CN108690866A - 检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，所述方法是在盛放有土壤的培养装置中培养目标微生物，培养结束后，对目标微生物进行生长状况指标检测，所述培养装置包括相对放置的培养皿一和培养皿二，以及覆盖在培养皿二上用于阻隔土壤与目标微生物直接接触的透气覆盖膜，培养皿一用来盛放目标微生物培养所需的培养基和微生物，培养皿二用来盛放土壤。本发明的方法使用的装置组装简单，耗时短，且反应空间小，可以更好地解释挥发性有机物对微生物生长造成的影响。

Description

检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法。
背景技术
挥发性有机物(VOCs)是低分子量高蒸气压的碳化合物的总称，常温情况下以气体形式存在，能轻易地在土壤颗粒中穿梭。早在1921年，Zoller和Clark第一次报道了来自痢疾组的细菌所产生的挥发性有机物。五年后，俄罗斯的研究学者称“土壤空气”应被当作一种有机体，并应当同土壤三相一样重要。但是由于当时科学技术的局限性，对土壤挥发性有机物的大规模研究主要集中在最近十年。而近年来，土壤生态健康问题受到广泛关注，土壤健康与植物健康息息相关，土壤挥发性有机物在“土壤-植物-微生物”三角之间扮演的角色引起了研究学者的注意。
在土壤生态系统中，土壤微生物扮演着至关重要的角色，而土壤微生物挥发性有机物(mVOCs)被认为是土壤微生物与微生物之间的信号物质。有研究发现，土壤中真菌与细菌之间能产生大量抑制或刺激其他微生物生长的挥发性有机物，例如萜烯类化合物。其次，大部分的十字花科作物作为土壤生物熏蒸处理被翻压到大田中时，能产生大量的含硫挥发性有机物，进而抑制土壤中病原物的生长。但目前的研究手段主要是通过先收集土壤中的挥发性有机物，然后对目标微生物进行生理检测。该种手段的优点在于可以利用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)推测出可能的挥发性有机物物质结构，但这种检测又通常会由于待测气体的复杂性和检测数据的无规律性而导致责任物质的缺失。其次，这种挥发物收集装置普遍存在成本高、组装复杂等一系列问题。此外，土壤作为土壤挥发性有机物持续供应的载体，在对外源微生物生长影响的研究当中，三者应当是共同存在的。因此，构建一种检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的装置及方法，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，该方法使用的装置组装简单，耗时短，且反应空间小，可以更好地解释挥发性有机物对微生物生长造成的影响。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，所述方法是在盛放有土壤的培养装置中培养目标微生物，培养结束后，对目标微生物进行生长状况指标检测，所述培养装置包括相对放置的培养皿一和培养皿二，以及覆盖在培养皿二上用于阻隔土壤与目标微生物直接接触的透气覆盖膜，培养皿一用来盛放目标微生物培养所需的培养基和微生物，培养皿二用来盛放土壤。
进一步，所述检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法具体如下：
在洁净工作台中，在培养皿一中加入培养基，待培养基凝固后，将目标微生物接种在培养基上，并在培养皿二中加入土壤，随后在培养皿二上覆盖透气覆盖膜，将培养皿一倒置放在培养皿二上，并用封口膜和气体阻隔胶带封闭连接处，培养目标微生物；
培养结束后，在无菌环境下取下培养皿一，对培养皿一中的目标微生物进行生长状况指标检测，分析评判目标微生物受土壤挥发性有机物影响结果。
进一步，所述目标微生物为真菌、卵菌、细菌中的一种。
进一步，所述目标微生物为真菌或卵菌时，培养结束后，采用冻干法进行菌丝干重的测定。
进一步，所述目标微生物为生长缓慢的真菌时，培养结束后，采用纸片法进行菌丝面积的测定。
进一步，所述目标微生物为细菌时，培养结束后，采用浊度法进行菌液浊度的测定。
进一步，所述目标微生物为生长缓慢或涂板浓度低的细菌时，采用计数法进行细菌菌落的测定。
进一步，所述培养装置包括相对放置的培养皿一和培养皿二，所述培养皿一的皿底与皿壁交接的位置一体成型有环形凸阶，所述培养皿一的皿壁上开设有第一环形凹槽，所述第一环形凹槽内固定安装有多个呈弧形的第一软磁片和第二软磁片，所述第一软磁片和第二软磁片间隔排列，且所述第一软磁片外端面的磁极和第二软磁片外端面的磁极相反；所述培养皿二上覆盖有透气覆盖膜，所述培养皿二上一体成型有与环形凸阶配合的环形凸条，所述环形凸条的外壁于第一环形凹槽对应的位置开设有第二环形凹槽，所述第二环形凹槽内固定安装有多个呈弧形的第三软磁片和第四软磁片，所述第三软磁片和第四软磁片间隔排列，且所述第三软磁片外端面的磁极和第四软磁片外端面的磁极相反，所述培养皿一与培养皿二对接的接口外侧粘贴有封口膜，所述封口膜外粘贴有气体阻隔胶带。
进一步，所述透气覆盖膜为500目的透气膜。500目的透气膜既能有利于培养皿二中的土壤中挥发性有机物的挥发进入培养皿一中，又可以将培养皿一中的土壤与培养皿二中的可培养微生物进行有效隔断。
进一步，所述培养皿一的皿壁端面上开设有第一环形弧槽，所述培养皿二的皿壁上于第一环形弧槽对应的位置开设有第二环形弧槽，所述第一环形弧槽和第二环形弧槽相对设置形成环形腔体，所述环形腔体内放置有密封圈。密封圈的设置进一步提高了该装置的气密性，防止土壤中挥发性有机物挥发至装置外，影响检测结果。
本发明的有益效果：本发明公开了一种检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，该方法使用的装置组装简单，耗时短；透气覆盖膜可以阻隔培养皿二中的土壤与培养皿一中培养的微生物直接接触；且反应空间小，可以更好地解释挥发性有机物对微生物生长造成的影响。该方法能针对不同生长速率的真菌、卵菌、细菌，选择相对应的检测方法及指标。
附图说明
图1是本发明检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法所使用的培养装置的剖视结构示意图；
图2是图1中培养皿一的结构示意图；
图3是图1中培养皿二的结构示意图；
图4为不同土壤的挥发性有机物对终极腐霉菌生长的影响；
图5为不同土壤的挥发性有机物对尖孢镰刀菌生长的影响；
图6为不同土壤的挥发性有机物对低浓度青枯雷尔氏菌生长的影响；
图7为不同土壤的挥发性有机物对高浓度青枯雷尔氏菌生长的影响其中。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明：
本发明的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法具体如下：
在洁净工作台中，在培养皿一中加入培养基，待培养基凝固后，将目标微生物接种在培养基上，并在培养皿二中加入土壤，随后在培养皿二上覆盖透气覆盖膜，将培养皿一倒置放在培养皿二上，并用封口膜和气体阻隔胶带封闭连接处，培养目标微生物；培养结束后，在无菌环境下取下培养皿一，对培养皿一中的目标微生物进行生长状况指标检测，分析评判目标微生物受土壤挥发性有机物影响结果。
如图1-图3所示，其中使用的培养装置包括相对放置的培养皿一1和培养皿二2，培养皿一1和培养皿二2均透明，培养皿一1的皿底与皿壁交接的位置一体成型有环形凸阶3，培养皿一1的皿壁上开设有第一环形凹槽4，第一环形凹槽4内固定安装有多个呈弧形的第一软磁片51和第二软磁片52，第一软磁片51和第二软磁片52间隔排列，且第一软磁片51外端面的磁极和第二软磁片52外端面的磁极相反；培养皿二2上覆盖有透气覆盖膜6，透气覆盖膜6为500目的透气膜，培养皿二2上一体成型有与环形凸阶3配合的环形凸条7，环形凸条7的外壁于第一环形凹槽4对应的位置开设有第二环形凹槽8，第二环形凹槽8内固定安装有多个呈弧形的第三软磁片91和第四软磁片92，第三软磁片91和第四软磁片92间隔排列，且第三软磁片91外端面的磁极和第四软磁片92外端面的磁极相反，培养皿一1与培养皿二2对接的接口外侧粘贴有封口膜(附图中未画出)，封口膜外粘贴有气体阻隔胶带10。透气覆盖膜6覆盖在培养皿二2上被培养皿一1压紧，且被气体阻隔胶带10粘贴固定，透气覆盖膜6的膜边位于气体阻隔胶带10外侧。培养皿一1的皿壁端面上开设有第一环形弧槽111，培养皿二2的皿壁上于第一环形弧槽111对应的位置开设有第二环形弧槽112，第一环形弧槽111和第二环形弧槽112相对设置形成环形腔体，环形腔体内放置有密封圈(附图中未画出)。第一软磁片51和第二软磁片52的圆弧弧度相等，第三软磁片91和第四软磁片92的圆弧弧度相等。培养皿一1的皿壁外侧面上设有一圈环形防滑纹12。
实施例一
检测不同土壤的挥发性有机物对终极腐霉菌(Pythium ultimum)生长的影响，腐霉菌是一种适应性较强的真菌，多侵害植物的叶、花、果实等部位。本实施例使用的终极腐霉菌保存于荷兰微生物菌种保藏中心，菌种编号CBS127506，具体操作步骤如下：
在超净工作台中，首先将图1的培养装置顶部的培养皿一皿底朝上放置，以盛放20mL的PDA培养基，待培养基凝固后，挑取同等大小的菌饼放置于培养基上圆心处，等待约30分钟，即可轻轻将培养皿一倒置并与下端的培养皿二闭合，并在连接处粘接封口膜和气体阻隔胶带。其间的30分钟，可用于在图1的培养装置底部的培养皿二中放入50g的土壤。本实施例分别设有土壤A、B、C，并设对照组CK(空白培养皿),每处理重复3个。
由于终极腐霉菌生长较快，在20℃培育4天后，采用冻干法进行菌丝干重测定。将顶部培养皿中的带有菌丝的培养基在微波炉中进行高火2分钟融化，利用镊子夹出全部菌丝，并放置于已经称好质量为m1的空的冻干瓶中，利用冻干机进行24小时-20℃的冻干，然后称取冻干瓶质量为m2。图4中比较终极腐霉菌生长状况的值即为m2-m1，由此可知，该方法能检测不同土壤的挥发性有机物对终极腐霉菌生长的影响。图4的数据显示，土壤B、C中的挥发性有机物对终极腐霉菌生长影响较大，且会抑制终极腐霉菌的生长。
实施例二
检测不同土壤的挥发性有机物对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)生长的影响，尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物又可在土壤内生存的兼性寄生真菌。本实施例使用的尖孢镰刀菌保存于荷兰微生物菌种保藏中心，菌种编号CBS138.97，具体步骤如下:
在超净工作台中，首先将图1的培养装置顶部的培养皿一皿底朝上放置，以盛放20mL的PDA培养基，待培养基凝固后，挑取同等大小的菌饼放置于培养基上圆心处，等待约30分钟，即可轻轻将培养皿一倒置并与下端的培养皿二闭合，并在连接处粘接封口膜和气体阻隔胶带。其间的30分钟，可用于在图1的培养装置底部的培养皿二中放入50g的土壤。本实施例分别设有土壤D、E、F，并设对照组CK(空白培养皿),每处理重复3个。
由于尖孢镰刀菌生长较缓慢且从菌饼中心呈圆形辐射开，在20℃培育7天后，采用纸片法进行菌丝干重测定。利用记号笔标记培养皿顶部的尖孢镰刀菌生长轨迹，将该轨迹拓印至常规A4纸上，扫描该图形使之成为可以被识别的电子文档，利用AutoCAD或其他软件进行封闭区域的面积计算。图5中比较尖孢镰刀菌生长状况的值即为纸片面积值，由此可知，该方法能检测不同土壤的挥发性有机物对尖孢镰刀菌生长的影响。由图5的数据表明，土壤D、E、F中的挥发性有机物均对尖孢镰刀菌的生长有不同程度的影响，且均体现有抑制作用，其中土壤E的抑制作用最大。
实施例三
检测不同土壤的挥发性有机物对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)生长的影响，本实施例使用的青枯雷尔氏菌，是西南大学天然产物农药研究室在重庆市彭水县润溪乡发病烟株上分离得到，菌株编号CQPS-1。具体操作步骤如下:
在超净工作台中，将过夜培养的青枯菌悬浮液(OD600＝1.0)进行梯度稀释，选择稀释105倍和106倍的菌悬液分别进行后续试验。首先将图1的培养装置顶部的培养皿一皿底朝上放置，以盛放20mL的NA培养基，待培养基凝固后，加入100μL稀释后的菌悬液进行涂板，等待平板上无明显的菌液后，可轻轻将培养皿一倒置并与下端的培养皿二闭合，并在连接处粘接封口膜和气体阻隔胶带。其间，可用于在图1的培养装置底部的培养皿二中放入50g的土壤。本实施例分别设有土壤G、H、I，并设对照组CK(空白培养皿),每处理重复3个。
由于涂板使用的稀释106倍后的青枯雷尔氏菌菌悬液浓度较低，在30℃培育2天后，仍可见清晰的单一菌落，采用计数法进行菌落测定。利用记号笔标记培养皿一顶部的青枯雷尔氏菌数量，如图6所示。图6中比较青枯雷尔氏菌生长状况的值即为菌落个数，数据显示表明土壤G、H、I土壤中的挥发性有机物均对低浓度的青枯雷尔氏菌的生长有均一定的抑制作用，其土壤I的抑制作用最为明显。由此可知，该方法能检测不同土壤的挥发性有机物对低浓度的青枯雷尔氏菌生长的影响。
由于涂板使用的稀释105倍后的青枯雷尔氏菌菌悬液浓度较高，且青枯雷尔氏菌生长较快，在30℃培育2天后，采用浊度法进行菌液浊度测定。加入1mL无菌水于带有青枯雷尔氏菌的培养基表面，在不破坏培养基的前提下将菌体洗落形成菌悬液，吸取其中200μL菌液于800μL无菌水中，涡旋混匀进行OD600值测定，结果如图7所示。图7中比较青枯雷尔氏菌生长状况的值即为OD600测定值的5倍，由此可知，该方法能检测不同土壤的挥发性有机物对高浓度的青枯雷尔氏菌生长的影响。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (10)

1.检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述方法是在盛放有土壤的培养装置中培养目标微生物，培养结束后，对目标微生物进行生长状况指标检测，所述培养装置包括相对放置的培养皿一和培养皿二，以及覆盖在培养皿二上用于阻隔土壤与目标微生物直接接触的透气覆盖膜，培养皿一用来盛放目标微生物培养所需的培养基和微生物，培养皿二用来盛放土壤。
2.根据权利要求1所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述方法具体如下：
在洁净工作台中，在培养皿一中加入培养基，待培养基凝固后，将目标微生物接种在培养基上，等待30min，并在培养皿二中加入土壤，随后在培养皿二上覆盖透气覆盖膜，将培养皿一倒置放在培养皿二上，并用封口膜和气体阻隔胶带封闭连接处，于环境温度20～30℃条件下培养目标微生物；
培养结束后，在无菌环境下取下培养皿一，对培养皿一中的目标微生物进行生长状况指标检测，分析评判目标微生物受土壤挥发性有机物影响结果。
3.根据权利要求2所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述目标微生物为真菌、卵菌、细菌中的一种。
4.根据权利要求3所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述目标微生物为真菌或卵菌时，培养结束后，采用冻干法进行菌丝干重的测定。
5.根据权利要求3所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述目标微生物为生长缓慢的真菌时，培养结束后，采用纸片法进行菌丝面积的测定。
6.根据权利要求3所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述目标微生物为细菌时，培养结束后，采用浊度法进行菌液浊度的测定。
7.根据权利要求3所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述目标微生物为生长缓慢或涂板浓度低的细菌时，采用计数法进行细菌菌落的测定。
8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述培养装置包括相对放置的培养皿一和培养皿二，所述培养皿一的皿底与皿壁交接的位置一体成型有环形凸阶，所述培养皿一的皿壁上开设有第一环形凹槽，所述第一环形凹槽内固定安装有多个呈弧形的第一软磁片和第二软磁片，所述第一软磁片和第二软磁片间隔排列，且所述第一软磁片外端面的磁极和第二软磁片外端面的磁极相反；所述培养皿二上覆盖有透气覆盖膜，所述培养皿二上一体成型有与环形凸阶配合的环形凸条，所述环形凸条的外壁于第一环形凹槽对应的位置开设有第二环形凹槽，所述第二环形凹槽内固定安装有多个呈弧形的第三软磁片和第四软磁片，所述第三软磁片和第四软磁片间隔排列，且所述第三软磁片外端面的磁极和第四软磁片外端面的磁极相反，所述培养皿一与培养皿二对接的接口外侧粘贴有封口膜，所述封口膜外粘贴有气体阻隔胶带。
9.根据权利要求8所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述透气覆盖膜为500目的透气膜。
10.根据权利要求9所述的检测土壤中挥发性有机物影响可培养微生物生长的方法，其特征在于，所述培养皿一的皿壁端面上开设有第一环形弧槽，所述培养皿二的皿壁上于第一环形弧槽对应的位置开设有第二环形弧槽，所述第一环形弧槽和第二环形弧槽相对设置形成环形腔体，所述环形腔体内放置有密封圈。
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