CN112899183A - 一种用于培育高有效成分的黄芪营养液及其黄芪培育方法 - Google Patents

一种用于培育高有效成分的黄芪营养液及其黄芪培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种一种用于培育高有效成分的黄芪营养液及其黄芪培育方法。通用本发明所述的营养液后，实验田黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量显著升高，且质量更加稳定，品质更加优良。

Description

一种用于培育高有效成分的黄芪营养液及其黄芪培育方法
技术领域
本发明属于生物菌剂领域，具体涉及一种用于培育高有效成分的黄芪营养液及其黄芪培育方法。
背景技术
黄芪是我国重要的中药材之一，为豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，托毒排脓，敛疮生肌的作用。其中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为黄芪的主要有效成分，具有降压、抗炎、镇静、镇痛、调节代谢等作用，是黄芪注射液、补中益气丸等常用中成药的主要有效成分。
黄芪为多年生草本植物，传统上一直是野生或者仿野生栽培(采籽撒播于山野中任其生长)方式，至少生长4年以上，通常6～8年采收。随着黄芪需求量不断增加，传统采刨式的多年生传统黄芪已经不能满足市场需求，因此，甘肃、内蒙、山西等地探索的育苗移栽2年生蒙古黄芪栽培技术获得成功，得到大面积推广。
但是育苗移栽法由于存在培育方式不同等人为因素，黄芪饮片中药典标示的有效成分含量存在一定的差异，且含量不高，目前急需一种能够稳定提高黄酮有效成分的培育方法。
发明内容
一方面，本发明提供一种植物的营养液，其中，所述营养液含有阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉。
在一些实施方案中，所述植物为多年生草本植物，优选为黄芪，更优选为2年生黄芪。
在一些实施方案中，所述营养液中阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉的浓度为0.3-0.6％；更优选为0.4-0.5％。
在一些实施方案中，所述营养液在黄芪培育中的应用。
在一些实施方案中，所述营养液用于黄芪培育中，饮片黄芪皂苷含量的提升。
在一些实施方案中，所述营养液用于两年生黄芪培育中，饮片中黄芪皂苷含量的提升。
在一些实施方案中，所述黄芪皂苷为黄芪甲苷和毛睿异黄酮葡萄糖苷。
另一方面，本发明提供了一种二年生黄芪的培育方法，施用所述营养液，每次每平米为5L营养液。
另一方面，本发明提供了一种植物营养液的制备方法：
a、斜面培养将冷冻保存的阿氟曼链霉菌ATCC-4917菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，25℃恒温培养14天，即得活化培养物；
b、种子培养将活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，25℃与200rpm恒温振荡培养3天，将湿菌体与无菌水(质量比1：4)进行混合，再分散20min制备菌悬液。按照每升菌悬液为10mL的接种量接种于种子培养基中，25℃与200rpm的恒温振荡培养36h，得到阿氟曼链霉菌ATCC-4917种子液；
c、发酵培养按照以发酵培养基体积计1％-5％接种量，将种子液接种到发酵培养基中，25℃培养2天，再6℃培养5天，即得阿氟曼链霉菌ATCC-4917发酵液；
d、阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉制备将发酵液离心分离，得到的湿菌体，用蒸馏水洗涤，再离心分离后，冻干，即得阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉；
e、将阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉溶于水中即得植物的营养液。
本发明所述的含量均为质量比，阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉的浓度为0.3-0.6％指每100g水中含有0.3-0.6g的阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉。
阿氟曼链霉菌ATCC-4917可购于ATCC及其他公开途径。
附图说明
图1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品HPLC图。
图2为试验田取样方式图。
具体实施方式
实施例1阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉的制备
1、斜面培养将冷冻保存的阿氟曼链霉菌ATCC-4917菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，25℃恒温培养14天，即得活化培养物。
2、种子培养将活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，25℃与200rpm恒温振荡培养3天，将湿菌体与无菌水(质量比1：4)进行混合，再分散20min制备菌悬液。按照每升菌悬液为10mL的接种量接种于种子培养基中，25℃与200rpm的恒温振荡培养36h，得到阿氟曼链霉菌ATCC-4917种子液。
3、发酵培养按照以发酵培养基体积计1％-5％接种量，将种子液接种到发酵培养基中，25℃培养2天，再6℃培养5天，即得阿氟曼链霉菌ATCC-4917发酵液。
4、阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉制备将发酵液离心分离，得到的湿菌体，用蒸馏水洗涤，再离心分离后，冻干，即得阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉。
实施例2黄芪仿野生栽培
将试验田划分为10份，每份试验100平方米，移栽黄芪幼苗，再按照如下方式施肥，每次施肥量为5L/m2，每年5月、6月、7月和8月，月中施肥。
试验田序号 浇灌方式
A-1 自来水
A-2 0.1％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-3 0.2％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-4 0.3％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-5 0.4％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-6 0.5％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-7 0.6％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-8 0.7％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-9 0.8％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液
A-10 2.5g/L含氮磷钾的复合肥
第二年待成熟后，11月采收。采收时要避免挖断主根或碰伤外皮。收后去净泥土，趁鲜切下芦头，晒至半干将根理直捆成把，再晒或烘干即成生黄芪。
依据药典2015版HPLC测定黄芪甲苷含量。具体操作如下：
分别取A-1至A-10试验田的生黄芪饮片4g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40mg，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10mg，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
依据药典2015版HPLC测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。具体操作如下：
采用C-18色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm。
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-20 20-40 80-60
20-30 40 60
对照品溶液的制备取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含50叫的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约lg，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加人甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
每块试验田分别取样，平行测定3次。
各组试验田黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量如下：
试验田序号 黄芪甲苷0.04 毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.02％
A-1 0.052±0.012 0.031±0.006
A-2 0.053±0.014 0.028±0.005
A-3 0.053±0.009 0.033±0.007
A-4 0.087±0.006 0.052±0.003
A-5 0.089±0.008 0.059±0.04
A-6 0.090±0.008 0.064±0.005
A-7 0.072±0.005 0.065±0.005
A-8 0.054±0.008 0.030±0.004
A-9 0.046±0.010 0.027±0.007
A-10 0.056±0.010 0.035±0.006
根据各组试验田，营养液中阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉的浓度为0.3-0.6％时，实验田黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量显著升高，阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉的浓度为0.4-0.5％时，达到最高。
实施例3
将试验田400平方米，移栽黄芪幼苗，每年施用3次营养液，营养液为0.5％阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉水溶液，每次施肥量为5L/m2。待第二年黄芪成熟后，按照图2所示的采样点采收。
在上述实验田旁边另找400平方米实验田，移栽黄芪幼苗，按传统方法正常施用氮磷钾复合有机肥，待第二年黄芪成熟后，按照图2所示的采样点采收。
采收时要避免挖断主根或碰伤外皮。收后去净泥土，趁鲜切下芦头，晒至半干将根理直捆成把，再晒或烘干即成生黄芪。
按照实施例2所述的测定方法测定7个取样点，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，并测定RSD值，结果如下表：
施用营养液 施用复合有机肥
黄芪甲苷 0.08 0.24
毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.07 0.26
通过测定结果显示，施用营养液后，黄芪甲苷和毛睿异黄酮葡萄糖苷各取样点测定结果相对标准偏差比施用复合有机肥明显降低，显示施用本发明记载的营养液，黄芪的质量更加稳定，品质更加优良。

Claims (8)

1.一种植物的营养液，其中，所述营养液含有阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉。
2.如权利要求1所述的植物营养液，述植物为多年生草本植物，优选为黄芪，更优选为2年生黄芪。
3.如权利要求1所述的植物营养液，阿氟曼链霉菌ATCC-49173冻干粉的浓度为0.3-0.6％；更优选为0.4-0.5％。
4.如权利要求1所述的植物营养液，在黄芪培育中的应用。
5.如权利要求4所述的植物营养液，在黄芪培育中的应用，可使饮片中黄芪皂苷含量的提升。
6.如权力要求5所述的植物营养液，在黄芪培育中的应用，可使饮片中黄芪甲苷和毛睿异黄酮葡萄糖苷含量提升。
7.一种二年生黄芪的培育方法，施用如权利要求1所述的营养液，每次每平米为5L营养液。
8.一种植物营养液的制备方法：
a、斜面培养将冷冻保存的阿氟曼链霉菌ATCC-4917菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，25℃恒温培养14天，即得活化培养物；
b、种子培养将活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，25℃与200rpm恒温振荡培养3天，将湿菌体与无菌水(质量比1：4)进行混合，再分散20min制备菌悬液，按照每升菌悬液为10mL的接种量接种于种子培养基中，25℃与200rpm的恒温振荡培养36h，得到阿氟曼链霉菌ATCC-4917种子液；
c、发酵培养按照以发酵培养基体积计1％-5％接种量，将种子液接种到发酵培养基中，25℃培养2天，再6℃培养5天，即得阿氟曼链霉菌ATCC-4917发酵液；
d、阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉制备将发酵液离心分离，得到的湿菌体，用蒸馏水洗涤，再离心分离后，冻干，即得阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉；
e、将阿氟曼链霉菌ATCC-4917冻干粉溶于水中即得植物的营养液。
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