CN111304110B - 一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产蛋白酶深海微小杆菌技术领域，公开了一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途。所述产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017(Exiguobacterium profundum MS 10017)，其保藏号为CCTCC NO：M2019795，采用嗜酸乳杆菌和产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017联用，连续两步发酵法实现高效脱钙与脱蛋白提取虾壳或蟹壳中的甲壳素。所述产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017所产蛋白酶活性更高。

Description

一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途
技术领域
本发明涉及产蛋白酶深海微小杆菌，特别涉及一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途。
背景技术
甲壳素是自然界中第二大碳水化合物，具有良好的生物相容性、抗菌性和生物降解性，这使其能够在高端(如药物和生物技术)和低端(如营养和食品加工)中得到广泛应用。我国的海岸线较长，对虾和蟹类加工产生大量的虾蟹壳，成为甲壳素生产的主要原料，但目前对甲壳素的制备技术水平较低，工业化生产中主要采用传统的化学提取法—强酸脱钙和强碱脱蛋白，但强酸强碱的化学法会引起甲壳素结构和生理生化性质的改变，带来环境污染及高额的处理成本等问题。因此研究新方法克服化学法的缺点、使操作步骤简易化、提高其他物质的回收效率，并实现大规模的工业化生产，对我国虾蟹壳资源的回收和再利用具有十分重要的意义。
微生物发酵技术应用于甲壳素的提取具有广大的发展空间，主要是利用产蛋白酶菌发酵脱蛋白，产酸菌发酵脱钙。但现有发酵法提取甲壳素脱除蛋白质和矿物质，受到微生物相对低的蛋白酶活性和遗传稳定性的影响，甲壳素产率低、纯度不符合标准SCT3403-2004，亟待研究新技术解决上述技术问题，有鉴于此，本发明提供了一种产蛋白酶酶深海微小杆菌突变株及其用途。
发明内容
为了解决现有技术中的发酵法提取甲壳素脱除蛋白质效果不佳导致甲壳素产率低、纯度不符合标准等技术问题，本发明提供了一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017(Exiguobacterium profundum MS 10017)，其已经于2019年10月10日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，保藏编号为CCTCC M2019795。它是将产蛋白酶菌株深海微小杆菌通过ARTP(常压室温等离子体)诱变在含脱脂奶粉的培养基中选育出来的，所述产蛋白酶菌株深海微小杆菌可以选自从传统虾酱中筛选出来的深海微小杆菌，也可以选择其他途径得到的产蛋白酶菌株深海微小杆菌作为出发菌。
进一步的，产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017(Exiguobacterium profundumMS 10017)的16S rRNA的对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述。
本发明还提供了产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017(Exiguobacteriumprofundum MS 10017)在微生物发酵制备甲壳素中的应用。
同时，本发明还提供了一种制备甲壳素的方法，具体包括以下步骤：
(a)将嗜酸乳杆菌种子液接种到第一发酵培养基中，在pH 6.4±0.2条件下，于30-37℃温度下发酵96-120h，使培养基中虾壳或蟹壳脱钙；所述嗜酸乳杆菌种子液的浓度为108-109CFU/mL较佳。
(b)将所述的深海微小杆菌突变株MS10017接种到扩大培养基中扩大培养，得到深海微小杆菌突变株MS10017种子液；扩大培养的温度为30-37℃，扩大培养的时间为10-15h。
(c)将所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液接种到第二发酵培养基中，加入脱钙后虾壳或蟹壳，在pH 7.2±0.2条件下，于30-37℃温度下发酵96-120h，使所述脱钙虾壳脱蛋白，从发酵液中分离得到甲壳素。所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液的浓度为108-109CFU/mL较佳。
作为优选，所述第一发酵培养基组成为，葡萄糖50g/L，CH3COONa 5g/L，K2HPO42.0g/L，柠檬酸铵2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，虾壳或蟹壳50g/L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌15min。
作为优选，所述扩大培养基组成为，大豆蛋白胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，胰蛋白胨17g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L。
作为优选，所述第二发酵培养基组成为，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO42.5g/L，脱钙后虾壳或蟹壳，121℃灭菌15min。
本发明所提供的嗜酸乳杆菌和产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017联用，连续两步发酵法实现高效脱钙与脱蛋白提取虾壳或蟹壳中的甲壳素；产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017所产蛋白酶活性更高，其脱蛋白率为91-96％，甲壳素回收率60-75％；制备得到的甲壳素显示出具有光滑表面特征，其形态高度均匀，多孔，具有层状组织和致密断裂的结构。
附图说明
图1为MS 10017的遗传稳定性图；
图2为实施例2制备的甲壳素和未处理的虾壳、通过酸/碱法制备得到的甲壳素的SEM扫描图；
图3为MS 10017和深海微小杆菌发酵过程中蛋白酶活性测定图。
具体实施方式
本发明公开了一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途，下面将通过具体实施例来详述本发明的特征和各个方面。除非特别指明，本发明中所用的试验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和试剂。此外，试试方案应理解为说明性的，而不是要限制本发明的范围，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离加工条件进行的各种的改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017(Exiguobacteriumprofundum MS 10017)，其已经于2019年10月10日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，保藏编号为CCTCC M 2019795。它是在含脱脂奶粉的培养基中选育出来的产蛋白酶菌株深海微小杆菌通过常压室温等离子体诱变(ARTP)法得到的，所述产蛋白酶菌株深海微小杆菌可以选自从传统虾酱中筛选出来的深海微小杆菌，也可以选择其他来源的产蛋白酶菌株深海微小杆菌作为出发菌。
为了使本领域技术人员能够更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017的制备方法
(1)将传统虾酱(购买于青岛市开平路农贸市场)用0.9％NaCl溶液分散，将溶液稀释并涂布在含有2％脱脂乳的培养基中，温育后，挑取单菌落并保存；
(2)将所述单菌落配成10μL新鲜细胞悬浮液(106-108CFU/mL)，并均匀涂抹在灭菌的金属载玻片上，并暴露于ARTP喷射器中，时间为0-140秒，ARTP生物诱变系统工作参数：(i)射频功率输入为100W；(ii)等离子炬喷嘴出口与样品板之间的距离为2毫米；(iii)气流为10SLM；
(3)将诱变后的单菌落接种到含有脱脂奶粉的固体培养基中，具有大水解圈的菌落标记并接种到初始发酵培养基中，菌落在20～40℃下以120～170rpm的摇动速度生长0-120h后，收集发酵的上清液用于蛋白酶活性测定，筛选出产蛋白酶活性高的深海微小杆菌菌种，即为深海微小杆菌突变株MS10017，其16S rRNA的对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述。对深海微小杆菌突变株MS10017进行9次传代培养，并评估鉴定突变体的遗传稳定性，如图1所示，图1显示，在连续培养九轮后蛋白酶的产量保持相对稳定，实现突变株的遗传稳定性，在突变后的菌株具有遗传稳定性。
所述(3)步骤中，初始发酵培养基是具体组成是，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，脱钙后虾壳或蟹壳。
实施例2甲壳素的制备方法
(a)将嗜酸乳杆菌种子液(种子液的浓度为109CFU/mL)接种到第一发酵培养基中，在pH 6.4±0.2条件下，37℃发酵120h，使第一发酵培养基中虾壳或蟹壳脱钙；
所述第一发酵培养基组成为，葡萄糖50g/L，CH3COONa 5g/L，K2HPO4 2.0g/L，柠檬酸铵2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，虾壳或蟹壳50g/L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌15min。
(b)将所述的深海微小杆菌突变株MS10017接种到扩大培养基中扩大培养，得到深海微小杆菌突变株MS10017种子液；扩大培养温度为37℃，时间15h；所述扩大培养基组成为，大豆蛋白胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，胰蛋白胨17g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L；
(c)将所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液(109CFU/mL)接种到第二发酵培养基中，在pH 7.2±0.2条件下，于37℃发酵120h，对所述脱钙虾壳脱蛋白，从发酵液中分离得到固体残余物，固体残留物用氢氧化钠处理后在80℃下干燥48h，得到甲壳素；所述甲壳素水分≤12％、灰分≤3％，产品符合行业标准SCT3403-2004；所述甲壳素的脱钙率为95％，脱蛋白率为95％，甲壳素的回收率为70％；
所述第二发酵培养基组成为，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，脱钙后虾壳或蟹壳50g/L，121℃灭菌15min。
所述脱蛋白率通过等式1计算：
Figure GDA0002959880430000041
PO和PR是发酵前后的蛋白质浓度(％)，所述蛋白质浓度是指发酵前的虾壳含氮量和发酵后的甲壳素的含氮量；而O和R代表原始样品虾壳质量(g)和固体残余物的质量(g)，以干重计。
所述脱钙率通过等式2计算：
Figure GDA0002959880430000042
其中MO和MR是发酵前后的灰分含量(％)，灰分含量是指发酵前的虾壳的灰分含量和发酵后的样品的灰分含量；而O和R分别代表原始样品虾壳质量(g)和基于干重的固体残余物(g)。
所述甲壳素回收率通过等式3计算：
Figure GDA0002959880430000043
将本实施例制备得到的甲壳素和未处理的虾壳、通过酸/碱法制备得到的甲壳素进行SEM扫描，扫描图见图2，图2a(100倍)、图2b(1500倍)分别是虾壳的SEM扫描图，图2c(1500倍)、图2d(20000倍)是本实施例制备得到的甲壳素的SEM扫描图，图2e(1500倍)、图2f(20000倍)通过酸/碱法制备得到的甲壳素SEM扫描图。图2显示，未处理过的虾壳表面粗糙，没有毛孔，因为矿物质牢牢地嵌入甲壳素间隙和富含蛋白质的大分子中；与未处理的虾壳相比，本实施例通过连续两步发酵法提取的甲壳素的表面形态发生显着变化，通过发酵提取的甲壳素显示出具有孔的光滑表面特征，其形态高度均匀，多孔，具有层状组织和致密断裂的结构，类似于酸/碱制备的甲壳素。
所述酸/碱法制备得到的甲壳素的方法如下：2.0g虾壳，以1:10(w/v)的比率用1.5M HCl处理固体级分6小时，被HCl浸泡过的虾壳用清水洗去残留的HCl后加入20mL 10％NaOH在90℃左右的环境下回流3-4h。
实施例3甲壳素的制备方法
(a)将嗜酸乳杆菌种子液(种子液的浓度为109CFU/mL)接种到第一发酵培养基中，在pH 6.4±0.2条件下，37℃发酵108h，使第一发酵培养基中虾壳脱钙；
所述第一发酵培养基组成为，葡萄糖50g/L，CH3COONa 5g/L，K2HPO4 2.0g/L，柠檬酸铵2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，虾壳或蟹壳50g/L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌15min。
(b)将所述的深海微小杆菌突变株MS10017接种到扩大培养基中扩大培养，得到深海微小杆菌突变株MS10017种子液；
扩大培养的温度33℃，扩大培养的时间为13h；所述扩大培养基组成为，大豆蛋白胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，胰蛋白胨17g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L；
(c)将所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液(109CFU/mL)接种到第二发酵培养基中，在pH 7.2±0.2条件下，于33℃发酵108h，对所述脱钙虾壳脱蛋白，从发酵液中分离得到固体残余物，固体残留物用氢氧化钠处理后在80℃下干燥48h，得到甲壳素；所述甲壳素水分≤12％、灰分≤3％，产品符合行业标准SCT3403-2004；所述甲壳素的脱钙率为98％，脱蛋白率为94％，甲壳素的回收率为70％；
所述第二发酵培养基组成为，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，脱钙后虾壳或蟹壳50g/L，121℃灭菌15min。
在上述发酵过程中对蛋白酶的活性进行检测，检测结果如图3所示，将所述深海微小杆菌突变株MS10017替换成实施例1步骤1制备的未突变菌，其他条件不变，在发酵过程中检测蛋白酶活性检测结果如图3所示，本发明提供蛋白酶的活性检测方法可参照Kembhavi等人描述的方法(D.Barbano,J.Lynch,J.Fleming,Direct and indirect determinationof true protein content of milk by Kjeldahl analysis:collaborative study,J.Assoc.Offic.Anal.Chem.74(1991)281–288.)。图3显示，诱变菌MS10017和未突变之前的深海微小杆菌的最大蛋白酶水解活性分别为3.34U·mL-1和2.44U·mL-1，诱变菌MS10017最大蛋白酶活性的总生产力，与深海微小杆菌相比增加了36.39％，证明了本实施例采用深海微小杆菌突变株MS10017发酵，其产蛋白酶的活性更加有效，诱变菌发酵后的甲壳素回收率为70.18±2.68％高于未诱变菌的甲壳素回收率(60.75±1.22％)。
实施例4甲壳素的制备方法
(a)将嗜酸乳杆菌种子液(种子液的浓度为108CFU/mL)接种到第一发酵培养基中，在在pH 6.4±0.2条件下，30℃发酵96h，使第一发酵培养基中蟹壳脱钙；
所述第一发酵培养基组成为，葡萄糖50g/L，CH3COONa 5g/L，K2HPO4 2.0g/L，柠檬酸铵2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，虾壳或蟹壳50g/L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌15min。
(b)将所述的深海微小杆菌突变株MS10017接种到扩大培养基中扩大培养，得到深海微小杆菌突变株MS10017种子液；扩大培养温度为30℃，时间10h；所述扩大培养基组成为，大豆蛋白胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，胰蛋白胨17g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L；
(c)将所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液(108CFU/mL)接种到第二发酵培养基中，在pH 7.2±0.2条件下，于30℃发酵96h，对所述脱钙蟹壳脱蛋白，从发酵液中分离得到固体残余物，固体残留物用氢氧化钠处理后在80℃下干燥48h，得到甲壳素；所述甲壳素水分≤12％、灰分≤3％，产品符合行业标准SCT3403-2004；所述甲壳素的脱钙率为93％，脱蛋白率为91％，甲壳素的回收率为60％；
所述第二发酵培养基组成为，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，脱钙后蟹壳50g/L，121℃灭菌15min。
实施例5甲壳素的制备方法
(a)将嗜酸乳杆菌种子液(种子液的浓度为109CFU/mL)接种到第一发酵培养基中，在在pH 6.4±0.2条件下，32℃发酵120h，使第一发酵培养基中虾壳或蟹壳脱钙；
所述第一发酵培养基组成为，，葡萄糖50g/L，CH3COONa 5g/L，K2HPO4 2.0g/L，柠檬酸铵2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，虾壳或蟹壳50g/L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌15min。
(b)将所述的深海微小杆菌突变株MS10017接种到扩大培养基中扩大培养，得到深海微小杆菌突变株MS10017种子液；扩大培养温度为32℃，时间11h；所述扩大培养基组成为，大豆蛋白胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，胰蛋白胨17g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L；
(c)将所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液(108CFU/mL)接种到第二发酵培养基中，在pH 7.2±0.2条件下，于35℃发酵110h，对所述脱钙虾壳脱蛋白，从发酵液中分离得到固体残余物，固体残留物用氢氧化钠处理后在80℃下干燥48h，得到甲壳素；所述甲壳素水分≤12％、灰分≤3％，产品符合行业标准SCT3403-2004；所述甲壳素的脱钙率为98％，脱蛋白率为96％，甲壳素的回收率为75％；
所述第二发酵培养基组成为，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，脱钙后虾壳或蟹壳50g/L，121℃灭菌15min。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途
<141> 2019-11-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1472
<212> DNA
<213> 深海微小杆菌突变株(Exiguobacterium profundum)
<400> 1
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cgctacacgt ggaattccac tcttctctcc tatactcaag cctcccagtt tccaatggcc 840
ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga ggccgcctgc gcgcgcttta 900
cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctcgca aggtaccgtc aaggtgccgc cattgcctgc ggcacttgtt 1020
cttcccttac aacagaactt tacgacccga aagccttcat cgttcacgcg gcgttgctcc 1080
atcagacttt cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctatgcatc gtcgccttgg 1200
tgggccgtta ccccaccaac tagctaatgc accgcaaagc catccatggg cgacgccgga 1260
gcgcctttca tcatcggacc atgcggtccg atgacacatc cggtattagc cccgatttct 1320
cgtggttatc ccagacctat gggcaggttc tttacgtgtt actcacccgt ccgccgctca 1380
ttccaccgtc gtccccccga agggttcgga cggcttcctg cgctcgactt gcatgtatta 1440
ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccag ga 1472

Claims (7)

1.一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株MS10017(Exiguobacterium profundum MS10017)，其保藏号为CCTCC NO：M2019795。
2.如权利要求1所述的产蛋白酶深海微小杆菌突变株，其特征在于，其16S rRNA的对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述。
3.如权利要求1所述的产蛋白酶深海微小杆菌突变株在微生物发酵制备甲壳素中的应用。
4.一种制备甲壳素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(a)将嗜酸乳杆菌种子液接种到第一发酵培养基中，在pH 6.4±0.2条件下，于30-37℃温度下发酵96-120h，使培养基中虾壳或蟹壳脱钙；
(b)将权利要求1所述的深海微小杆菌突变株MS10017接种到扩大培养基中扩大培养，得到深海微小杆菌突变株MS10017种子液；
(c)将所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液接种到第二发酵培养基中，在pH7.2±0.2条件下，于30-37℃温度下发酵96-120h，使所述脱钙虾壳或脱钙蟹壳脱蛋白，最终从发酵液中分离得到甲壳素；
所述第一发酵培养基组成为，葡萄糖50g/L，CH3COONa 5g/L，K2HPO4 2.0g/L，柠檬酸铵2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，虾壳或蟹壳50g/L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌15min；
所述扩大培养基组成为，大豆蛋白胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，胰蛋白胨17g/L，NaCl5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，于30-37℃的温度下进行扩大培养10-15h；
所述第二发酵培养基组成为，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，脱钙后虾壳或蟹壳50g/L，121℃灭菌15min。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述嗜酸乳杆菌种子液的浓度为108-109CFU/mL。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，扩大培养温度为30-37℃，扩大培养的时间为10-15h。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述深海微小杆菌突变株MS10017种子液的浓度为108-109CFU/mL。
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