KR100717169B1

KR100717169B1 - 폴리감마글루탐산을 생산하는 신규한 바실러스속 ｙｎ-1균주와 이를 이용한 폴리감마글루탐산의 제조방법

Info

Publication number: KR100717169B1
Application number: KR1020050089398A
Authority: KR
Inventors: 권현주; 김병우; 김동은; 남수완; 전숭종; 김영만; 유경옥
Original assignee: (주)오리엔탈 바이오텍
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2005-09-26
Publication date: 2007-05-10
Also published as: KR20070034822A

Abstract

본 발명은 폴리감마글루탐산을 생산하는 신규한 바실러스속 YN-1 균주와 이를 이용한 폴리감마글루탐산의 제조방법에 관한 것으로, 상기 균주를 통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지에서 배양하고, 상기 배양물으로부터 폴리감마글루탐산을 수득하는 것을 포함하는 폴리감마글루탐산의 제조방법을 제공함으로써, 품질이 우수하고 값이 저렴한 폴리감마글루탐산의 제공할 수가 있다.

폴리감마글루탐산, 바실러스속 YN-1 균주

Description

폴리감마글루탐산을 생산하는 신규한 바실러스속 ＹＮ-1 균주와 이를 이용한 폴리감마글루탐산의 제조방법{Novel Bacillus sp. YN―1 and method for producing poly gamma glutamic acid using the same}

도 1은 바실러스속 YN-1 균주의 pH(A)와 온도(B)에 따른 폴리감마글루탐산의 생산량에 대한 그래프이고,

도 2는 바실러스속 YN-1 균주의 탄소원에 따른 폴리감마글루탐산의 생산량에 대한 그래프이고,

도 3은 바실러스속 YN-1 균주의 과당 농도에 따른 폴리감마글루탐산의 생산량에 대한 그래프이고,

도 4는 바실러스속 YN-1 균주의 질소원에 따른 폴리감마글루탐산의 생산량에 대한 그래프이고,

도 5는 L-글루탐산 비의존성 폴리감마글루탐산 생산 균주의 체내 대사 과정을 간략하게 나타낸 도식화이고,

도 6은 바실러스 속 YN-1 균주의 배양 시간에 따라 생산된 폴리감마글루탐산의 물리적인 특성의 변화를 SDS-PAGE의 결과로 나타낸 사진이고,

도 7은 바실러스속 YN-1 균주의 성장곡선과 성장 시간에 따른 PGA생산량과 pH의 변화를 나타낸 그래프이다.

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본 발명은 폴리감마글루탐산을 생산하는 신규한 바실러스속 YN-1 균주와 이를 이용한 폴리감마글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

최근 환경문제의 심각성과 각종 환경 규제로 인해 친환경 생분해성 고분자에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이중 많은 연구와 관심이 집중되어 있는 생분해성 고분자에는 미생물이 생산하는 폴리에스터계의 폴리히드록시알칸노에이트(polyhydroxyalkanoates; PHA), 풀룰란(pullulan), 미생물 셀룰로오스(microbial cellulose) 등의 다당류와 폴리펩타이드계의 폴리 감마 글루탐산(poly-γ-glutamic acid; 이하 PGA라 칭함) 등이 있다. 이중 PGA는 일본 전통식품 낫토(natto), 한국 청국장의 점액물질로 잘 알려져 있으며, 글루탐산의 감마-카르복실산(γ-carboxylic acid)과 α-아미노기(α-amino)가 아미드 링크(amide linkages)에 의해 연결되어 있는 거대한 중합체(polymer)로 그 분자량은 생산균에 의해 100∼1000 kDa 정도이다[문헌정보 1, 6, 7, 16]. 그리고, 이의 PGA의 주요 생산 균주로는 바실러스속(Bacillus sp.)으로 B. 안트라시아(B. anthracis), B. 리케니포르미스(B. licheniformis), B. 메가테리움(B. megaterium), B. 서브틸리스[B. subtilis (natto)], B. 서브틸리스[B. subtilis (chungkookjang)] 등이 알려져 있다[문헌정보 2, 4].

PGA는 바실러스 서브틸리스 등의 몇몇 바실러스 속 균주의 발효 생산물로써, 배양 시에 세포 밖으로 분비되어 지며 사람과 환경에 독성이 전혀 없고, 수용성이며 생분해 가능한 고분자로 알려져 있다[문헌정보 6, 7]. 이런 특징 때문에 PGA는 침전농축장치, 습윤제, 동결방지제, 약물 담체(drug carrier), 생분해성 섬유, 사료첨가제 등의 다양한 분야에서 이용이 가능하며, 이러한 이유로 몇 년 전부터 식품, 화장품, 의약 등의 산업에서 많은 관심을 가지고 있는 고부가가치 바이오소재로 인식되어 오고 있다.

일반적으로 PGA 생산 균주는 크게 두 가지 형태로 분류하는 데, 배지 내에 L-글루탐산의 존재 하에서만 PGA를 생산하는 것과 L-글루탐산의 존재 유무에 상관없이 PGA를 생산하는 균주로 구분한다. 이중, L-글루탐산 의존 균주는 바실러스 서브틸리스[문헌정보 5], 바실러스 서브틸리스 ATCC9945[문헌정보 15], 바실러스 서브틸리스 IFO3335[문헌정보 7]와 바실러스 서브틸리스 F-2-01[문헌정보 11] 등이 보고되어 있다. 그리고 L-글루탐산 비의존성 균주로는 바실러스 서브틸리스 TAM-4 [문헌정보 10] 와 바실러스 리케니포르미스 A35[문헌정보 6]가 보고되어 있다.

그러나, 현재까지 보고된 PGA 연구에 대한 결과는 주로 합성경로와 유전자 등에 관한 것으로 산업화에 직접 적용할 수 있는 대량 생산 균주의 보고 및 대량 생산 방법에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다.

이에, 본 발명자는 청국장에서 PGA를 대량 생산하는 신규한 균주를 분리하고, 상기 균주의 생화학적 특성을 연구하여 산업적으로 PGA의 대량 생산공정에 사용할 수 있도록 함으로써, 품질 좋고 가격이 저렴한 PGA를 소비자에게 제공하고자 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지로부터 폴리감마글루탐산의 생산효율이 우수한 신규한 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 균주를 통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지에서 배양하고, 상기 배양물으로부터 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지로부터 폴리감마글루탐산을 생산하는 기탁번호가 KACC 91170P인 바실러스속 YN-1 균주(Bacillus sp. YN-1)를 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 균주를 통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지에서 배양하고, 상기 배양물으로부터 폴리감마글루탐산을 수득하는 것을 포함하는 폴리감마글루탐산의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

1. 신규 미생물의 분리 및 동정

본 발명은 통상의 탄소원과 질소원이 포함된 배지에서 미생물을 이용하여 폴리감마글루탐산(Poly-γ-glutamic acid; PGA)을 생산하는 방법에 있어서, 생산 효율이 매우 우수하여 종래 사용되는 균주를 대체할 수 있는 신규 바실러스 속 균주를 연구하고 이를 산업 기술에 적용하기 위하여, 전국 각 지역의 청국장으로부터 연구 목적에 부합되는 신규 미생물을 분리하였으며, 이를 바실러스속 YN-1(Bacillus sp. YN-1)라 명명하였다. 그리고, 상기 균주를 동정한 결과, 바실러스 서브틸러스 MO4(Bacillus subtilis MO4), 바실러스속 WL-3(Bacillus sp . WL-3), 바실러스 아밀로리퀘파시엔 Ba-S13(Bacillus amyloliquefaciens Ba-S13), 및 바실러스 리첸니포르미스 DFM13(Bacillus licheniformis DSM 13)과 밀접한 근연종으로 확인되었다.

그리고, 상기 균주는 2005년 7월 20일 농업진흥청 산하 농업생명공학연구원에 기탁하여, 기탁번호 KACC 91170P를 부여받았다.

2. 바실러스속 YN-1의 배양

가. 배지

본 발명에서 바실러스속 YN-1의 폴리감마글루탐산 생산량을 증가시키기 위해, 사용하는 배지에 탄소원은 과당(fructose), 젖당(lactose), 갈락토스(galactose), 글리세롤(glycerol) 및 시트르산(citric acid)으로 이루어지는 군에서 적어도 1종이 선택된 탄소원을 사용하고, 질소원은 염화암모늄 또는 L-글루탐산을 포함하여 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 탄소원은 가장 바람직하게 과당을 배지 중량기준으로 1∼4%를 사용하는 것이 바람직한 데, 이는 1% 미만일 경우에는 폴리감마글루탐산의 생산량이 감소되고, 4%를 초과할 경우에는 초과량에 비하여 증산 효과가 거의 없기 때문이다. 그리고, 본 발명에서는 가장 바람직하게는 멸균수에 3% 글루탐산, 4% 과당, 1% 시트르산, 1% 염화암모늄[(NH₄)₂SO₄], 0.1% 이인산칼륨(K₂HPO₄), 0.05% 황산마그네슘(MgSO₄), 0.005% 제이염화철(FeCl₃), 0.02% 염화칼슘(CaCl₂), 0.002% 황산망간(MnSO₄)를 혼합하고, 상기 배지의 ㎖ 당 50㎍의 바이오틴(biotine)을 첨가하여 이루어지는 배지를 사용한다.

나, 조건

본 발명의 바실러스속 YN-1 균주는 pH 8.0과 온도 37℃에서 가장 높은 PGA의 생산량을 나타낸다.

3. 폴리감마글루탐산의 물리적인 특성

본 발명의 바실러스속 YN-1 균주는 최적의 조건에서 12시간 이상 배양을 하면 4,000∼6,000KDa 분자량의 폴리감마글루탐산을 생산한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 셜명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

[ 실험예 ] PGA 분리, 정제 및 분자량 측정

먼저, LB배지에 배양한 균주를 완전 배지(complete medium; 0.5% polypeptone, 0.25% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.05% MgSO₄·7H₂O, pH7.0)에 접종하고 배양액이 660nm에서 흡광도(OD_660nm ₎가 2.1이 될 때까지 배양한 다음, 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 수거하고, 수거한 균체는 0.85% NaCl 용액으로 현탁하고 원심분리하여 다시 균체를 수거하였다. 그리고, 상기 수거된 균체를 NaCl로 재현탁하고, 이를 균체가 10%가 되도록 PGA 기초 생산 배지에 접종하여 37℃, 72시간 동안 배양하였다. 이때, PGA 기초 생산 배지는 2% 글루탐산, 1% 황산암모늄, 1% 시트르산, 0.1% 이인산칼륨, 0.1% 인산수소나트륨(Na₂HPO₄), 0.05% 황산마그네슘, 0.005% 염화제이철, 0.02% 염화칼슘, 0.002% 황산망간에 50㎍/㎖의 바이오틴이 첨가되어 이루어져 있으며, 생산된 PGA는 배양 완료된 배지를 시료로 하여 측정하였다.

그런 다음, 배양액은 12,000×g, 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 모은다[문헌정보 3]. 상등액의 4배 부피의 메탄올을 첨가하여 PGA를 침전시키고, 침전된 PGA는 멸균수 2㎖에 녹인 후 멸균수를 이용하여 투석하여 순수한 PGA만 남도록 하였다. 분리 정제된 PGA는 SDS-PAGE를 행하여 확인하였다.

또한, 투석으로 수득된 PGA는 멸균수에 녹인 다음, PGA 용액 10㎕를 SDS-PAGE(5% acrylamide)로 분석하였다. PGA는 메틸렌 블루(methylene blue)염색으로 확인하였다[문헌정보10]. 그리고, 전기영동으로 분리된 PGA은 플루오르켐 5500 이미지 분석기(FluorchemTM 5500 Image Analyzer)를 사용하여 정량하였다.

[ 실시예 1] 폴리감마글루탐산 (PGA) 생산 균주 분리 및 동정

PGA 생산 균주를 분리할 목적으로 전국 각 지역의 재래식으로 조제된 청국장을 채집하고, 각각의 청국장 1g을 멸균수 10㎖에 현탁한 후, 포자를 형성하지 않는 균주들을 제거하기 위하여 100℃에서 5분간 열처리하였다. 그리고, LB-아가 배지(0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1% Bacto tryptone, 1.5% Agar)에 100℃, 5분간 열처리한 청국장을 평판 희석하고 37℃에서 배양하여 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 PGA 생산배지[2% Glutamic acid, 1% (NH₄)₂SO₄, 1% Citric acid, 0.1% K₂HPO₄, 0.1% Na₂HPO₄, 0.05% MgSO₄, 0.005% FeCl₃, 0.02% CaCl₂, 0.002% MnSO₄, 50㎍/㎖ biotin]에 배양하고, 배양물에서 PGA의 존재유무를 SDS-PAGE로 확인하여 PGA 생산균주를 분리하였다.

분리된 PGA 생산 균주는 16s rRNA 서열 분석(Macrogen), API test (bioMetrieux) 및 베르게이 메뉴얼(Bergey's manual) 상에 준하여 동정하였다.

이의 결과, 먼저, 열처리를 거쳐 순수 분리된 세균 콜로니는 약 30여 종류였고, 이의 균주들을 각각 완전배지(complete medium)에서 전 배양을 하고, PGA생산 배지에서 72시간 본 배양하여 PGA의 생산 정도를 비교하여 순수 분리된 30여 종류의 세균 중에서 PGA를 생산하는 12종의 균주를 선정하였고, 이중 중 가장 생산성이 높은 균주를 선택하였다.

그리고, 가장 생산성이 높은 균주의 형태적 및 생리적 특성과 탄소원의 이용성 및 16s rRNA 염기서열의 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

이의 결과, 최종 선발된 균주는 그람 양성의 간균이며 운동성이 없으며 내열성의 포자를 형성하고, 전분 가수분해(starch hydrolysis)와 리파제 가수분해(lipase hydrolysis)가 음성이며 45℃의 온도에서도 활발하게 성장하는 생화학적인 특성을 나타내었다. 또한 이 균주는 고 농도의 NaCl(7%)에서도 활발한 성장을 나타내었으며, 탄소원의 이용성을 조사한 결과 바실러스 속으로 나타났다.

그리고, 16s rRNA 서열분석(sequencing)을 이용하여 확인 및 동정한 결과 바실러스 서브틸리스 MO4과 97.7%, 바실러스속 WL-3과 97.6%, 바실러스 아밀로리퀘파시엔 Ba-S13와 97.6%, 바실러스 리첸니포르미스 DFM13와 88.6%의 상동성을 나타내었다.

이에, 본 발명자는 최종 선발 균주를 바실러스속 YN-1로 명명하였으며, 이의 균주를 2005년 7월 20일 농업진흥청 산하 농업생명공학연구원에 기탁하여, 기탁번호 KACC 91170P를 부여받았다.

[ 실시예 2] PGA 생산 균주의 글루탐산 요구성

통상적으로 PGA생산 균주는 크게 두 가지로 분류되는 데, 한 그룹은 PGA생산 및 균주 성장에 글루탐산을 필요로 하는 글루탐산 의존 그룹(glutamic acid dependent group)과 글루탐산이 필요없는 글루탐산 비의존 그룹(glutamic acid independent group)이라 하는 데, 본 실시예에서는 본 발명의 신규한 균주의 글루탐산의 요구성을 알아보고자, PGA 기초 생산 배지에서 글루탐산을 제외하고 배양하여 균주 성장의 유무를 확인해 보았다.

이의 결과, 본 발명의 균주 성장에 글루탐산을 요구하지 않았어도 PGA 생산이 원활하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다(미도시). 따라서 본 발명의 바실러스속 YN-1 균주는 글루탐산 비의존 그룹에 속하는 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 3] PGA 생산의 최적 조건

일반적으로 PGA생산 균주는 배양조건에 따라 PGA생산량의 크게 차이를 보이며 PGA의 생산량의 약 2∼20배의 탄소원과 질소원을 필요로 하는 등의 PGA생산에 배양조건이 아주 중요한 것으로 알려져 있다[문헌정보 12].

이에, 본 실시예는 본 발명의 바실러스속 YN-1 균주의 PGA대량 생산 조건을 결정하고자, pH, 온도, 탄소원 및 질소원 등의 최적 배양 조건을 알아보고자 하였다.

1. pH와 온도

pH와 온도 변화에 따른 PGA생산량 변화를 측정하였다.

이의 결과, 도 1의 (A)에 도시된 바와 같이, 산성 환경인 경우에는 PGA생산량이 현저히 약하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고 알칼리성의 환경에서 PGA생산량이 증가하는 것을 알 수 있었으며, 이 중에서 PGA 생산 최적 pH를 8.0으로 결정하였다.

그리고, 도 1의 (B)에 의하면, 온도에 따른 PGA 생산량에 차이를 나타내었으며, 이중 37℃에서 가장 높은 량의 PGA를 생산함을 알 수 있었다.

2. 탄소원과 질소원

PGA 생산 최적 조건의 탄소원과 질소원을 결정하기 위하여, 먼저 탄소원은 말토스(maltose), 과당(fructose), 젖당(lactose), 갈락토스(galactose), 포도당(glucose), 글리세롤(glycerol), 자일로스(xylose), 사카로스(saccharose)를 최종 농도 2%가 되도록 PGA 기초 생산 배지에 첨가하였다. 그리고, 각각 탄소원이 첨가된 배지에서 본 발명의 바실러스속 YN-1을 배양하여 생성된 PGA를 SDS-PAGE로 확인하여 가장 많은 양의 PGA가 생성된 탄소원의 배지를 선정하여 PGA 생산 최적의 탄소원으로 결정하였으며, 질소원은 질산나트륨(NaNO₃), 질산암모늄(NH₄NO₃), 염화암모늄(NH₄Cl), 황산암모늄[(NH₄)₂SO₄], 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract)을 1%가 되도록 PGA 기초 생산배지에 첨가하여 배양한 후, PGA 생산량을 검토하여 PGA 생산 최적 질소원을 결정하였다.

먼저, 탄소원의 경우, PGA 생산에 필요한 탄소원을 결정하고자, 도 2에 도시된 바와 같이, 탄소원의 최종 농도는 2%로 하였으며 과당을 포함한 10종의 탄소원을 이용하여 본 균주의 PGA 생산량 변화를 확인한 결과, 말토스, 자일로스, 포도당, 사카로스를 탄소원으로 한 경우에는 탄소원을 첨가하지 경우에 비교하여 PGA생산량에는 큰 차이점이 나타나지 않았으며, 젖당, 갈락토스, 글리세롤을 탄소원으로 첨가한 경우에는 1.5∼2.5배 정도의 PGA 생산량이 증가하였고, 과당을 사용한 경우에는 4배 이상의 PGA 생산량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히, 과당의 경우, 도 3에 도시된 바와 같이, 1∼4%까지는 과당의 첨가량에 따라 점차적으로 PGA의 생산량이 증가하였으나 4% 이상의 첨가에는 생산량의 변화가 없었다. 따라서 본 발명의 바실러스속 YN-1의 탄소원으로 4%의 과당이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

질소원의 경우에는 도 4에 도시된 바와 같이, 각종 질소원을 각각 1%의 농도로 첨가한 결과, 펩톤(peptone)을 비롯한 여러 가지 질소원들은 PGA 생산량을 증가시키지 못하였으나, 염화암모늄(NH₄Cl)을 첨가한 경우에는 5배 이상의 PGA 생산량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 균주의 질소원은 염화암모늄이 가장 바람직한 것을 알 수 있었다.

그리고, PGA 생산 균주 중, L-글루탐산 비의존성 균주인 경우에는 도 5에 도시된 바와 같이, 일반적으로 균체내의 대사 과정에서 L-글루탐산이 생성되고 L-글루탐산은 트리카르복실산 사이클(tricarboxylic acid cycle)에 의해 2-옥소글루타르산(2-oxoglutaric acid)과 이소시트르산(isocitric acid)을 통한 시트르산(citric acid)으로부터 생산되는 것으로 추정된다[문헌정보 12]. 그리고, 2-옥소글루타르산에서 L-글루탐산으로 전환되는 경로는 2가지로 알려져 있는 데, 이중 한 가지 경로는 글루타메이트 디하이드로게나제(glutamate dehydrogenase) 경로에 의한 것으로 TCA 사이클의 한 물질인 α-케토글루타르산(α-Ketoglutaric acid)에 암모니아(NH₃)가 함께 작용하여 L-글루탐산을 생산하고[문헌정보 13], 또 다른 경로는 글루타민 합성효소(glutamine synthetase; GS)와 글루타민 2--옥소글루타레이트 아미노트랜스퍼라제(glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase; GOGAT)에 의해 생성되는 반응하여 L-글루탐산을 생산하는 것이 알려져 있다[문헌정보 9].

이에, 본 발명의 바실러스속 YN-1 균주는 상기 실시한 실시예의 결과와 기공지된 연구 논문에 따라, PGA 대량 생산을 위하여 시트르산과 소량의 글루탐산 필요로 하고, L-글루탐산으로 전환되는 2가지 경로 모두를 경유하는 것으로 판단된다. 또한, 본 발명의 균주는 과당과 염화 암모늄(ammonium chloride)을 PGA 생산에 필요로 하는 데, 이는 과당의 경우 여러 효소에 의해 글리세르알데히드-D-인산(glyceralde-D-phosphate)로 되면 해당과정을 거쳐 TCA 사이클로 들어가게 되고 시트르산 등의 과정을 거쳐 글루탐산을 생산하도록 하고, 염화암모늄은 글루타메이트 디하이드로게나제나 글루타민 합성효소에 암모니아를 제공하는 것으로 추정된다.

이의 판단 근거로, PGA생산 균주 중 하나인 바실러스 서브틸리스 IF03335가 글루탐산 L/D형의 이소머(isomer)가 17/83 의 비율로 존재하여 PGA를 생성하고 있는 것으로 보고하고 있고[문헌정보 12], D-글루탐산은 보통 직접적으로 L-글루탐산에서 변형되기보다는 간접적으로 생성되는 미생물들이 많은 것으로 알려져 있는 데, 구체적인 예로 일본 청국장인 낫토 미생물인 바실러스 서브틸리스(natto)와 바실러스 안트라시아(B. anthracis)의 D-글루탐산 생성 경로를 보면 2-옥소글루타르산과 L-알라닌은 L-글루탐산과 피루브산에 의해 생성되고, D-알라닌은 L-알라닌에서 라세미화(racemization)를 통하여 생성하게 되면서, 생성된 D-알리닌과 2-옥소글루타르산으로부터 D-글루탐산과 피루브산이 합성되는 것으로 보고되어 있다[문헌정보8, 14].

따라서, 상기와 같은 실시예 결과와 공지된 문헌에 의한 판단을 종합한 결과, 본 발명의 바실러스속 YN-1 균주의 최적 PGA 대량 생산 배지는 3% 글루탐산, 4% 과당, 1% 시트르산, 1% 염화암모늄, 0.1% 이인산칼륨(K₂HPO₄), 0.05% 황산 마그네슘(MgSO₄),0.005% 염화제이철(FeCl₃), 0.02% 염화칼슘(CaCl₂), 0.002% 황산망간(MnSO₄) 및 50㎍/㎖ 바이오틴으로 결정하였다.

[ 실시예 4] 성장곡선에 따른 PGA 생산 및 분자량 측정

본 실시예는 본 발명의 균주 성장곡선과 성장 시간에 따른 PGA 생산량과 PGA의 분자량을 알아보고자 하였다.

이의 결과, 본 발명의 균주를 대량 PGA 생산 배지에 접종하여 배양하면, 다른 균주와는 달리 12시간 이후부터 PGA가 생산되고, 이의 크기는 4,000∼6,000 kDa 정도로 생산 초기부터 큰 분자량의 PGA를 생산하는 특징이 있음을 알 수 있었다(도 6 참조). 특히, 종래 글루탐산 비의존성 균주로 알려진 바실러스 서브틸리스 TAM-4 균주의 성장곡선에 따른 PGA 생산 양상의 경우, 균주의 배양 시간이 36시간 정도가 되면 분자량이 200 kDa 이하의 PGA를 생산하고 54시간 이상 배양하게 되면 200 kDa 이상의 PGA를 생산[문헌정보 10]하는 것과 비교하면 그 효율이 매우 우수함을 알 수 있다.

이외에, 일반적으로 PGA를 생산하는 균주는 성장에 따른 pH 변화도 크게 중성의 범위에서 벗어나지 않지만, 본 발명의 균주는 균주의 배양시간에 관계없이 배양 12시간부터 PGA를 생산하기 시작하여 시간에 따른 생산량은 증가하면서, 배양에 따른 pH의 변화는 점차 산성쪽으로 pH가 변화하는 것을 알 수 있었다(도 7 참조).

이상과 같이, 본 발명의 신규한 바실러스속 YN-1 균주는 통상의 탄소원과 질소원을 포함한 배지 내에서 질 좋은 폴리감마글루탐산의 생산효율이 매우 우수하여, 미생물을 이용한 폴리감마글루탐산의 제조공정에 적용하면 품질이 우수하고 값이 저렴한 폴리감마글루탐산의 제공할 수가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지로부터 폴리감마글루탐산을 생산하는 기탁번호가 KACC 91170P인 바실러스속 YN-1 균주(Bacillus sp. YN-1).
제 1항 기재의 균주를 통상의 탄소원 및 질소원을 포함한 배지에서 배양하고, 상기 배양물으로부터 폴리감마글루탐산을 수득하는 것을 포함하는 폴리감마글루탐산의 제조방법.
제 2항에 있어서,

상기 배지는 과당, 젖당, 갈락토스, 글리세롤 및 시트르산으로 이루어지는 군에서 적어도 1종 이상 선택된 탄소원이 포함된 배지인 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산의 제조방법.
제 3 항에 있어서,

상기 배지는 중량기준으로 1∼4 %의 과당이 포함된 배지인 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산의 제조방법.
제 2 항에 있어서,

상기 배지는 염화암모늄(NH₄Cl) 또는 글루탐산이 질소원으로 포함된 배지인 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산의 제조방법.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배지는 3% 글루탐산, 4% 과당, 1% 시트르산, 1% 염화암모늄, 0.1% K2HPO4, 0.05% 황산마그네슘, 0.005% 제이염화철, 0.02% 염화칼슘, 0.002% 황산망간 및 50㎍/㎖ 바이오틴과 나머지는 멸균수로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산의 제조방법.