CN105695353A - 芽孢杆菌新菌株及其发酵产物的制备方法和发酵产物在防治梨黑斑病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌新菌株及其发酵产物的制备方法和发酵产物在防治梨黑斑病中的应用，其中，芽孢杆菌(Bacilus amyloliquefaciens)新菌株ZG2的保藏号为CGMCC No.11868，发酵产物的制备方法包括以下步骤：(1)单菌落接种于溶菌肉汤培养液中，28℃下震荡恒温培养制得种子液；(2)种子液接入溶菌肉汤培养液中，28℃下震荡恒温培养制得发酵液；溶菌肉汤培养液的配方如下：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂粉18g、蒸馏水1000ml。本发明的有益之处在于：发酵产物可以有效防治梨黑斑病，防治机会多，生防效果好，在梨果采收前防治，防治效果可达90％以上；在梨果采收后立即防治，防治效果可达82％以上；在梨果预冷后防治，防治效果可达65％以上；如果将不同时期结合防治，效果更好。

Description

芽孢杆菌新菌株及其发酵产物的制备方法和发酵产物在防治梨黑斑病中的应用
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌的新菌株，同时还涉及该新菌株的发酵产物的制备方法，以及该发酵产物在防治梨黑斑病中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
梨黑斑病是一种危害严重的世界性气传真菌病害，由链格孢(Alternariaalternata)引起，在梨果采前和采后均有发生。
我国是梨种植和出口大国，采后病原微生物的侵染造成采后腐烂损失严重，直接影响梨果贮运生产，梨黑斑病的有效防治成为梨产业中急待解决的问题。
使用化学杀菌剂控制水果的采后病害一直被认为是最有效的控制方法。然而，随着病原菌抗药性的逐渐增加，及人们对水果质量要求的提高和环保意识的加强，果蔬采后生物防治方法作为一种控制采后病害的新途径，逐渐为人们所认可，并成为研究热点。
近年，有不少关于梨黑斑病生物防治的研究报道，例如：
齐东梅等筛选了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)H110，其发酵液对梨采后黑斑病的防治率达到86.6％；
谢莉从土壤中分离到金色链霉菌(Streptomycesaureus)B-105，其发酵液对梨黑斑病的抑制率67.4％；
Benbow等研究了隐球酵母属的Cryptococcusinformominiatus和红酵母属的Rhodotorulaglutinis对梨病害的抑菌效果，Cryptococcusinformominiatus和Rhodotorulaglutinis在采收前1d对梨进行处理，能有效地控制梨的采后黑斑病；
宋聪等分离到一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)J18，梨果在菌悬液中浸果30s，晾干后喷施接种链格孢菌，梨黑斑病的发病率仅为16.57％，且菌株能在梨果上很好地定殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌的新菌株，该新菌株的发酵产物能有效防治梨黑斑病。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2，其特征在于，前述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2为以保藏号CGMCCNo.11868保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株。
一种芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1、制备种子液：
将新鲜芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2单菌落接种于溶菌肉汤培养液中，28℃下震荡恒温培养，制得芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液；
Step2、制备发酵液：
将芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液接入溶菌肉汤培养液中，28℃下震荡恒温培养，制得芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液。
前述的制备方法，其特征在于，在Step1和Step2中，前述溶菌肉汤培养液的配方如下：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂粉18g、蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6。
前述的制备方法，其特征在于，在Step2中，芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液的接种比例为1％。
前述的制备方法，其特征在于，在Step2中，震荡恒温培养的时间为72h。
本发明的有益之处在于：芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵产物可以有效防治梨黑斑病，防治机会多，生防效果好，其中：在梨果采收前防治，防治效果可以达到90％以上；在梨果采收后立即防治，防治效果可以达到82％以上；在梨果预冷后防治，防治效果可以达到65％以上；如果将不同时期结合防治，效果更好。
附图说明
图1是芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在透射电镜下的形态特征；
图2是28℃时芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口上的生长动态；
图3是20℃时芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口上的生长动态；
图4是4℃和0℃时芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口上的生长动态。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
第一部分：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2
新菌株已做保藏。
保藏日期：2015年12月11日。
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏编号：CGMCCNo.11868。
新菌株是从山西省原平市石封村枣果实表面分离并纯化得到的。分离纯化的具体过程如下：
(1)将采摘的枣果用0.05M的磷酸缓冲液浸泡，在摇床上100rpm/min震荡10min，收集洗液；
(2)再次用0.05M的磷酸缓冲液浸泡上述枣果，超声清洗30min，收集洗液；
(3)用稀释平板法，将收集的洗液连续稀释，分别取0.1mL涂布于溶菌肉汤培养基平板上，每个稀释度重复3次；
(4)在30℃下培养24h-48h，观察菌株生长情况；
(5)待长出菌落后，挑取菌落形态差异明显的单菌落，在溶菌肉汤培养基上进行纯化培养，并编号。
新菌株具有以下特征：
(一)形态学特征
(1)在溶菌肉汤培养基上培养48h-72h，新菌株ZG2呈革兰氏阳性菌，杆状，大小为(0.8μm-1.2μm)×(1.6μm-2.5μm)，有鞭毛(见图1)；
(2)在溶菌肉汤培养基平板上好氧培养24h-48h后，产生初期为凸起、表面粘稠、边缘不规则的乳白色菌落，后期为皱缩变干的浅黄色菌落。
溶菌肉汤培养基(pH7.4-7.6)的配方如下：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml。
(二)生理生化特征
(1)新菌株为兼性厌氧菌，生长pH范围为5.5-7.5，生长温度范围为5℃-40℃，NaCl浓度范围2％-6％；
(2)其他生理生化指标如下表所示：
新菌株生理生化特征
(三)基因特征
经16SrDNA序列测定，PCR扩增得到新菌株的16SrDNA片段，测序长度为1451bp，将新菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，新菌株与Bacillusamyloliquefaciens(GU125620)相似度达到100％。
结合形态特征、生理生化指标和基因特征，我们最终确定分离纯化得到的菌株为芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2。
第二部分：制备芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵产物
第1步：制备种子液
从试管斜面上用接种针挑取一环新鲜芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2单菌落，接种于溶菌肉汤培养液中，28℃、160rpm/min震荡恒温培养24h，制得芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液。
溶菌肉汤培养液(pH7.4-7.6)的配方如下：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂粉18g、蒸馏水1000ml。
第2步：制备发酵液
将芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液按照1％的比例接入溶菌肉汤培养液中，28℃、160rpm/min震荡恒温培养72h，制得芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液。
第三部分：发酵产物的应用
发酵产物主要应用在梨黑斑病的防治中。
(一)不同处理菌液对梨黑斑病的防治试验
1、试验方法
将芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液制成以下4种菌液：
A：配制成浓度为1×106cfu/mL的发酵原液；
B：浓度为1×106cfu/mL的发酵原液经0.22μm滤膜过滤后的过滤液；
C：浓度为1×106cfu/mL的发酵原液离心后，弃上清液，沉淀经灭菌水清洗2次，制备成浓度为1×106cfu/mL的菌悬液；
D：浓度为1×106cfu/mL的发酵原液在121℃100KPa高压灭菌20min，制备成浓度为1×106cfu/mL的热杀死液。
梨黑斑病菌孢子悬浮液配制：
新鲜的梨黑斑病菌平板中加入10mL无菌水，用灭菌涂布器轻轻刮洗菌饼表面，洗下新鲜病原菌的分生孢子，收集洗液，用灭菌的四层纱布过滤制成孢子悬浮液，光学显微镜镜检悬浮液中孢子情况，配置成所需浓度。
将上述A、B、C、D4种菌液分别取30μl接种于梨果伤口(3mm×3mm)，对照为加等量无菌水，晾干后，分别取1×105个孢子/mL梨黑斑病菌孢子悬浮液15μl接种于梨果伤口，晾干，套袋保湿，25℃恒温培养7d，每个处理10个梨果，重复3次，统计发病情况。
梨果实发病程度分级标准：
0级——无病；
1级——病斑占果表面积的1％以下；
3级——病斑占果表面积的2％-3％；
5级——病斑占果表面积的4％-6％；
7级——病斑占果表面积的7％-10％；
9级——病斑占果表面积的11％以上。
2、试验结果
试验结果表明，接种于伤口处的A、B、D三种菌液对梨黑斑病菌均有保护作用，防病效果由强到弱依次是：A菌液(发酵原液)、B菌液(过滤液)、D菌液(热杀死液)、C菌液(菌悬液)，其中，A菌液(发酵原液)的防效达到95％，C菌液(菌悬液)的防效仅为2.8％，说明芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵原液的防病效果最好，详见表2。
表2芽孢杆菌ZG2不同处理液对梨黑斑病的影响
注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。
(二)不同浓度的发酵液对梨黑斑病的防治试验
1、试验方法
将芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液浓度分别配制为1×108cfu/mL、1×106cfu/mL、1×104cfu/mL。
将梨黑斑病菌孢子浓度分别配制为1×106个孢子/mL、1×105个孢子/mL、1×104个孢子/mL。
将不同浓度的发酵液各取30μl加入梨果伤口，晾干后，接种不同浓度梨黑斑病菌孢子悬浮液15μl，晾干，套袋保湿，25℃恒温培养7d，统计发病情况(方法同前)。每个处理10个梨果，重复3次。
2、试验结果
试验结果表明，接种芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发酵液的梨果伤口，其病情指数低于各自对照；伤口上的发酵液使用浓度越大，病原菌接种浓度越低，其防效越高。相同发酵液浓度时，其防效随病原菌浓度的增大而减小；相同梨黑斑病菌孢子悬浮液浓度时，防效与发酵液浓度无线性关系。梨黑斑病原孢子浓度1×104个孢子/mL和1×105个孢子/mL时，发酵液可以有效抑制病害发生，三个浓度的防效均在71％以上；梨黑斑病原孢子浓度为1×106个孢子/mL时，发酵液只能降低病害的发生程度，三个浓度的防效均在65％以下，详见表3。
表3不同浓度发酵液对采后梨黑斑病的影响
(三)发酵液不同接种时间对梨黑斑病的防治试验
1、试验方法
在接种15μl浓度为1×105个孢子/mL的梨黑斑病菌孢子悬浮液前24h、前12h、前4h、0h、后4h、后12h、后24h的不同时间在梨果伤口(3mm×3mm)分别接种30μl浓度为1×108cfu/mL芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发酵液，对照为先在伤口接30μl无菌水，3h后接入梨黑斑病菌悬浮液，晾干，套袋保湿，25℃恒温培养7d，统计发病情况(方法同前)。每个处理10个梨果，重复3次。
2、试验结果
芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发酵液在不同相对接种时间接种于梨果伤口(3mm×3mm)，对梨黑斑病均有防治效果，发酵液和梨黑斑病菌孢子的相对接种时间影响防治效果，发酵液接种时间相对早的处理防效显著优于相对时间晚的处理(P＝0.05)。提前12h接种发酵液的处理防效最高，达到94.94％；发酵液相对病菌液晚接种的处理，防效均在20％以下，彼此间在0.05水平上差异不显著，详见表4。
表4发酵液和病原孢子接种时间对梨黑斑病的影响
(四)芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口上的生长动态
1、试验方法
取30μl1×108cfu/mL的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发酵液接种于梨果伤口(3mm×3mm)内，lh后测定的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2细菌数为起始值(0h)。将接种芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的梨果分别保湿贮于28℃、20℃、4℃和0℃下。每处理10个果实，试验重复3次。28℃下的梨果每天测定一次，20℃下的梨果每3天测定一次，4℃和0℃下的梨果每6天测定一次。测定方法是用无菌打孔器从梨果伤口处取直径和深度均为10mm的果肉组织，放于己加1.0mL的0.05mol/LpH7.0的磷酸缓冲液的无菌研钵内，在无菌操作台内研磨后用稀释平板法记数。将所得拮抗菌的cfu转化成log10 cfu。
2、试验结果
在28℃、20℃、4℃和0℃下，芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口呈先增长后平稳的繁殖趋势，均能在伤口较好定殖。芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口起始数均为6.25×107cfu/mL，28℃下接种1d时，梨果伤口菌数是起始的4.2×107倍-3×108倍，接种4d时，伤口菌数达到最大值，是起始的2.25×1010倍-1.7×1011倍，接种9d时，伤口菌数仍是起始菌数的3×105倍-1.34×106倍(见图2)；20℃下接种3d时，伤口菌数达到最大，是起始菌数的1.4×106倍-2.5×107倍，9d之后保持平稳，接种24d时，伤口菌数是起始菌数的79倍-3.5×102倍(见图3)；4℃下接种6d时，伤口菌数达到最大，之后基本维持水平，接种66d时，伤口菌数是起始菌数的2.4×104倍-2×105倍；0℃下伤口菌数增长幅度不大，低温抑制病原菌生长的同时也抑制了拮抗菌的生长，但到第66d时，伤口菌数是起始菌数的3倍-16倍(见图4)。
基于以上相关试验，我们最终确定了利用芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发酵液防治梨黑斑病的三个最佳时机，分别是：梨果采收前防治、梨果采收后立即防治和梨果预冷后防治。
1、梨果采收前防治
采用梨果采收前防治方法时，于梨果采收前3d-5d，用喷雾器在果实表面喷施芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液，发酵液的浓度为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL。
注意：应选择天气晴朗、日照充足的时间段实施防治。
经验证，该防治方法对梨黑斑病的防效达到90％以上。
2、梨果采收后立即防治
采用梨果采收后立即防治方法时，于梨果采摘后，立即将梨果浸泡于芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液中，发酵液的浓度为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL，浸泡时间为2min-3min，然后取出，置于塑料周转箱内，待果实自然晾干后再入保鲜库预冷、贮藏。
注意：在自然晾干过程中，避免将梨果与土壤等其他可能携带病原菌的物质接触。
经验证，该防治方法对梨黑斑病的防效达到80％以上。
3、梨果预冷后防治
采用梨果预冷后防治方法时，于梨果在保鲜库预冷24h后，将没有机械伤的梨果浸泡于芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液中，发酵液的浓度为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL，浸泡时间为2min-3min，然后取出，置于塑料周转箱内，待果实自然晾干后再进行装箱工作。
注意：整个浸泡和晾干过程均需要在保鲜库中进行，防止梨果温度升高，出现冷凝水。
经验证，该防治方法对梨黑斑病的防效达到65％以上。
在实际生产中，应用芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发酵液对梨采后黑斑病进行生物防治时，应因地制宜，选用适合的防治方法，或者将三种方法相结合的办法，使芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2发挥最大的生防作用。
综上所述，本发明可以获得以下有益效果：
1、本发明的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2是梨采后黑斑病生物防治的高效菌株，其发酵液的各种处理均能抑制梨采后黑斑病，其中接种发酵液的处理抑病效果显著优于其他处理；
2、本发明的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2对梨采后黑斑病的防治是多种成分和因素发挥作用，病害难以产生抗药性：芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的抑菌机理是代谢产物起到防治梨采后黑斑病的效果，此外，根据细菌产生的抑菌活性物质(如细菌素)能同时影响敏感菌的多种代谢途径，推断出因病原菌发生突变而对细菌素产生抗性的可能性不容易出现；
3、本发明的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液制备工艺简单，芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵条件不苛刻，可实现工业化生产，可制成干粉菌剂应用到工业化生产当中，商业价值大；
4、用本发明的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的菌剂对梨采后黑斑病的防治效果更加持久，由于芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2是从枣果实表面分离出来，具有与梨采后黑斑病相同或相近的生态适应性及对寄主植物的亲和性，定殖容易，再加上细菌繁殖迅速，使得芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2对梨采后黑斑病的防效更加持久；
5、生防作用效率高：芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2属于生防细菌，繁殖速度快，在适宜条件下，几十分钟分裂繁殖依次，具有很高的生防效率；
6、有利于维持有益微生物的生态平衡：芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2所产生的抑菌物质直接针对梨采后黑斑病起作用，特异性强，依次不会对农业生态系统中其它有益微生物产生不利影响，有助于维持有益微生物的生态平衡；
7、用本发明的芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的菌剂防治梨采后黑斑病可在梨果采收前防治、梨果采收后立即防治和梨果预冷后防治三种方法，防治效果分别达到90％以上、80％以上和65％以上，防治机会多，生防效果好，如果将不同时期结合防治效果更好。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一株芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2，其特征在于，所述芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2为以保藏号CGMCCNo.11868保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株。
2.一种芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1、制备种子液：
将新鲜芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2单菌落接种于溶菌肉汤培养液中，28℃下震荡恒温培养，制得芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液；
Step2、制备发酵液：
将芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液接入溶菌肉汤培养液中，28℃下震荡恒温培养，制得芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在Step1和Step2中，所述溶菌肉汤培养液的配方如下：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂粉18g、蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在Step2中，芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液的接种比例为1％。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在Step2中，震荡恒温培养的时间为72h。
6.采用权利要求2至5任意一项所述方法制备得到的发酵产物在防治梨黑斑病中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用发酵产物防治梨黑斑病的时机包括：梨果采收前防治、梨果采收后立即防治和梨果预冷后防治。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用梨果采收前防治方法时，于梨果采收前3d-5d，在果实表面喷施芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液，发酵液的浓度为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用梨果采收后立即防治方法时，于梨果采摘后，立即将梨果浸泡于芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液中，发酵液的浓度为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL，浸泡时间为2min-3min，然后取出自然晾干。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用梨果预冷后防治方法时，于梨果在保鲜库预冷24h后，将梨果浸泡于芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)新菌株ZG2的发酵液中，发酵液的浓度为1×106cfu/mL-1×108cfu/mL，浸泡时间为2min-3min，然后取出自然晾干。
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