CN112961892A - 一种豌豆多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及豌豆的深加工技术领域,特别涉及一种豌豆多肽的制备方法,将豌豆蛋白粉与水混合,采用酸性蛋白酶和中性蛋白酶进行双酶水解,其水解液灭酶处理后静置,离心去除水解液中的沉淀,然后通过膜分离得到分子量300‑4000Da的多肽溶液,通过浓缩和干燥得到豌豆多肽粉。本发明提供的豌豆多肽的制备方法,工艺简单,产品的功能性突出,豌豆蛋白经两次酶水解和膜分离后,得到300‑4000Da的混合豌豆肽在6‑25mg/ml浓度范围内对酪氨酸酶抑制率高,具有抑制皮肤黑色素形成的作用。

Description

一种豌豆多肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及豌豆的深加工技术领域,特别涉及一种豌豆多肽及其制备方法。
背景技术
豌豆是我国重要的食用豆类之一,豌豆蛋白粉是加工豌豆淀粉和豌豆粉丝过程中产生的副产品。生产豌豆淀粉或粉丝的过程中废水经过等电点沉淀、回收、干燥等步骤可以得到豌豆蛋白粉,该蛋白粉虽然可以食用,但是色泽和溶解性较差,可溶性蛋白不到20%。
经过蛋白酶水解可以将豌豆蛋白加工成溶解性好,易于吸收的多肽。如公开号为CN111019989A,公开日为2020年04月17日,名称为《一种豌豆低聚肽粉及其制备方法》的专利文件公开了采用中性蛋白酶和胃蛋白酶多酶混合物一次水解得到豌豆低聚肽。又如公开号为CN109055466A,公开日为2018年12月21日,名称为《一种豌豆肽的制备方法及其在美白领域中的应用》的专利文件公开了采用复合中性蛋白酶在pH6.5-7.0下对预先经挤压膨化的豌豆蛋白水解10-11h,得到的多肽经逐级超滤,分离出小于1000Da的小肽,该小分子肽在30mg/ml的浓度下对酪氨酸酶的抑制率可达73%。
但上述豌豆多肽在制备过程中需要将豌豆原料进行挤压膨化和超声波处理,加工过程较为复杂,不利于工业化生产,有待进一步改进。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的问题,本发明提供一种豌豆多肽的制备方法,其中,包括以下制备步骤:
S100、将豌豆蛋白粉与纯水以1:20-30的质量比混合,用混合酸溶液调pH至3.0-4.0,在42-50℃浸泡2-4个小时;
S200、按总蛋白的质量加入3.350酸性蛋白酶3000-6000u/g进行第一次水解;
S300、经过灭酶处理的第一次水解液用混合钙悬浊液调节水解液的PH值到6.5-7.5,按总蛋白的质量加入阿玛诺(AMANO)NY50C中性蛋白酶3500-7000u/g进行第二次水解;
S400、经过灭酶处理的第二次水解液静置时间为20-40min;之后离心去除不溶性沉淀物,取上清液截留300Da-4000Da的滤液,经加热浓缩干燥即得所述豌豆多肽;优选地,在45-60℃下真空浓缩,然后干燥成粉状。
在上述方案的基础上,进一步地,所述第一次水解的温度为45-55℃,时间80-160min;所述第二次水解的温度为45-55℃,时间40-90min。
在上述方案的基础上,进一步地,第一次水解液的灭酶条件为85-90℃,5-8min;第二次水解液的灭酶条件为98-100℃,7-10min。
在上述方案的基础上,进一步地,所述混合酸溶液为乳酸、乙酸与苹果酸按摩尔比10:1-3:0-4混合。
在上述方案的基础上,进一步地,所述混合钙悬浊液由氢氧化钙、硫酸钙、天门冬氨酸钙按摩尔比20:1-4:0-5混合后与纯水配制成悬浊液,或氧化钙、硫酸钙、天门冬氨酸钙按摩尔比20:1-4:0-5混合后与纯水配制成悬浊液。
在上述方案的基础上,进一步地,在S400中300Da-4000Da的滤液加热浓缩前,向滤液中加入多肽质量0-50%的乳糖醇。
在上述方案的基础上,进一步地,在S400中的离心转速为5000-8000rpm。
在上述方案的基础上,进一步地,S400中的上清液通过超滤装置截留分子量4000Da的滤出液,再通过300Da纳滤膜除去小分子物质后得到300Da-4000Da的滤液。
在上述方案的基础上,进一步地,在S100中豌豆蛋白粉与纯水的比例:1:20-26。
本发明还提供一种豌豆多肽,采用如上任意所述的豌豆多肽制备方法制得。
1、采用混合酸溶液调节水解液的pH,能显著改善口感,使多肽溶液口感柔和,且按比例配制的混合有机酸有助于与钙离子形成沉淀并通过离心去除,降低超滤膜过滤的压力;
2、采用混合钙的碱性悬浊液调节第二次酶解所需的pH值可保证中性蛋白酶酶解所需pH环境,还为NY50C中性蛋白酶的酶活提供所需的钙离子浓度保护;同时混合钙的悬浊液在与有机酸发生中和反应后,能加快沉淀生成,减少静置与离心分离时间;此外,采用碱性钙中和溶液中的酸性物质,更有利于纳滤脱盐;
3、筛选得到的3.350酸性蛋白酶和NY50中性蛋白酶先后两次水解豌豆蛋白,既能得到较高的豌豆多肽得率,又能得到较高的酪氨酸酶活抑制率。
4、多肽溶液在浓缩前添加一定质量比的乳糖醇,能抑制因加热浓缩而导致该多肽对络氨酸酶抑制活性的下降。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供如下实施例
实施例1
S100、将蛋白含量为72%的豌豆蛋白粉100克与2000克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.5,在42℃浸泡4个小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.03mol和苹果酸0.02mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶38万u,在52℃下进行第一次水解,水解时间120min;
S300、第一次水解液在85℃灭酶8min,用混合钙悬浊液调节水解液的pH至7.3;加入阿玛诺NY50C中性蛋白酶32万u,在45℃进行第二次水解,水解时间85min;其中,混合钙悬浊液为氧化钙0.3mol、硫酸钙0.05mol和纯水配制成的悬浊液。
S400、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶8min,静置20min后,在7000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液分别用截留分子量为10000Da、4000Da、2000Da和1000Da的超滤膜和300Da的纳滤膜分离,得到5个分子量Mw组分(4000-10000Da、2000-4000Da、1000-2000Da、300-4000Da和Mw<1000Da);
将5段多肽分离液调整到多肽含量15mg/ml后,分别测定各样品的酪氨酸酶抑制率和肽段占比,测试结果如表1所示:
表1-各段多肽的含量分布和酪氨酸酶活性抑制率/%
多肽分离液样品 4000-10000Da 2000-4000Da 1000-2000Da 300-4000Da <1000Da
酪氨酸酶抑制率 1.2 23.9 74.8 66.82 30.25
多肽分布% 6.42 21.60 35.44 92.34 37.29
从表1的测试结果可以看出,虽然1000-2000Da多肽的酪氨酸酶抑制率最佳,达到74.8%,但是2000-4000Da和Mw<1000Da的多肽均有一定的抑制活性;凝胶层析分析表明,300-4000Da分子段的多肽占总多肽的92.34%,且酪氨酸酶抑制率能达到66.82%,因此这段多肽的性价比最高;将这段300-4000Da多肽溶液继续真空加热浓缩、喷雾干燥,得到的粉状固体检测多肽含量为96.1%;
将该多肽粉配成多肽含量为15mg/ml、20mg/ml和25mg/ml的溶液后,测得3个样品的酪氨酸酶抑制率分别53.24%,63.75%和72.29%。
其中15mg/ml浓度段比未加热浓缩的相同浓度豌豆多肽的酪氨酸酶抑制率减少了13.58%,下降率为20.32%,说明浓缩干燥过程中,混合多肽可能会产生一定的聚合而使其抑制酪氨酸酶的活性下降。
需要说明的是,本发明提供的3.350酸性蛋白酶为黑曲霉3.350菌株产的酸性蛋白酶;阿玛诺NY50C中性蛋白酶为解淀粉芽孢杆菌产的中性蛋白酶。
实施例2
S100、取蛋白含量为80%的豌豆蛋白粉100克与2200克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.0,在45℃浸泡3个小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.04mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶35万u,在50℃下进行第一次水解,水解时间100min;
S300、第一次水解液在90℃灭酶5min,用混合钙悬浊液调节水解液的pH值到6.8;加入NY50C蛋白酶40万u,在50℃水解60min,其中,混合钙悬浊液为0.2mol氢氧化钙、0.03mol硫酸钙和纯水配制而成的悬浊液;
S400、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶8min;静置40min后,在8000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液用4000Da的超滤膜和300Da纳滤膜分离得到的300-4000Da多肽溶液,经真空加热浓缩、喷雾干燥成豌豆多肽粉。
将该多肽粉配成多肽含量为15mg/ml的溶液后,测得样品的酪氨酸酶抑制率为54.1%,多肽得率44.37%。
实施例3
S100、取蛋白含量为80%的豌豆蛋白粉100克与2200克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.2,在42℃浸泡4个小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.02mol和苹果酸0.04mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶40万u,在55℃下进行第一次水解,水解时间80min;
S300、第一次水解液在90℃灭酶8min,用混合钙悬浊液调节水解液的pH值到7.0;加入NY50C蛋白酶45万u,在52℃水解70min,其中,混合钙悬浊液由0.2mol氧化钙、0.03mol硫酸钙和纯水配制而成的悬浊液;
S400、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶10min;静置20min后,在6000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液用4000Da的超滤膜和300Da纳滤膜分离得到的300-4000Da多肽溶液,经真空加热浓缩和喷雾干燥成豌豆多肽粉。
将该多肽粉配成多肽含量为15mg/ml的溶液,测得样品的酪氨酸酶抑制率为53.32%,多肽得率42.85%。
发明人经过对比还发现,相比于单用乳酸来调节酸度,采用三种有机酸按特定比例配制来调溶液的酸度所得的多肽溶液,口感更为柔和,并且添加有苹果酸的实施例3比实施例2、实施例1形成的沉淀速度快,静置时间短,沉淀更利于离心去除。
实施例4
S100、取蛋白含量为80%的豌豆蛋白粉100克与2400克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.5,在50℃浸泡2个小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.04mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶32万u,在50℃下进行第一次水解,水解时间150min;
S300、第一次水解液在90℃灭酶6min,用混合钙悬浊液调节水解液的pH值到7.3;加入NY50C蛋白酶38万u,在46℃水解90min,其中,混合钙悬浊液为0.2mol氢氧化钙、0.015mol硫酸钙、0.04mol天门冬氨酸钙和纯水配制而成的悬浊液;
S400、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶8min;静置40min后,在7000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液用4000Da的超滤膜和300Da纳滤膜分离得到的300-4000Da多肽溶液,经真空加热浓缩、喷雾干燥成豌豆多肽粉。
将该多肽粉配成多肽含量为15mg/ml的溶液,样品的酪氨酸酶抑制率为52.67%,多肽得率43.74%.。同时实施例4所得的多肽溶液,口感好,多肽溶液基本无苦涩味,而实施例1、实施例2和实施例3均有一定苦涩味。
实施例5
S100、取蛋白含量为80%的豌豆蛋白粉100克与2400克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.0,在45℃浸泡3.5个小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.04mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶35万u,在52℃下进行第一次水解,水解时间90min;
S300、第一次水解液在90℃灭酶5min,用混合钙悬浊液调节水解液的PH值到6.8;加入NY50C蛋白酶40万u,在50℃水解60min,其中,混合钙悬浊液为0.2mol氢氧化钙、0.03mol硫酸钙和纯水配制而成的悬浊液;
S400、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶8min;静置40min后,在8000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液用4000Da的超滤膜和300Da纳滤膜分离得到的300-4000Da多肽溶液,按照多肽质量的30%加入乳糖醇,溶解后经真空加热浓缩、喷雾干燥成豌豆多肽粉。
将该多肽粉配成多肽含量为15mg/ml的溶液,测得样品的酪氨酸酶抑制率为72.41%,多肽得率43.36%;由此可见,添加有乳糖醇的实施例5的多肽得率与实施例1-4基本相同,但抑制率却比未加乳糖醇的实施例1-4高。
为此,本发明还提供对比例1-4,分别采用相同质量的木糖醇、甘露醇,麦芽糖醇和山梨糖醇分别代替实施例5中的乳糖醇,将得到的多肽粉分别配成含多肽15mg/ml的肽液,检测各肽液的酪氨酸酶抑制率和多肽得率,测试结果如表2所示:
表2
Figure BDA0002952985750000081
从表2的测试结果可以看出,乳糖醇不仅可作为甜味剂使用,还可以有效阻止加热浓缩过程中豌豆多肽的酪氨酸酶抑制活性降低,起到保护剂的作用,可能是由于乳糖醇在热浓缩过程中能阻止豌豆多肽的聚合,而其他糖醇类的甜味剂无此活性。
实施例6
S100、取蛋白含量为80%的豌豆蛋白粉100克与2600克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.0,在42℃浸泡4个小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.02mol,苹果酸0.05mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶45万u,在55℃下进行第一次水解,水解时间80min;
S300、第一次水解液在85℃灭酶8min,用混合钙悬浊液调节水解液的PH值到6.5;加入NY50C蛋白酶45万u,在55℃水解40min,其中,混合钙悬浊液为氢氧化钙0.2mol、0.015mol的硫酸钙和纯水配制而成的悬浊液;
S300、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶8min;静置20min后,在6000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液用4000Da的超滤膜和300Da纳滤膜分离得到的300-4000Da多肽溶液,按照多肽质量的40%加入乳糖醇,溶解后经真空加热浓缩、喷雾干燥成豌豆多肽粉。
本发明还提供如下对比例5-7
对比例5
仅用3.350酸性蛋白酶进行第一次水解,无第二次酶解,其余均与实施例6一致。
对比例6
将3.350酸性蛋白酶替换成3.4310酸性蛋白酶(黑曲霉3.4310菌株产),其余与实施例6一致;
对比例7
将3.350酸性蛋白酶替换成537酸性蛋白酶(宇佐美曲霉537菌株产),其余与实施例6一致。
将实施例6和对比例5-7所得到的多肽粉分别配成含多肽10mg/ml的肽液,检测各肽液的酪氨酸酶抑制率和多肽得率,测试结果如表3。
表3酪氨酸酶抑制率(10mg/ml)和多肽得率统计表
实施例6 对比例5 对比例6 对比例7
多肽得率% 44.26 21.41 28.06 30.75
酪氨酸酶抑制率% 65.48 29.47 44.28 46.55
结合实验结果可以看出,对比例5只经过3.350酸性蛋白酶一次酶解,未经过中性水解所制得的肽液,其酪氨酸酶抑制率不足30%,多肽得率仅为21.4%;
对比例6和对比例7分别采用3.4310酸性蛋白酶和537酸性蛋白酶进行第一次酶解,所制得的肽液的酪氨酸酶抑制率和多肽得率明显低于采用3.350酸性蛋白酶的实施例6;
实施例7
S100、取蛋白含量为80%的豌豆蛋白粉100克与2200克纯水混合;用混合酸溶液调pH至3.0,在45℃浸泡3.5小时,其中,混合酸溶液由乳酸0.2mol、乙酸0.02mol和苹果酸0.06mol配制而成;
S200、加入3.350酸性蛋白酶40万u,在50℃下进行第一次水解,水解时间100min;
S300、第一次水解液在90℃灭酶5min,用混合钙悬浊液调节水解液的PH值到7.0;加入NY50C蛋白酶40万u,在50℃水解60min,其中,混合钙悬浊液为0.2mol氢氧化钙、0.02mol的硫酸钙、0.05mol天门冬氨酸钙和纯水配制而成的悬浊液;
S400、第二次水解液在100℃下煮沸灭酶8min;静置20min后,在6000rpm下离心去除水解液中沉淀物,上清液用4000Da的超滤膜和300Da纳滤膜分离得到的300-4000Da多肽溶液,按照多肽质量的30%加入乳糖醇,溶解后再经真空加热浓缩、喷雾干燥制得豌豆多肽粉。
本发明还提供对比例8-10
对比例8
将NY50C中性蛋白酶替换成阿玛诺(AMANO)AX米曲霉(Aspergillus oryzae)中性蛋白酶,其余与实施例7一致。
对比例9
将NY50C中性蛋白酶替换成诺维信(novozymes)0.8L枯草杆菌(Bacillussubtilis)中性蛋白酶,其余与实施例7一致。
对比例10
将NY50C中性蛋白酶替换成阿玛诺(AMANO)2SD米曲霉(Aspergillus oryzae)中性蛋白酶,其余与实施例7一致。
将实施例7和各对比例8-10制作的多肽粉配成多肽含量为15mg/ml的溶液,测各样品的酪氨酸酶抑制率,并计算各样品的多肽得率见表4。
表4
实施例7 对比例8 对比例9 对比例10
多肽得率% 44.26 19.20 33.75 29.52
酪氨酸酶抑制率% 75.13 0 0 0
可以看出,对比例8-10采用阿玛诺AX中性蛋白酶、诺维信0.8L中性蛋白酶和阿玛诺(AMANO)2SD中性蛋白酶进行第二次水解后,肽液均丧失了酪氨酸酶的抑制活性,且多肽得率均明显低于实施例7;
以上实验对比说明本发明采用的3.350酸性蛋白酶+NY50C中性蛋白酶两次酶解的工艺所制得的肽液具有高酪氨酸酶抑制率和多肽得率,可以作为食品或化妆品的原料。同时工艺简单,经济合理,适于工业化生产。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种豌豆多肽的制备方法,其特征在于,包括以下制备步骤:
S100、将豌豆蛋白粉与纯水混合,用混合酸溶液调pH至3.0-4.0,在42-50℃浸泡;
S200、按总蛋白的质量加入3.350酸性蛋白酶3000-6000u/g进行第一次水解;
S300、经过灭酶处理的第一次水解液用混合钙悬浊液调节水解液的PH值到6.5-7.5,按总蛋白的质量加入阿玛诺NY50C中性蛋白酶3500-7000u/g,进行第二次水解;
S400、经过灭酶处理的第二次水解液静置20-40min;之后离心去除不溶性沉淀物,取上清液截留300Da-4000Da的滤液,经浓缩干燥即得所述豌豆多肽。
2.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:所述第一次水解的温度为45-55℃,时间80-160min;所述第二次水解的温度为45-55℃,时间40-90min。
3.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:所述第一次水解液的灭酶条件为85-90℃,5-8min;所述第二次水解液的灭酶条件为98-100℃,7-10min。
4.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:所述混合酸溶液为乳酸、乙酸与苹果酸按摩尔比10:1-3:0-4混合。
5.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:所述混合钙悬浊液由氢氧化钙、硫酸钙、天门冬氨酸钙按摩尔比20:1-4:0-5混合后与纯水配制成悬浊液,或氧化钙、硫酸钙、天门冬氨酸钙按摩尔比20:1-4:0-5混合后与纯水配制成悬浊液。
6.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:在S400中300Da-4000Da的滤液浓缩前,向滤液中加入多肽质量0-50%的乳糖醇。
7.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:在S400中的离心转速为5000-8000rpm。
8.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:S400中的上清液通过超滤装置截留分子量4000Da的滤出液,再通过300Da纳滤膜除去小分子物质后得到300Da-4000Da的滤液。
9.根据权利要求1所述的豌豆多肽的制备方法,其特征在于:在S100中豌豆蛋白粉与纯水的比例:1:20-26。
10.一种豌豆多肽,其特征在于:由权利要求1-9任一项所述的豌豆多肽的制备方法制得。
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