KR20160047431A - 폴리-감마-글루탐산의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

수탁 번호 NITE BP-01552, NITE BP-01551, NITE BP-01553, NITE BP-01554, 또는 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물, 및 상기 미생물을 배양하여 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 생산 방법.

Description

폴리-감마-글루탐산의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING POLY（GAMMA-GLUTAMIC ACID）}

본 발명은, 폴리-감마-글루탐산의 생산 방법, 및 이것에 사용하는 미생물에 관한 것이다.

폴리-감마-글루탐산 (이하, 본 명세서에 있어서「PGA」라고도 한다) 은, 글루탐산의 γ 위치의 카르복실기와 α 위치의 아미노기가 펩티드 결합에 의해 결합된 고분자 화합물이다. 또, PGA 는 γ-폴리글루탐산으로 호칭되는 경우도 있다. PGA 는, 납두균 (Bacillus subtilis var. natto) 이 산생하는 점성 물질로서 알려져 있고, 여러 가지 성질로부터 최근 새로운 고분자 소재로서 주목받고 있다.

PGA 를 산생하는 미생물로는, 납두균을 포함하는 일부의 Bacillus 속 세균과 그 근연종, 또한 호염 고세균 나트리알바·애집티아카 (Natrialba aegyptiaca) 등을 들 수 있다 (비특허문헌 1 참조). 또, 이들 PGA 생산균에는, PGA 의 생산성에 대한 글루탐산 의존성이 상이한 미생물이 있는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 2 참조). 즉, PGA 생산에 있어서 글루탐산을 필요로 하는 미생물과 글루탐산을 필요로 하지 않는 미생물이 존재한다고 되어 있다.

종래의 지견에 의하면, 고초균 (Bacillus subtilis) TAM-4 주는, 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 사카로오스, 락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세린을 각각 유일한 탄소원으로서 글루탐산 비의존적으로 PGA 를 생산하는 것이 기재되어 있다 (비특허문헌 2 참조). 그러나, 상기 탄소원 중 글리세린을 사용한 조건에서는, 고초균 TAM-4 주의 PGA 의 생산 능력은 0.6 g/L/4 일이다. 그 때문에, 고초균 TAM-4 주의 PGA 생산성은 공업적인 관점에서는 충분한 생산량을 달성하고 있지 않은 것으로 생각된다.

또, 비특허문헌 3 에 의하면, 글루탐산 비의존적으로 PGA 를 생산하는 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) A35 주는, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 락토오스, 수크로오스, 자일로오스를 각각 유일한 탄소원으로서 PGA 를 생산한다. 그러나, 글리세린을 유일한 탄소원으로 하는 조건에서는, 바실루스·리케니포르미스 A35 주는 PGA 를 생산하지 않는 것이 기재되어 있다.

또, 비특허문헌 2 에 있어서, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주는 글루탐산 의존적으로 PGA 를 생산하는 것으로 기재되어 있다. 한편, 비특허문헌 4 에 있어서는, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주는 글루탐산 비의존적으로 PGA 를 생산하는 것이 기재되어 있다. 그러나 비특허문헌 4 에는, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주가 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 를 생산하는 것은 확인되어 있지 않다. 또한 비특허문헌 5 에 있어서, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주는 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 를 생산하지 않는 것이 기재되어 있다.

한편으로, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주의 변이주인 바실루스·리케니포르미스 WBL-3 주는, 글리세린을 유일한 탄소원으로 하는 조건으로, 8.9 g/L/4 일의 PGA 생산성을 갖는 것이 비특허문헌 6 에 기재되어 있다.

이와 같이, 종래 지견에 의하면, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 글루탐산 비의존적으로 효율적으로 PGA 를 생산하는 미생물에 관한 정보는 불명확하다. 나아가서는, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 글루탐산 비의존적으로 효율적으로 PGA 를 생산하는 야생주는 거의 알려져 있지 않다.

글루탐산은, 바이오매스를 원료로 하는 발효법에 의해 생산할 수 있으며, 식품 소재 또는 사료로서 이용되고 있다. 이와 같은 글루탐산을 원료에 사용하지 않고, 유용한 고분자 소재인 PGA 를 효율적으로 생산할 수 있는 미생물은, 식량과의 경합을 피한다는 시점, 혹은 공업적으로 본 생산 코스트의 시점에서도 유익한 것으로 생각된다.

또한, 최근 글리세린은, 바이오 연료 등의 제조시에 발생하는 부산물로서 그 유효 이용이 요망되고 있다. 그래서, 이들 글리세린을 유일한 탄소원으로서 글루탐산 비의존적으로 효율적으로 PGA 를 생산하는 미생물을 찾아낼 수 있으면, 산업적으로 보아 이용 가치가 높은 것으로 생각된다.

Ashiuchi, M., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, vol.59, p.9-14 Ito, Y., et al., Biosci. Biotec. Biochem., 1996, vol.60, p.1239-1242 Cheng, C., et al., Agric. Biol. Chem., 1989, vol.53, p.2369-2375 Birrer, G. A., et al., Int. J. Biol. Macromol., 1994, vol.16, p.265-275 Birrer, G. A., et al., Polym. Mater. Sci. Eng., 1992, vol.67, p.134-136 Guocheng Du, et al., Process Biochemistry, 2005, vol.40, p.2143-2147

본 발명은, 수탁 번호 NITE BP-01552, NITE BP-01551, NITE BP-01553, NITE BP-01554, 또는 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물에 관한 것이다.

또 본 발명은, 상기 미생물을 배양하여 PGA 를 생산하는 PGA 의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은, PGA 생산능이 우수한, 야생형 미생물을 제공하는 것을 과제로 한다.

또 본 발명은, 글루탐산의 비존재하여도, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 의 고생산이 가능한, 야생형 미생물을 제공하는 것을 과제로 한다.

또 본 발명은, PGA 의 고생산이 가능한 PGA 의 생산 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 감안하여 예의 검토를 실시하였다. 그 결과, 글루탐산의 비존재하여도, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 의 고생산이 가능한 야생형 미생물을 알아냈다.

본 발명은 이 지견에 기초하여 완성된 것이다.

본 발명의 미생물은, PGA 생산능을 갖는 종래의 야생형 미생물과 비교하여 PGA 생산능이 우수하다.

또 본 발명의 미생물은, 글루탐산의 비존재하여도, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 의 고생산이 가능하다.

또한 상기 미생물을 사용하는 본 발명의 PGA 의 생산 방법은, PGA 의 고생산이 가능하다.

본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은, 하기의 기재로부터 보다 명확해질 것이다.

본 명세서에 있어서「야생형 미생물」이란, 자연계에서 분리 또는 단리된 미생물로서, 인공적 변이 처리나 인공적 유전자 재조합 조작을 실시하지 않은 상태의 미생물을 의미한다.

본 발명의 미생물은, PGA 생산능을 갖는 종래의 야생형 미생물과 비교하여 PGA 생산능이 우수한, 야생형 미생물이다. 또 본 발명의 미생물은, 글루탐산의 비존재하여도, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 의 고생산이 가능한 야생형 미생물이다.

또한 상기 미생물을 사용하는 본 발명의 PGA 의 생산 방법은, PGA 의 고생산을 가능하게 한다.

이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

본 발명의 미생물 중, 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01552 로 기탁되었다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01551 로 기탁되었다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01553 으로 기탁되었다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01554 로 기탁되었다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01555 로, 각각 기탁되었다.

이들 본 발명의 미생물은 모두 야생형 미생물이다. 또한, 이들 본 발명의 미생물은 모두, 분류학상 바실루스·리케니포르미스로 분류된다.

다음으로, 본 발명의 미생물이 갖는 16S rDNA 에 대해 설명한다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주는, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주는, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주는, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개 의 염기가 결실 (缺失), 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033 주는, 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033 주는, 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033 주는, 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주는, 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주는, 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주는, 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다.

바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주는, 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주는, 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다. 혹은 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주는, 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는다.

여기서 본 발명에 있어서, 염기 서열의 상동성은, 공개된 데이터베이스 NCIMB (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.gov/) 의 메뉴 "Nucleotide" 내의 "BLAST" 중에 있는 "Basic BLAST" 를 사용하여 산출할 수 있다. 혹은, Genetyx-Win (유전자 정보 처리 소프트웨어, 제네틱스사 제조) 의 호몰로지 해석 프로그램을 사용하여, Unit size (k-tuple) 를 6 으로 하여 해석을 실시함으로써 염기 서열의 상동성을 산출할 수도 있다.

또한, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열 사이에서, Genetyx-Win (유전자 정보 처리 소프트웨어, 제네틱스사 제조) 의 호몰로지 해석 프로그램에 의해 염기 서열의 상동성을 산출하였다. 그 결과, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열 사이에서, 상동성은 100 ％ 였다. 이 결과는, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 와, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 는, 실질적으로 동일한 16S rDNA 인 것을 나타내고 있다.

다음으로, 본 발명의 미생물의 균학적 성질에 대해 설명한다.

본 발명의 미생물은 각각, 하기 표 1 에 나타내는 균학적 성질을 갖는다.

표 1 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 미생물은 공통의 성질로서, 덜시톨 비자화성의 성질을 갖는다. 따라서, 본 발명의 미생물은, 균학적 성질로서 덜시톨 자화성을 갖지 않는 것이 바람직하다.

또한 표 1 에 나타내는 바와 같이, 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주와 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는, 표 1 에 기재된 균학적 성질에 대해 실질적으로 동일한 성질을 갖는다.

본 발명의 미생물은, 글루탐산의 비존재하, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지에서 배양하여 PGA 를 생산한다. 구체적으로는,탄소원으로 하여 함유 배양 조건에 따라 다르기도 하지만, 하기에 나타내는 조성의 7.5 ％ 글리세린-M 배지 또는 10 ％ 글리세린-M 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양했을 때, 배지 1 ℓ 당 1.2 g/4 일 이상, 바람직하게는 3.0 g/4 일 이상, 보다 바람직하게는 4.0 g/4 일 이상, 더욱 바람직하게는 6.0 g/4 일 이상의 PGA 의 생산능을 갖는 야생형 미생물이다.

이하에, 7.5 ％ 글리세린-M 배지 및 10 ％ 글리세린-M 배지를 하기 표 2 및 3 에 나타낸다.

본 발명의 미생물은, 배양 조건 따라 다르기도 하지만, 배지 중의 글리세린이 고농도로 존재하는 조건, 즉, 표준적인 기준주 (예를 들어, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주 등) 에서는 생육의 억제가 확인되는 환경에 있어서도, 생육이 잘 억제되지 않는다. 즉 본 발명의 미생물은, 글리세린 고농도 조건 하에 있어서, 기준주보다 생육도가 높은 것이 바람직하다.

구체적으로는, 글리세린 함유량이 15 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양한 경우, 기준주 (예를 들어, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주) 의 생육도를 100 ％ 로 했을 때의 본 발명의 미생물의 생육도는 115 ％ 이상, 바람직하게는 120 ％ 이상, 보다 바람직하게는 150 ％ 이상인 것이 바람직하다. 혹은, 글리세린 함유량이 20 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양한 경우, 기준주 (예를 들어, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주) 의 생육도를 100 ％ 로 했을 때의 본 발명의 미생물의 생육도는 120 ％ 이상, 바람직하게는 200 ％ 이상, 보다 바람직하게는 280 ％ 이상인 것이 바람직하다.

또, 글리세린 함유량이 15 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 본 발명의 미생물의 생육도가, 글리세린 함유량이 10 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 생육도의 85 ％ 이상, 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 바람직하게는 100 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 120 ％ 이상인 것이 바람직하다. 혹은, 글리세린 함유량이 20 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 본 발명의 미생물의 생육도가, 글리세린 함유량이 10 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 생육도의 30 ％ 이상, 바람직하게는 40 ％ 이상, 보다 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 55 ％ 이상, 특히 바람직하게는 70 ％ 이상인 것이 바람직하다.

또한, 본 명세서에 있어서「생육도」는, 배양 후의 배양액의 흡광도 (OD₆₀₀) 를 측정함으로써 상대적으로 산출할 수 있다.

본 발명의 미생물은, 통상적인 방법에 의해 단리, 취득하였다.

구체적으로는, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여, 글루탐산의 비존재하에서 배양하고, 다른 미생물과 비교하여 PGA 의 생산량이 높은 야생형 미생물을 선택하여, 단리, 취득하였다.

상기 서술한 바와 같이, 비특허문헌 6 에 기재되어 있는 바실루스·리케니포르미스 WBL-3 주는, 8.9 g/L/4 일이라는 높은 PGA 생산성을 갖는다. 그러나 바실루스·리케니포르미스 WBL-3 주는 야생형 미생물이 아니고 변이형의 미생물로서, 본 발명의 야생형 미생물은 바실루스·리케니포르미스 WBL-3 주와는 상이하다.

구체적으로 설명하면, 바실루스·리케니포르미스 WBL-3 주는 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주의 변이주로서, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주 에 대해 He-Ne 레이저 조사를 실시하고 있다.

본 발명의 PGA 의 생산 방법은, 상기 서술한 본 발명의 미생물을 사용하여 PGA 의 생산을 실시한다.

상기 서술한 바와 같이, 본 발명의 미생물은, 종래의 야생형 미생물과 비교하여 PGA 생산능이 우수하다. 따라서 본 발명의 PGA 의 생산 방법에 의하면 PGA 의 고생산이 가능하다.

또 본 발명의 미생물은, 글루탐산의 비존재하여도, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 PGA 의 고생산이 가능하다. 상기 서술한 바와 같이, 글루탐산은 식료의 원료로서 널리 사용되고 있다. 따라서 본 발명의 PGA 의 생산 방법에 의하면, 식량 생산과 경합하지 않고, 저비용으로의 PGA 의 고생산을 가능하게 한다.

본 발명의 미생물을 사용하여 PGA 를 생산할 때에는, 적절한 배지에 있어서 본 발명의 미생물을 배양하고, 균체 외에 생산된 PGA 를 배지로부터 회수한다.

배지로는, 글리세린, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스, 수크로오스, 전분 등의 당류를, PGA 를 생산하기 위한 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 또, 시트르산, 아세트산 등의 각종 유기산 또는 그 염, 그리고 글루탐산 또는 그 염 등을, PGA 를 생산하기 위한 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 PGA 의 생산 방법에 있어서, PGA 를 생산하기 위한 탄소원으로는, 상기 탄소원 중 1 종을 사용해도 되고, 2 종 이상을 조합하여 사용해도 된다. 본 발명의 PGA 의 생산 방법에 있어서, 글리세린을 탄소원으로서 함유하는 배지, 글루탐산을 함유하지 않고 글리세린을 유일한 탄소원으로 하는 배지, 글리세린을 주된 탄소원으로 하고, 유기산, 글루탐산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 보조적인 탄소원으로 하는 배지 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 여기서,「주된 탄소원」및「보조적인 탄소원」이란 배지 중의 각 탄소원의 함유량의 많고 적음을 나타내는 것이다.

본 발명의 PGA 의 생산 방법에서 사용하는 배지에는, 필요에 따라, 각종 대두 단백 등의 천연물, 아미노산, 폴리펩톤, 트립톤, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄이나 우레아 등의 질소원 등을 함유시켜도 된다. 또한, 본 발명의 PGA 의 생산 방법에서 사용하는 배지에는, 나트륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 등의 무기염류 및 그 밖에 필요한 영양원, 미량 금속염 등을 함유시켜도 된다. 또, 본 발명의 PGA 의 생산 방법에서 사용하는 배지는, 합성 배지여도 되고, 천연 배지여도 된다.

본 발명의 미생물은, 글루탐산의 비존재하여도 글리세린을 탄소원으로서 PGA 의 고생산이 가능하다. 따라서, 글루탐산을 함유하지 않고 글리세린을 탄소원으로서 함유하는 배지, 또는 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지에서 본 발명의 미생물을 배양하여 PGA 를 생산하는 것이, 생산 코스트의 관점에서 바람직하다.

PGA 의 생산에 사용하는 글리세린은, 시판품이어도 되고, 바이오 연료 등의 제조시에 부산물로서 발생하는 글리세린이어도 된다. 부산물로서 발생하는 글리세린을 사용함으로써, 잉여 물질 처리에 관련된 에너지 저감, 폐기에 의한 환경오염의 저감과 같은 부차적인 효과가 얻어져, 환경 부하의 저감으로도 연결된다. 또한, 부산물로서 발생하는 글리세린은 염가로 구입할 수 있으므로, 생산 코스트의 관점에서도 바람직하다.

본 발명의 PGA 의 생산 방법에 있어서, PGA 를 생산하기 위한 탄소원으로서 글리세린을 사용하는 경우, 배지 중의 글리세린 함유량은, 사용하는 미생물 종에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 1 ％ (w/v) 이상이 바람직하고, 5 ％ (w/v) 이상이 보다 바람직하고, 10 ％ (w/v) 이상이 보다 더 바람직하고, 30 ％ (w/v) 이하가 바람직하고, 20 ％ (w/v) 이하가 보다 바람직하다.

상기 미생물의 배양 조건은, 사용하는 미생물 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 지적 (至適) 온도는, 바람직하게는 20 ℃ 이상 (바람직하게는 25 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 30 ℃ 이상), 50 ℃ 이하 (바람직하게는 45 ℃ 이하, 보다 바람직하게는 40 ℃ 이하) 이다. 지적 pH 는, 바람직하게는 5 이상 (바람직하게는 5.5 이상, 보다 바람직하게는 6.5 이상), 8 이하 (바람직하게는 7.5 이하, 보다 바람직하게는 7 이하) 이다. 또, 배양일수는, 종균 접종 후, 1 일 이상 (바람직하게는 3 일 이상, 보다 바람직하게는 4 일 이상) 이다. 배양 방법에 특별히 제한은 없지만, 진탕 배양, 교반 배양, 통기 배양, 정치 (靜置) 배양 등을 들 수 있다.

배지 중에 축적된 PGA 를 회수할 때에는, PGA 를 생산시킨 미생물 균체를 제거할 필요가 있다. 균체를 제거하는 방법으로는, 원심 분리에 의한 방법, 정밀 여과나 한외 여과막을 사용하는 방법, 전기 투석법, pH 를 PGA 의 등전점 부근으로 유지함으로써 침전으로서 회수하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 상기 방법을 적절히 조합하여 사용하는 것도 가능하다.

또, 배지로부터의 PGA 의 회수 방법에 대해서도 특별히 제한은 없고, 생산된 물질을 단리, 회수할 때에 통상적으로 사용되는 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 클로로포름/메탄올 추출법, 헥산 추출법, 에탄올 추출법 등에 의해 목적의 PGA 를 단리, 회수할 수 있다.

본 발명에 의해 생산된 PGA 는, 화장품, 의약품, 식품, 수질 정화제, 보수 재료, 증점제 등의 여러 가지 용도에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 미생물의 PGA 의 생산성은 다른 미생물과 비교하여 우수하기 때문에, PGA 의 생산 코스트를 대폭 저감시킬 수 있다.

상기 서술한 실시형태에 관하여, 본 발명은 추가로 이하 미생물, 및 PGA 의 생산 방법을 개시한다.

＜1＞ 수탁 번호 NITE BP-01552, NITE BP-01551, NITE BP-01553, NITE BP-01554, 또는 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물.

＜2＞ 수탁 번호 NITE BP-01552 로 특정되는 미생물이, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열, 또는 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 혹은 서열 번호 7 에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,

수탁 번호 NITE BP-01551 로 특정되는 미생물이, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열, 또는 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 혹은 서열 번호 8 에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,

수탁 번호 NITE BP-01553 으로 특정되는 미생물이, 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열, 또는 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 혹은 서열 번호 9 에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,

수탁 번호 NITE BP-01554 로 특정되는 미생물이, 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열, 또는 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 혹은 서열 번호 10 에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,

수탁 번호 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물이, 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열, 또는 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열과 99.5 ％ 이상, 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 혹은 서열 번호 11 에 있어서 1 ∼ 14 개, 바람직하게는 1 ∼ 7 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는,

상기 ＜1＞ 항에 기재된 미생물.

＜3＞ 수탁 번호 NITE BP-01552 로 특정되는 미생물이 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고, 수탁 번호 NITE BP-01551 로 특정되는 미생물이 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고, 수탁 번호 NITE BP-01553 으로 특정되는 미생물이 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고, 수탁 번호 NITE BP-01554 로 특정되는 미생물이 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고, 수탁 번호 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물이 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는, 상기 ＜1＞ 또는 ＜2＞ 항에 기재된 미생물.

＜4＞ 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 와, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 가, 실질적으로 동일한 16S rDNA 인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜3＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜5＞ 상기 미생물이 바실루스·리케니포르미스인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜4＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜6＞ 상기 미생물이 야생형 미생물인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜5＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜7＞ 상기 미생물이 각각 상기 표 1 에 기재된 균학적 성질을 갖는, 상기 ＜1＞ ∼ ＜6＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜8＞ 상기 미생물이 각각 덜시톨 비자화성의 성질을 갖는, 상기 ＜1＞ ∼ ＜7＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜9＞ 수탁 번호 NITE BP-01552 로 특정되는 미생물과 수탁 번호 NITE BP-01551 로 특정되는 미생물이 서로, 상기 표 1 에 기재된 균학적 성질에 대해 실질적으로 동일한 성질을 갖는, 상기 ＜1＞ ∼ ＜8＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜10＞ 상기 미생물이, 글루탐산의 비존재하, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지에서 배양하여 PGA 를 생산하는, 상기 ＜1＞ ∼ ＜9＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜11＞ 상기 7.5 ％ 글리세린-M 배지 또는 10 ％ 글리세린-M 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양했을 때, 배지 1 ℓ 당의 상기 미생물의 PGA 의 생산능이 1.2 g/4 일 이상, 바람직하게는 3.0 g/4 일 이상, 보다 바람직하게는 4.0 g/4 일 이상, 더욱 바람직하게는 6.0 g/4 일 이상인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜10＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜12＞ 글리세린 함유량이 15 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양한 경우, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주의 생육도를 100 ％ 로 했을 때의 상기 미생물의 생육도가 115 ％ 이상, 바람직하게는 120 ％ 이상, 보다 바람직하게는 150 ％ 이상인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜11＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜13＞ 글리세린 함유량이 20 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양한 경우, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주의 생육도를 100 ％ 로 했을 때의 상기 미생물의 생육도가 120 ％ 이상, 바람직하게는 200 ％ 이상, 보다 바람직하게는 280 ％ 이상인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜12＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜14＞ 글리세린 함유량이 15 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 상기 미생물의 생육도가, 글리세린 함유량이 10 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 생육도의 85 ％ 이상, 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 바람직하게는 100 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 120 ％ 이상인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜13＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜15＞ 글리세린 함유량이 20 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 상기 미생물의 생육도가, 글리세린 함유량이 10 ％ (w/v) 인 배지를 사용하여 배양했을 때의 생육도의 30 ％ 이상, 바람직하게는 40 ％ 이상, 보다 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 55 ％ 이상, 특히 바람직하게는 70 ％ 이상인, 상기 ＜1＞ ∼ ＜14＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜16＞ 수탁 번호 NITE BP-01552 또는 NITE BP-01551 로 특정되는, 상기 ＜1＞ ∼ ＜15＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물.

＜17＞ 상기 ＜1＞ ∼ ＜16＞ 중 어느 한 항에 기재된 미생물을 배양하여 PGA 를 생산하는, PGA 의 생산 방법.

＜18＞ 글리세린을 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양하는, 상기 ＜17＞ 항에 기재된 PGA 의 생산 방법.

＜19＞ 글리세린을 주된 탄소원으로 하고, 유기산, 글루탐산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 보조적인 탄소원으로 하는 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양하는, 상기 ＜17＞ 또는 ＜18＞ 항에 기재된 PGA 의 생산 방법.

＜20＞ 글루탐산을 함유하지 않고, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양하는, 상기 ＜17＞ 또는 ＜18＞ 항에 기재된 PGA 의 생산 방법.

＜21＞ PGA 를 생산하기 위한 배지 중의 탄소원으로서 글리세린을 사용하는 경우, 배지 중의 글리세린 함유량이 1 ％ (w/v) 이상, 바람직하게는 5 ％ (w/v) 이상, 보다 바람직하게는 10 ％ (w/v) 이상, 바람직하게는 30 ％ (w/v) 이하, 보다 바람직하게는 20 ％ (w/v) 이하인, 상기 ＜18＞ ∼ ＜20＞ 중 어느 한 항에 기재된 PGA 의 생산 방법.

＜22＞ 배지에 함유되는 상기 글리세린이, 바이오 연료 등의 제조시에 부산물로서 발생하는 글리세린인, 상기 ＜18＞ ∼ ＜21＞ 중 어느 한 항에 기재된 PGA 의 생산 방법.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다. 또, 제조원을 기재하지 않는 시약에는, 일반적으로 입수 가능한 시약을 사용할 수 있다.

시험예 1 미생물의 취득

미리 멸균한 4.0 ㎖ 의 0.85 ％ (w/v) 염화나트륨 수용액에 일본 각지에서 수집한 토양 시료 및 식품 시료를 첨가하고, 교반, 혼합한 후, 80 ℃ 에서 30 분간 가열 처리를 실시하여, 시료 원액을 조제하였다. 이 시료 원액을, 동일한 염화나트륨 수용액을 사용하여, 10^-2 배, 10^-4 배로 희석한 시료 희석액을 조제하였다. 계속해서, LB 한천 배지 (배지 조성 : 1.0 ％ (w/v) Bacto trypton (Becton, Dickinson and Company), 0.5 ％ (w/v) Yeast extract (Becton, Dickinson and Company), 1.0 ％ (w/v) 염화나트륨, 1.5 ％ (w/v) 한천) 및 Margaritis 한천 배지 (배지 조성 : 3.82 ％ (w/v) 글루탐산나트륨 1 수화물, 1.0 ％ (w/v) 황산암모늄, 3.06 ％ (w/v) 시트르산3나트륨 2 수화물, 2.0 ％ (w/v) 글리세롤, 0.05 ％ (w/v) 황산마그네슘 7 수화물, 0.005 ％ (w/v) 염화철 6 수화물, 0.02 ％ (w/v) 염화칼슘 7 수화물, 0.003 ％ (w/v) 황산망간 4-5 수화물, 0.1 ％ (w/v) 인산수소2칼륨, 0.1 ％ (w/v) 인산수소2나트륨 12 수화물, 0.00005 ％ (w/v) 비오틴, 0.01 ％ (w/v) L-트립토판, 1.5 ％ (w/v) 한천) 에, 상기 시료 원액 및 시료 희석액을 200 ㎕ 씩 도말 (塗抹) 한 후, 30 ℃ 에서 2 ∼ 4 일간 배양하였다. 항온에서 배양한 후, 한천 배지 상에 출현한 콜로니를 선발하였다. 또한, 균주 순화를 위하여, 선발한 콜로니를 토양 시료 및 식품 시료의 도말에 사용한 동 조성의 한천 배지에 백금이 (白金耳) 로 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 2 ∼ 4 일간 배양하였다. 한천 배지 상에서 단일 콜로니로서 생육한 균체를 백금이로 채취하고, 이들을 20 ％ (w/v) 의 글리세롤을 함유하는 LB 배지 (배지 조성 : 1.0 ％ (w/v) Bacto trypton (Becton, Dickinson and Company), 0.5 ％ (w/v) Yeast extract (Becton, Dickinson and Company), 1.0 ％ (w/v) 염화나트륨) 에 현탁한 후, －80 ℃ 에서 동결 보존하였다.

실시예 1

시험예 1 에서 선발한 미생물의 －80 ℃ 보존 시료를 LB 한천 배지 상에 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 얻어진 단일 콜로니를 비특허문헌 2 에 기재된 GB 배지 (배지 조성 : 1.0 ％ (w/v) 쿄쿠토 펩톤 (교쿠토 제약 공업), 1.0 ％ (w/v) 프리미디어 보통 부용 배지 (교쿠토 제약 공업), 0.5 ％ (w/v) 염화나트륨 (와코 순약 공업), pH 7.0 으로 조정) 5 ㎖ 에 접종하고, 30 ℃, 250 rpm 으로 18 ∼ 24 시간 진탕 배양을 실시하였다. 또한 7.5 ％ 글리세린-M 배지 (배지 조성 : 7.5 ％ (w/v) 글리세롤, 1.8 ％ (w/v) 염화암모늄, 0.15 ％ (w/v) 인산수소2칼륨, 0.035 ％ (w/v) 황산마그네슘 7 수화물, 0.005 ％ (w/v) 황산망간 5 수화물, 3.0 ％ (w/v) 탄산칼슘) 30 ㎖ 에 상기 배양액 0.6 ㎖ (2 ％ (v/v)) 를 접종하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 4 일간, 진탕 배양을 실시하였다. 그 후, 각 균주의 PGA 생산성을 측정하였다.

각 균주의 PGA 생산성의 결과를 표 4 에 나타낸다.

표 4 에 나타내는 바와 같이, 비특허문헌 2 와 동일한 실험 조건 하에서 배양을 실시한 결과, 공지된 바실루스·서브틸리스 TAM-4 주와 비교하여, 본 발명의 미생물은 높은 PGA 생산성을 나타내는 것을 확인하였다.

또, 공지된 균주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 기준주에 있어서도, 비특허문헌 5 에 기재된 내용에 반하여, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 글루탐산 비의존적으로 PGA 생산하는 것을 새롭게 확인하였다.

실시예 2

시험예 1 에서 선발한 다른 미생물을 포함하여, 하기 표 5 에 나타내는 미생물을, LB 한천 배지 상에 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 얻어진 단일 콜로니를 LB 배지 5 ㎖ 에 접종하고, 30 ℃, 250 rpm 으로 18 ∼ 24 시간 진탕 배양을 실시하였다. 또한 7.5 ％ 글리세린-M 배지 30 ㎖ 에 상기 배양액 0.6 ㎖ (2 ％ (v/v)) 를 접종하고, 37 ℃, 210 rpm 으로 4 일간, 진탕 배양을 실시하였다. 그 후, 각 균주의 PGA 생산성을 측정하였다.

각 균주의 PGA 생산성의 결과를 표 5 에 나타낸다.

표 5 에 나타내는 바와 같이, 비특허문헌 2 의 실험 조건에 대해 종 배지 조성의 변경, 및 배양 조건의 변경에 의해, 본 발명의 미생물은 보다 높은 PGA 생산성을 나타내는 것을 확인하였다.

또, 배양 조건을 지적화함으로써, 공지 균주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 기준주와 비교하여, 본 발명의 미생물은, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 글루탐산 비의존적으로 효율이 양호한 PGA 의 생산이 가능한 것을 확인하였다.

실시예 3

시험예 1 에서 선발한 미생물을 LB 한천 배지 상에 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 얻어진 단일 콜로니를 LB 배지 5 ㎖ 와 10 ％ 글리세린-M 배지 (배지 조성 : 10 ％ (w/v) 글리세린, 1.8 ％ (w/v) 염화암모늄, 0.15 ％ (w/v) 인산수소2칼륨, 0.035 ％ (w/v) 황산마그네슘 7 수화물, 0.005 ％ (w/v) 황산망간 5 수화물, 3 ％ (w/v) 탄산칼슘) 의 혼합 배지 (LB 배지 : M 배지 ＝ 2 : 8, 이하「LM 배지」라고 한다) 에 접종하고, 30 ℃, 250 rpm 으로 18 ∼ 24 시간 진탕 배양을 실시하였다. 또한 이 배양액을 OD₆₀₀ 이 약 0.1 이 되도록, 상기 배양액을 10 ％ 글리세린-M 배지 30 ㎖ 에 접종하고, 30 ℃, 210 rpm 으로 5 일간, 진탕 배양을 실시하였다. 그 후, 각 균주의 PGA 생산성을 측정하였다.

각 균주의 PGA 생산성의 결과를 표 6 에 나타낸다.

표 6 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 미생물, 특히 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주는, 글리세린 농도 등의 배양 조건을 최적화함으로써 더욱 높은 PGA 생산성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4

시험예 1 에서 선발한 미생물을 LB 한천 배지 상에 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 얻어진 단일 콜로니를 LB 배지 5 ㎖ 에 접종하고, 30 ℃, 250 rpm 으로 18 ∼ 24 시간 진탕 배양을 실시하였다. 또한 GC-E 배지 (배지 조성 : 8 ％ (w/v) 글리세린, 1.84 ％ (w/v) 시트르산3나트륨 2 수화물, 0.7 ％ (w/v) 염화암모늄, 0.05 ％ (w/v) 인산수소2칼륨, 0.05 ％ (w/v) 황산마그네슘 7 수화물, 0.0148 ％ (w/v) 황산망간 5 수화물, 0.015 ％ (w/v) 염화칼슘 2 수화물, 0.00017 ％ (w/v) 황산아연 7 수화물, 0.000043 ％ (w/v) 황산구리 1 수화물, 0.000006 ％ (w/v) 염화코발트 6 수화물, 0.00073 ％ (w/v) 염화칼슘 7 수화물, 0.000006 ％ (w/v) 몰리브덴산나트륨 2 수화물) 30 ㎖ 에 상기 배양액 0.6 ㎖ (2 ％ (v/v)) 를 접종하고, 37 ℃, 210 rpm 으로 4 일간, 진탕 배양을 실시하였다. 그 후, 각 균주의 PGA 생산성을 측정하였다.

각 균주의 PGA 생산성의 결과를 표 7 에 나타낸다.

표 7 에 나타내는 바와 같이, 글리세린을 주된 탄소원으로 하고, 유기산을 보조적인 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 본 발명의 미생물을 배양한 경우 에 있어서도, 본 발명의 미생물은 PGA 의 고생산이 가능하였다.

실시예 5

시험예 1 에서 선발한 미생물을 LB 한천 배지 상에 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 얻어진 단일 콜로니를 LB 배지 5 ㎖ 에 접종하고, 30 ℃, 250 rpm 으로 18 ∼ 24 시간 진탕 배양을 실시하였다. 또한 GCM-E 배지 (배지 조성 : 8 ％ (w/v) 글리세린, 1.84 ％ (w/v) 시트르산3나트륨 2 수화물, 2.54 ％ (w/v) 글루탐산나트륨 1 수화물, 0.7 ％ (w/v) 염화암모늄, 0.05 ％ (w/v) 인산수소2칼륨, 0.05 ％ (w/v) 황산마그네슘 7 수화물, 0.0148 ％ (w/v) 황산망간 5 수화물, 0.015 ％ (w/v) 염화칼슘 2 수화물, 0.00017 ％ (w/v) 황산아연 7 수화물, 0.000043 ％ (w/v) 황산구리 1 수화물, 0.000006 ％ (w/v) 염화코발트 6 수화물, 0.00073 ％ (w/v) 염화칼슘 7 수화물, 0.000006 ％ (w/v) 몰리브덴산나트륨 2 수화물) 30 ㎖ 에 상기 배양액 0.6 ㎖ (2 ％ (v/v)) 를 접종하고, 37 ℃, 210 rpm 으로 4 일간, 진탕 배양을 실시하였다. 그 후, 각 균주의 PGA 생산성을 측정하였다.

각 균주의 PGA 생산성의 결과를 표 8 에 나타낸다.

표 8 에 나타내는 바와 같이, 글리세린을 주된 탄소원으로 하고, 유기산 및 글루탐산을 보조적인 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 본 발명의 미생물을 배양한 경우에 있어서도, 본 발명의 미생물은 PGA 의 고생산이 가능하였다.

시험예 2 미생물의 생육도의 측정

시험예 1 에서 선발한 미생물을 LB 한천 배지 상에 획선 도말하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하였다. 얻어진 단일 콜로니를 LB 배지 5 ㎖ 에 접종하고, 30 ℃, 250 rpm 으로 18 ∼ 24 시간 진탕 배양을 실시하였다. 또한 10 ％, 15 ％, 20 ％ 의 글리세린을 함유하는 M/MOPS 배지 (배지 조성 : 10.0 ∼ 20.0 ％ (w/v) 글리세린, 1.8 ％ (w/v) 염화암모늄, 0.15 ％ (w/v) 인산수소2칼륨, 0.035 ％ (w/v) 황산마그네슘 7 수화물, 0.005 ％ (w/v) 황산망간 5 수화물, 100 mM MOPS 완충액 (모르폴리노프로판술폰산, pH 7.0)) 5 ㎖ 에 상기 배양액 0.05 ㎖ (1 ％ (v/v)) 를 접종하고, 37 ℃, 250 rpm 으로 4 일간, 진탕 배양을 실시하였다.

기준주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주를 10 ％ 글리세린-M/MOPS 배지에서 배양한 경우의 생육도 (OD₆₀₀) 를 100 으로 하고, 각 균주의 생육도를 상대치로 측정하였다. 그 결과를 표 9 에 나타냈다. 또, 각 글리세린 농도 에 있어서의 상기 기준주의 생육도를 100 으로 하고, 15 ％ 및 20 ％ 글리세린 농도 각각에 있어서의 생육도의 상대치로 측정하였다. 그 결과를 표 9 의 괄호 내에 나타냈다.

표 9 에 나타내는 바와 같이, 기준주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주는, 고농도 글리세린 조건에서는 생육도가 크게 저하되었다. 이에 반하여, 본 발명의 미생물은 고농도 글리세린 조건에 있어서의 생육도의 저하가 적었다.

또한, 본 발명의 미생물에 있어서, 글리세린 15 ％ 에 있어서의 생육도가 글리세린 10 ％ 에 있어서의 생육도의 90 ％ 이상이거나, 혹은 90 ％ 이하여도, 글리세린 20 ％ 에 있어서의 생육도가 글리세린 10 ％ 에 있어서의 생육도의 50 ％ 이상인 것이 특징적이었다. 즉 이들의 성질은, 글루탐산의 비존재하여도 글리세린을 유일한 탄소원으로서 높은 PGA 생산성을 나타내는 주의 공통된 특징일 가능성이 시사되었다.

또, 기준주의 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주와 비교하여, 글리세린 농도 10 ％ ∼ 20 ％ 를 함유하는 배지에 있어서의 본 발명의 미생물의 생육도가 높은 것이 공통된 특징일 가능성이 시사되었다. 구체적으로는, 글리세린 농도 10 ％ ∼ 20 ％ 를 함유하는 배지에 있어서의 본 발명의 미생물의 생육도가 기준주와 비교하여 109 ％ 이상인 것이 특징이었다.

시험예 3 균학적 제 (諸) 성질

상기 바실루스·리케니포르미스의 각 균주 (KSM-PG121 주, KSM-PG115 주, KSM-FFA033 주, KSM-FFA036 주, 및 KSM-FFA039 주) 의 균학적 성질의 검토를 실시하였다. 그 결과를 표 10 에 나타낸다.

당으로부터의 산 및 가스의 생성에 관하여, 특정의 당류에 대한 자화성이, 시험예 1 에서 선발한 균주와 공지 균주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 기준주 사이에서 상이한 것이 확인되었다.

구체적으로는, 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주 및 KSM-PG121 주는, L-소르보스, L-람노오스, 덜시톨, D-멜리비오스, 이눌린, D-라피노오스 및 글루콘산에 대한 자화성을 갖지 않아, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 기준주와 상이하다.

또, 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033, KSM-FFA036 및 KSM-FFA039 주는, 덜시톨, N-아세틸글루코사민 및 D-락토오스에 대한 자화성을 갖지 않아, 기준주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주와 상이하다.

또, 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주는, D-멜리비오스 및 D-투라노오스에 대한 자화성을 갖지 않아, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 기준주와 상이하다.

또한, 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주는, L-소르보스 및 겐티오비오스에 대한 자화성을 갖지 않아, 기준주인 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 주와 상이하다.

표 10 에 나타내는 바와 같이, 바실루스·리케니포르미스 ATCC9945a 기준주는 덜시톨 자화성을 갖는다. 이에 반하여, 시험예 1 에서 선발한 균주는, 공통적으로 덜시톨 자화성을 갖지 않고, 글루탐산의 비존재하여도 글리세린을 유일한 탄소원으로서 높은 PGA 생산성을 나타내는 주의 공통된 특징일 가능성이 시사되었다.

또한 표 10 에 나타내는 바와 같이, 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주와 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는, 표 10 에 나타내는 균학적 성질에 대해 실질적으로 동일한 성질을 갖는다. 이들의 균학적 성질은, 글루탐산을 함유하지 않고 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 배양한 경우, 특히 높은 PGA 생산성을 나타내는 바실루스·리케니포르미스의 특징일 가능성이 시사되었다.

시험예 4 각 균주의 16S rDNA 염기 서열의 해석

상기 바실루스·리케니포르미스의 각 균주 (KSM-PG115 주, KSM-PG121 주, KSM-FFA033 주, KSM-FFA036 주, 및 KSM-FFA039 주) 에 대해, 16S rDNA 염기 서열에 의한 균학적 동정을 실시하였다.

동결 보존 균체를 1 mM TE 버퍼 (pH 8.0) 에서 30 배 희석한 것을 PCR 반응의 주형으로 하고, 표 11 에 나타내는 염기 서열의 프라이머 27f 및 1525r 을 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 16S rDNA 영역의 전체 길이 DNA 단편을 증폭하였다. DNA 폴리메라아제는, TaKaRa LA Taq (다카라 바이오) 를 사용하였다. PCR 반응 조건은, 95 ℃ 에서 5 분간, 주형 DNA 를 변성시킨 후, 95 ℃ 에서 1 분간, 55 ℃ 에서 30 초간, 72 ℃ 에서 2 분간을 1 사이클로 하여 30 사이클 실시하고, 또한 72 ℃ 에서 2 분간 항온하였다. 얻어진 16S rDNA 영역 약 1.5 kb 의 DNA 단편에 대해, 표 11 에 나타내는 염기 서열의 프라이머 27f, f2L(-), 926f, rE1L, r2L', 및 1525r 을 각각 시퀀스용 프라이머로서 사용하여, DNA 염기 서열의 해석을 실시하였다. 또한, 시퀀스 해석 시료의 조제에는, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) 를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라 시료 조제를 실시하였다. 해석 전의 시료 정제에는, Montage SEQ96 Sequencing Reaction Cleanp kit (Merck Millipore) 를 사용하였다.

조제한 시퀀스 시료는, DNA 시퀀서 (상품명 : ABI 3130 xl Genetic Analyzer, Life Technologies) 를 사용하여 서열 해석을 실시하여, 염기 서열을 결정하였다. 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주의 16S rDNA 의 염기 서열을 서열 번호 7 에 나타낸다. 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주의 16S rDNA 의 염기 서열을 서열 번호 8 에 나타낸다. 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033 주의 16S rDNA 의 염기 서열을 서열 번호 9 에 나타낸다. 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주의 16S rDNA 의 염기 서열을 서열 번호 10 에 나타낸다. 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주의 16S rDNA 의 염기 서열을 서열 번호 11 에 나타낸다.

얻어진 각 염기 서열을 Genetyx-Win (유전자 정보 처리 소프트웨어, 제네틱스사 제조) 을 사용하여 1 단편화 (斷片化) 하였다. 또한, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열 사이에서, Genetyx-Win (유전자 정보 처리 소프트웨어, 제네틱스사 제조) 의 호몰로지 해석 프로그램을 사용하여 염기 서열의 상동성을 산출하였다. 그 결과, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열 사이에서, 상동성은 100 ％ 였다. 이 결과로부터 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 와, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 는, 실질적으로 동일한 16S rDNA 이고, KSM-PG121 주 및 KSM-PG115 주는 동일한 16S rDNA 를 갖는 것이 확인되었다.

서열의 상동성 검색은, 공개 데이터베이스 NCIMB (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.gov/) 의 메뉴 "Nucleotide" 내의 "BLAST" 중에 있는 "Basic BLAST" 를 사용하여, BLAST 프로그램으로부터"nucleotide blast" 를 선택하였다. 검색 대상의 데이터베이스에 "Reference genomic sequences (refseq_genomics), 선택 프로그램에 "Highly similar sequences (megablast)" 를 지정하고, 각 염기 서열의 상동성 검색 결과를 기초로 근연종의 추정을 실시하였다. 그 결과를 표 12 에 나타낸다.

16S rDNA 염기 서열 해석의 결과, 상기 균주의 전부가 바실루스·리케니포르미스 ATCC14580 주와 가장 상동성이 높은 16S rDNA 의 염기 서열을 갖고 있는 것이 분명해졌다.

따라서, 상기 균주는 균학적 성질과 아울러, 바실루스·리케니포르미스에 유연의 안전성이 높은 미생물주인 것으로 판단하였다.

또한, 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG121 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01552 로 기탁되었다. 또, 바실루스·리케니포르미스 KSM-PG115 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01551 로 기탁되었다. 또, 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA033 주는, 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01553 으로 기탁되었다. 또, 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA036 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01554 로 기탁되었다. 또, 바실루스·리케니포르미스 KSM-FFA039 주는 2013년 2월 28일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 에 수탁 번호 NITE BP-01555 로 기탁되었다.

시험예 5 배양액 상청 시료 중의 고분자 물질의 동정

배양 종료 후의 배양액 시료를, 실온에서 14,800 rpm 으로 30 분간의 원심 분리 (기종명 : himacCF15RX, 히타치 공기) 에 제공하고, 얻어진 원심 분리 후의 시료 상청 중에 함유되는 고분자 물질에 대해 동정을 실시하였다.

분석 대상이 되는 상청 시료 0.5 ∼ 1.0 ㎖ 를 스크루 캡이 부착된 시험관 (상품명 : ST-15S, 닛폰 전자 이화 유리) 에 채취하고, 이 상청 시료에 대해 2 배 용량의 에탄올을 새로 첨가하였다. 터치 믹서로 교반, 혼합한 시료를 4 ℃ 에서 하룻밤 항온 방치하였다. 그 후, 4 ℃, 3,000 rpm 으로 30 분간의 원심 분리 (기종명 : himacCF7D2, 히타치 공기) 에 제공하고, 침전 획분을 회수하였다. 계속해서, 침전 획분을 0.5 ㎖ 의 1 ％ NaCl 용액에 재차 용해시키고, 2 배 용량의 에탄올을 첨가하고, 생성된 침전 획분을 상기 동일한 원심 분리 조건으로 회수하였다. 회수한 침전 생성물은 원심 이배퍼레이터 (기종명 : CVE-200D, EYELA) 로 건고 (乾固) 시키고, 회수한 고형분의 중량을 측정하였다. 이 건고 시료를 증류수 0.5 ㎖ 로 재차 용해시키고, 이것에 0.5 ㎖ 의 농염산을 첨가하고 교반 후, 질소 봉입하여, 105 ∼ 110 ℃ 에서 16 시간 가열 처리를 실시하였다. 가열 처리 후, 드래프트 내에서 질소 기류하에서 염산 및 수분을 증류 제거하고 (약 6 시간), 얻어진 건고물을 가수 분해 시료로 하였다.

또한, PGA 표품으로서 시판 PGA (분자량 880 k, 메이지 푸드 마테리아), 가수 분해 시료의 대조로서 L-Glutamic acid 및 D-Glutamic acid (와코 순약 공업사 제조) 를 사용하였다.

계속해서, 얻어진 가수 분해 시료를 적절히 희석하여, 전자동 아미노산 분석 장치 (기종명 : L-8900, 히타치 하이테크놀로지스) 로 시료 중의 각종 아미노산 분석, 및 글루탐산의 정량을 실시하였다. 또, L-글루탐산 측정 키트 (야마사 간장) 를 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 기재된 방법에 준하여 L-글루탐산량의 측정을 실시하였다. 전자동 아미노산 분석 장치에 의한 측정에서는, 광학 활성 이성체 (D/L) 의 총량을 정량 결과로서 얻었다. 이것으로부터 L-글루탐산 측정 키트에서 얻어진 정량 결과를 뺀 차분을 D-글루탐산량으로 하였다. 이들의 결과를 표 13 에 나타낸다.

상기 방법에 의해, 글루탐산 이외의 아미노산은 거의 검출되지 않은 점에서, 배양 상청 중 고분자 물질을 PGA 로 판단하였다.

또한, 바실루스·리케니포르미스의 각 균주 (KSM-PG115 주, KSM-PG121 주, KSM-FFA033 주, KSM-FFA036 주, 및 KSM-FFA039 주) 가 생산한 PGA 의 D : L 비는, 지금까지 보고되어 있는, 바실루스·리케니포르미스가 생산한 PGA 의 D : L 비와 가까운 값이었다.

시험예 6 PGA 의 정량법

실시예 1 ∼ 5 에서 조제한 PGA 의 정량은, 하기에 나타내는 방법에 의해 실시하였다.

실시예 1 ∼ 5 에서 실시한 평가 배양의 배양액 시료를, 실온에서 14,800 rpm 으로 30 분간의 원심 분리 (기종명 : himacCF15RX, 히타치 공기) 에 제공하고, 배양액 상청 시료를 조제하였다. 이 상청 시료를 0.1 M 황산나트륨으로 적절히 희석하고, MULTI SCREEN MNHV45 (MILLIPORE 제조, 0.45 ㎛ 듀라포어막) 를 사용하여 불용물을 제거하기 위한 전처리를 실시하였다. 이 조제 시료를 HPLC 분석 시료로 하여, 겔 여과 칼럼을 사용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 실시하였다. 분석 칼럼에는, TSKGel G4000PWXL 및 TSKGel G6000PWXL (상품명, 토소) 을 사용하였다. 용리액은, 0.1 M 황산나트륨을 사용하고, 유속을 1.0 ㎖/분, 칼럼 온도를 50 ℃, UV 검출 파장을 210 ㎚ 로 하였다. 또한, 농도 검정에는, 분자량 88 만의 PGA (메이지 푸드 마테리아) 를 사용하여 작성한 검량선을 사용하였다.

본 발명을 그 실시양태와 함께 설명했지만, 우리들은 특별히 지정하지 않는 한 우리들의 발명을 설명의 어느 세부에 있어서도 한정하고자 하는 것이 아니며, 첨부된 청구의 범위에 나타낸 발명의 정신과 범위에 반하는 일 없이 폭넓게 해석되는 것이 당연한 것으로 생각한다.

본원은, 2013년 9월 3일에 일본에서 특허 출원된 일본 특허출원 2013-182367호, 및 2014년 8월 27일에 일본에서 특허 출원된 일본 특허출원 2014-172346호에 기초하는 우선권을 주장하는 것으로서, 이들은 여기에 참조하여 그 내용을 본 명세서의 기재된 일부로서 받아들인다.

독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 NITEBP-01552 20130228 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 NITEBP-01551 20130228 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 NITEBP-01553 20130228 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 NITEBP-01554 20130228 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 NITEBP-01555 20130228

SEQUENCE LISTING <110> Kao Corporation <120> Method for producing poly-gamma-gultamic acid <130> P14-0390WO00 <150> JP 2013-182367 <151> 2013-09-03 <150> JP 2014-172346 <151> 2014-08-27 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying the 16S rDNA region, primer 27f <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying the 16S rDNA region, primer 1525r <400> 2 aaaggaggtg atccagcc 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for sequencing the nucleotide sequence of the 16S rDNA region, primer rE1L <400> 3 gtaggagtct ggaccgtgt 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for sequencing the nucleotide sequence of the 16S rDNA region, primer f2L(-) <400> 4 ccagcagccg cggtaata 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for sequencing the nucleotide sequence of the 16S rDNA region, primer 926f <400> 5 aaactcaaag gaattgacgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for sequencing the nucleotide sequence of the 16S rDNA region, primer r2L' <400> 6 gactaccagg gtatctaatc 20 <210> 7 <211> 1458 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 7 gacgggagct tgctccctta ggtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 60 ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatgcttg attgaaccgc 120 atggttcaat cataaaaggt ggcttttagc taccacttrc agatggaccc gcggcgcatt 180 agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg 240 atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat 300 cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga 360 tcgtaaaact ctgttgttag ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg yaccttgacg 420 gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 480 caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg 540 tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag 600 aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg 660 gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca 720 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc 780 cgccctttag tgctgcagca aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 840 ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900 aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaaccctag agatagggct 960 tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg 1080 cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1140 tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaagc 1200 cgcgaggcta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga 1260 ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1320 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg 1380 taaccttttg gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag tcgtaacaag 1440 gtagccgtat cggaaggt 1458 <210> 8 <211> 1458 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 8 gacgggagct tgctccctta ggtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 60 ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatgcttg attgaaccgc 120 atggttcaat cataaaaggt ggcttttagc taccacttrc agatggaccc gcggcgcatt 180 agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg 240 atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat 300 cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga 360 tcgtaaaact ctgttgttag ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg yaccttgacg 420 gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 480 caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg 540 tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag 600 aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg 660 gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca 720 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc 780 cgccctttag tgctgcagca aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 840 ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900 aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaaccctag agatagggct 960 tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg 1080 cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1140 tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaagc 1200 cgcgaggcta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga 1260 ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1320 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg 1380 taaccttttg gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag tcgtaacaag 1440 gtagccgtat cggaaggt 1458 <210> 9 <211> 1437 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 9 gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60 gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120 ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg cttgattgaa 180 ccgcatggtt caattataaa aggtggcttt tagctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt 480 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg 840 tttccgccct ttagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag 1020 ggcttcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260 aagccgcgag gctaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtc 1437 <210> 10 <211> 1520 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 10 ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg gacagatggg 60 agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 120 gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg cttgattgaa ccgcatggtt 180 caattataaa aggtggcttt tagctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag 240 ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 360 caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa 420 aactctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct 480 aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540 ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag 600 cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga 660 gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 720 gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 780 gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct 840 ttagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 900 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960 cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggcttcccct 1020 tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080 ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct 1140 aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200 ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg aagccgcgag 1260 gctaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt 1320 gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380 tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct 1440 tttggagcca gccgccgaag gtgggacaga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1500 gtatcggaag gtgcggctgg 1520 <210> 11 <211> 1514 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 11 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct 60 tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact 120 gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatgcttg attgaaccgc atggttcaat 180 tataaaaggt ggcttttagc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240 tgaggtaacg gctcaccaag gcarcgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360 ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact 420 ctgttgttag ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc 480 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540 ccggaattat tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 600 cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg 660 aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga 720 ctctctggtc tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag 840 tgctgcagca aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca 900 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaaccctag agatagggct tccccttcgg 1020 gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg 1140 tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaagc cgcgaggcta 1260 agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1320 ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taaccttttg 1440 gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag tcgtaacaag gtagccgtat 1500 cggaaggtgc ggct 1514

Claims (8)

1. 수탁 번호 NITE BP-01552, NITE BP-01551, NITE BP-01553, NITE BP-01554, 또는 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물.
2. 제 1 항에 있어서,
   수탁 번호 NITE BP-01552 로 특정되는 미생물이 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,
   수탁 번호 NITE BP-01551 로 특정되는 미생물이 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,
   수탁 번호 NITE BP-01553 으로 특정되는 미생물이 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,
   수탁 번호 NITE BP-01554 로 특정되는 미생물이 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖고,
   수탁 번호 NITE BP-01555 로 특정되는 미생물이 서열 번호 11 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 16S rDNA 를 갖는 미생물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 미생물이, 글루탐산의 비존재하, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지에서 배양하여 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 미생물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미생물이 하기 표 1 에 기재된 균학적 성질을 갖는 미생물.
   [표 1 ]
   

   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   수탁 번호 NITE BP-01552 또는 NITE BP-01551 로 특정되는 미생물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 미생물을 배양하여 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 생산 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   글리세린을 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양하는 폴리-감마-글루탐산의 생산 방법.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
   글루탐산을 함유하지 않고, 글리세린을 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지를 사용하여 상기 미생물을 배양하는 폴리-감마-글루탐산의 생산 방법.