продуктивность нового штамма S. hygroscopicus ВКМ Ас-2737D, определенная методом ВЭЖХ составляет (655±5) мг/мл, что значительно превосходит продуктивность известных штаммов продуцентов рапамицина.
2. Следующим этапом работы было дальнейшее повышение продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. путем оптимизации состава питательной среды.
Получение штаммов с высоким уровнем биосинтеза антибиотических веществ зачастую сопровождается изменением требований не только к условиям культивирования, но и к составу питательных веществ и соотношению концентраций тех или иных компонентов индивидуально для каждого штамма.
Для того чтобы выяснить какие компоненты питательной среды и в каком количестве способствуют повышению продуктивности, был проведен ряд экспериментов по подбору оптимального состава жидкой питательной среды. Результаты оценивали по изменению продуцирующей способности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. Исследуемые компоненты добавляли в среду перед стерилизацией.
Так было проверено:
1. Влияние различных источников углерода на рост культуры S. hygroscopicus и уровень биосинтеза рапамицина
Установлено, что положительное влияние на биосинтез рапамицина оказывают глюкоза и глицерин. Было оценено влияние различных концентраций, дополнительно добавляемых в среду глюкозы или глицерина на биосинтез целевого соединения штаммом S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. Максимальная продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D была достигнута при дополнительном внесении глюкозы в количестве 20 г/л (общее содержание глюкозы в питательной среде составило 100 г/л) и составила 741±4 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации глюкозы в питательной среде ингибировало биосинтез целевого вещества. Дополнительное внесение в среду глицерина не привело к существенному повышению продуктивности штамма.
2. Влияние альтернативного источника органического азота
Хлопковая мука, входящая в состав исходной питательной среды, отличается высоким содержанием белка (45-50%), однако относится к дорогостоящим компонентам, в связи с чем, ее использование в процессе биосинтеза рапамицина экономически нецелесообразно.
Влияние источников органического азота на продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. оценивали относительно исходного компонента (хлопковой муки). Исследуемый диапазон концентраций составлял 20-40 г/л для различных видов муки и 1-15 г/л для пептонов и экстрактов. (Табл. 1)
Максимально положительный эффект на биосинтез рапамицина был выявлен в случае совместного использования соевой муки (30 г/л), соевого пептона (5 г/л) и дрожжевого экстракта (5 г/л). Максимальная концентрация рапамицина в культуральной жидкости на данном этапе оптимизации составила (792±5) мг/л.
* концентрация компонента, оказывающая максимально положительный эффект на биосинтез целевого вещества.
3. Влияние источников неорганического азота
Было изучено влияние неорганических источников азота на продуцирующую способность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. В качестве контрольной питательной среды использовали среду следующего состава (г/л): соевая мука (полножировая) - 30, соевый пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, L-лизин - 15, NaCl - 5, глицерин - 20, глюкоза - 100, дистиллированная вода - до 1 л. Для получения сред №1-15 к контрольной среде добавляли неорганические источники азота в концентрациях, указанных в Табл. 2.
Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D оказался не способен утилизировать мочевину (CH4N2O) и нитраты (KNO3), но хорошо усваивал азот в виде солей аммония ((NH4)2SO4, NH4Cl, C6H8O7⋅2NH3). При этом максимальное содержание рапамицина (835±6 мг/л) наблюдали при использовании сульфата аммония в концентрации 1 г/л.
4. Влияние макроэлементов
Авторы установили, что в период интенсивного роста (первые 48 ч) падение уровня рН ниже значения 5.5 негативно сказывается на накоплении биомассы и оказывает ингибирующее воздействие на биосинтез рапамицина.
В связи с этим было изучено влияние дополнительных количеств макроэлементов (фосфора, магния, калия, кальция) на поддержание рН среды и на биосинтез рапамицина в процессе культивирования. (Табл. 3)
В качестве контрольной питательной среды использовали среду следующего состава г/л: соевая мука (полножировая) - 30.0, соевый пептон -10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, L-лизин - 15.0, NaCl - 5.0, (NH4)2SO4 - 1.0, глицерин - 20.0, глюкоза - 100.0, дистиллированная вода - до 1 л.
Максимальная концентрация рапамицина в культуральной жидкости была отмечена при добавлении к исходной питательной среде Na2HPO4 (5 г/л) и MgSO4 (1 г/л). При совместном внесении данных компонентов питательную среду содержание рапамицина к концу периода культивирования достигало 937±3 мг/л.
Проведенная оптимизация питательной среды для штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D позволила получить данные необходимые для разработки ферментационной среды следующего состава (г/л): соевая мука -36.2±0.2, лизин - 20.4±0.4, дрожжевой экстракт - 5.0±0.05, соевый пептон - 5.0±0.05, глюкоза - 85.2±0.2, хлорид натрия - 5.0±0.05, сульфат магния - 1.0±0.05, сульфат аммония - 1.0±0.05, натрий фосфорнокислый 2-замещенный -5.0±0.05, вода дистиллированная до 1 л (рН 6.8-6.9).
Заявляемые соотношения компонентов в этой ферментационной среде, найденные экспериментальным путем, являются оптимальными и позволяют при их использовании достичь к концу периода культивирования штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D содержания рапамицина (1215±5) мг/л.
3. Следующим этапом работы по повышению продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D является оптимизация условий его культивирования. Основными параметрами условий культивирования штаммов являются температура процесса, рН среды, концентрация растворенного кислорода. Авторы проверили влияние данных параметров на биосинтез рапамицина с целью подбора оптимальных значений
А. Для проверки влиянии рН на биосинтез целевого продукта и определения его оптимальных значений проведен ряд ферментаций при различных рН среды. Поддержание заданных уровней рН производили в автоматическом режиме. Наилучшие показатели ферментации были достигнуты при уровне рН равном 6.8-7.0 (рис. 2, 3).
Б. Одним из важных факторов, влияющих на продуктивность биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ, в том числе и рапамицина, является содержание растворенного кислорода в ферментационной среде. В связи с этим были проведены эксперименты по оценке влияния различных концентраций растворенного кислорода на рост биомассы и продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D в условиях автоматического контроля значения рН на уровне 6.8-7.0. Содержание растворенного кислорода в среде изменяли путем изменения оборотов перемешивающего устройства и изменения количества расходуемого в процессе ферментации воздуха. Наибольшая продуктивность по рапамицину и максимальный прирост биомассы были отмечены при концентрации растворенного кислорода 30% (рис. 4).
В. Изменения метаболизма мутантных штаммов, связанные с повышением их продуктивности, как правило, оказывают влияние на интенсивность потребления источников питательных веществ и возможность их усвоения. Так, высокопродуктивные штаммы обычно отличаются более интенсивным ростом, в связи, с чем нуждаются в более высокой концентрации питательных элементов (в первую очередь, углеводов) в среде.
К наиболее доступным для микроорганизмов источникам углерода в первую очередь следует отнести моно и дисахара. Авторами было показано, что оптимальным дополнительным источником углерода является глюкоза.
Непрерывную подачу 50% стерильного раствора глюкозы в ферментер осуществляли в автоматическом режиме при рН 6.8, начиная с 72 ч ферментации, в условиях поддержания рН и концентрации растворенного кислорода на ранее определенных оптимальных уровнях (6.8-7.0 и 30%, соответственно).
Добавление в ферментационную среду 50% раствора глюкозы в процессе ферментации обеспечило дополнительную стабилизацию рН среды культивирования за счет образования органических кислот в процессе метаболизма культуры и увеличило содержание сырой биомассы, тем самым позволив увеличить время активного синтеза рапамицина. Это положительно сказалось на накоплении рапамицина в культуральной жидкости, достигшем к 216 ч роста 1275±5 мг/л. Потребление глюкозы культурой в среднем, составило 10 г/л/сутки.
Таким образом, поддержание активной кислотности среды в процессе ферментации на оптимальном уровне (6.8-7.0), концентрации растворенного кислорода на уровне 30%, использование дополнительных количеств глюкозы в процессе ферментации в концентрации Юг/л в сутки позволило увеличить содержание рапамицина в культуральной жидкости с (1215±5) до (1275±5) мг/л.
Авторами проведено успешное масштабирование процесса биосинтеза и тем самым продемонстрирована возможность проведения процесса биосинтеза рапамицина с использованием штамма S. hygroscopicus ВКМ Ас-2737D в промышленном масштабе.
Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении высокопродуктивного штамма способного в специально разработанных для него условиях синтезировать рапамицин в промышленных масштабах с высоким выходом, составляющим 1275±5 мг/л.
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами:
Пример 1
Получение нового высокопродуктивного штамма культуры S. hygroscopicus
Мутагенез.
В качестве исходного штамма в работе использовали штамм Streptomyces hygroscopicus АТСС 29253.
В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны, 250-280 нм (лампа Mineralight, мощность 12.5 Вт).
Суспензию, полученную путем смыва с поверхности агаризованной среды и содержащую споры и обрывки мицелия, фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор; при необходимости суспензию разводили до конечной концентрации (1.5-2)*106 спор/мл. После подсчета и разведения суспензию подвергали облучению в открытой чашке Петри на расстоянии 40 см от лампы. Время экспозиции варьировало от 20 до 25 минут. Далее облученную суспензию в объеме 100-200 мкл переносили на твердую агаризованную среду и равномерно распределяли по ее поверхности. Культивирование проводили в течение 10-12 суток при температуре 29°С, после чего из развившихся колоний отбирали 20-50 морфологически измененных колоний.
Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Эффективность мутагенеза определяли по количеству возникающих морфологически измененных колоний. Выросшие изолированные колонии повторно пересевали на агаризованную среду, затем культивировали в колбах с использованием питательной среды (ферментационной). Для предварительной оценки продуктивности отобранных изолятов использовали метод тонкослойной хроматографии. Изоляты, обладающие максимальной продуктивностью, пересевали и повторно подвергали УФ-облучению. Для определения содержания рапамицина в культуральной жидкости использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Продуктивность нового штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D, определенная методом ВЭЖХ составляла (655±5) мг/мл.
Пример 2
Идентификация исходного и полученного штаммов
Для генетической идентификации исходного АТСС 29253 и полученного ВКМ Ac-2737D штаммов S. hygroscopicus было проведено секвенирование штаммов и определена частичная последовательность амплификата гена (1472 bp), кодирующего 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов для обоих образцов оказались идентичными между собой. Анализ полученной последовательности был проведен путем сравнения с аналогичными последовательностями, помещенными в базу данных GenBank (Табл. 4). Филогенетически наиболее близкими к исследованным образцам среди описанных образцов оказались штаммы S. hygroscopicus АТСС 14891 и S. sp. 219847. Уровень сходства последовательностей исследуемых образцов с указанными штаммами составил 99.3% и 98.0%, соответственно. Согласно современным стандартам, обнаруженный уровень сходства последовательностей 16S рРНК позволяет отнести изучаемый штамм к роду Streptomyces hygroscopicus.
Пример 3
Определение устойчивости к антибиотикам
Для определения чувствительности штамма ВКМ Ac-2737D к различным видам антибиотиков использовали метод серийных разведений в плотных средах. Для этого подготавливали тройные серийные разведения препаратов в различных концентрациях и по 1 мл каждого разведения вносили в пробирки, содержащие по 20 мл охлажденной до 45°С среды R1 и тщательно перемешивали. Содержимое пробирок переносили в чашки Петри и оставляли до полного застывания, после чего засевали исследуемыми штаммами S. hygroscopicus, производя сплошной посев петлей либо внося по 100-200 мкл предварительно подготовленной суспензии, и культивировали при 29°С в течение 10-12 суток. После инкубации определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) по отсутствию роста на чашках, содержащих наименьшую концентрацию препарата. Штамм ВКМ Ac-2737D устойчив к повышенным концентрациям собственного антибиотика (МИК>1000 мкг/мл), к циклогексимиду (МИК>200 мг/мл) и амфотерицину (МИК 1.0 мкг/мл) (Табл. 5).
Пример 4
Биосинтез рапамицина в биореакторе объемом 15 литров в режиме регистрации основных технологических и биохимических параметров.
Подготовка посевного материала.
Для приготовления посевного материала в чашках Петри используют агаризованную среду состава г/л: агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л, рН - 6.8±0.1.
Проверенную агаризованную среду засевают мицелием исходной рабочей культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 10 до 12 суток, при температуре 29°С.
Выращивание посевного материала 1 генерации.
Выращивание посевного материала в колбах проводят в одну стадию (маточные колбы) на вегетативной среде следующего состава, (г/л): соевая мука -21.0, L-лизин-6.0, дрожжевой экстракт - 6.0, глюкоза - 20.0, дистиллированная вода - до 1 л. рН 6.6±0.1. Культивирование осуществляют при 29°С в течение 48 часов на термостатируемой качал очной установке при 230-250 об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопии наблюдается негустая базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована.
Биосинтез рапамицина.
Выросший посевной материал в объеме 1.0 л засевали в 15-л ферментационную установку. Ферментацию проводили на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 36.2, лизин - 20.4, дрожжевой экстракт - 5.0, соевый пептон - 5.0, глюкоза - 85.2, хлорид натрия - 5.0, сульфат магния - 1.0, сульфат аммония - 1.0, натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 5.0, вода дистиллированная до 1 л (рН 6.8-6.9).
Общий объем среды в ферментере - 10 л. Выращивание штамма-продуцента в ферментере ведут при следующих условиях: температура (29±1)°С; аэрация 5 л/мин от 0 до 48 часов роста от 48 часов роста до конца ферментации - 10 л/мин; давление от 0,05 до 0,08 Мпа; обороты перемешивающего устройства 200-500 об/мин.
Начиная с 72 часов, ведут контроль содержания рапамицина методом ВЭЖХ. В качестве стандарта используют образец антибиотика с содержанием рапамицина 96% (SIGMA). Время ферментации - (216±24) часа. Параметры культуральной жидкости на момент окончания процесса биосинтеза: - посторонняя микрофлора - отсутствует; - микроскопическая картина - ветвящиеся гифы, собранные в плотные колонии; протоплазма в гифах дифференцирована; содержание рапамицина не менее 1220 мг/мл (ВЭЖХ).
Пример 5. Продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D на ферментационной среде с добавлением дополнительного источника углерода.
Биосинтез осуществляют аналогично примеру 4, а с 72 ч ферментации начинают непрерывную подачу 50% стерильного раствора глюкозы в биореактор в автоматическом режиме, в условиях поддержания рН и концентрации растворенного кислорода на ранее определенных оптимальных уровнях (6.8-7.0 и 30%, соответственно).
Параметры культуральной жидкости на момент окончания процесса биосинтеза: - посторонняя микрофлора - отсутствует; - микроскопическая картина - ветвящиеся короткие гифы, колонии округлой формы, протоплазма в гифах дифференцирована; - содержание рапамицина не менее 1270 мг/мл (ВЭЖХ).
Claims (6)
1. Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D - продуцент антибиотика рапамицина.
2. Способ увеличения продуктивности штамма продуцента антибиотика рапамицина рода S. hygroscopicus путем использования для его культивирования водной питательной среды, содержащей один или более источников углерода, азота, ионов металлов в виде растворимых солей, с дополнительной подачей источника углерода в течение продуктивной стадии, отличающийся тем, что биосинтез проводят с использованием штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D в среде с pH 6.8-7.0 и температурой 29±1°C, содержащей 30% кислорода и глюкозу в качестве дополнительного источника углерода, имеющей следующий состав, г/л:
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что глюкозу в качестве дополнительного источника углерода вносят, начиная с 72-го часа биосинтеза.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что количество дополнительно вносимой глюкозы составляет 10 г/л в сутки.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что позволяет увеличить продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D до 1275±5 мг/л.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018105983A RU2679051C1 (ru) | 2018-02-16 | 2018-02-16 | Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018105983A RU2679051C1 (ru) | 2018-02-16 | 2018-02-16 | Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2679051C1 true RU2679051C1 (ru) | 2019-02-05 |
Family
ID=65273673
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018105983A RU2679051C1 (ru) | 2018-02-16 | 2018-02-16 | Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2679051C1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2112807C1 (ru) * | 1992-12-30 | 1998-06-10 | Сантэн Ой | Способ получения иммунодепрессанта циклоспорина а и штамм tolypocladium species свs630.92, продуцирующий циклоспорин а |
-
2018
- 2018-02-16 RU RU2018105983A patent/RU2679051C1/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2112807C1 (ru) * | 1992-12-30 | 1998-06-10 | Сантэн Ой | Способ получения иммунодепрессанта циклоспорина а и штамм tolypocladium species свs630.92, продуцирующий циклоспорин а |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
САВЕЛЬЕВА В.В. Создание высокоактвиного штамма Streptomyces hydroscopicus, продуцента фармацевтической субстанции рапамицина, методом индуцированного ненаправленного мутагенеза. Материалы конференции молодых ученых и специалистов. "Актуальные исследования молодых ученых в биологии, защите растений и смежных отраслях", 26.12.2014. Большие Вяземы, с.18-19. * |
САВЕЛЬЕВА В.В., ДЖАВАХИЯ В.В. и др. Получение высокоактивного штамма Streptomyces hydroscopicus R 33-41 и оптимизация состава питательной среды для повышенной продукции рапамицина. Биофармацевтический журнал, 2017, т.9 N 6, с.16-24. * |
САВЕЛЬЕВА В.В., ДЖАВАХИЯ В.В. и др. Получение высокоактивного штамма Streptomyces hydroscopicus R 33-41 и оптимизация состава питательной среды для повышенной продукции рапамицина. Биофармацевтический журнал, 2017, т.9 N 6, с.16-24. САВЕЛЬЕВА В.В. Создание высокоактвиного штамма Streptomyces hydroscopicus, продуцента фармацевтической субстанции рапамицина, методом индуцированного ненаправленного мутагенеза. Материалы конференции молодых ученых и специалистов. "Актуальные исследования молодых ученых в биологии, защите растений и смежных отраслях", 26.12.2014. Большие Вяземы, с.18-19. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112458012A (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂及其应用 | |
CN102161975A (zh) | 链霉菌gsdx-1318及发酵法生产寡聚糖类抗生素阿维拉霉素的方法 | |
WO2006075395A1 (ja) | β−ラクタム抗生物質の活性増強剤及びその製造法 | |
CN115820461B (zh) | 一种高产吲哚乙酸菌株jb0319及其应用 | |
Rajasekar et al. | Isolation and characterization of Marine fungal metabolites against clinical pathogens | |
JP6527521B2 (ja) | 新規なストレプトマイセス・フィラメントサス変異株及びこれを用いたダプトマイシンの生産方法 | |
CN108823110A (zh) | 一株产灰黄霉素的菌株及其应用 | |
CN108841889A (zh) | 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法 | |
US9365880B2 (en) | Fermentation process for the production of rapamycin | |
RU2679051C1 (ru) | Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности | |
CN112175883A (zh) | 一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌 | |
CN101608209B (zh) | 核糖体抗性诱变选育万古霉素生产菌株及其应用 | |
CN108004154B (zh) | 腥掷孢酵母菌17wy1、其微生物制剂及其在小麦白粉病防治中的应用 | |
CN114250176B (zh) | 一种微生物防治三七根腐病剂的制备方法及其应用 | |
CN112725238B (zh) | 一种发酵产利普司他汀的毒三素链霉菌株及其应用 | |
Holmalahti et al. | Production of dihydroabikoviromycin by Streptomyces anulatus: production parameters and chemical characterization of genotoxicity | |
CN111876344B (zh) | 一种24元环大环内酯高产菌株及其应用 | |
RU2686779C1 (ru) | Штамм streptomyces tsukubensis - продуцент такролимуса и способ получения такролимуса | |
CN113817653A (zh) | 一株荧光假单胞菌BsEB-1及其应用 | |
KR20110130306A (ko) | 발리다마이신의 생산 배지 및 그 배양 방법 | |
Valiullin et al. | Exploring the potential of Bacillus subtilis as an additive for decontamination of feed | |
CN115851534B (zh) | 一株烟草根际贝莱斯芽孢杆菌及在烟草病害防控中的应用 | |
US20080009050A1 (en) | Regulation of acid metabolite production | |
Singh et al. | Bio-prospecting of Root Endophytic Aquatic Fungus Cylindrocarpon aquaticum (Nils.) Marvanova and Descals as Antibacterial Potential | |
CN116004750B (zh) | 桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法 |