CN107365729B - 一种多粘类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

多粘类芽孢杆菌不仅具有促进植株生长的能力，而且还具有显著的生防潜力。选择高效抑菌的多粘类芽孢杆菌是当前烟草生物防治的一个重要方向。本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌NX1‑4‑4，该菌株处理烟草幼苗后，烟草幼苗的株高、鲜重、叶绿素含量等与CK1和CK2相比均明显提高，并且菌株NX1‑4‑4可以很好防治烟草青枯病。

Description

一种多粘类芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌及其应用。

背景技术

青枯病是中国最严重的烟草细菌性病害，分布比较广泛。目前，烟草青枯病已成为制约山东烟草产量和品质的主要因子，直接影响到烟农的增收。

青枯病的防控主要集中在培育抗病品种、农业防治、化学防治和生物防治等四方面。生物防治烟草青枯病是利用微生物间的拮抗、竞争、捕食、寄生等关系抑制病原菌的生长发育与繁殖，从而减少病害的发生。常用于其生物防治的主要有芽孢杆菌、假单孢杆菌、放线菌和其他生防微生物。目前用于病害生物防治的芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和多粘类芽孢杆菌（P.polymyxa）等。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)不仅具有促进植株生长的能力，而且还具有显著的生防潜力。该类细菌能够产生IAA(吲哚乙酸)、解磷、固氮等促进植物生长；同时该类细菌可通过抑制病原菌生长、产生抗菌物质等方式用于病害生物防治。因此选择高效抑菌的多粘类芽孢杆菌是当前烟草生物防治的一个重要方向。

发明内容

为解决现有技术上的不足，本发明提供一种多粘类芽孢杆菌。

本发明的目的是提供一种多粘类芽孢杆菌，用于烟草的生物防治和促进烟草的生长。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种多粘类芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.9792的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株NX1-4-4。

优选的，所述的多粘类芽孢杆菌能够产生IAA(吲哚乙酸)。

优选的，所述的多粘类芽孢杆菌在0.1%-2.5%盐浓度条件下，菌株的生长情况最好；2.5%-7.5%盐浓度条件下，菌株的生长缓慢；盐浓度高于7.5%，生长受到抑制。

优选的，所述的多粘类芽孢杆菌添加0.5%的 MHJ(麦芽糊精)或添加1.0%MNA(木质素磺酸钠)菌体的保存良好。

所述的多粘类芽孢杆菌在农业生物防治中的应用。

优选的，所述的多粘类芽孢杆菌在防治烟草青枯病或黑胫病中的应用。

所述的多粘类芽孢杆菌在促进农作物生长中的应用。

优选的，所述的多粘类芽孢杆菌在促进烟草植株生长中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的多粘类芽孢杆菌可以明显促进烟草生长。室内促生效果测定表明，菌株NX1-4-4对烟草苗期促生效果明显，与CK1相比烟草最大叶长、最大叶宽、株高、叶绿素、地上部鲜重和地下部鲜重等指标分别增加了0.27%、7.46%、32.18%、16.37%、11.66%和9.22%，同时与CK2相比其增加了0.83%、8.9%、2.15%、2.7%、9.5%、5.2%和10.6%,说明NX1-4-4具有促生效果。

2. 本发明提供的多粘类芽孢杆菌可以高效防治烟草病害。菌株NX1-4-4对烟草青枯病防效达65%，与CK1和CK2相比均有显著提高，处理后发病率、病情指数与CK1和CK2相比均大大降低。

生物样品保藏信息如下：

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株NX1-4-4，于2014年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9792。保藏单位出具了存活证明。

附图说明

图1为菌株NX1-4-1-4和CK2对烟草青枯病菌的抑菌效果图；

图2为对烟草黑胫病菌的抑菌效果图；

图3为IAA的标准曲线图；

图4为菌株NX1-4-4的生长曲线图；

图5为菌株NX1-4-4在不同盐浓度下的菌体生长变化图；

图6为不同添加物对菌体存活率的影响；

图7为菌株NX1-4-1-4和CK2对烟草促生效果作用图；

图8为菌株NX1-4-1-4和CK2烟草青枯病防治效果图。

具体实施方式

下面结合实施实例，对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。

实施例1：拮抗细菌NX1-4-4的分离和鉴定

从烟草根围土壤筛选出拮抗细菌，采用分子生物学方法对筛选得到的拮抗细菌进行鉴定。

对菌株NX1-4-4的16S rDNA全序列进行测定与分析。

采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵cetyltrimethylammonium AmmoniumBromide）提取菌株DNA，进行PCR扩增，将所得片段进行测序，并对所得序列与NCBI网站的GenBank已经提交的序列比对结果显示，菌株NX1-4-4与Paenibacillus polymyxa 的同源性最高，表明为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。

实施例2：抑菌效果

实验观察了菌株NX1-4-4和CK2对烟草青枯病菌与黑胫病菌的抑制效果，证明抑制作用确切，具有良好的防治效果。

1）菌株NX1-4-4对烟草青枯病原菌的拮抗作用

菌株NX1-4-4和CK2点接到NA（营养琼脂）培养基中央，将培养好的青枯病菌悬液均匀喷在NA板上，28℃培养观察2d，观察抑菌圈的大小，由图1可知，抑菌圈与CK2相比较明显，说明该菌株对烟草青枯病菌有一定的的抑制作用。

2）菌株对烟草黑胫病菌的拮抗效果

采用平板对峙法，测试多粘类芽孢杆菌NX1-4-4对烟草黑胫病菌拮抗效果。在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar）板的中央接菌株NX1-4-4，左右距离为2.5cm处接种病原菌菌丝块，每菌株重复3个平板。仅仅接种黑胫病菌丝块的为对照，28℃光照培养箱培养5d，观察菌株对黑胫病菌的抑制效果。如图2所示，菌株NX1-4-4能够抑制烟草黑胫病原菌菌丝生长，说明该菌株对烟草黑胫病原菌有的抑制作用。

实施例3：菌株NX1-4-4产IAA(吲哚乙酸)量的测定

实验证明，菌株NX1-4-4可以产生IAA，产IAA的量为104.71mg/L。

1）IAA标准曲线的建立

准确称取IAA100 mg，用无菌水制成1mg/mL的标准液，备用。分别吸取IAA标准液采用倍比稀释法配置成10，20，30，40，50，60，70，80，90，100mg/L的IAA溶液。取上述溶液各800µL与 1600µL Salkowski比色液混合，室温避光放置 25min后观察颜色变化，于OD540 nm处测定吸光度。以水代替IAA液为空白对照。根据IAA浓度及吸光度值绘制回归方程，以IAA浓度为纵坐标（Y），吸光度为横坐标（X），做出IAA标准曲线（图3），可见该曲线基本为一条直线，经计算得回归方程为Y=250.56X-5.5331，其中R² =0.9934，由此可知，IAA在10-100mg/L范围内，标准曲线线性良好。

2）菌株NX1-4-4分泌IAA能力的测定，

菌株NX1-4-4在含有 L-色氨酸(1000mg/L)的LB液体培养基中培养96h，离心取上清液，然后参照上述方法，测定吸光度，平行测定3次，根据标准曲线得到3个样品的IAA含量，计算平均值，计算出菌株NX1-4-4产IAA的量为104.71mg/L，说明该菌株能够产生IAA。

实施例4：菌株NX1-4-4生长曲线和耐盐性的测定

实验证明，菌株NX1-4-4具有一定的耐盐性。

1）菌株NX1-4-4生长曲线的测定

首先分析了NX1-4-4菌株在 NB液体培养基中的生长变化，结果如图4。从图中可以看出，菌株生长16h 后菌体生长量趋于稳定，开始进入稳定期和衰亡期。

2）菌株NX1-4-4耐盐性的测定

根据生长曲线得知菌株NX1-4-4在NB培养基中培养24h后菌体生长已经趋于稳定，因此测不同浓度的NaCl对菌体的影响时从24h开始每隔24h测一次菌体的生长量，设定NaCl浓度为0、2.5%、5%、7.5%、10%，结果如图5所示。在连续培养24h时，不同盐浓度下菌体的生长情况差异比较大，其中在2.5%盐浓度度条件下，菌株的生长情况最好，而随着盐浓度的不断提高，菌株生长缓慢。连续培养48h后，5%、7.5%的盐浓度条件下，菌体生长趋于稳定的状态，当盐浓度高于7.5%时菌体生长情况趋于下降，说明盐浓度高于7.5%时菌株不易生长，开始受到抑制。

实施例5：不同添加物对菌体存活期的影响

首先将海藻酸钠配制成浓度为 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的溶液；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成浓度为 1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的溶液；麦芽糊精配制成浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%的溶液；腐殖酸配制成浓度为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的溶液；木质素磺酸钠配制成浓度为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2%的溶液；高温高压灭菌备用。然后将在优化培养基上培养好的菌株NX1-4-4分别与上述添加物的溶液按1：1比例混合，置于室温保存，采用稀释平板涂布法测定菌株保存30d、60d时的有效活菌数，以菌体在无菌水中保存为对照(CK)，每组处理3个重复。由图6可知，菌体的初浓度为1×10⁹CFU.mL^-1，室温保存60d后菌体的浓度，在添加0.5%的 MHJ中菌体的浓度为1.5×10⁹CFU.mL^-1，在添加1.0%木质素磺酸钠中菌体的浓度为1.78×10⁹CFU.mL^-1。与菌体的初浓度无差异，说明具有较好的保存效果。

实施例6：菌株NX1-4-4对烟草幼苗的促生效果

1）菌悬液的制备

菌株NX1-4-4于NA板上划线培养2天，挑取单菌落于NB培养液中培养24h，3%的接种量接种到优化培养基中（大豆粉1%，玉米粉1%，蔗糖0.4%，碳酸钙0.5%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钠0.1%，硫酸镁0.05%，pH7.0~7.5。），180rpm，28℃振荡培养48h。备用。

2）促生效果

烟草4-5片叶时移栽，缓苗1周后，菌悬液用无菌水稀释，处理烟苗，使土壤中拮抗菌NX1-4-4的浓度为10⁸CFU.mL^-1，每棵烟苗用量为50mL，连续处理3次，每次间隔7d，测定烟株最大叶长、最大叶宽、株高、有效叶片数、茎围、叶绿素含量、地上部和地下部的鲜重等，每处理9株烟苗。以清水处理为CK1, 其他生防菌处理为CK2。

表1 NX1-4-4菌悬液对烟草苗期生长的影响

图7是经菌株NX1-4-4和CK2菌悬液处理后烟苗的生长状况。可见，菌株NX1-4-4菌悬液处理后，烟草的最大叶长、最大叶宽、株高、叶绿素、地上部鲜重和地下部鲜重比CK1增加了0.27%、7.46%、32.18%、16.37%、11.66%和9.22%，比CK2增加了0.83%、8.9%、2.15%、2.7%、9.5%、5.2%、10.6%（如表1）。差异显著性分析表明，菌株NX1-4-4处理在株高、叶绿素和地上部鲜重等方面与CK1和CK2相比均达到显著水平。

实施例7：菌株NX1-4-4对烟草青枯病的室内防效

1）实验方法和计算

烟草长到4-5片叶时移栽，移栽时伤根处理，浓度为10⁸CFU.mL^-1的青枯菌悬液50mL进行灌根，2d后，用浓度为10⁸CFU.mL^-1的NX1-4-4的菌悬液灌根处理，每棵烟苗的用量为50mL。连续处理3次，每次间隔7d。从发病开始，每天观察记录发病株数，植株可见明显青枯病症状即记为发病株。按照病害分级标准计算病情指数与防病效果，以青枯菌处理为CK1，其他生防菌处理为CK2。

青枯病发病等级：

0级：全株无病；

1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧1/3以下叶片凋萎；

3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高的1/2，或病侧1/3-1/2叶片凋萎；

5级：茎部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达茎顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎；

7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎；

9级：病株基本枯死。

病情指数（%）=

×100

防病效果（%）=

×100

按照上述公式计算病情指数和防治效果。

2）室内防效结果

结果如表2所示，菌株NX1-4-4对烟草青枯病防效达65%，与CK1和CK2相比有显著提高，处理后发病率、病情指数与CK1和CK2相比均大大降低。

表2 不同处理对烟草病的防治效果

综上所述，菌株NX-4-4处理不仅对烟草幼苗的生长有明显的促进作用，而且对烟草青枯病有较好的防治作用，因此菌株处理不仅能够调节作物生长，而且可以有效的防治烟株病害，在农业生产中发挥重要的作用。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌为保藏编号是CGMCCNo.9792的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株NX1-4-4。

2.根据权利要求1所述的一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌能够产生IAA。

3.根据权利要求1所述的一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌在0.1%-2.5%盐浓度条件下，菌株的生长情况最好；2.5%-7.5%盐浓度条件下，菌株的生长缓慢；盐浓度高于7.5%，生长受到抑制。

4.根据权利要求1所述的一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌添加0.5%的 麦芽糊精或添加1.0%木质素磺酸钠菌体的保存良好。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种多粘类芽孢杆菌在农业生物防治中的应用。

6.根据权利要求5所述的一种多粘类芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌在防治烟草青枯病中的应用。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的一种多粘类芽孢杆菌在促进农作物生长中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种多粘类芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌在促进烟草植株生长中的应用。

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