JP2013201996A - 水溶性ローヤルゼリー及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】透明で安定性に優れるとともに１０−ＨＤＡを高含有した水溶性ローヤルゼリーを製造する方法を提供する。
【解決手段】 原料ローヤルゼリーに、エンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼの２種のエンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼのうちの少なくとも１種と、を反応させ、得られた反応液を固液分離した後、濾液を乾燥粉末化させて、水溶性ローヤルゼリー粉末を得る。
【選択図】なし

Description

本発明は、透明で安定性に優れるとともに１０−ＨＤＡを高含有した水溶性ローヤルゼリーを製造する方法に関する。

ローヤルゼリー（Royal jelly）は、雌の働き蜂の喉頭腺から分泌される物質で、女王蜂となる幼虫や成虫となった女王蜂、更には若齢幼虫の働き蜂に給餌される食物である。ローヤルゼリーは、タンパク質、炭水化物、脂質の３大栄養素をはじめ、人の健康に不可欠なさまざまな必須アミノ酸、ミネラル、ビタミン類等の５０種類以上もの栄養素をバランス良く含むため、完全栄養食品ともいわれている。また、ローヤルゼリーだけに含まれ、その品質基準ともなっている１０−ヒドロキシ−２−デセン酸（10-Hydroxy-25-decenoic Acid、１０−ＨＤＡ）は、コレステロール低下、抗炎症、外傷治癒、抗菌作用等の活性を示すことが知られている。このため、ローヤルゼリーは、健康食品ばかりでなく、医薬品や化粧品等の成分として広範な利用が期待されている。

しかし、生ローヤルゼリーは、乳白色を帯びた強い酸味のある粘稠物質であり、水に難溶性の原料であるため製剤化が難しいという問題があり、これまで様々な方法による水溶化、製剤化が試みられてきた。例えば、特許文献１には、ローヤルゼリーに水を加えて遠心分離し、得られる上清を限外濾過又はゲル濾過して低分子物質を採取する方法が開示されている。また、特許文献２には、ローヤルゼリーに含まれるタンパク質を酸性プロテアーゼを用いて酵素分解して低分子化することが開示されており、更に、特許文献３にはアルカリプロテアーゼとＳＯＤ酵素、特許文献４にはプロテアーゼとカルボキシペプチダーゼ、及び特許文献５には基質に対する作用部位の異なる二種類以上のプロテアーゼを、それぞれ組み合わせて用いることにより、酵素の分解効率を向上させることが開示されている。

ＷＯ２００４／０２１８０３号公報 特開２００３−３３４００３号公報 特開２００６−４２７８８号公報 特開平３−１５１８３８号公報 特開平５−１２３１１９号公報

しかしながら、特許文献１のように、ローヤルゼリーに水を加えて遠心分離した場合、活性成分の１０−ＨＤＡは上清に存在するため限外濾過等で低分子タンパク質を除去することは実用的でなく、１０−ＨＤＡの回収率も大幅に低下するという問題があった。また、特許文献２のように、ローヤルゼリーに含まれるタンパク質を酸性プロテアーゼにより酵素分解して低分子化しようとする場合、プロテアーゼのみではその特性上分解効率が極めて悪く、固液分離工程に多大な時間を要するうえに１０−ＨＤＡの回収率も悪いので実用に堪えなかった。また、特許文献３のように、アルカリプロテアーゼを利用した場合、一旦ｐＨを約１０に調整して酵素処理した後更に酸を用いてｐＨを５付近に調整する必要があり、かかるｐＨ調整により塩類が多量に発生し、ローヤルゼリー本来の味覚が失われて商品価値が低下するという問題があった。また、特許文献４のカルボキシペプチダーゼのようなエキソ型のプロテアーゼを用いる場合、タンパク質がアミノ酸単位まで分解されることによる苦味が発生し、ローヤルゼリー本来の風味を悪化させてしまうという問題があった。さらに、特許文献５のように、作用部位の異なる２種類以上のプロテアーゼを用いればタンパク質の分解効率は向上するが、ローヤルゼリー中に約２０質量％も含まれる炭水化物が依然水溶化を妨害するため、透明な水溶性ローヤルゼリーを製造することは未だ困難であった。

本発明は上記従来技術の有する問題点に鑑みなされたものであり、その目的とするところは、透明で安定性に優れた水溶性ローヤルゼリーを高い生産効率で製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、１０−ＨＤＡを高含有した水溶性ローヤルゼリーを製造する方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、原料ローヤルゼリー本来の味覚が損なわれることなく高い商品価値を有する水溶性ローヤルゼリーを製造する方法を提供することにある。

本発明の上記目的は、下記の手段によって達成される。

（１）即ち、本発明は、原料ローヤルゼリーに、至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼのうちの少なくとも１種と、を反応させる工程を有することを特徴とする、水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（２）本発明はまた、前記至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼは、エンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼである、（１）に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（３）本発明はまた、前記エンド型酸性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、モナスカス・ピロサス（Monascus pilosus）、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、ムコール・ルキシー（Mucor rouxii）、ペニシリウム・シトリウム（Penicillium citrinum）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）、リゾプス・キネンシス（Rhizopus chinensis）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、ピクノポーラス・コッシネウス（Pycnoporus coccineus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）ｊ４、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）、シュードモナス・パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）又はサッカロマイセス（Sacchaomyces）の培養液から得られるものである、（２）に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（４）本発明はまた、前記アミラーゼは、アスペルギルス・アウレウス（Aspergillus aureus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、スルホロブス・ソルファタリカス（Slufolobus solfataricus）又はサーモモノスポラ・ビリディス（Thermomonospora viridis）の培養液から得られるものである、（１）〜（３）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（５）本発明はまた、前記セルラーゼは、アスペルギルス・セルロリティカス（Aspergillus cellulolyticus）、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・コニンギー（Tricoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Tricoderma longibrackiatumn）、トリコデルマ・リーゼイ（Tricoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Tricoderma viride）、コルチシウム（Corticium）、イルベックス（Irpex）、ピクノポーラス・コッシネウス（Pycnoporus coccineus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）又はバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）の培養液から得られるものである、（１）〜（４）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（６）本発明はまた、前記ペクチナーゼは、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アリアセウス（Aspergillus alliaceus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・プルベルレンタス（Aspergillus pulverulentus）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、トリコデルマ（Tricoderma）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis））、コルチシウム（Corticium）又はトリコスポロン（Trichosporon）の培養液から得られるものである、（１）〜（５）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（７）本発明はまた、前記反応させる工程で得られた反応液を固液分離する工程と、前記固液分離する工程で得られた濾液を乾燥粉末化させる工程と、を更に有する、（１）〜（６）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法である。

（８）更に、本発明は、原料ローヤルゼリーに、至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼのうちの少なくとも１種と、を反応させて得られることを特徴とする、水溶性ローヤルゼリーである。

（９）本発明はまた、前記至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼは、エンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼである、（８）に記載の水溶性ローヤルゼリーである。

（１０）本発明はまた、分子量５００以下のペプチド類を９０％以上含有する、（８）又は（９）に記載の水溶性ローヤルゼリーである。

（１１）本発明はまた、３％水溶液の４５０ｎｍにおける吸光度が０．１以下である、（８）〜（１０）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーである。

（１２）本発明はまた、３％水溶液に３倍量のエタノールを添加したときの６００ｎｍにおける吸光度が０．３以下である、（８）〜（１１）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーである。

（１３）更に、本発明は、（８）〜（１２）の何れか１つに記載の水溶性ローヤルゼリーを粉末化して得られる水溶性ローヤルゼリー粉末であって、１０−ヒドロキシデセン酸（10-Hydroxy-2-decenoicAcid）の含有量が２．２質量％以上である、水溶性ローヤルゼリー粉末である。

本発明の水溶性ローヤルゼリーの製造方法によれば、原料ローヤルゼリーに、至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ及びペクチナーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素と、を反応させるので、原料ローヤルゼリーに含まれる水溶化の妨げとなる糖タンパク質や炭水化物を有効に分解して低分子化することができ、透明で安定性に優れるとともに１０−ＨＤＡを高含有した水溶性ローヤルゼリーを高い生産効率で製造することができる。

特に、少なくとも２種のエンド型プロテアーゼとして、エンド型酸性プロテアーゼとエンド型中性プロテアーゼとを用いることにより、酵素処理において反応液を適正ｐＨに調整することができ、味覚に多大な影響を与えるｐＨ調整剤を使用する必要がなく原料ローヤルゼリー本来の味覚が損なわれることがないので、商品価値が高く、かつ分解効率が高いので極めて透明性に優れた水溶性ローヤルゼリーを製造することができる。

実施例１で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末中の１０−ＨＤＡ含有量を測定した結果を示す液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。 実施例１で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末の分子量分布を測定した結果を示す液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。

以下、本発明の水溶性ローヤルゼリーの製造方法を、実施形態を示して詳細に説明する。

本発明で利用される原料ローヤルゼリーは、分泌する蜂の種類や産地等に特に限定されず、また、生のものに限らず冷凍したものや凍結乾燥したものであってもよい。生ローヤルゼリーの場合、通常、水分６０〜７０質量％、タンパク質１２〜１５質量％、糖分１０〜１６質量％、脂質３〜６質量％、その他ビタミン類、塩類、アミノ酸等の低分子等から構成されており、更に、主たる活性成分である１０−ＨＤＡを１〜３質量％含んでいる。

本発明の水溶性ローヤルゼリーの製造方法では、まず、原料ローヤルゼリーに水を加えて懸濁液を調製する。懸濁液中のローヤルゼリーの濃度は、１．０〜５０．０質量％、好ましくは５．０〜２０．０質量％であり、懸濁液のｐＨは、２．０〜６．０、好ましくは３．０〜５．０である。

次に、得られたローヤルゼリー懸濁液に、エンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼと、を添加して反応させる。

本発明では、原料ローヤルゼリーに含まれる水溶性の妨げとなっているアピシン（Apisin、分子量35,000）を主体とする糖タンパク質を有効に分解して低分子化するために、エンド型プロテアーゼを用いて原料ローヤルゼリーを酵素処理する。エキソ型プロテアーゼを用いた場合、糖タンパク質がアミノ酸単位にまで細分解され、苦味が発生してしまい、商品価値が低下するので好ましくない。

また、本発明では、エンド型プロテアーゼとして、ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼを組み合わせて使用することが好ましく、特にエンド型酸性プロテアーゼとエンド型中性プロテアーゼとを組み合わせて使用するのが好ましい。エンド型酸性プロテアーゼとエンド型中性プロテアーゼの２種のプロテアーゼを組み合わせて使用することにより、酵素処理において、味覚に多大な影響を与えるｐＨ調整剤を使用することなく反応液を適正ｐＨに調整することができる。

ここで、エンド型酸性プロテアーゼとは、酸性領域に至適ｐＨを持つエンド型プロテアーゼであり、例えば、ニューラーゼＦ３Ｇ、ニューラーゼＡ（以上、天野エンザイム社製）、スミチームＡＰ（新日本化学工業社製）、デナプシン２Ｐ（ナガセケムテックス社製）、オリエンターゼ２０Ａ（エイチビィアイ社製）、ブリューワーズクラレックス、バリダーゼＡＦＰ（ディー・エス・エム・ジャパン社製）、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ（ヤクルト薬品工業社製）等が挙げられる。また、エンド型中性プロテアーゼとは、中性領域に至適ｐＨを持つエンド型プロテアーゼであり、例えば、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、パパインＷ−４０、プロメラインＦ、プロチンＳＤ−ＮＹ１０、プロチンＳＤ−ＰＣ１０Ｆ（以上、天野エンザイム社製）、スミチームＬＰ、スミチームＦＰ、スミチームＬＰＬ（以上、新日本化学工業社製）、バリダーゼＦＰ６０、ブリューワーズプロテアーゼ（以上、ディー・エス・エム・ジャパン社製）、精製パパイン（三菱化学フーズ社製）、食品用精製パパイン、デナチームＡＰ（以上、ナガセケムテックス社製）、ＰＴＮ、ニュートラーゼ（以上、ノボザイムズジャパン社製）、ヌクレイシン、オリエンターゼ１０ＮＬ、オリエンターゼ９０Ｎ、オリエンターゼＯＮＳ（以上、エイチビィアイ社製）、ＰａｐａｉｎＦ、ＴＲＹＰＳＩＮ４．０Ｔ、ＣＯＲＯＬＡＳＥＮ、ＶＥＲＯＮＬ１０、ＣＯＲＯＬＡＳＥＬ１０、パンチダーゼＰ、アロアーゼＡＰ−１０、アロアーゼＮＰ−１０、アロアーゼＮＳ（ヤクルト薬品工業社製）、エンチロンＮＢＳ（洛東化成工業社製）、パパイン、プロテックス７Ｌ、プロテックス１４Ｌ（ジェネンコア協和社製）等が挙げられる。これらのエンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼとしては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、モナスカス・ピロサス（Monascus pilosus）、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、ムコール・ルキシー（Mucor rouxii）、ペニシリウム・シトリウム （Penicillium citrinum）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）、リゾプス・キネンシス（Rhizopus chinensis）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）等の糸状菌、ピクノポーラス・コッシネウス（Pycnoporus coccineus）等の担子菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）等の放線菌、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）ｊ４、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）、シュードモナス・パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）等の細菌、サッカロマイセス（Sacchaomyces）等の酵母等の培養液から得られるものが特に好適に利用される。

また、本発明では、原料ローヤルゼリーに含まれる水溶性の妨げとなっている炭水化物を有効に分解して低分子化するために、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼのうちの少なくとも１つを用いて原料ローヤルゼリーを酵素処理する。

本発明で利用されるアミラーゼとしてはα−アミラーゼ、ビオザイムＡ、クライスターゼＳＤ８、コクゲンＬ、コクゲンＳＤ−Ａ（（以上、天野エンザイム社製）、コクラーゼ（三菱化学フーズ社製）、スミチームＬ（新日本化学工業社製）、ビオテックスＬ＃３０００、ビオテックスＴＳ、スピターゼＨＳ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ、ネオスピターゼＰＫ−２、スピターゼＸＰ−４０４（以上、ナガセケムテックス社製）、ブリューワーズファーメックスＭＧ、マイコラーゼＬＶ（ディー・エス・エム・ジャパン社製）、グリンドアミルＡ、グリンドアミルＥＢ７７（以上、ダニスコジャパン社製）、ＢＡＮ、ファンガミル、ターマミル、ノバミル、マルトゲナーゼ、リコザイムスープラ、ステインザイム、デュラミル（以上、ノボザイムズジャパン社製）、リクィファーゼＬ４５、フクタミラーゼ３０、フクタミラーゼ５０、フクタミラーゼ１０Ｌ、液化酵素６Ｔ、液化酵素Ｔ（以上、エイチビィアイ社製）、ＶＥＲＯＮＡＸ、ＶＥＲＯＮＭ４、ＶｅｒｏｎＳｏｆｔ（以上、樋口商会社製）、ユニアーゼＢＭ−８（ヤクルト薬品工業社製）、ラクターゼＳＲ、ラクトーゼＲＣＳ、ＳＶＡ、マグナックスＪＷ−１２１（以上、洛東化成工業社製）、スミチームＡ−１０、スミチームＡＳ（以上、新日本化学工業社製）、スペザイムＡＡ、スペザイムＦＲＥＤ、ピュラスターＯｘＡｍ、ピュラスターＳＴ（以上、ダニスコジャパン社製）、ベイクザイムＰ５００（ＤＫＳＨジャパン社製）、ベイクザイムＡＮ３０１、ＭＡＴＬクラシック、ＤＥＸＬＯ(r)ＣＬ（以上、ディー・エス・エム・ジャパン社製）、クライスターゼＴ１０Ｓ、コクゲンＳＤ−Ｔ、コクゲンＳＤ−ＴＣ３（以上、天野エンザイム社製）等が挙げられ、アスペルギルス・アウレウス（Aspergillus aureus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）等の糸状菌、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、スルホロブス・ソルファタリカス（Slufolobus solfataricus）等の細菌、サーモモノスポラ・ビリディス（Thermomonospora viridis）等の放線菌等の培養液から得られたものが特に好適に利用される。

また、本発明で利用されるセルラーゼとしては、セルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４（以上、天野エンザイム社製）、β−グルカナーゼ、スペザイムＣＰ、マルチフェクト、マルチフェクトＧＣエクストラ、オプチフローＲＣ、プリマファースト、インディエイジニュートラフレックス、アクセルレース、オプチマーゼＣＸ、ピュラダックスＨＡ（以上、ダニスコジャパン社製）、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ、ＧＯＤＯ−ＴＣＬ、ＧＯＤＯＴＣＤ−Ｈ３、ベッセレックス（以上、合同酒精社製）、超耐熱性セルラーゼ（社製耐熱性酵素研究所）、セルライザーＣＬ、セルライザーＡＣＥ、セルレースナガセ、セルチームＣ、セルラーゼＳＳ、セルラーゼＸＬ−５３１（以上、ナガセケムテックス社製）、シトラーゼＣＬ（ディー・エス・エムジャパン社製）、バリダーゼＴＲＬ、バリダーゼＡＮＣ４０（以上、ディー・エス・エムジャパン社製）、セルソフト、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ（以上、ノボザイムズジャパン社製）、セルロシンＡＣ４０、セルロシンＡＬ、セルロシンＴＦ（以上、エイチビィアイ社製）、セルラーゼ「オノズカ」３Ｓ、セルラーゼＹ−ＮＣ、パンセラーゼｂｒ（以上、ヤクルト薬品工業社製）、ＣｅｌｌＳＥＢＴｓ（樋口商会社製）、スミチームＡＣ、スミチームＣ（以上、新日本化学工業社製）、スクラーゼＣ（三菱化学フーズ社製）、エンチロンＣＭ、エンチロンＭＣＨ、バイオヒット、セルラーゼＥＳ（以上、洛東化成工業社製）、フィニザイム、ウルトラフロ、ビスコザイム（以上、ノボザイムズジャパン社製）、フィルトラーゼＬ、フィルトラーゼＮＬＣＬ、フィルトラーゼＮＬ、フィルトラーゼＰｕｒｅｍｉｕｍＬ（以上、ディー・エス・エム・ジャパン社製）、スミチームＢＧＡ（新日本化学社製）等が挙げられ、アスペルギルス・セルロリティカス（Aspergillus cellulolyticus）、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・コニンギー（Tricoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Tricoderma longibrackiatumn）、トリコデルマ・リーゼイ（Tricoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Tricoderma viride）等の糸状菌、コルチシウム（Corticium）、イルベックス（Irpex）、ピクノポーラス・コッシネウス等の担子菌、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サブティリス等の細菌等の培養液から得られるものが特に好適に利用される。

また、本発明で利用されるペクチナーゼとしては、ぺクチナーゼＧ「アマノ」、ぺクチナーゼＰＬ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ−ＧＯＤＯ（合同酒精社製）、スクラーゼＡ、スクラーゼＮ、スクラーゼＳ（以上、三菱化学フーズ社製）、ラピダーゼ（ディー・エス・エム・ジャパン社製）、マルチフェクトペクチナーゼＦＥ（ダニスコジャパン社製）、スミチームＡＰ−２、液状スミチームＡＰ−２、スミチームＳＰＣ、スミチームＳＰＧ、スミチームＰＭＥ、スミチームＭＣ（以上、新日本化学工業社製）、ペクチナーゼＸＰ−５３４ＮＥＯ、ペクチネックス、ペクチネックスウルトラＳＰ−Ｌ、ウルトラザイム、ビノザイム（以上、ノボザイムズジャパン社製）、セルロシンＰＥ６０、セルロシンＰＥＬ、可溶性ペクチナーゼＴ（以上、エイチビィアイ社製）、ペクチナーゼＳＳ、ペクチナーゼＨＬ（以上、ヤクルト薬品工業社製）、スミチームＰＸ（新日本化学工業社製）、ラピダーゼＰＲＯＬ、ラピダーゼＧＬＵＣＡＬＥＥＳ、ラピダーゼＦＣ、ラピダーゼＡＤＥＸ、マキソリヴァ（以上、ディー・エス・エム・ジャパン社製）等が挙げられ、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アリアセウス（Aspergillus alliaceus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・プルベルレンタス（Aspergillus pulverulentus）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、トリコデルマ（Tricoderma）等の糸状菌、バチルス・サブティリス（Bacillus sublilis）等の細菌、コルチシウム（Corticium）等の担子菌、トリコスポロン（Trichosporon）等の酵母等の培養液から得られるものが特に好適に利用される。

本発明における上記各酵素の添加量は、エンド型酸性プロテアーゼが原料ローヤルゼリーに対して０．０５〜１．５質量％、好ましくは０．１〜１．０質量％、エンド型中性プロテアーゼが原料ローヤルゼリーに対して０．０１〜０．４質量％、好ましくは０．０５〜０．２質量％、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼが原料ローヤルゼリーに対して０．０１〜０．４質量％、好ましくは０．０５〜０．３質量％がよい。

また、酵素処理の条件は、原料ローヤルゼリーの成分及び使用する酵素の種類や添加量によって適宜設計されるが、通常は、３０〜７０℃の処理温度で２〜２４時間処理することが好ましい。酵素処理を終了するには、７０〜９０℃の温度で０．２〜２．０時間撹拌することにより酵素を失活させる。

次に、得られた反応液を、既知の方法、例えば有孔壁遠心分離機、無孔壁遠心分離機、加圧濾過機等を用いて固液分離し、濾液を例えば減圧濃縮機等により減圧濃縮した後、必要により、デキストリン、でんぷん等の賦形剤等を添加して、例えば凍結乾燥機、スプレードライヤー等により乾燥して、本発明の水溶性ローヤルゼリー粉末を得る。但し、本発明の水溶性ロイヤルゼリーは、必ずしも粉末化する必要はなく、減圧濃縮した濾液をそのまま製品に利用しても構わない。

本発明の水溶性ローヤルゼリーは、粉末又は水溶液として単体で、又は適宜他の成分と混合して製剤し、健康食品や医薬品、化粧品等として利用することができる。

本発明の水溶性ロイヤルゼリーは、好適には分子量５００以下のペプチド類を９０％以上含有するものであり、原料ローヤルゼリーに含まれるタンパク質が高度に分解され低分子化されていることから、水に対する溶解性が高く、透明で安定な水溶液とすることができる。

また、本発明の水溶性ロイヤルゼリーは、好適には３％水溶液としたときの４５０ｎｍにおける吸光度が０．１以下であり、極めて高い透明性を有するものである。

また、本発明の水溶性ロイヤルゼリーは、好適には３％水溶液に３倍量のエタノールを添加したときの６００ｎｍにおける吸光度が０．３以下であり、残存するタンパク質や高分子領域の糖質が極めて少ない。

更に、本発明の水溶性ローヤルゼリーを粉末化して得られる水溶性ローヤルゼリー粉末は、好適には１０−ＨＤＡの含有量が２．２質量％以上であり、コレステロール低下、抗炎症、外傷治癒、抗菌作用等に対する有効性に優れ、健康食品、医薬品、化粧品等の原料として極めて有用である。

次に、本発明の水溶性ローヤルゼリー粉末及びその製造方法を、実施例により更に詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定されるものではない。
［原料］

生ローヤルゼリーの栄養成分値及び１０−ＨＤＡ含有量

使用した生ローヤルゼリーの栄養成分値及び１０−ＨＤＡの含有量を表１に示した。

エンド型酸性プロテアーゼ、エンド型中性プロテアーゼ及びα−アミラーゼを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

室温下で上記の生ローヤルゼリー１００ｇを水９００ｇに加えて撹拌し、均一に分散させた。得られた懸濁液に、エンド型酸性プロテアーゼ（エイチビィアイ株式会社製「オリエンターゼ２０Ａ」（アスペルギルス・ニガー由来））０．３ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．３質量％）、エンド型中性プロテアーゼ（エイチビィアイ株式会社製「オリエンターゼ９０Ｎ」（バチルス・サブティリス由来））０．０６ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０６質量％）及びα−アミラーゼ（エイチビィアイ株式会社製「フクタミラーゼ５０」（バチルス・サブティリス由来））０．０５ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０５質量％）を添加し、５５℃に加熱して１５時間撹拌した。得られた反応液を９０℃に加熱し、３０分間撹拌して酵素を失活させた後室温まで冷却した。これを加圧濾過機により固液分離して、濾液を減圧濃縮し、デキストリン（松谷化学工業社製「マックス１０００」）７０ｇを添加して、凍結乾燥機を用いて乾燥して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。

エンド型酸性プロテアーゼ、エンド型中性プロテアーゼ及びセルラーゼを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、α−アミラーゼに替えてセルラーゼ（エイチビィアイ社製「セルロシンＡＣ４０」(アスペルギルス・ニガー由来)）０．０５ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０５質量％）を添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。

エンド型酸性プロテアーゼ、エンド型中性プロテアーゼ及びペクチナーゼを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、α−アミラーゼに替えてペクチナーゼ（エイチビィアイ社製「セルロシンＰＥ６０」（アスペルギルス・ニガー由来））０．０５ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０５質量％）を添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。
［比較例１］

エンド型酸性プロテアーゼのみを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、酵素としてエンド型酸性プロテアーゼ（エイチビィアイ社製「オリエンターゼ２０Ａ」）０．３ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．３質量％）のみを添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。
［比較例２］

エンド型中性プロテアーゼのみを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、酵素としてエンド型中性プロテアーゼ（エイチビィアイ社製「オリエンターゼ９０Ｎ」）０．３ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．３質量％）のみを添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。
［比較例３］

エンド型アルカリ性プロテアーゼのみを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、酵素としてエンド型アルカリ性プロテアーゼ（エイチビィアイ社製「オリエンターゼ２２ＢＦ」（バチルス・サブティリス由来）」）０．３ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．３質量％）のみを添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。
［比較例４］

エンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼのみを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、酵素としてエンド型酸性プロテアーゼ（「オリエンターゼ２０Ａ」エイチビィアイ株式会社製）０．３ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．３質量％）及びエンド型中性プロテアーゼ（「オリエンターゼ９０Ｎ」エイチビィアイ株式会社製）０．０６ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０６質量％）のみを添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。
［比較例５］

α−アミラーゼ、セルラーゼ及びペクチナーゼのみを用いた水溶性ローヤルゼリー粉末の製造

実施例１において、酵素としてα−アミラーゼ（エイチビィアイ株式会社製「フクタミラーゼ５０」（バチルス・サブティリス由来））０．０５ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０５質量％）、セルラーゼ（エイチビィアイ社製「セルロシンＡＣ４０」(アスペルギルス・ニガー由来)）０．０５ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０５質量％）及びペクチナーゼ（エイチビィアイ社製「セルロシンＰＥ６０」（アスペルギルス・ニガー由来））０．０５ｇ（生ローヤルゼリーに対して０．０５質量％）を添加した以外はほぼ同様に処理して、目的の水溶性ローヤルゼリー粉末を得た。
［評価１］

水溶性ローヤルゼリー粉末の収量及び１０−ＨＤＡ含有量

実施例１〜３及び比較例１〜５で得られた濾液の液量、ｐＨ及び固形分濃度、並びに水溶性ローヤルゼリー粉末の収量及び１０−ＨＤＡ濃度を測定した。なお、水溶性ローヤルゼリー粉末の１０−ＨＤＡ濃度は、液体クロマトグラフィー（移動相：リン酸水溶液（１→１０００）／ＭｅＯＨ（５０／５０）混液、カラム温度：４０℃、カラム：ｓｙｍｍｒｔｒｙＣ１８ ４．６×１５０ｍｍ ５μｍ（ｗａｔｅｒｓ社製）、流速：内標準物質（安息香酸）が約６分に溶出するように調節、検出器：紫外分光光度計（２１５ｎｍ）（島津製作所社製「ＳＰＤ−２０Ａ」））により測定した。結果を表２に示した。また、実施例１で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末中の１０−ＨＤＡ濃度の測定結果のクロマトグラムを図１に示した。

表２の結果から明らかなとおり、２種（酸性及び中性）のエンド型プロテアーゼを用い、更にアミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼを組み合わせて用いることにより（実施例１〜３）、１種又は２種のエンド型プロテアーゼのみを用いた場合（比較例１〜４）及びアミラーゼ、セルラーゼ及びペクチナーゼのみを用いた場合（比較例５）と比較して、濾液の固形分濃度が増加し、水溶性ローヤルゼリー粉末の収量及び１０−ＨＤＡ濃度が顕著に増大した。また、濾過速度が向上し、固液分離工程にかかる時間が大幅に短縮され生産効率が顕著に改善された。
［評価２］

水溶性ローヤルゼリー粉末の分子量分布の測定

実施例１で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末の分子量分布を液体クロマトグラフィー（移動相：水／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ混液（５５：４５：０．１）、カラム温度：４０℃、カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷ ７．８×３００ｍｍ （昭和電工株式会社製）、検出器：紫外分光光度計（２２０ｎｍ）（島津製作所社製「ＳＰＤ−２０Ａ」））により測定した。結果を図２及び表３に示した。

表３の結果から明らかなとおり、実施例１で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末は、分子量が５００以下のペプチド類を９０％以上含有するものであり、本発明の方法は、ローヤルゼリー中のタンパク質に対する分解効率が非常に優れていることがわかった。
［評価３］

水溶性ローヤルゼリー粉末の水溶液の透明度の評価

実施例１〜３及び比較例１〜４で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末を３％水溶液に調製し、水溶液の着色度を、紫外分光光度計（島津製作所社製「ＵＶ−１２００」）により吸光度（測定波長：４５０ｎｍ付近）を測定して評価した。結果を表４に示した。

表４の結果から明らかなとおり、実施例１〜３で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末では、比較例１〜４で得られたものと比較して、極めて透明性の高い水溶液が得られた。
［評価４］

水溶性ローヤルゼリー粉末の水溶液のエタノール沈殿により残存するタンパク質量の評価

実施例１〜３及び比較例１〜４で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末を３％水溶液に調製し、３倍量のエタノールを加えて白濁の度合いを、紫外分光光度計（島津製作所社製「ＵＶ−１２００」）により吸光度（測定波長：６００ｎｍ付近）を測定して評価した。結果を表５に示した。

表５の結果から明らかなとおり、実施例１〜３で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末では、比較例１〜４で得られたものと比較して、吸光度が低く残存するタンパク質や高分子領域の糖質が極めて少なかった。
［評価５］

水溶性ローヤルゼリー粉末の水溶液の冷蔵保存による経時変化の評価

実施例１〜３及び比較例１〜４で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末を３％水溶液に調製し、５℃で冷蔵保存して、経時的に発生する沈殿物の量を肉眼で観察することにより評価した。結果を表６に示した。

表６の結果から明らかなとおり、実施例１〜３で得られた水溶性ローヤルゼリー粉末では、比較例１〜４で得られたものと比較して、水溶液の冷蔵保存による経時的な沈殿物の発生が少なく極めて安定性が高かった。

上述したように、本発明の水溶性ローヤルゼリーの製造方法は、原料ローヤルゼリー本来の味覚を保持しつつ、透明で安定性に優れるとともに１０−ＨＤＡを高含有した水溶性ローヤルゼリーを高い生産効率で製造することができるので極めて有用である。

Claims (13)

1. 原料ローヤルゼリーに、至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼのうちの少なくとも１種と、を反応させる工程を有することを特徴とする、水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
2. 前記至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼは、エンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼである、請求項１に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
3. 前記エンド型酸性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、モナスカス・ピロサス（Monascus pilosus）、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、ムコール・ルキシー（Mucor rouxii）、ペニシリウム・シトリウム （Penicillium citrinum）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）、リゾプス・キネンシス（Rhizopus chinensis）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、ピクノポーラス・コッシネウス（Pycnoporus coccineus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）ｊ４、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）、シュードモナス・パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）又はサッカロマイセス（Sacchaomyces）の培養液から得られるものである、請求項２に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
4. 前記アミラーゼは、アスペルギルス・アウレウス（Aspergillus aureus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、スルホロブス・ソルファタリカス（Slufolobus solfataricus）又はサーモモノスポラ・ビリディス（Thermomonospora viridis）の培養液から得られるものである、請求項１〜３の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
5. 前記セルラーゼは、アスペルギルス・セルロリティカス（Aspergillus cellulolyticus）、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・コニンギー（Tricoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Tricoderma longibrackiatumn）、トリコデルマ・リーゼイ（Tricoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Tricoderma viride）、コルチシウム（Corticium）、イルベックス（Irpex）、ピクノポーラス・コッシネウス（Pycnoporus coccineus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）又はバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）の培養液から得られるものである、請求項１〜４の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
6. 前記ペクチナーゼは、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アリアセウス（Aspergillus alliaceus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・プルベルレンタス（Aspergillus pulverulentus）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、トリコデルマ（Tricoderma）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis））、コルチシウム（Corticium）又はトリコスポロン（Trichosporon）の培養液から得られるものである、請求項１〜５の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
7. 前記反応させる工程で得られた反応液を固液分離する工程と、前記固液分離する工程で得られた濾液を乾燥粉末化させる工程と、を更に有する、請求項１〜６の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリーの製造方法。
8. 原料ローヤルゼリーに、至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼと、アミラーゼ、セルラーゼ又はペクチナーゼのうちの少なくとも１種と、を反応させて得られることを特徴とする、水溶性ローヤルゼリー。
9. 前記至適ｐＨ値の異なる少なくとも２種のエンド型プロテアーゼは、エンド型酸性プロテアーゼ及びエンド型中性プロテアーゼである、請求項８に記載の水溶性ローヤルゼリー。
10. 分子量５００以下のペプチド類を９０％以上含有する、請求項８又は９に記載の水溶性ローヤルゼリー。
11. ３％水溶液の４５０ｎｍにおける吸光度が０．１以下である、請求項８〜１０の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリー。
12. ３％水溶液に３倍量のエタノールを添加したときの６００ｎｍにおける吸光度が０．３以下である、請求項８〜１１の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリー。
13. 請求項８〜１２の何れか１項に記載の水溶性ローヤルゼリーを粉末化して得られる水溶性ローヤルゼリー粉末であって、１０−ヒドロキシデセン酸（10-Hydroxy-2-decenoic Acid）の含有量が２．２質量％以上である、水溶性ローヤルゼリー粉末。

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