CN106818881A - 一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂由枯草芽孢杆菌EDR4和化学农药A组成。所述枯草芽孢杆菌EDR4，其保藏编号为CGMCC No.2133。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4和水分散粒剂为活性成份的微生物复配制剂制备简单，操作方便，易于储藏和运输，对农作物无药害，并能保持一定的活菌量，显著抑制病菌菌丝的生长。因此，利用本发明所制备的微生物复配制剂能够应用在防治葡萄灰霉病和炭疽病中。

Description

一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法。
背景技术
由植物病原真菌葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea引起的葡萄灰霉病是全世界葡萄生产中危害最为严重的病害之一，可导致成熟期果实腐烂或裂果，完全丧失商品价值，严重发生时可造成高达50％左右的产量损失，对葡萄产业影响极大。随着设施栽培葡萄的兴起，大棚内温、湿度小气候环境十分有利于葡萄灰霉病菌的侵染与为害。葡萄炭疽病(Grapebitter rot，又名葡萄晚腐病)是我国乃至全世界葡萄生产中危害最为严重的真菌病害之一，其病原为炭疽菌属(Colletotrichum spp.)真菌，其中，C.gloeosporioides是引起葡萄炭疽病的主要类群，其主要危害葡萄果实，一般情况下可造成产量损10％～15％，如遇潮湿、多雨年份易造成大流行，病穗率达50％～70％。随着设施葡萄栽培的兴起，大棚内温湿度小气候环境十分有利于灰霉病菌和炭疽病菌的侵染与危害，这两种病害逐渐发展为设施葡萄生产的主要病害。B.cinerea是一种强腐生性致病菌，寄主范围广，不同寄主植物间的B.cinerea可相互侵染致病，在作物种质资源中尚未发现完全抗病的材料，也很难培育出抗病品种。因此目前对灰霉病仍以化学防治为主，辅以生物防治和生态防治。常用杀菌剂包括苯并咪唑类、二甲酰亚胺类及甲氧基丙烯酸酯类等，但由于B.cinerea群体结构多样，繁殖速度快，菌株变异速率快且突变菌系田间适应性强等原因，病原菌对上述杀菌剂产生了不同程度的抗药性，某些地区农药防效明显下降，增加了灰霉病防治的难度。葡萄炭疽病的防治以化学防治为主，常用农药有苯并咪唑类和相关衍生物、脱甲基抑制剂(DMIs)、二甲酞亚胺类、氨基甲酸酯类等，但由于C.gloeosporioides群体结构遗传多样，以及单一作用位点化学农药长期使用产生的快速变异菌株且突变菌系田间适应性强，使这两种病原菌对这些药剂都产生了不同程度的抗性，有的地区农药防效明显下降，给葡萄灰霉病和炭疽病防治带来了很大的困难。同时，化学农药的长期使用也带来了农药残留和环境污染等问题，采用低毒、低残留，不污染环境的拮抗微生物防治植物病害成为近年的研究热点。目前国内外研究已发现多种真菌、细菌或其它微生物对灰霉菌和炭疽菌具有寄生或拮抗作用，而且已经有商品制剂应用于生产，但是至今仍存在一些亟待解决的问题。首先，目前开发的生防资源易受外界条件的影响，不容易在植物体内定殖，防治效果不稳定。其次，生防菌发酵液不易储存和运输，在使用过程中，制发酵液繁琐，不易操纵，且单一使用效果并不理想，见效期长，不利于进一步推广应用。目前研究表明，化学农药往往作用位点单一，有害生物抗药性风险极高，并造成大量环境污染以及人畜中毒现象，违背了“绿色植保”的要求。因此，化学农药的长期使用，并不利于有害生物的防控及生态平衡。植物内生菌是一种能在植物组织中定殖与运转，对植物无害甚至有益的微生物，由于它在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。造成近几年，内生菌因其独特的优点成为生物防治的研究热点，为生物防治的应用开辟了新的天地。
综上所述，目前开发的生防资源易受外界条件的影响，不容易在植物体内定殖，防治效果不稳定；生防菌发酵液不易储存和运输，在使用过程中，制发酵液繁琐，不易操纵，且单一使用效果并不理想，见效期长，不利于进一步推广应用；化学农药往往作用位点单一，有害生物抗药性风险极高，并造成大量环境污染以及人畜中毒现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法，旨在解决目前开发的生防资源易受外界条件的影响，不容易在植物体内定殖，防治效果不稳定；生防菌发酵液不易储存和运输，在使用过程中，制发酵液繁琐，不易操纵，且单一使用效果并不理想，见效期长，不利于进一步推广应用；化学农药往往作用位点单一，有害生物抗药性风险极高，并造成大量环境污染以及人畜中毒现象的问题。
本发明是这样实现的，一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂由枯草芽孢杆菌EDR4和化学农药A组成。
进一步，所述枯草芽孢杆菌EDR4，CGMCC No.2133。
进一步，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂为液体悬浮状。
进一步，所述枯草芽孢杆菌EDR4的活菌数量为1.593×103CFU/mL。
本发明的另一目的在于提供一种所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌EDR4菌株在LB固体培养基上活化，挑取枯草芽孢杆菌EDR4单菌落，接种于100mL的LB培养液，于28℃、150rpm振荡培养18h～24h；
步骤二，然后按照1％的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h；将得到的发酵液12000rpm离心5min，收集枯草芽孢杆菌EDR4菌体；
步骤三，用无菌水悬浮，配制终浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，与1化学农药A混合后获得到微生物复配制剂。
进一步，所述LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl和1000mL蒸馏水组成，其pH值为7.2。
进一步，所述化学农药A为水分散粒剂。
本发明的另一目的在于提供一种由所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂制备的防治葡萄灰霉病制剂。
本发明的另一目的在于提供一种由所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂制备的防治炭疽病制剂。
本发明提供的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂及其制备方法，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4和化学农药A为活性成份的微生物复配制剂制备简单，操作方便，易于储藏和运输，对农作物无药害，并能保持一定的活菌量，显著抑制病菌菌丝的生长。因此，利用本发明所制备的微生物复配制剂能够应用在防治葡萄灰霉病和炭疽病中。所述复配制剂对葡萄灰霉农菌和葡萄炭疽病菌抑菌效果优异，防病效果良好且稳定；农药使用成本降低，易于制备。
附图说明
图1是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的活性成分EDR4菌株对四种化学农药的耐受性示意图；(A药浓度为1000mg/L,B药浓度为100mg/L,C药浓度为500mg/L,D药浓度为1000mg/L)。
图3是本发明实施例提供的制备的微生物复配制剂对葡萄灰霉病菌生长的抑制作用示意图；(A为农药A处理，B为微生物复配制剂AEDR4处理,C为EDR4处理，D为CK)。
图4是本发明实施例提供的制备的微生物复配制剂对葡萄炭疽病菌生长的抑制作用示意图；(A为农药A处理，B为微生物复配制剂AEDR4处理,C为EDR4处理，D为CK；下同)。
图5是本发明实施例提供的制备的微生物复配制剂处理后葡萄灰霉病和葡萄炭疽病病情指数示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4和化学农药A组成。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4，16S rRNA基因编号(GenBank)为GU258545.1。化学农药A为水分散粒剂。
所述枯草芽孢杆菌EDR4，保藏编号CGMCC No.2133，于2007年8月16日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到，并登记入册，由2007年8月16日起保存三十年；保藏中心于2007年8月16日监测，结果是存活；建议的分类命名：芽孢杆菌Bacillus sp.请求保藏人：康振生，西北农林科技大学；地址：陕西省杨凌西北农林科技大学生物技术中心。
本发明枯草芽孢杆菌分离自我国陕西省田间自然生长的小麦根部，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为芽孢杆菌的一个新菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4保藏于西北农林科技大学旱区逆境生物学国家重点实验室，保存方法为：在含25％甘油的NBY培养基(蛋白胨5g，牛肉粉3g，酵母粉3g，蒸馏水1000mL)–80℃保存。
本发明所制备的微生物复配制剂中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4和化学农药A，其中，EDR4菌株保藏于西北农林科技大学旱区逆境生物学国家重点实验室；化学农药A生产商为瑞士先正达农化公司。
如图1所示，本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法包括以下步骤：
S101：将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4菌株在LB固体培养基上活化，挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4单菌落，接种于100mL的LB培养液(250mL三角瓶)，于28℃、150rpm振荡培养18～24h；
S102：然后按照1％的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h。将得到的发酵液12000rpm离心5min，收集枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4菌体；
S103：用无菌水悬浮，配制终浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，与化学农药A混合后获得到微生物复配制剂。
LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸馏水组成，其pH值为7.2。
所述的化学农药A机型为水分散粒剂。配制时，直接称重加入。
所述本发明的微生物复配制剂制剂为液体悬浮状，无分层等现象，其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4的活菌数量为1.593×103CFU/mL。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4的发酵培养
将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4在LB固体培养基上活化，挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4单菌落，接种于100mL的LB培养液(250mL三角瓶)，28℃、150rpm振荡培养18～24h，然后按照1％的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h，得到菌体的发酵产物一。其中，LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸馏水组成，pH值为7.2。
实施例2
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4对四种化学农药耐受性测定的方法
实施例1中的两种发酵液12000rpm离心5min，收集枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)EDR4菌体,用无菌水悬浮，配制终浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，稀释后涂布于含有化学农药A、B、C、D(浓度为1000mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L)的LB平板上，测定其对化学农药A、B、C、D的耐受性。
如图2所示，结果表明草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4菌株在化学农药A平板上正常生长。EDR4菌体浓度为5.42×101CFU/mL时，化学农药B、C和D完全抑制其生长，而化学农药A抑制作用最小。同时，EDR4菌体在化学农药A(1000mg/L)平板上稳定生长，且活性稳定。
实施例3
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4和化学农药A为活性成分的微生物复配制剂的制备方法
向实施例2中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4菌悬液中加入等量化学农药A(体积,mL/质量，g)，然后涡旋混匀，制剂无结块分层。于室温条件下密封保存。
下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
试验例1
微生物复配制剂对葡萄灰霉菌抑菌活性检测试验
取微生物复配制剂1mL，加入100mL PDA中，采用菌丝生长速率法检测两种微生物复配制剂对葡萄灰霉菌菌丝生长的影响。待PDA培养基温度低于40℃时加入微生物复配制剂倒板，于PDA平板中央放置培养3d的葡萄灰霉病菌。以在PDA培养基中加入等量化学农药A和实施例2中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4菌悬液为另外处理，以滴加清水的处理作为对照，每个处理设置三次重复。于25℃恒温培养5d后，观察菌丝的生长情况，测量菌落直径。
如图3所示，通过生长速率测定发现，将微生物复配制剂稀释100倍后，仍可以显著抑制葡萄灰霉菌的生长，处理后菌落直径均小于10mm。
试验例2
微生物复配制剂对葡萄炭疽菌抑菌活性检测试验
取微生物复配制剂1mL，加入100mL PDA中，采用菌丝生长速率法检测两种微生物复配制剂对葡萄炭疽菌菌丝生长的影响。待PDA培养基温度低于40℃时加入微生物复配制剂倒板，于PDA平板中央放置培养3d的葡萄炭疽病菌。以在PDA培养基中加入等量化学农药A和实施例2中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4菌悬液为另外处理，以滴加清水的处理作为对照，每个处理设置三次重复。于25℃恒温培养5d后，观察菌丝的生长情况，测量菌落直径。
如图4所示，通过生长速率测定发现，将微生物复配制剂稀释100倍后，仍可以显著抑制葡萄炭疽病的生长，处理后菌落直径均小于10mm。
试验例3
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)EDR4和化学农药A为活性成分的微生物复配制剂对葡萄灰霉病和炭疽病的室内防效
选取大小、成熟度一致的新鲜红提，进行以下处理：每处理5个果粒，设3个重复。先将葡萄在药剂液(100倍稀释)中充分浸润10min后晾干表面水分，刺伤(D＝4mm的圆形伤口)并接种灰霉病菌(炭疽病菌)菌饼(D＝5mm)，LB液体培养基作对照，在27℃保温、保湿7d后观察病斑大小，并按下列葡萄灰霉病分级标准记录计算病情指数和相对防效。
0级全果无病
1级果粒腐烂面积1/4以下；
2级果粒腐烂面积1/4～1/2；
3级果粒腐烂面积1/2～3/4；
4级果粒腐烂面积3/4以上。
病情指数＝∑(各级病果数×相应级数值)/(调查果粒数×4)×100；相对防效(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
通过EDR4微生物复配制剂100倍稀释液的处理葡萄灰霉菌和葡萄炭疽菌对葡萄果实的侵染和菌丝的扩展受到显著地抑制作用；如图5所示，EDR4微生物复配制剂100倍稀释液处理后葡萄灰霉病和葡萄炭疽病病情指数分别为27.75和15.83，防效分别为65.63％和69.84％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂由枯草芽孢杆菌EDR4和水分散粒剂组成。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌EDR4，CGMCC No.2133。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂为液体悬浮状。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌EDR4的活菌数量为1.593×103CFU/mL。
5.一种如权利要求1所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌EDR4菌株在LB固体培养基上活化，挑取枯草芽孢杆菌EDR4单菌落，接种于100mL的LB培养液，于28℃、150rpm振荡培养18h～24h；
步骤二，然后按照1％的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h；将得到的发酵液12000rpm离心5min，收集枯草芽孢杆菌EDR4菌体；
步骤三，用无菌水悬浮，配制终浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，与10％苯醚甲环唑WGD混合后获得到微生物复配制剂。
6.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法，其特征在于，所述LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl和1000mL蒸馏水组成，其pH值为7.2。
7.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂的制备方法，其特征在于，所述化学农药A为水分散粒剂。
8.一种由权利要求1～4任意一项所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂制备的防治葡萄灰霉病制剂。
9.一种由权利要求1～4任意一项所述枯草芽孢杆菌和化学农药的复配制剂制备的防治炭疽病制剂。
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