JP6392226B2 - 茶類抽出物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、酵素処理した茶類抽出物の製造方法に関する。さらに詳しくは茶類飲料に配合することにより茶の有する甘味、旨味を強化しつつ茶特有の苦渋味を低減することにより、茶類飲料の嗜好性を著しく向上することのできる茶類抽出物の製造方法に関する。

近年、茶類飲料を缶あるいはペットボトル等に充填した商品が提供されている。無糖の茶類飲料は、消費者の甘味離れから高い支持を得て、その生産量は１９９０年〜２０１０年頃にかけて大幅に増加し、その後も消費者からの安定した支持を受け、飲料市場において、高い水準の割合を占める安定した市場を形成している。最近の傾向としては、旨味やコク味が強く、渋味が抑えられた茶類飲料が好まれている。

これらの茶類飲料の製造用原料の一部として、また、風味の向上を目的として、茶類の抽出物を使用することが一般的に行われている。茶類の抽出物は茶類から特定の効果のある部分のみを取り出したものであり、最終製品の形態、風味、目的などに応じた品質のものが調製可能である。茶類抽出物の使用は、茶類飲料製造において、最終飲料の目的に応じて望ましいものを添加することで、目的とする効果を容易に得ることができるため、茶類飲料製造において簡便で有利な効果をもたらす方法である。

茶類抽出物の製造方法においては、さまざまな提案がされているが、特に、旨味、こく味、甘味の強いエキスを得るための方法として、茶葉中に多量に存在するタンパク質を有効利用する方法が考えられる。茶葉中には約２５％のタンパク質が含まれているが（５訂食品成分表）、茶葉中のタンパク質は水に不溶であるため、通常の熱水抽出等では全く利用されない。この茶葉中に残存し、利用されていないタンパク質をプロテアーゼを用いて分解すれば、アミノ酸が生成し、旨味の強い茶類抽出物が得られることが予想されるため、従来から様々な試みがされてきた。例えば、特許文献１では茶葉抽出残渣をセルラーゼおよびプロテアーゼで処理する方法が提案されている。

しかしながら、茶葉の蛋白質はタンニンと強く結合しているため、プロテアーゼを単独で作用させても、それほど多くのアミノ酸の遊離は見られなかった。そこで、本出願人は、以前、茶葉を、プロテアーゼおよびタンナーゼの存在下に抽出することにより、プロテアーゼの作用の阻害要因となっているタンニンを分解し、プロテアーゼをタンパク質に作用させ易くすることで、旨味やコク味が強く、渋味の少ない茶類抽出物が得られるという発明を提案し開示した（特許文献２）。しかしながら、この方法によっても、まだ、茶葉中のタンパク質の多くは未分解のまま残存しており、茶葉中のタンパク質を十分有効に利用しているものとはいえなかった。

また、別の提案として、緑茶葉をプロテアーゼ存在下に水で抽出し、得られた抽出液をさらにプロテアーゼで処理する茶エキスの抽出方法（特許文献３）、高温抽出により一旦カテキンを抽出除去した茶葉抽出残渣にプロテアーゼを作用させて抽出し、最初の抽出液と後の抽出液を合わせることにより、茶抽出物中の茶葉由来固形分に対し、アミノ酸の総量の割合が２．５質量％以上であり、カテキン類の総量の割合が１５．０質量％以下である、茶抽出物を得る方法（特許文献４）、セルラーゼ、ヘミセルラーゼからなる群のうち１以上と、ペクチナーゼと、タンナーゼを含有する酵素群にさらにプロテアーゼを含有する酵素群と、茶葉とを混合し、茶葉を酵素分解抽出処理する茶葉抽出液の製造方法（特許文献５）などが提案され、それなりの成果を上げているが、未だに茶葉中のタンパク質を十分有効に利用しているものとはいえなかった。

特開平４−２２８０２８号公報 特開２００３−１４４０４９号公報 特開２００８−６７６３１号公報 特開２００９−９５３３３号公報 特開２０１１−５０２７１号公報

本発明の目的は、従来の茶酵素処理抽出物の製造方法では、十分利用できず茶葉抽出残渣に残存するタンパク質を、従来よりも効率よくアミノ酸へと分解することにより、旨味、こく味、甘味の強い茶類抽出物を製造することを目的とする。また、本発明の方法により得られた抽出物を茶類飲料に配合することにより、茶類飲料の甘味、旨味等の風味を増強するとともに、苦渋味を抑え、茶類飲料の嗜好性を著しく向上することができるという優れた効果がもたらされる。

茶葉を粉砕し水に分散するとそのｐＨは通常、ｐＨ５〜６の範囲内となる。この系に対し、プロテアーゼや糖質分解酵素などの酵素処理を施すと、通常ｐＨは低下する。また、酵素処理として、特にタンナーゼ処理を行うと、茶タンニン（特にカテキン類のガレートエステル）の分解による没食子酸の生成によりｐＨはさらに酸性側となり、ｐＨ４〜５程度となる。また、プロテアーゼ処理を行った場合、ｐＨは低下し、４．３〜４．８程度まで低下することが多い。さらにまた、従来技術における酵素処理においては、劣化防止のためビタミンＣやアスコルビン酸ナトリウムを添加する方法は行われているが、積極的にｐＨを酵素の至適ｐＨに調整して酵素処理を行うという記載は見当たらない。これは、従来の茶類の酵素処理抽出においては、茶の自然な風味を活かしたまま有効に抽出を行うため、あえてｐＨ調整を行わないためであると推測される。

しかしながら、このようにｐＨ調整を行わずにプロテアーゼ処理を行う場合、プロテアーゼとして酸性プロテアーゼを選択せざるを得ず、また、プロテアーゼを作用させても、酸性域で溶解するタンパク質だけが酵素反応により分解を受け、弱酸性から弱アルカリ域で溶解するタンパク質は、酵素反応をほとんど受けずに未分解のまま茶葉抽出残渣に残存してしまうという問題があった。

そこで、本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を行った結果、おどろくべきことにプロテアーゼ、タンナーゼで処理された茶葉を、処理後にｐＨを、上昇させ、弱酸性から弱アルカリ域に調整した後、再度プロテアーゼで処理したところ、従来技術では今まで分解しきれなかった弱酸性から弱アルカリ域で溶解するタンパク質を分解することができ、よりアミノ酸がより多く遊離し、旨味の強い緑茶エキスが得られることを見出した。そして、得られた茶類抽出物を茶類飲料に配合したところ、茶類飲料の甘味、旨味を増強しながら、茶特有の苦渋味を低減し、茶類飲料の嗜好性が著しく向上する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。かくして、本発明は、茶葉のタンナーゼ処理およびプロテアーゼ処理を含む茶類抽出物の製造方法であって、以下の工程Ａ〜Ｃを含む、製造方法を提供する。
工程Ａ：茶葉を第１段目の酵素処理する工程、
工程Ｂ：工程Ａの終了後、工程Ａの実施されたｐＨに対しｐＨを０．１以上上昇させる工程および
工程Ｃ：工程Ｂの後に第２段目の酵素処理する工程。

なお、本発明によれば、当該技術分野で茶葉の酵素処理に使用できる酵素であれば、タンナーゼおよびプロテアーゼに限定されることなく、上記工程Ａ〜Ｃにより効率よく茶類抽出物を得る製造方法が提供できるので、
（工程Ａ）茶葉を第１段目の酵素処理する工程、
（工程Ｂ）工程Ａの終了後、ｐＨを０．１以上上昇させる工程、
（工程Ｃ）工程Ｂの後に第２段目の酵素処理する工程、
を含む茶類抽出物の製造方法、も提供できる。

この場合の、工程Ａの第１段目の酵素処理の適当なｐＨは４．０〜６．０の範囲内であり、また、工程Ｃの第２段目の酵素処理の適当なｐＨは、工程Ａの実施されたｐＨに対しｐＨを０．１以上上昇させることを前提条件として、４．２〜１１．０の範囲内とすることができる。この際のｐＨの保持にはｐＨ調整剤を使用することができる。

使用する酵素としては、第１段目の酵素処理である工程Ａにおける酵素はタンナーゼを含むことができ、さらにプロテアーゼを含むことができる。工程Ｃの第２段目の酵素処理は、工程Ａにて添加した酵素を失活せずにそのまま引き続き使用しても良いし、工程Ｃにおいて酵素を新たに添加しても良い。この際、添加する酵素は、工程Ａで使用した酵素とは異なる酵素であっても良い。なお、第２段目の酵素処理である工程Ｃにおける酵素はプロテアーゼを含むものとすることができる。また、工程Ａの第１段目の酵素処理および／または工程Ｃの第２段目の酵素処理における酵素はグルタミナーゼおよび／またはアスパラギナーゼを含むものとすることができる。さらには、工程Ａの第１段目の酵素処理、工程Ｃ第２段目の酵素処理のいずれにおいても、酵素としては糖質分解酵素を含むことができる。また、本発明で使用する茶葉は不発酵茶、半発酵茶または発酵茶とすることができる。さらにまた、本発明には、第１段目の酵素処理を全く省略し、ｐＨ調整剤を添加することにより、ｐＨを４．８〜１１．０の範囲内に保持しながらプロテアーゼ処理する工程を含む茶類抽出物の製造方法も含まれる。

本発明によれば、従来の茶酵素処理抽出物と比較して、今まで十分利用されなかった茶葉のタンパク質がさらに分解され、遊離アミノ酸量が著しく増加し、旨味、こく味、甘味の強い茶類抽出物を得ることができる。また、その抽出物を茶類飲料に配合することにより、茶類飲料の旨味、こく味、甘味を大幅に増強することができ、また、同時に苦渋味を低減する効果を有することから、その茶類飲料の嗜好性を著しく向上させることができる。

図１は本発明品２におけるアミノ酸生成量の推移を示したグラフである（実施例２）。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の方法において原料で使用しうる茶葉としては、ツバキ科の常緑樹であるチャ（学名：Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ）Ｏ．Ｋｕｎｔｚｅ）の芽、葉、茎などから得られる生葉、製茶された茶、例えば、不発酵茶、半発酵茶および発酵茶いずれでもよく、不発酵茶は煎茶、焙じ茶、玉露、かぶせ茶、てん茶等、番茶、玉緑茶、抹茶、釜炒り茶、などが挙げられる。半発酵茶は包種茶、鉄観音茶、ウーロン茶など、発酵茶は紅茶、阿波番茶、碁石茶、プアール茶などを挙げることができる。また、不発酵茶、半発酵茶および発酵茶を花で加香したジャスミン茶のような茶も使用することができる。また、焙煎した穀物を茶に添加した玄米茶なども使用することができる。特に、一般にタンパク質、アミノ酸の含量が多いといわれる不発酵茶および半発酵茶が好適である。

これらの茶葉は水と混合する前に適当な大きさに粉砕または裁断することで、水との混合・攪拌状態を良好にすることができるが、あまり細かくしてしまうと、雑味が出る原因となる。好ましい粉砕または裁断の大きさは０．１ｍｍ〜原体（未粉砕）程度であるが、雑味の出にくさと、水との混合・攪拌状態を考慮した場合０．２ｍｍ〜２０ｍｍが好ましく、さらには０．５ｍｍ〜１０ｍｍが好ましい。粉砕粒度が０．１ｍｍを下回る場合、抽出液に雑味、嫌みがでるため好ましくない。

使用する水の量は茶葉が水と混合され、物理的に攪拌が容易な量であれば特に制限はなく、茶葉の性質、茶葉の粉砕・裁断粒度にもよるため一概に規定はできないが、通常茶葉１質量部に対し２質量部〜１００質量部を例示することができる。しかし、茶葉に対し水が少なすぎると、攪拌、酵素反応が行いにくく、また、水が多すぎると抽出液の濃度が低下してしまうため、茶葉１質量部に対し５質量部〜５０質量部が好ましく、さらに、茶葉１質量部に対し８質量部〜２０質量部が特に好ましい。水の量が茶葉１質量部に対し２質量部未満の場合、攪拌ができなくなってしまい、酵素反応には不適当である。また、水の量が茶葉１質量部に対し１００質量部より多く使用した場合、抽出液の濃度が薄くなってしまい、飲料などに添加する場合に多量に必要になったり、また、抽出液を濃縮する場合でも多量の水を蒸発させなければならないなど不利益な面が多くなってしまい好ましくない。なお、茶葉と水の混合物は、酵素処理に先立ち、約６０℃〜約１２１℃で約２秒〜約２０分間殺菌した後冷却してから酵素処理に供することが好ましい。また、茶葉の酸化劣化防止のため、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムを茶葉と水の混合物全量に対し、１０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍ程度配合することが好ましい。

本発明では、この茶葉と水の混合物にまず、工程Ａとして、第１段目の酵素処理を行う。次いで工程ＢとしてｐＨを０．１以上上昇させる。さらに工程Ｂの後に、工程Ｃとして第２段目の酵素処理を行う。この一連の工程を採用することにより、効率的で効果的な酵素処理を行うことができる。

（工程Ａ）
工程Ａの第１段目の酵素処理に使用する酵素としては、各種の酵素が使用できるが、タンナーゼを最も好ましく例示でき、さらにはタンナーゼに加えて、プロテアーゼを併用しても良い。茶葉中には多量の蛋白質が存在するが、茶葉に単にプロテアーゼを作用させても、アミノ酸の遊離はあまり多くない。これは、蛋白質がタンニンと固く結合しているためと推定される。第１段目の酵素処理としてタンナーゼを作用させることで、茶葉中の蛋白質とタンニンの結合を切り離すことができ、プロテアーゼやその他の酵素が作用しやすくなる。

タンナーゼは、タンニン中の水酸基に没食子酸がエステル結合しているデプシド結合を加水分解する酵素、例えば、エピガロカテキンガレートをエピガロカテキンと没食子酸に加水分解する酵素である。本発明で使用することのできるタンナーゼとしては、具体的には、例えば、アスペルギルス (Aspergillus) 属、ペニシリウム (Penicillium) 属、リゾプス (Rhizopus) 属、リゾムコール (Rhizomucor) 属、ラクトバシラス (Lactobacillus) 属、スタフィロコッカス (Staphylococcus) 属、ストレプトコッカス (Streptococcus) 属、ロネピネラ(Ronepinella)属などに属するタンナーゼ生産菌を、これら糸状菌の培養に通常用いられる培地で常法に従って固体培養または液体培養し、得られる培養物またはその処理物を常法により精製処理することにより得られるものを挙げることができる。また、市販されているタンナーゼ、例えば、タンナーゼ―ＫＴＦＨ、タンナーゼ―ＫＴ０５、タンナーゼ―ＫＴ５０（以上、キッコーマンバイオケミファ社製）；タンナーゼ（５００Ｕ／ｇ、三菱化学フーズ社製）；スミチーム（登録商標）ＴＡＮ（新日本化学工業社製）などを用いることもできる。タンナーゼの使用量は、力価などにより異なり一概には言えないが、通常、茶葉の質量を基準として０．１〜５０Ｕ／ｇ、好ましくは約０.５〜約２０Ｕ／ｇの範囲内を例示することができる。

茶葉の水懸濁液のｐＨは前述の通りｐＨ５〜６程度であるが、タンナーゼの至適ｐＨは５．０〜５．５程度である。しかしながら、茶葉にタンナーゼを作用させると、前記の通り、没食子酸が生成するため、反応の進行に伴い、徐々にｐＨが低下し、４．０〜５．０程度となる。この間に、至適ｐＨの範囲内を経由することとなる。

この第１段目の酵素処理において、タンナーゼを作用させるに際しては、タンナーゼがやや酸性側で作用し易いことも考慮すると、特にｐＨ調整を行う必要はなく、反応の際のｐＨはｐＨ調整をしなくとも４．０〜６．０程度となる。しかしながら、必要に応じて，ｐＨ調整を行い、ｐＨ４．０〜６．０の範囲内を保持しながら行っても良いことはいうまでもない。第１段目におけるタンナーゼ処理の反応温度および時間は、２０℃〜６０℃、特に２５℃〜５０℃が好ましい。また、反応時間としては５分〜２４時間、好ましくは１時間〜２０時間、より好ましくは４時間〜１８時間を例示することができる。

この第１段目の酵素処理においてはタンナーゼに加えて、さらに、プロテアーゼを添加して作用させることにより、茶葉中のタンパク質を分解することもできる。前述の通り、第１段目の酵素処理の際のｐＨは４〜６程度となり、また、タンナーゼの至適ｐＨは５．０〜５．５程度である。したがって、この際に添加するプロテアーゼは、作用中のｐＨの範囲を考慮すると、酸性プロテアーゼが好ましいともいえる。しかしながら、工程ＢによりｐＨを上昇させた後プロテアーゼを失活させずに引き続き工程Ｃの２段目の酵素反応を行うことも考慮した場合、特に制限はなく、市販の各種プロテアーゼを少なくとも１種類以上を使用することができる。

使用できるプロテアーゼとしては、例えば、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、ウマミザイムＧ、ペプチダーゼＲ、ニューラーゼ（登録商標）Ｆ、プロザイム、プロレザー（登録商標）ＦＧーＦ、プロテアックス（登録商標）、プロチンＳＤ―ＮＹ１０、サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ、パパインＷ―４０（以上、天野エンザイム社製）；スミチーム（登録商標）ＡＰ、ＬＰ、ＭＰ、ＦＰ、ＬＰＬ（以上、新日本化学工業社製）；デナプシン２Ｐ、デナチーム（登録商標）ＡＰ、ＸＰー４１５、食品用精製パパイン（以上、ナガセケムテックス社製）；オリエンターゼ（登録商標）ＡＹ、１０ＮＬ、９０Ｎ、２０Ａ、ＯＮＳ、テトラーゼ（登録商標）Ｓ、ヌクレイシン（登録商標）（以上、エイチビィアイ社製）；モルシン（登録商標）Ｆ、ＰＤ酵素、ＩＰ酵素、ＡＯ−プロテアーゼ（以上、キッコーマンバイオケミファ社製）；サカナーゼ（科研製薬社製）；プロテアーゼＹＰーＳＳ、パンチダーゼ（登録商標）ＮＰー２、Ｐ、アロアーゼ（登録商標）ＡＰー１０（以上、ヤクルト薬品工業社製）；Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）、プロタメックス、ニュートラーゼ、アルカラーゼ（以上、ノボザイムズ社製）；コクラーゼ（登録商標）ＳＳ、Ｐ（以上、三菱化学フーズ社製）；ＶＥＲＯＮ（登録商標）ＰＳ、Ｗ、ＣＯＲＯＬＡＳＥ（登録商標）ＰＮーＬ、Ｎ、７０８９（以上、ＡＢＥｎｚｙｍｅｓ社製）；エンチロンＮＢＳ（洛東化成工業社製）；プロテックス７Ｌ、プロテックス１４Ｌ（以上、ダニスコジャパン社製）；アクチナーゼ（登録商標）ＡＳ（科研ファルマ社製）；その他動物由来のペプシン、トリプシンなども挙げることができる。前記プロテアーゼは１種もしくは２種以上組み合わせて使用することで、その効果を一層高めることができる。プロテアーゼの使用量は、力価などにより一概には言えないが、例えば、茶葉の質量を基準として０．０１〜１００Ｕ／ｇの範囲を例示することができる。

ｐＨ以外の酵素処理の条件としては、使用したプロテアーゼに応じた通常の酵素処理条件を採用することができる。酵素反応の温度としては、必ずしも酵素の至適温度で反応させる必要はなく、風味劣化を防止するため、やや低めで反応させることが好ましい場合もあり、例えば、プロテアーゼ処理の条件としては、前述のタンナーゼ処理と同様に、２０℃〜６０℃、特に２５℃〜５０℃が好ましい。また、反応時間としては５分〜２４時間、好ましくは１時間〜２０時間、より好ましくは４時間〜１８時間を例示することができる。

また、酵素反応中には茶葉成分の酸化劣化防止のため、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムを酵素抽出液全量に対し、１０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍ程度添加しても良い。

（工程Ｂ）
本発明では、工程Ａの後に、工程ＢとしてｐＨを上昇させる工程を行う。このｐＨを上昇させる工程を行うことで、次の工程Ｃの第２段目の酵素処理において、第１段目の酵素と異なった特性を有し得る酵素が作用しやすくなり、全体として効率的、効果的に茶葉成分、特に蛋白質を分解することができる。上昇させるｐＨの値は特に問わないが、工程Ａの実施されたｐＨに対して、０．１以上とすることができ、０．２以上が好ましく、０．４以上をより好ましく、０．６以上をさらに好ましく、０．８以上を特に好ましく、１．０以上を最も好ましく挙げることができる。ｐＨの上昇の値をある程度大きな値とすることにより、第２段目の酵素処理において、第１段目の酵素と異なった特性を有し得る酵素が作用しやすくなる傾向がある。

第１段目の酵素処理におけるｐＨは前述の通り、４〜６程度であるが、工程Ｂで上昇させた後のｐＨは４．２〜１１．０、好ましくは４．４〜１０．０、より好ましくは４．６〜９．０、いっそうより好ましくは、４．８〜８．０とすることができる。

工程ＢにおいてｐＨを上昇させるためには、ｐＨ調整剤を添加する方法を採用することができる。ｐＨ調整剤としては、食品添加物として使用できる一般的なアルカリ金属塩が使用でき、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムなどが例示できる。ｐＨ調整剤は、第１段目の酵素処理終了後に一度に添加することもできるが、第２段目の酵素処理途中のｐＨの変化を測定しながら、追加的に添加し、ｐＨを４．２〜１１．０、好ましくは４．４〜１０．０、より好ましくは４．６〜９．０、いっそうより好ましくは、４．８〜８．０の範囲内に保つ方法を採用することもできる。使用するｐＨ調整剤の量は、使用する茶葉や酵素の量、併用する酵素などの条件により、一概に言えないが、おおよそ茶葉に対し、質量比で０．０１％〜１％程度を例示できる。

なお、工程Ａの第１段目の酵素処理と工程Ｃの第２段段間目の酵素処理の間には、酵素失活処理を行っても良く、また、酵素失活を行わなくても良い。酵素失活する場合の条件としては、約６０℃〜約１２１℃で約２秒〜約２０分間の加熱処理を採用することができる。酵素失活を行わない場合は、工程Ｃの第２段目の酵素処理において、第１段目の酵素処理で使用した酵素が、引き続き作用することとなる。例えば、第１段目の酵素として使用した酵素がややアルカリ性領域で作用するプロテアーゼを含む酵素製剤などであった場合に、第１段目の酵素処理とは異なったｐＨでの作用が期待できる。

（工程Ｃ）
本発明では、工程Ｂの後に、工程Ｃとして第２段目の酵素処理する工程を行う。この第２段目の酵素処理により、第１段目の酵素と異なった特性を有し得る酵素が作用し、全体として効率的、効果的に茶葉成分、特に蛋白質を分解することができる。第２段目の酵素処理のｐＨは前述の通り４．２〜１１．０、好ましくは４．４〜１０．０、より好ましくは４．６〜９．０、いっそうより好ましくは、４．８〜９．０程度の範囲を採用できるが、ｐＨが特に高い場合、例えば、ｐＨ９以上とした場合には特に注意が必要である。ｐＨが９以上の場合は、茶葉成分の分解は効率的に進行するというメリットが得られるが、その一方で、茶葉抽出液が褐変したり、分解に伴うドブ様の臭気が発生するというマイナス面が顕著となる可能性もある。

第２段目の酵素処理における酵素としては、プロテアーゼが好ましく、特に、中性域からややアルカリ性域で作用する酵素が好ましい。使用できるプロテアーゼとしては、前述と同様の市販のプロテアーゼを挙げることができる。この工程でのプロテアーゼの使用量も第１段目の酵素処理と同様に、力価などにより一概には言えないが、例えば、茶葉の質量を基準として０．０１〜１００Ｕ／ｇの範囲を例示することができる。

また、第２段目の酵素処理においても酵素反応中の酸化劣化防止のため、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムを酵素抽出液全量に対し、１０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍ程度添加しても良い。

また、反応温度や時間も、使用したプロテアーゼに応じた通常の酵素処理条件を採用することができる。酵素反応の温度としては、必ずしも酵素の至適温度で反応させる必要はなく、風味劣化を防止するため、やや低めで反応させることが好ましい場合もあり、例えば、２０℃〜６０℃を例示でき、特に２５℃〜５０℃が好ましい。また、反応時間としては５分〜２４時間、好ましくは１時間〜２０時間、より好ましくは４時間〜１８時間を例示することができる。

また、本発明では、工程（Ａ）でプロテアーゼおよびタンナーゼを用いた場合には、工程（Ａ）および／または工程（Ｃ）でグルタミナーゼおよび／またはアスパラギナーゼを作用させることで、より旨味の強い茶抽出物、特に緑茶抽出物を得ることができる。

グルタミナーゼは、グルタミンやテアニンをグルタミン酸に加水分解する活性を有する酵素であり、具体的には、グルタミナーゼ生産能を有する糸状菌や大腸菌を常法に従って培養し、得られた培養物を常法により精製したものを挙げることができる。また、市販されているグルタミナーゼ、例えば、Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ（Ｆｌｕｋａ社製：糸状菌由来）、Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製：大腸菌由来）、グルタミナーゼ ダイワ Ｃ１００Ｓ（大和化成社製：糸状菌由来）、グルタミナーゼ ダイワ Ｃ３００Ｓ（大和化成社製：糸状菌由来）、グルタミナーゼ ダイワ Ｃ１００Ｍ（大和化成社製：糸状菌由来）、スミチームＯＰ（新日本化学社製：糸状菌由来）などを用いても良い。グルタミナーゼの使用量は、力価などにより異なるが、例えば、茶類原料の重量を基準として０．００１〜１００Ｕ／ｇの範囲を例示することができる。市販のグルタミナーゼには、テアニンに作用せず、グルタミンにのみ作用するものもあり、例えば、スミチームＧＴ（新日本化学社製：糸状菌由来）などが挙げられる。

アスパラギナーゼは、アスパラギンをアスパラギン酸に加水分解する活性を有する酵素であり、具体的には、アスパラギナーゼ生産能を有する糸状菌や大腸菌を常法に従って培養し、得られた培養物を 常法により精製したものを挙げることができる。また、市販されているアスパラギナーゼ、例えば、アスパラギナーゼ（ＤＳＭニュートリションジャパン社製：糸状菌由来）などを用いても良い。アスパラギナーゼの使用量は、力価などにより異なるが、例えば、茶類原料の重量を基準として０．００１〜１００ｕｎｉｔ／ｇの範囲を例示することができる。

茶葉中の遊離アミノ酸、または、茶葉から製茶された茶類、特に緑茶中の遊離アミノ酸は通常、主成分としてテアニンが多くの割合を占め、グルタミン酸およびアスパラギン酸もかなりの割合を占めているが、グルタミンやアスパラギンは通常の茶葉中にはあまり多く含まれていない。一方、工程（Ａ）においてタンナーゼおよびプロテアーゼを作用させて茶葉中に存在する構成タンパク質を分解すると、テアニンは全く生成せず、グルタミン酸、アスパラギン酸の生成量もあまり多くないが、グルタミンおよびアスパラギンは多量に生成する。グルタミン酸およびアスパラギン酸は茶の旨味に大きく寄与するアミノ酸と考えられており、工程（Ａ）において茶葉にタンナーゼおよびプロテアーゼを作用させてグルタミンおよびアスパラギンを生成させて、それを工程（Ａ）および／または工程（Ｃ）においてグルタミナーゼおよび／またはアスパラギナーゼを作用させることにより、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸を生成させることにより、従来の方法では得られなかった旨味の強い緑茶エキスを得ることができる。

なお、テアニンは、実際には旨味にはあまり寄与しない成分とされており、テアニンをグルタミン酸に変換することで、旨味を増強することができるが、テアニンは茶特有の成分であり、各種の優れた機能性を有する成分である。そのため、テアニンを有効に利用したい場合には、グルタミナーゼとして、テアニンに作用せずグルタミンにのみ作用するグルタミナーゼを用いることが可能である。

また、本発明では、前記の第１段目または第２段目の工程のいずれにおいても、糖質分解酵素を併用させることができる。糖質分解酵素を茶葉に作用させることで、茶葉中のセルロース、ヘミセルロース、ペクチンなどが分解し、単糖、２糖、オリゴ糖などが生成し、より一層甘味、こく味の豊富な茶類抽出物を得ることができる。

本発明で使用することのできる糖質分解酵素としては、例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、など多糖類に作用して、単糖、オリゴ糖などを生成する酵素を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

ペクチナーゼは、ポリガラクツロナーゼ、ペクチックエンザイム、ポリメチルガラクツロナーゼ、ペクチンデポリメラーゼとも呼ばれ、ペクリニン酸、ペクチン、ペクチン酸などのα−１，４結合を加水分解する酵素である。ペクチナーゼは、細菌、カビ、酵母、高等植物、カタツムリなどに含まれていることが知られており、本発明ではこれらをはじめとする生物から採取したペクチナーゼを広く使用することができる。また、市販のペクチナーゼ製剤を使用することもできる。例えば、ペクチナーゼＰＬ「アマノ」、ペクチナーゼＧ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）；ＰｅｃｔｉｎａｓｅーＧＯＤＯ（合同酒精社製）；スクラーゼ（登録商標）Ａ、Ｎ、Ｓ（以上、三菱化学フーズ社製）；スミチーム（登録商標）ＡＰー２、ＳＰＣ、ＳＰＧ、ＭＣ、ＰＸ、液状スミチームＡＰー２、（以上、新日本化学工業社製）；ペクチナーゼＸＰー５３４（ナガセケムテックス社製）；ペクチネックス（登録商標）、ペクチネックスウルトラＳＰーＬ、ウルトラザイム（登録商標）、ビノザイム、Ｃｉｔｏｒｏｚｙｍ（登録商標）、Ｐｅｅｌｚｙｍｅ（登録商標）（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）；セルロシン（登録商標）、ＰＥ６０、ＰＥＬ、可溶性ペクチナーゼＴ（以上、エイチビィアイ社製）；ペクチナーゼＳＳ、ペクチナーゼＨＬ（以上、ヤクルト薬品工業社製）などを例示することができる。

ペクチナーゼの使用量は、ペクチナーゼ製剤には通常複数種類の酵素が含まれているため活性単位では表しにくく、元の茶葉に対して通常、約０．０１質量％〜約５質量％、好ましくは約０．１質量％〜約２質量％の範囲内を例示することができる。

セルラーゼはβ−１，４ーグルカン（例えば、セルロース）のグリコシド結合を加水分解する酵素である。セルロースはＤーグルコースがβ−１，４結合で分枝無くつながった多糖類の一種でグルコースの数はおよそ５，０００個程度と言われている。植物の細胞壁の主要な構成成分で、親水性は強いが水に不溶である。セルラーゼにはセルロースを分子内部から切断するエンドグルカナーゼと、糖鎖の還元末端と非還元末端のいずれかから分解し、セロビオースを遊離するエキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）がある。また、市販のセルラーゼ類には、β−グルコシダーゼが混在し、グルコースを遊離するものも多い。本発明で用いることのできるセルラーゼとしては、セルロースを分解する活性を有するものであれば特に制限はなく任意のものを使用することができ、市販品のセルラーゼ製剤としては、例えば、セルラーゼＴ「アマノ」、セルラーゼＡ「アマノ」（以上天野エンザイム社製）；ドリセラーゼ（登録商標）ＫＳＭ、マルチフェクト（登録商標）Ａ４０、セルラーゼＧＣ２２０（以上ジェネンコア協和社製）；セルラーゼＧＯＤＯーＴＣＬ、セルラーゼＧＯＤＯＴＣＤーＨ、ベッセレックス（登録商標）、セルラーゼＧＯＤＯＡＣＤ（以上、合同酒精社製）；Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（東洋紡績社製）；セルライザー（登録商標）、セルラーゼＸＬー５２２（以上ナガセケムテックス社製）；セルソフト（登録商標）、デニマックス（登録商標）（以上ノボザイムズ社製）；セルロシン（登録商標）ＡＣ４０、セルロシン（登録商標）ＡＬ、セルロシン（登録商標）Ｔ２（以上エイチビィアイ社製）；セルラーゼ“オノズカ”３Ｓ、セルラーゼＹーＮＣ（以上ヤクルト薬品工業社製）；スミチーム（登録商標）ＡＣ、スミチーム（登録商標）Ｃ（以上新日本化学工業社製）；エンチロンＣＭ、エンチロンＭＣＨ、バイオヒット（洛東化成工業社製）などが挙げられる。セルラーゼの使用量は元の茶葉に対して通常、約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。

ヘミセルラーゼはヘミセルロースを分解する酵素である。ヘミセルロースは、陸上植物細胞の細胞壁を構成する多糖類のうち、セルロースとペクチン以外のものであり、構成する糖が多様であり、結合様式も複雑である。さらにセルロースと水素結合、リグニンと共有結合などを形成し、細胞壁を補強する役割をしている。骨格となる主鎖の糖に側鎖の糖などが結合した構造をしており、それを分解するヘミセルラーゼは、非常に種類が多い。

ヘミセルラーゼとしては、例えば、グルカナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ポリガラクツロナーゼなどを挙げることができるが、これらの多種類の糖結合を分解する活性を複数併せ持った酵素ととらえることもできる。市販のヘミセルラーゼとしては、例えばヘミセルラーゼ「アマノ」（天野製薬社製）；ベイクザイム（登録商標）ＨＳ２０００、ベイクザイム（登録商標）ＩＣｏｎｃ（以上、日本シイベルヘグナー社製）；エンチロンＬＱ（洛東化成工業社製）；セルロシン（登録商標）ＨＣ１００、セルロシン（登録商標）ＨＣ、セルロシン（登録商標）ＴＰ２５、セルロシン（登録商標）Ｂ、ヘミセルラーゼＭ（以上、エイチビィアイ社製）；スミチーム（登録商標）Ｘ（新日本化学工業社製）；ＶＥＲＯＮ１９１、ＶＥＲＯＮ３９３（以上、レーム・エンザイム社製）などが挙げられる。ヘミセルラーゼの使用量は元の茶葉に対して通常約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。

アミラーゼはグリコシド結合を加水分解することでデンプン中のアミロースやアミロペクチンを、グルコース、マルトースおよびオリゴ糖に変換する酵素である。アミラーゼにはα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼがある。α−アミラーゼはデンプンやグリコーゲンのα−１，４結合を不規則に切断し、多糖ないしオリゴ糖を生み出す酵素である。β−アミラーゼはデンプンやグリコーゲンを麦芽糖に分解する酵素である。グルコアミラーゼは糖鎖の非還元末端のα−１，４結合を分解してブドウ糖を産生する酵素である。これらのアミラーゼのうち、特にグルコアミラーゼを好ましく例示できる。グルコアミラーゼは糖鎖の非還元末端のα−１，４結合を分解してグルコースを産生する酵素であるため、茶葉に作用させることにより甘味の強いグルコースが生成するため甘味の増強に効果が大きいと考えられる。市販のグルコアミラーゼとしては、例えば、グルク（登録商標）ＳＧ、グルクザイム（登録商標）ＡＦ６、グルクザイム（登録商標）ＮＬ４．２、酒造用グルコアミラーゼ「アマノ」ＳＤ（以上、天野エンザイム社製）；ＧＯＤＯーＡＮＧＨ（合同酒精社製）；コクラーゼ（登録商標）Ｇ２、コクラーゼ（登録商標）Ｍ（以上、三菱化学フーズ社製）；オプチデックスＬ（ジェネンコア協和社製）；スミチーム（登録商標）、スミチーム（登録商標）ＳＧ（以上、新日本化学工業社製）；グルコチーム（登録商標）＃２００００（ナガセケムテックス社製）；ＡＭＧ、サンスーパー（以上、ノボザイムズジャパン社製）；グルターゼＡＮ（エイチビィアイ社製）；ユニアーゼ（登録商標）Ｋ、ユニアーゼ（登録商標）２Ｋ、ユニアーゼ（登録商標）３０、ユニアーゼ（登録商標）６．０Ｆ（以上、ヤクルト薬品工業社製）；マグナックス（登録商標）ＪＷー２０１（洛東化成工業社製）；グリンドアミル（登録商標）ＡＧ（ダニスコジャパン社製）などが挙げられる。アミラーゼの使用量は元の茶葉に対して通常に対し約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。

グルカナーゼは広義にはグルカンを加水分解する酵素である。グルカンとは、グルコースがグリコシド結合で繋がったポリマーで、結合様式としてはα−１，４、α−１，６、β−１，３、β−１，４、β−１，６などがある。一つのグルカンの中に二つの結合様式が混在することはあるが、α型とβ型が混在することはなく、それぞれα−グルカン、β−グルカンと言われ、天然に最も多く存在する多糖である。α−グルカンの代表的な物質として澱粉（α−１，４）、β−グルカンの代表的物質としてセルロース（β−１，４）が挙げられる。グルカナーゼは狭義にはアミラーゼおよびセルラーゼを除いたものを指すことも多く、β−グルカン（β−１，３、β−１，４、β−１，６結合によるグルコースのポリマー）を分解する酵素をいうこともあり、本発明でいうグルカナーゼはβ−グルカンを分解する酵素を意味する。市販のグルカナーゼとしては、例えば、フィニザイム（登録商標）、ウルトラフロ（登録商標）、ビスコザイム（登録商標）、グルカネックス、セレミックス（以上、ノボザイムズジャパン社製）；マルチフェクト（登録商標）ＢＧＬ、β−グルカナーゼ７５０Ｌ（以上、ジェネンコア協和社製）；ツニカーゼ（登録商標）ＦＮ（大和化成社製）；グルカナーゼ（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＩｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）社製）などが挙げられる。グルカナーゼの使用量は元の茶葉に対して通常約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。

マンナナーゼはβ−１，４−Ｄーマンノピラノシド結合を加水分解する反応を行う酵素である。市販酵素としては、例えば、マンナナーゼＢＧＭ「アマノ」、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０、セルラーゼＡ「アマノ」３、ペクチナーゼＰＬ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）；β−１，４ーマンナナーゼ（ヤクルト薬品工業社製）；スミチーム（登録商標）ＡＣＨ、スミチーム（登録商標）ＡＣ、スミチーム（登録商標）Ｘ、スミチーム（登録商標）ＳＰＣ（以上、新日本化学社製）；セルロシン（登録商標）ＧＭ５（エイチビイアイ社製）；スクラーゼＣ（以上、三菱化学フーズ社製）などを例示することができる。マンナナーゼの使用量は元の茶葉に対して通常約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。

α−ガラクトシダーゼはＤ−ガラクトピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシドなどのα−ガラクトシド結合を加水分解する反応を行う酵素である。市販のα−ガラクトシダーゼとしては、スミチーム（登録商標）ＡＧＳ（新日本化学工業社製）が挙げられる。ガラクトシダーゼの使用量は元の茶葉に対して通常約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。

本発明では、糖質分解酵素である、前記のペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼおよびα−ガラクトシダーゼのうち２種類以上を組み合わせて使用することで、より効果的に抽出液の甘味、旨味を増強することができる。本発明では澱粉質を分解するためにさらにα−アミラーゼおよび／またはβ−アミラーゼを併用することにより甘味や旨味の増強につながることもある。α−アミラーゼおよびβーアミラーゼは特に澱粉質の多い、穀物類に対して有効である。

市販のα−アミラーゼ製剤としては、ビオザイム（登録商標）Ｆ１ＯＳＤ、アミラーゼＳ「アマノ」３５Ｇ、ビオザイム（登録商標）Ａ、ビオザイム（登録商標）Ｌ（以上アマノエンザイム社製）；コクラーゼ（登録商標）（三菱化学フーズ社製）；スミチーム（登録商標）Ｌ（新日本化学工業社製）；クライスターゼ（登録商標）Ｌ１、クライスター（登録商標）Ｐ８、クライスターゼ（登録商標）ＳＤ８０、コクゲンＳＤーＡ、コクゲンＬ、クライスターゼ（登録商標）Ｔ１０Ｓ（以上、大和化成社製）；ビオテックスＬ＃３０００、ビオテックスＴＳ、スピターゼＨＳ、スピターゼＣＰー４０ＦＧ、スピターゼＸＰー４０４（以上、ナガセケムテックス社製）；グリンドアミル（登録商標）Ａ（ダニスコジャパン社製）；ＢＡＮ、ファンガミル（登録商標）、ターマミル（登録商標）、ノバミル（登録商標）、マルトゲナーゼ（登録商標）、リコザイムスープラ、ステインザイム（登録商標）、アクアザイム、サーモザイム（登録商標）、デュラミル（登録商標）（以上、ノボザイムズジャパン社製）；フクタミラーゼ（登録商標）３０、フクタミラーゼ（登録商標）５０、フクタミラーゼ（登録商標）１０Ｌ、液化酵素６Ｔ、液化酵素、リクィファーゼＬ４５（以上、エイチビーアイ社製）；ＶＥＲＯＮＡＸ、ＶＥＲＯＮＧＸ、ＶＥＲＯＮＭ４、ＶＥＲＯＮＥＬＳ（以上、樋口商会社製）；ユニアーゼ（登録商標）ＢＭー８（ヤクルト薬品工業社製）；ラタターゼ、ラタターゼＲＣＳ、ＳＶＡ、マグナックスＪＷー１２１、スミチーム（登録商標）Ａー１０、スミチーム（登録商標）ＡＳ（以上、新日本化学工業社製）；ソフターゲン（登録商標）・３Ｈ（タイショウテクノス社製）；スペザイム（登録商標）ＡＡ、スペザイム（登録商標）ＦＲＥＤ、ピュラスターＯｘＡｍ、ピュラスターＳＴ（以上、ジェネンコア協和社製）；ベイクザイム（登録商標）Ｐ５００（日本シイベルヘグナー社製）などが挙げられる。またβ−アミラーゼ製剤としてはオプチマルトＢＢＡ（ジェネンコア協和社製）；β−アミラーゼ＃１５００、β−アミラーゼＬ、β−アミラーゼ＃１５００Ｓ（以上、ナガセケムテックス社製）；ハイマルトシン（登録商標）Ｇ、ハイマルトシン（登録商標）ＧＬ（以上、エイチビィアイ社製）；ユニアーゼ（登録商標）Ｌ（ヤクルト薬品工業社製）；ＧＯＤＯーＧＢＡ（合同清酒社製）などが挙げられる。また、α−アミラーゼ活性、β−アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性の全てを含むアミラーゼ複合酵素製剤なども使用することができる。アミラーゼの使用量は元の茶葉に対して通常約０．０１質量％〜約１質量％、好ましくは約０．１質量％〜約０．５質量％の範囲内を例示することができる。
酵素処理の条件としては、前記の各工程における酵素処理の条件をそのまま使用することができる。

また、本発明では、第１段目の酵素処理を全く省略し、ｐＨ調整剤を添加することにより、ｐＨを未調整の場合よりも、やや高い範囲内に保持しながらプロテアーゼ処理することもできる。第１段目の酵素処理においてタンナーゼ処理を行わなくとも、ｐＨをやや高めとすることで、蛋白質とタンニンの結合が緩くなり、蛋白質にプロテアーゼが作用しやすくなる。また、従来茶葉の酵素分解に使用していた酸性プロテアーゼ以外にも、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼなども作用しやすくなる。この際のｐＨは未調整よりも高ければ特に限定はないが、ｐＨとしては、例えば、４．８〜１１．０、好ましくは５．８〜９．０、より好ましくは６．０〜８．５、特に好ましくは７．０〜８．０を挙げることができる。

この場合のｐＨ調整剤としても、前述の、食品添加物として使用できる一般的なアルカリ金属塩、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムなどが使用できる。また、プロテアーゼとしても、前記の各種プロテアーゼを少なくとも１種類以上を使用することができ、プロテアーゼ処理と併用して、タンナーゼや糖質分解酵素を作用させることもできる。また、反応温度や時間も、使用したプロテアーゼに応じた通常の酵素処理条件を採用することができ、例えば、２０℃〜６０℃を例示でき、特に２５℃〜５０℃が好ましい。また、反応時間としては５分〜２４時間、好ましくは１時間〜２０時間、より好ましくは４時間〜１８時間を例示することができる。

すべての酵素反応終了後の酵素処理物は、６０℃〜１２１℃で２秒〜２０分間酵素失活した後冷却し、遠心分離、濾紙濾過等の適宜な分離手段を採用して分離することにより清澄な茶類抽出物を得ることができる。

得られた茶類抽出物は、このままでも本発明の茶類抽出物とすることもできるが、さらにＰＶＰＰ（ポリビニルピロリドン）、活性炭等で処理することにより、茶類抽出物中に残存するタンニンや、カフェイン、ポリフェノールを除去でき、さらにすっきりした甘味、旨味を有する茶類抽出物とすることができる。ＰＶＰＰの添加量は、該抽出液の固形分に対して５質量％〜１００質量％、特に１０質量％〜５０質量％添加するのが好ましい。５質量％未満では呈味の改善効果はあまり期待できず、１００質量％を超える範囲では茶自体の風味が損なわれる可能性があり好ましくない。ＰＶＰＰによる処理は、所望する茶類抽出物の風味により一概にはいえないが、例えば、約１０℃〜約５０℃程度の温度範囲で、約１０分〜約２時間攪拌処理する方法を例示することができる。ＰＶＰＰで処理する際、または処理後にアスコルビン酸ナトリウムを配合することにより風味の劣化を防止することができ効果的である。アスコルビン酸ナトリウムの配合量は特に制限されないが、例えば、茶類抽出物の質量を基準として、約０．００５質量％〜約０．５質量％を例示することができる。

その後、得られた茶類抽出物は所望により適宜な濃縮手段、例えば減圧濃縮、逆浸透膜濃縮、凍結濃縮などを採用し濃縮液の形態とすることもできる。濃縮の程度は特に制限されないが、一般には、Ｂｘ３°〜８０°、好ましくは８°〜６０°、より好ましくは１０°〜５０°の範囲内が好適である。

かくして得られる茶類抽出物は、例えば、茶類飲料に配合し、甘味、旨味を大きく増強すると共に、茶類飲料がもつ苦渋味を低減することができる。配合率は求める風味の違いにより一概にいえないが、０．０１質量％〜９０質量％、より好ましくは０．１質量％〜８０質量％である。

また、茶類飲料以外にも乳飲料、機能性飲料、また、菓子類であるキャンディーやクッキー、ケーキ、さらにゼリーなどに配合することができる。前記乳飲料、機能性飲料、菓子類等に配合するのは茶風味を付与するだけではなく、これらが従来有する甘味、旨味を増強することができる。
以下、実施例、比較例および参考例をあげて本発明の好ましい態様をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例において、％表示は質量を基準としたものとして記載している。

実施例１（ｐＨ未調整で酵素処理後、ｐＨを８．０に調整してプロテアーゼ処理）
７５℃イオン交換水６５０ｇにアスコルビン酸ナトリウム０．１５ｇを溶解した水溶液に、ハンマーミル（スクリーン１．２ｍｍ）で粉砕した市販の静岡産１番茶葉５０ｇを加え、８０℃達温にて殺菌後、直ちに４５℃に冷却した。この段階でのｐＨは５．６であった。これにタンナーゼ（三菱化学フーズ社製のタンナーゼ）０．５ｇを加え、１０分間撹拌後、さらに、プロテアーゼＭ（天野エンザイム社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え、４５℃、８時間攪拌反応させた（工程Ａ）。反応終了後のｐＨは４．５であった。１段目の反応終了後９０℃で５分間加熱殺菌し、直ちに４５℃に冷却後、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ８．０に調整した（工程Ｂ）。ここにさらにスミチームＬＰ（新日本化学工業社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え１０分間撹拌後、４５℃にて１６時間静置反応させた（工程Ｃ）。反応終了後のｐＨは６．８２であった。反応終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、本発明の緑茶抽出物（本発明品１）１５８ｇを得た（対茶葉収率３１６％、ｐＨ６．７５、Ｂｘ１５．０°）。

実施例２（ｐＨ未調整でタンナーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼおよびセルラーゼ処理後、ｐＨを８．０に調整してプロテアーゼ処理）
７５℃イオン交換水６５０ｇにアスコルビン酸ナトリウム０．１５ｇおよびハンマーミル（スクリーン１．２ｍｍ）で粉砕した市販の静岡産１番茶葉５０ｇを加え８０℃達温にて殺菌後、直ちに４５℃に冷却した。この段階でのｐＨは５．６であった。これにタンナーゼ（三菱化学フーズ社製）０．５ｇを加え、１０分間撹拌後、さらに、スミチームＡＰ２（新日本化学工業社製のペクチナーゼ）０．５ｇ、セルロシンＡＣ４０（エイチビィアイ社製）０．５ｇおよびプロテアーゼＭ（天野エンザイム社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え、４５℃、８時間攪拌反応させた（工程Ａ）。反応終了後のｐＨは４．５であった。１段目の反応終了後９０℃で５分間加熱殺菌し、直ちに４５℃に冷却後、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ８．０に調整した（工程Ｂ）。ここにさらにスミチームＬＰ（新日本化学工業社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え１０分間撹拌後、４５℃にて１６時間静置反応させた（工程Ｃ）。反応終了後のｐＨは６．８２であった。反応終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、これを冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、本発明の緑茶抽出物（本発明品２）１９７ｇを得た（対茶葉収率３９４％、ｐＨ６．６１、Ｂｘ１５．０°）。

実施例３（ｐＨを８．０に調整してプロテアーゼ処理）
７５℃イオン交換水６５０ｇにアスコルビン酸ナトリウム０．１５ｇを溶解した水溶液に、ハンマーミル（スクリーン１．２ｍｍ）で粉砕した市販の静岡産１番茶葉５０ｇを加え、８０℃達温にて殺菌後、直ちに４５℃に冷却した。この時のｐＨは５．６であった。ここに１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ８．０に調整した後、スミチームＬＰ（新日本化学工業社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え１０分間撹拌後、４５℃にて１６時間静置反応させた。反応終了後のｐＨは７．０５であった。反応終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、本発明の緑茶抽出物（本発明品３）１２５ｇを得た（対茶葉収率２５０％、ｐＨ６．９８、Ｂｘ１５．０°）。

比較例１（酵素無処理）
７５℃イオン交換水６５０ｇにアスコルビン酸ナトリウム０．１５ｇを溶解した水溶液に、ハンマーミル（スクリーン１．２ｍｍ）で粉砕した市販の静岡産１番茶葉５０ｇを加え、８０℃達温にて殺菌後、４５℃にて１時間抽出した。引き続き、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、緑茶抽出物（比較品１）１００ｇを得た（対茶葉収率２００％、ｐＨ５．８６、Ｂｘ１５．０°）。

比較例２（ｐＨ調整せずに、タンナーゼおよびプロテアーゼ処理）
７５℃イオン交換水６５０ｇにアスコルビン酸ナトリウム０．１５ｇを溶解した水溶液に、ハンマーミル（スクリーン１．２ｍｍ）で粉砕した市販の静岡産１番茶葉５０ｇを加え、８０℃達温にて殺菌後、直ちに４５℃に冷却した。これにタンナーゼ（三菱化学フーズ社製）０．５ｇを加え、１０分間撹拌後、さらにプロテアーゼＭ（天野エンザイム社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え、４５℃、８時間攪拌反応させた。反応終了後のｐＨは４．５であった。反応終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、緑茶抽出物（比較品２）１１７ｇを得た（対茶葉収率２３４％、ｐＨ４．５１、Ｂｘ１５．０°）。

比較例３（１段目の酵素処理後、ｐＨ調整を行わずにプロテアーゼ処理）
実施例１において、１段目の反応終了後におけるｐＨ調整（１０％水酸化ナトリウム水溶液の添加）を行わない以外は、実施例１と同様の操作を行い、緑茶抽出物（比較品３）１４０ｇを得た（対茶葉収率２８０％、ｐＨ４．５２、Ｂｘ１５．０°）。

実施例４ 官能評価（緑茶飲料に本発明品および比較品を添加して官能評価）
８０℃に加熱したイオン交換水２０ｋｇに静岡県産緑茶葉１ｋｇを投入し、５分間ゆっくり攪拌した後、４０メッシュ金網を用いて、茶葉を分離し、分離した液を２０℃に冷却し、抽出液１４ｋｇを得、アスコルビン酸ナトリウム７．０ｇ（５００ｐｐｍ）を加え、Ｎｏ．２濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製：保留粒子径５μ）にて濾過し、緑茶飲料原液を得た（緑茶飲料原液の分析値；Ｂｘ：２．２２°、ｐＨ：６．４、タンニン含量（酒石酸鉄法）：０．４４％、アミノ酸含量：０．０７１％）。これを小分けし、イオン交換水にて１０倍（質量比）に希釈し、その希釈液に本発明品１〜３および比較品１〜３をそれぞれ０．５％添加したものを調製し、１３７℃、３０秒間加熱殺菌後、８８℃まで冷却して５００ｍｌペットボトルに充填し、２分間保持後、室温（２５℃）まで冷却し、ペットボトル入り緑茶飲料とした。

上記ペットボトル入り緑茶飲料を良く訓練された１０名のパネラーにて評価を行った。評価は苦渋味、甘味、旨味、バランスについてそれぞれ、非常によい：１０点、良い：８点、やや良い：６点、やや悪い：４点、悪い：２点、非常に悪い０点として、コメントを記した。その平均点およびコメントの平均的な内容を表１に示す。

表１に示した通り、工程（Ａ）としてｐＨ４〜６（実測値５．６）でタンナーゼおよびプロテアーゼ処理後、工程（Ｂ）としてｐＨを８．０に調整し、工程（Ｃ）としてプロテアーゼ処理を行った本発明品１を添加した緑茶飲料は、緑茶の旨味、甘味、こく味が強く、また、苦渋味がほのかでマイルドで、風味全体のバランスが良く、高級抹茶のような呈味であり、極めて良好な評価であった。さらにまた、工程（Ａ）としてｐＨ４〜６（実測値５．６）でタンナーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼおよびセルラーゼ処理後、工程（Ｂ）としてｐＨを８．０に調整し、工程（Ｃ）としてプロテアーゼ処理した本発明品２（すなわち、本発明品１に対し、第１段目の工程においてさらに糖質分解酵素を作用させたもの）を添加した緑茶飲料は、緑茶の旨味、こく味が強く、甘味が際だって強く、また、苦渋味がほのかでマイルドで、風味全体のバランスが良く、高級抹茶のような呈味であり、かつ、苦渋味、甘味、旨味、バランスのいずれについても本発明品１よりも評価の点数が高く、極めて良好であった。

ｐＨを８．０に調整してプロテアーゼ処理した本発明品３を添加した緑茶飲料は緑茶の旨味、甘味、こく味があり、また、苦渋味はあるが、あまり目立たないという良好な評価であり、評価の点数としては、本発明品１および２と比べるとやや劣っているが、ある程度良好な結果であった。

一方、酵素処理を全く行っていない比較品１を添加した緑茶飲料は、緑茶の旨味、甘味が弱く、強い苦渋味を有しているという評価で、苦渋味、甘味、旨味、バランスのいずれについても評価が低かった。

茶葉をｐＨ調整せずにタンナーゼおよびプロテアーゼで処理した比較品２を添加した緑茶飲料は、比較品１を添加した緑茶飲料と比べると、大幅に緑茶の旨味が強くなっているという評価であったが、本発明品１および２と比べると評価はやや低く、本発明品３と比べても劣っていた。苦渋味については比較品１を添加した緑茶飲料より弱いが、まだかなり強く、甘味はやや乏しいという評価であった。

また、ｐＨ調整せずに、タンナーゼおよびプロテアーゼ処理を行い、酵素失活後においても、ｐＨ調整を行わずに、さらにプロテアーゼを作用させ処理した比較品３を添加した緑茶飲料は、比較品２を添加した飲料と比べてやや旨味、甘味が強かったが、苦渋味がやや際だっておりバランスが悪く、総合評価では比較品２と比べて大きな差はなく、本発明品１および２と比べて評価は低かった。

実施例５ 成分分析
本発明品１〜３および比較品１〜３のアミノ酸組成について分析し、固形分収率およびアミノ酸について比較した。
アミノ酸分析装置：日立高速Ｌ−８８００Ａ
測定方法：ニンヒドリンを用いたポストカラム発色によるＨＰＬＣ法
本発明品１〜３および比較品１〜３の抽出物の収量およびアミノ酸分析値（アミノ酸濃度）
を表２に示す。
また、これらの値を茶葉からの値に換算し、茶葉からの固形分収率（Ｂｘ換算）および茶葉１ｇからのアミノ酸抽出量（ｍｇ）としたものを表３に示す。

まず、比較品２は、ｐＨ調整せずに、タンナーゼおよびプロテアーゼ処理を行ったものであるが、酵素処理を全く行わない比較品１に対し、約６倍のアミノ酸が抽出され、茶葉中のタンパク質が分解し、アミノ酸が生成しているものと認められる。一方、ｐＨ調整せずに、タンナーゼおよびプロテアーゼ処理を行い、酵素失活後、ｐＨ調整を行わずにさらにプロテアーゼを作用させ処理した比較品３のアミノ酸収率は、比較品２よりやや多いが、それほど増加しておらず、第２段目のプロテアーゼ処理によりそれほど多くのアミノ酸が生成していないことが判明した。

それに対し、本発明品３は、ｐＨを８．０に調整してプロテアーゼ処理したものであるが、タンナーゼ処理を全く行っていないにもかかわらず、比較品３よりも多くのアミノ酸が生成していた。この理由として、茶葉の水分散液をアルカリ性とすることで、タンニンとタンパク質の結合が弱くなり、その状態でのプロテアーゼ処理により、茶葉中のタンパク質にプロテアーゼが作用しやすくなったことが推定される。また、茶葉からの可溶性固形分収率も全体的に増加することが認められた。

さらに、本発明品１は工程（Ａ）としてｐＨ４〜６でタンナーゼおよびプロテアーゼ処理後、工程（Ｂ）としてｐＨを８．０に調整し、工程（Ｃ）としてプロテアーゼ処理を行ったもの（すなわち、比較品２と同一の工程後に、ｐＨ８．０に調整してプロテアーゼ処理を行ったもの）であるが、比較品２、３と比べてアミノ酸収率が多く、工程（Ｃ）により、多量のアミノ酸が生成していると認められた。また、本発明品１のアミノ酸収率は、本発明品３と比べても極めて多く、工程（Ａ）において、タンナーゼおよびプロテアーゼを用いた酵素処理を行うことにより、工程（Ｃ）におけるタンパク質分解の効果を著しく高めるものと認められた。この理由として、工程（Ａ）において、特にタンナーゼ処理の作用により、茶葉中のタンニンが分解されることにより、茶葉中のタンパク質とタンニンの結合が弱まり、工程（Ｃ）におけるｐＨを上昇させた後のプロテアーゼ処理において、プロテアーゼが茶葉タンパク質に作用しやすくなったものと推定される。また、茶葉からの可溶性固形分収率も全体的さらに増加することが認められた。

さらにまた、本発明品２は、本発明品１における工程（Ａ）において、糖質分解酵素を作用させたものであるが、本発明品１よりもさらにアミノ酸収率が増加し、また、茶葉からの可溶性固形分収率も全体的にさらに増加することが認められた。糖質分解酵素の作用により、細胞壁成分が分解し、また、その結果プロテアーゼがさらに作用しやすくなることによると推定される。

以上の結果より、茶葉に対しプロテアーゼ処理を行う際に、ｐＨ調整剤を添加してｐＨを上昇させることにより、従来分解されにくかった茶葉のタンパク質がさらに分解され、遊離アミノ酸量が著しく増加することが明らかとなった。

また、実施例４における官能評価の結果から、風味の良好であった茶類抽出物は、アミノ酸の生成量が多いことが認められ、茶葉中のタンパク質をアミノ酸に分解することにより、茶類飲料の旨味、こく味、甘味の増強の高い抽出物が得られると認められた。

実施例６ 本発明によるアミノ酸生成量の推移
実施例１および比較例３において、最初の酵素添加直後（０時間）から２時間毎にサンプリングし遊離アミノ酸を測定した。測定方法は反応液約１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブにサンプリングしサンプリング液は直ちに５分間沸騰水浴して酵素反応を停止させ、放冷後、サンプリング液を小型遠心機で１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。上清はイオン交換水で適宜希釈し、希釈サンプル液０．２ｍｌに除タンパク液０．６ｍｌ加える。１５分静置後、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心処理する。ニンヒドリン比色法で上清中のアミノ酸を定量した。遊離アミノ酸量の推移を図１に示す。

実施例１では反応開始から８時間後に行った工程（Ｃ）、すなわち、ｐＨ８．０への調整後のプロテアーゼ添加後の酵素反応により、遊離アミノ酸が急激、かつ、格段に増加していることが認められた。それに対し、ｐＨ調整を行わずにプロテアーゼ反応を行った比較例３でも遊離アミノ酸は時間の推移と共に徐々に増加しているが、約１６時間後では実施例１と比較して約１／２であり、大きな差が見られた。したがって、第１段目の反応の後に、ｐＨ８．０への調整を行い、プロテアーゼ処理を行ったことで、茶葉中のタンパク質の分解が劇的に進んだことが認められる。

実施例７〜１２（工程（Ｂ）において上昇させるｐＨを変えたもの）
７５℃イオン交換水６５０ｇにアスコルビン酸ナトリウム０．１５ｇおよびハンマーミル（スクリーン１．２ｍｍ）で粉砕した市販の静岡産１番茶葉５０ｇを加え８０℃達温にて殺菌後、直ちに４５℃に冷却した。この段階でのｐＨは５．６であった。これにタンナーゼ（三菱化学フーズ社製）０．５ｇを加え、１０分間撹拌後、さらにスミチームＡＰ２（新日本化学工業社製のペクチナーゼ）０．５ｇ、セルロシンＡＣ４０（エイチビィアイ社製）０．５ｇおよびプロテアーゼＭ（天野エンザイム社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え、４５℃、８時間攪拌反応させた（工程Ａ）。反応終了後のｐＨは４．５であった。１段目の反応終了後、殺菌工程を行わずに、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ５．０（実施例７）、５．５（実施例８）、６．０（実施例９）、６．５（実施例１０）、７．０（実施例１１）または７．５（実施例１２）に調整した（工程Ｂ）。ここにさらにスミチームＬＰ（新日本化学工業社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え１０分間撹拌後、４５℃にて１６時間静置反応させた（工程Ｃ）。反応終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、これを冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、本発明の緑茶抽出物（本発明品７〜１２）を得た。

実施例７〜１２の工程Ｂにより調整したｐＨ、本発明品７〜１２のｐＨ、製品収率（対茶葉％）、アミノ酸含量（％）、カフェイン含量（％）およびタンニン含量（％）を表４に示す。

比較例４（実施例７の工程（Ｂ）および（Ｃ）を行わないもの）
実施例７において第１段目の酵素処理反応（工程Ａ）終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、緑茶抽出物（比較品４）を得た。

比較例５（実施例７において工程（Ｂ）の後ｐＨ調整せずに工程（Ｃ）行ったもの）
実施例７において第１段目の酵素処理反応（工程Ａ）終了後、ｐＨ調整を行わずに、さらにスミチームＬＰ（新日本化学工業社製のプロテアーゼ）０．５ｇを加え１０分間撹拌後、５０℃にて１６時間静置反応させた（工程Ｃ）。反応終了後、固液分離をおこない、分離液を９０℃にて１分間加熱殺菌し、冷却した後、ロータリーエバポレーターを用いてＢｘ１５°まで減圧濃縮し、２０℃に冷却後、８００×ｇにて１０分間遠心分離して沈殿物を除去し、緑茶抽出物（比較品５）を得た。
比較品４および５のｐＨ、製品収率（対茶葉％）、アミノ酸含量（％）、カフェイン含量（％）、タンニン含量（％）を表４に示す。

表４に示した通り、第１段目の酵素処理（工程Ａ）の終了後にｐＨを上昇（工程Ｂ）させた後、さらにプロテアーゼを加えて酵素処理（工程Ｃ）を行った本発明品７〜１２は、いずれも、比較品４、５（両者とも酵素反応途中にｐＨ調整を行っていない）と比較して、製品収率が高く、特に、成分としてアミノ酸が多く抽出されていた。表４より工程ＢにおけるｐＨは６．０（本発明品９）付近が最も良好であることが読み取れるが、５．０（本発明品７、０．３の上昇）であっても、比較品５との対比により、大きな効果（製品収率増加効果、アミノ酸収率増加効果）が得られることが認められた。この結果から、工程Ｂにおいて上昇させるｐＨはわずか（０．１程度）であっても、かなりの効果が得られることが予想される。

実施例７ 官能評価（緑茶飲料に本発明品および比較品を添加して官能評価）
実施例４と同一の方法により、緑茶飲料原液を得た（緑茶飲料原液の分析値；Ｂｘ：２．２２°、ｐＨ：６．４、タンニン含量（酒石酸鉄法）：０．４４％、アミノ酸含量：０．０７１％）。これを小分けし、イオン交換水にて１０倍（質量比）に希釈し、その希釈液に本発明品７〜１２ならびに比較品４および５をそれぞれ０．５％添加したものを調製し、１３７℃、３０秒間加熱殺菌後、８８℃まで冷却して５００ｍｌペットボトルに充填し、２分間保持後、室温（２５℃）まで冷却し、ペットボトル入り緑茶飲料とした。

上記ペットボトル入り緑茶飲料を良く訓練された１０名のパネラーにて評価を行った。評価は苦渋味、甘味、旨味、バランスについてそれぞれ、非常によい：１０点、良い：８点、やや良い：６点、やや悪い：４点、悪い：２点、非常に悪い０点として、コメントを記した。その平均点およびコメントの平均的な内容を表５に示す。

表５に示した通り、第１段目の酵素処理（工程Ａ）の終了後にｐＨを上昇（工程Ｂ）させた後、さらにプロテアーゼを加えて酵素処理（工程Ｃ）を行った本発明品７〜１２を添加した緑茶飲料は、いずれも、比較品４、５（両者とも酵素反応途中にｐＨ調整を行っていない）を添加した緑茶飲料と比較して、緑茶の旨味、こく味が強く、甘味が際だって強く、また、苦渋味がほのかでマイルドで、風味全体のバランスが良く、高級抹茶のような呈味を有しているという結果であった。したがって、工程ＢにおいてｐＨを上昇させてからさらに酵素処理を行って得られた抽出物を添加することにより、本発明品の抽出物を添加された飲料の呈味は大きく改善されることが認められた。また、工程ＢでｐＨ調整を行っていない比較品５と、工程ＢにおいてｐＨを０．３上昇させた本発明品７との比較から、工程ＢにおけるｐＨの上昇は０．３であっても大きな効果（旨味等増強効果）が得られることが認められた。この官能評価の結果からも、工程Ｂにおいて上昇させるｐＨはわずか（０．１程度）であっても、かなりの効果が得られることが予想される。

実施例１３
実施例７において、工程Ｃにおいて、スミチームＬＰ（新日本化学工業社製のプロテアーゼ）０．５ｇに加えて、グルタミナーゼＧＴを０．５ｇ（新日本化学工業社製テアニンに作用せず、グルタミンに作用するグルタミナーゼ）およびアスパラギナーゼを０．５ｇ添加する以外は実施例７と同様の操作を行い、本発明の緑茶抽出物（本発明品１３）２０２ｇ（対茶葉収率４０４％）を得た。
本発明品７および１３のアミノ酸組成を表６に示す。

表６に示す通り、本発明品１３は本発明品７と比べ、アスパラギンおよびグルタミンが激減しており、一方で、アスパラギン酸およびグルタミン酸が激増しており、アスパラギン酸の増加分はほぼアスパラギンの減少分に相当し、グルタミン酸の増加分はほぼグルタミンの減少分に相当していた。一方、テアニンについては、含有量はほぼ同程度であった。したがって、本発明品７のアスパラギンがアスパラギナーゼの作用によりアスパラギン酸に変換され、また、グルタミンがグルタミン酸に変換されて、本発明品１３の数値となったと推定される。

実施例１４
本発明品７と１３をそれぞれ２％水溶液とし、良く訓練された１０名のパネラーにて評価を行った。その結果、１０名全員が、本発明品１３が本発明品７と比較して、旨味が強いと判断した。

Claims (5)

1. 茶葉のタンナーゼ処理およびプロテアーゼ処理を含む茶類抽出物の製造方法であって、以下の工程Ａ〜Ｃを含む、製造方法。
   工程Ａ：茶葉を第１段目の酵素処理する工程であって、酵素としてタンナーゼおよび酸性プロテアーゼを含む、工程、
   工程Ｂ：工程Ａの終了後、工程Ａの実施された後のｐＨに対しｐＨを０．４以上上昇させる工程、
   工程Ｃ：工程Ｂの後に第２段目の酵素処理する工程であって、酵素として工程Ａのプロテアーゼとは異なる中性域からややアルカリ性域で作用するプロテアーゼを含み、該酵素処理をｐＨ４．８〜１０．０の範囲内に保持しながら行う、工程。
2. 第１段目の酵素処理をｐＨ４．０〜６．０の範囲内を保持しながら行い、第２段目の酵素処理をｐＨ８．０〜１０．０の範囲内を保持しながら行う請求項１に記載の方法。
3. 工程Ａおよび／または工程Ｃの酵素がグルタミナーゼおよび／またはアスパラギナーゼを含むものである請求項１または２に記載の方法。
4. 工程Ａおよび／または工程Ｃの酵素が糖質分解酵素を含むものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 茶葉が不発酵茶、半発酵茶または発酵茶から選ばれる１種または２種以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
   

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