CN103396973A

CN103396973A - 一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法

Info

Publication number: CN103396973A
Application number: CN2013103715482A
Authority: CN
Inventors: 郑天凌; 熊小京; 蔡冠竟
Original assignee: Xiamen University; Shenzhen Research Institute of Xiamen University
Current assignee: Xiamen University; Shenzhen Research Institute of Xiamen University
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103396973B

Abstract

一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，涉及菌体蛋白饲料。Bacillus methylotrophicus MJ1保藏编号CGMCC No.6927；解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3保藏编号CGMCC No.6926。将餐厨垃圾过滤，分为滤液和滤渣，将滤渣粉碎后过筛；将两菌株MJ1和JM3接种到芽胞菌完全培养基中，摇瓶培养至指数生长期；将在指数生长期的MJ1和JM3同时接入餐厨垃圾滤液中，摇瓶培养后离心，得菌体，烘干后获得菌体蛋白干重；将餐厨垃圾滤渣粉末加入水调匀成浆状，灭菌，将在指数生长期的MJ1和JM3接入餐厨垃圾培养基中。

Description

一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法

技术领域

本发明涉及菌体蛋白饲料，特别涉及一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法。

背景技术

随着改革开放后经济迅速发展、城市化进程不断加快，我国城市垃圾成倍增长，垃圾处理也正成为各地政府的沉重负担。目前，我国的城市生活垃圾年产量约1.6亿吨，而且正以每年9％的速度递增。而城市垃圾的无害化处理率则不到20％。全国200多座大中城市正逐步被垃圾“包围”，合理“消化”垃圾已经刻不容缓。

城市垃圾中的主要成分是餐厨垃圾。餐厨垃圾包括城镇菜场垃圾、餐馆饮食业垃圾、家庭厨房垃圾和各种市场的瓜果皮等城镇垃圾。餐厨垃圾的共同特点是：含水率高（一般高达85%～90%）、有机质比例高（占干物质的95%以上）、含盐量高、有害物质含量少、氮磷钾等营养元素丰富和易腐烂。由于餐厨垃圾的组成、性质不稳定，受多种因素的影响很大，不同因素对餐厨垃圾的组成、性质和产量有不同的影响，餐厨垃圾的生物降解率可高达80％，因此适宜采用各种生物转化技术进行处理，对其处理既要治理污染，又要利用其有效成分。

利用餐厨垃圾生产饲料，制作饲料是目前餐厨垃圾的一大重要用途。随着我国饲料工业的不断发展，对蛋白饲料的需求量将越来越大。然而我国是一个饲料蛋白严重短缺的大国，我国每年需从国外进口大量的鱼粉蛋白来缓解供小于需的矛盾，将大量的精粮(如玉米、大米等)用于养殖业。

微生物饲料即指利用某些特殊的有益功能微生物与饲料（不含药物）及辅料混合发酵经干燥或制粒等特殊工艺加工而成的含活性益生菌的安全、无污染、无药物残留的优质饲料(Thassitou,P.K.,Arvanitoyannis,I.S.Bioremediation:a novel approach to food wastemanagement[J].Trends in Food Science&Technology2001,12:185-196.)。微生物饲料大体上可分为两类：一类主要是利用微生物的发酵作用改变饲料原料的理化性状，或增加其适口性，提高消化吸收率及其营养价值，或解毒、脱毒，或积累有用的中间产物，这一类微生物饲料主要包括乳酸发酵饲料（青贮饲料）、畜禽屠宰废弃物发酵饲料、发酵脱毒饲料、微生物发酵生产的饲料添加剂等；另一类微生物饲料是利用各种废弃物、纤维素类物质、淀粉质原料、矿物质等培养的微生物菌体蛋白、藻类等(Cohen,R.,Persky,L.,Hadar,Y.Biotechnologicalapplications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus[J].Appl MirobiolBiotechnol,2002,58:582-594)。

蛋白质废弃物的微生物发酵研究已有很多年的历史。龚仁等(龚仁,宋鹏,陈五岭.餐厨垃圾发酵生产生物活性蛋白饲料的工艺研究[J].饲料工业,2008,29(24):39-42)利用热带假丝酵母、黑曲霉和枯草芽孢杆菌对经预处理的餐厨垃圾进行固体发酵并烘干，获得粗蛋白含量为28.57%，粗脂肪为2.16%，灰分为1.27%，粗纤维2.09%，水分15.73%的生物蛋白饲料。王孝强等(王孝强,尹玮,汪群慧等.餐厨垃圾乳酸发酵残渣生产蛋白饲料的研究[J].哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2008,24(4):404-408)将酵母菌接种于未灭菌的餐厨垃圾乳酸发酵残渣中，在适宜条件下发酵获得真蛋白含量达31.1%的饲料。S.Y.Yang等(S.Y.Yang,K.S.Ji,W.S.Kwak,et al.Lactic acid fermentation of food waste for swine feed[J].Bioresource Technology,2006,97(15):1858–1864)使用乳酸菌对食品垃圾进行30天的厌氧发酵，发现产品中易利用的可溶性碳水化合物含量大幅提高而难水解的纤维等含量下降，可用于生猪养殖。

发明内容

本发明的第一目的在于提供Bacillus methylotrophicus MJ1和解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）JM3。

本发明的第二目的在于提供以餐厨垃圾为原料，采用微生物发酵工艺生产菌体蛋白（MBP）饲料，产品不仅蛋白含量高而且营养功能多，可连续生产并不受气候、土壤、自然灾害影响，成功率高的一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法。

所述Bacillus methylotrophicus MJ1已于2012年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.6927。

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3已于2012年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.6926。

所述Bacillus methylotrophicus MJ1和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3为能利用餐厨垃圾为底物发酵生产菌体蛋白饲料的优良菌株。

本发明所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，包括以下步骤：

1）将收集到的餐厨垃圾过滤，将其分为滤液和滤渣，将滤渣粉碎后过筛网备用；

2）将菌株Bacillus methylotrophicus MJ1和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3接种到芽胞菌完全培养基中，摇瓶培养至指数生长期；

3）按0.1%的接种量将在指数生长期的Bacillus methylotrophicus MJ1和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3同时接入餐厨垃圾滤液中，摇瓶培养后离心，得菌体，烘干后获得菌体蛋白（MBP）干重；

4）将餐厨垃圾滤渣粉末加入水调匀成浆状，灭菌，将在指数生长期的Bacillusmethylotrophicus MJ1和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3接入餐厨垃圾培养基中，发酵后测定产品的产率及粗蛋白、粗脂肪、灰份、氯化物、氨基酸态氮含量。

在步骤1）中，所述过滤可采用2层纱布过滤；所述粉碎可先用粉碎机粉碎，70～90℃烘干后，再粉碎；所述过筛网可过80～100目筛网。

在步骤2）中，所述芽胞菌完全培养基的组成可为：葡萄糖20g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.48g，硫酸锰0.2g，氯化钠1g，H₂O1000g，pH7.0～7.5，121℃灭菌20min；所述摇瓶培养可在30℃下、200r/min摇瓶培养；所述指数生长期，Bacillus methylotrophicus MJ1为16～20h，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3为24～28h。

在步骤3）中，所述摇瓶培养的条件可于30℃、200r/min条件下摇瓶培养64h；所述离心的条件可为10000g离心10min；经64h发酵后获得菌体蛋白的量为16.2g/L。

在步骤4）中，所述水的加入量按体积可为餐厨垃圾滤渣粉末的5倍；所述灭菌的条件可于121℃灭菌20min；所述发酵的条件可为在接种量2.0％、温度33℃、培养时间96h、6层纱布培养的条件下发酵。

本发明首先运用常规菌株分离方法结合产淀粉酶实验、产蛋白酶实验和餐厨垃圾上生长能力实验综合筛选出上述两种菌株。然后运用这两株菌对餐厨垃圾进行发酵生产菌体蛋白饲料，本发明发酵后产品产率为59.06％，粗蛋白的含量为45.3%、粗脂肪的含量为22.85%、灰份的含量为14.1%、氯化物的含量为1.95%、氨基酸态氮的含量为6.09%。

本发明是对循环经济理论的实际应用，对城市垃圾的无害化、减量化和资源化以及我国环境污染治理等方面具有重要的理论及现实意义。

附图说明

图1为JM3种子活化生长曲线。

图2为MJ1种子活化生长曲线。

图3为混菌发酵滤液菌体蛋白（MBP）产量。

图4为发酵时间对产品粗蛋白含量的影响。

图5为发酵时间对产品生产率的影响。

图6为发酵温度对产品粗蛋白含量的影响。

图7为发酵温度对产品产率的影响。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

实施例1：发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的优良菌株的分离筛选

发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料菌株的分离和初步筛选过程包括以下步骤：

1）取厦门大学菜市场垃圾堆上的废弃的果皮菜叶500g，用2L生理盐水浸泡10min，取上清液备用。取厦门大学食堂、三达膜公司食堂垃圾桶内剩余饭菜300g，用无菌水1L稀释，取上清液备用。

2）将步骤1）中得到的上清液接入装有生理盐水的三角瓶中，80℃水浴20min。水浴后，稀释、涂布于芽胞菌完全培养基固体平板（葡萄糖20g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.48g，硫酸锰0.2g，氯化钠1g，琼脂15g，H₂O1000g，pH7.0～7.5）上，28～37℃培养2～3d。培养后的菌落点种，通过结晶紫染色、镜检观察是否含有芽孢，挑选出含芽孢的菌种备用。

3）将步骤1）中得到的上清液涂布于10度麦芽汁固体培养基（100g粉碎的麦芽加水400ml，62℃水浴3.5h，碘试合格后，4层纱布过滤，滤液煮沸30min，滤纸过滤，加水将麦汁糖度调到10度）上，28～37℃培养2～3d。根据菌落形态及镜检菌体形态来辨别、分离出酵母菌备用。

4）将步骤1）中得到的上清液接种于查氏合成液体培养基（NaNO₃3g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KCl0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，pH值自然）中28～37℃富集培养3～4d后，稀释、涂布于查氏合成固体培养基平板（在查氏合成液体培养基中加入琼脂15～20g）上，28～37℃培养3～4d。根据菌落的形态与培养特征来鉴定、分离出霉菌备用。

5）将将步骤1）中得到的上清液接种于高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g，KNO₃1g，NaCl0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4）内28～37℃富集培养3～4d后，稀释、涂布于高氏一号固体培养基平板上，28～37℃培养3～4d。根据《放线菌鉴定手册》以菌落形态和培养特征鉴定、分离出放线菌备用。

6）将步骤2）、3）、4）、5）获得的单菌落划线于各自培养基固体平板上，置于28～37℃温度下培养3～4d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养。

经以上分离与初步筛选步骤，共获得20株菌株，分别编号为MJ1、MJ2、MJ3、MJ4、MJ5、YB1、YB2、YB3、YB4、YB5、YB6、YB7、YB8、YB9、YB10、JM1、JM2、JM3、JM4、FX1。为得到能利用餐厨垃圾为底物发酵生产菌体蛋白饲料的优良菌种，进行了以下复筛实验：

1）将以上20株菌株稀释、涂布在以可溶性淀粉为唯一碳源配制的完全培养基固体平板（配方及pH值根据菌种各自适宜调节）上，30℃培养3～4d。将稀碘液滴在菌落上。若菌落周围形成两个圈（内圈为透明棕黄色圈，外圈为蓝色圈），则挑出内圈即透明圈最大的菌落。

2）将以上20株菌株稀释、涂布于以干酪素为唯一氮源配制的乳白色完全培养基固体平板（配方及pH值根据菌种各自适宜调节）上30℃培养5～7d。若乳白色平板上菌落周围形成透明圈，则挑取出透明圈形成最快和最大的菌落。

3）将以上20株菌株接种到餐厨垃圾液体培养基内30℃摇瓶培养2～3d，然后点种到浓度分别为10%、20%、50%、100%的餐厨垃圾平板培养基上培养3～4d，观察实验记录。

具体实验结果如表1、2所示。

表1产淀粉酶、蛋白酶能力实验

注：“-”未见到生长，“+”生长状况不好，“++”生长状况一般，“+++”生长状况良好

表2生长能力实验

综合表1和2实验结果可知，MJ1、JM3、YB8这三株菌都能较好的分解和利用餐厨垃圾，能以餐厨垃圾为底物进行较好的生长、繁殖。其中MJ1能够产生淀粉酶；JM3能够产生蛋白酶；YB8既能够产生淀粉酶也能够产生蛋白酶。因此，初步选定以上三株菌作为能利用餐厨垃圾为底物发酵生产菌体蛋白饲料的优良菌种。

实施例2：菌株生长曲线的测定

将菌株MJ1和JM3接种到芽胞菌完全培养基（葡萄糖20g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.48g，硫酸锰0.2g，氯化钠1g，H2O1000g，pH7.0～7.5，121℃灭菌20min）中，30℃、200r/min摇瓶培养，以OD₆₀₀值为指标，作各自的生长曲线。

对数期是菌体生长代谢最为活跃的时期，也是由种子培养基接种大规模生产发酵培养基得最佳时期。由图1和2可知，这两种菌的最佳接种时间：MJ1为16～20h，JM3为24～28h。

实施例3：滤液发酵菌种组合的确定

按0.1%的接种量将菌株MJ1，JM3和YB8以不同组合形式同时接入餐厨垃圾滤液中，于30℃、200r/min条件下摇瓶培养，64h后10000g离心10min获得菌体，烘干获得菌体蛋白（MBP）干重。

从图3实验结果可知，发酵餐厨垃圾滤液生产菌体蛋白的最优组合为：MJ1+JM3，经过64h的发酵菌体蛋白含量达到16.2g/L。因此在对餐厨垃圾滤液的发酵处理上选用MJ1+JM3组合。

实施例4：滤渣发酵条件的优化

将餐厨垃圾固体粉末加入5倍体积的水调匀成浆状，121℃灭菌20min，餐厨垃圾流动性增加。将MJ1，JM3和YB8以不同组合形式，接种到餐厨垃圾培养基内，摇瓶培养。发酵完成后测定产品产率及粗蛋白、粗脂肪、灰份、氯化物、氨基酸态氮含量。

正交实验：正交实验因素和水平设计方案参见表3。

表3正交实验因素和水平设计方案

正交实验结果及分析如表4所示。由表4的级差分析结果可以看出，以产品的蛋白含量为指标，那么影响因子从大到小的排列顺序为：时间﹥温度﹥接种量﹥菌种组合﹥培养方式；以获得产品的产率为指标，那么影响因子从大到小的排列顺序为：菌种组合﹥时间﹥培养方式﹥温度﹥接种量。综合考虑，我们选择菌种组合MJ1+JM3，接种量2.0％，6层纱布培养作为最佳发酵条件，由于发酵时间和发酵温度对于发酵后产品蛋白含量、产量的影响较大，故通过单因素实验对其进行进一步优化。

表4餐厨垃圾滤渣发酵结果

表5和表6分别为发酵时间和发酵温度单因素实验设计方案

表5发酵时间实验设计方案

表6发酵温度实验设计方案

发酵时间对产品粗蛋白含量的影响如图5所示。

由图4和图5可知，在发酵进行到96h的时候，产品的收率不再继续下降，蛋白含量也不再提高。因此，我们可以确定96h为餐厨垃圾滤渣发酵的最佳时间。

由图6和图7可知，在发酵温度为33℃的时候，产品的蛋白含量达到最高，而在30～36℃范围内产品产率变化范围不大，因此，可以确定33℃为餐厨垃圾滤渣发酵的最佳温度。

综上所述，滤渣发酵的最优条件为：菌种组合MJ1+JM3、接种量2.0％、温度33℃、培养时间96h、6层纱布培养。

实施例5：通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法

1）将收集到的餐厨垃圾用2层纱布过滤，将其分为滤液和滤渣。将滤渣用粉碎机粉碎，70～90℃烘干，再粉碎，过80～100目筛网备用。

2）将菌株MJ1和JM3接种到芽胞菌完全培养基（葡萄糖20g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.48g，硫酸锰0.2g，氯化钠1g，H₂O1000g，pH7.0～7.5，121℃灭菌20min）中，30℃、200r/min摇瓶培养至指数生长期（MJ1为16～20h，JM3为24～28h）。

3）按0.1%的接种量将在指数生长期的MJ1和JM3同时接入餐厨垃圾滤液中，于30℃、200r/min条件下摇瓶培养，64h后10000g离心10min获得菌体，烘干获得菌体蛋白（MBP）干重。

4）将餐厨垃圾滤渣粉末加入5倍体积的水调匀成浆状，121℃灭菌20min，其流动性增加。将在指数生长期的MJ1和JM3接入餐厨垃圾培养基中，在接种量2.0％、温度33℃、培养时间96h、6层纱布培养的条件下发酵后测定产品的产率及粗蛋白、粗脂肪、灰份、氯化物、氨基酸态氮含量。

发酵后产品的蛋白含量为45.3％，产率为59.06％。

表7产品与原料营养成分对比

发酵后产品与原料营养成分对比见表7。

Claims

1.Bacillus methylotrophicus MJ1，保藏编号为：CGMCC No.6927。

2.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3，保藏编号为：CGMCC No.6926。

3.一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将收集到的餐厨垃圾过滤，将其分为滤液和滤渣，将滤渣粉碎后过筛网备用。

3）按0.1%的接种量将在指数生长期的Bacillus methylotrophicus MJ1和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3同时接入餐厨垃圾滤液中，摇瓶培养后离心，得菌体，烘干后获得菌体蛋白干重；

4.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤1）中，所述过滤采用2层纱布过滤。

5.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤1）中，所述粉碎是先用粉碎机粉碎，70～90℃烘干后，再粉碎；所述过筛网可过80～100目筛网。

6.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤2）中，所述芽胞菌完全培养基的组成为：葡萄糖20g，酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.48g，硫酸锰0.2g，氯化钠1g，H₂O1000g，pH7.0～7.5，121℃灭菌20min。

7.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤2）中，所述摇瓶培养是在30℃下、200r/min摇瓶培养；所述指数生长期，Bacillusmethylotrophicus MJ1为16～20h，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM3为24～28h。

8.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤3）中，所述摇瓶培养的条件是于30℃、200r/min条件下摇瓶培养64h；所述离心的条件为10000g离心10min；经64h发酵后获得菌体蛋白的量为16.2g/L。

9.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤4）中，所述水的加入量按体积为餐厨垃圾滤渣粉末的5倍；所述灭菌的条件可于121℃灭菌20min。

10.如权利要求3所述一种通过微生物发酵餐厨垃圾生产菌体蛋白饲料的方法，其特征在于在步骤4）中，所述发酵的条件为在接种量2.0％、温度33℃、培养时间96h、6层纱布培养的条件下发酵。