CN116024118A - 一株耐盐碱菌剂sym-6及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株紫花苜蓿内生菌Pseudomonas atacamensis SYM‑6及其应用，属于微生物肥料领域。Pseudomonas atacamensis SYM‑6于2021年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23575。该菌具有耐盐碱能力，同时，还具有产ACC脱氨酶活性、IAA、嗜铁素、溶解无机磷的能力。盆栽实验表明，与未接种的对照组相比，接种SYM‑6后可以显著促进盐碱胁迫下紫花苜蓿的生长，提高其根系活力，并增加植株内可溶性蛋白含量，明显降低植株中过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O^2‑）含量。该菌株能够用于提高紫花苜蓿对盐碱胁迫的抗逆性，并且促进植物生长，为紫花苜蓿微生物内生菌剂领域带来广阔的应用前景。

Description

一株耐盐碱菌剂SYM-6及其应用

技术领域

本发明属于微生物肥料领域，具体涉及一株 Pseudomonas atacamensisSYM-6及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是世界范围内的环境和资源问题。盐碱胁迫会导致植物体内乙烯过量积累，引发植物叶子变黄、器官衰老、花瓣脱落，甚至过早死亡等一系列反应，形成制约农牧产业的重要因素。解决这一问题较为绿色且高效的方法就是利用有益的植物微生物，包括植物内生菌和根际菌。

有益的植物内生菌与宿主植物在长期进化过程中会形成互惠共生的关系，即植物为内生菌提供营养和相对适宜的生长环境，内生菌则通过自身分泌物质或促进植物产生次生代谢产物来增加植物对胁迫环境的耐受性及促进植物的生长。一些植物内生菌可产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase，ACCdeaminase），将植物分泌的乙烯前体ACC分解，降低宿主植物体内乙烯含量，提高宿主植物抗逆性，增强宿主植物吸收养分能力，进而促进宿主植物生长。此外，植物内生菌还可通过分泌生长素（IAA）、嗜铁素、溶解无机磷等多种方式提高宿主植物对逆境的适应性，促进植物生长。与传统肥料相比，微生物菌剂具有安全无污染、改良土壤、防治病虫害、有利于实现农业可持续发展等优点。近十年来，我国微生物肥料的开发和应用取得了长足发展，但也存在短板，还需进一步筛选高效菌株，生物肥料的研究范围还需进一步拓展。

紫花苜蓿( Medicago sativaL.)是一种全球性栽培的多年生优质豆科牧草，其粗蛋白质含量和营养价值高，素有“牧草之王”和“饲料皇后”的美誉。紫花苜蓿对环境适应性强，在我国很多地区都能种植，但是，盐碱胁迫环境会降低紫花苜蓿的生长和产量。和其它植物一样，利用微生物菌剂来促进紫花苜蓿在盐碱胁迫条件下的生长是个良好的选择。本发明以黑龙江省盐碱地生长的紫花苜蓿为材料，分离筛选具有耐盐碱能力，且能够合成ACC脱氨酶、IAA、嗜铁素、溶解无机磷、缓解宿主植物盐碱胁迫的内生细菌，为进一步开发农业促生菌的应用奠定理论和实践基础。

发明内容

本发明的目的是在于克服传统化学肥料会造成环境污染的问题，而提供一种绿色的植物内生微生物菌剂的制备方法与用途。本发明提供一株具有耐盐碱能力的 Pseudomonas atacamensisSYM-6可在盐碱土壤中促进紫花苜蓿的生长。

本本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一株内生菌 Pseudomonas atacamensisSYM-6，该 Pseudomonas  atacamensisSYM-6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23575。

本发明提供的耐盐碱菌株分离自盐碱土生长的紫花苜蓿根系内。取盐碱土中生长的紫花苜蓿的根系，对其表面消毒，称取0.1 g无菌根系，研磨后，将研磨液稀释后涂布于NaCl含量为5%、pH值为9的LB培养基上初筛得到耐盐碱菌株，再以ACC为唯一氮源复筛得到菌株SYM-6。

菌株SYM-6在ACC脱氨酶活性、分泌IAA、嗜铁素、溶解无机磷方面表现出较强的能力，通过分泌ACC脱氨酶降低胁迫诱导宿主植物产生的乙烯，从而减轻盐碱胁迫对紫花苜蓿产生的危害；IAA能促进植物生长，用该细菌接种紫花苜蓿后可以促进其生长，进而增强植物对非生物胁迫的抗性，调节植物抗胁迫能力。

Pseudomonas atacamensisSYM-6具有以下特性：

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供了一株 Pseudomonas atacamensisSYM-6，于2021年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.23575。

本发明菌剂 Pseudomonas atacamensisSYM-6具有产生ACC脱氨酶，合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷的能力，能在盐碱胁迫环境中有效促进植物吸收营养物质，促进植物生长，同时可以帮助植株清除过量过氧化氢和超氧阴离子自由基等有害物质，提高植物的抗盐碱能力，改善作物品质，增加产量。

同时， Pseudomonas atacamensisSYM-6是筛选分离于紫花苜蓿根内的微生物菌剂，其再施用于紫花苜蓿，既可以克服化学农药对环境的危害，还可以很好的作用于宿主植物。

保藏说明

本发明对上述一种菌种进行了下述保藏：

保藏时间：2021年10月12日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)； Pseudomonas atacamensisSYM-6保藏号为CGMCC No.23575。

附图说明

图1为 Pseudomonas atacamensisSYM-6在LB培养基上的生长形态；

图2为不同盐度对 Pseudomonas atacamensisSYM-6生长的影响；

图3为不同pH对 Pseudomonas atacamensisSYM-6生长的影响；

图4为 Pseudomonas atacamensisSYM-6吲哚乙酸（IAA）合成含量；

图5为 Pseudomonas atacamensisSYM-6溶磷定性；

图6为 Pseudomonas atacamensisSYM-6产嗜铁素定性；

图7为 Pseudomonas atacamensisSYM-6在盐碱胁迫下对苜蓿的促生效果。

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施中的定量实验，均设置3次以上重复实验，结果取平均值。

一、 Pseudomonas atacamensisSYM-6 的分离和鉴定

1、 Pseudomonas atacamensisSYM-6 的分离

（1）植物样品采集

供试紫花苜蓿植株取自黑龙江省农科院兰西基地，将获得的紫花苜蓿植株放入提前准备的保鲜袋中带回实验室4℃保存备用。

（2）菌株的筛选和纯化

将紫花苜蓿用自来水冲洗干净晾干后，称取1 g根，在超净工作台里用75%乙醇浸泡3 min，无菌水冲洗3次后，用2%次氯酸钠浸泡30 s，用无菌水冲洗6次后，晾干表面水分，放入研钵中加入2 mL无菌水研磨至匀浆，将匀浆稀释成10^-1、10^-2、10^-3稀释液，分别吸取微量稀释液涂布于NaCl含量为5%，pH值为9的LB培养基上，28℃倒置培养2-3 d，挑取单菌落划线LB培养基上。纯化六代后，挑取单菌落划线至ADF固体培养基，28℃倒置培养12 h，转接五代后，将能持续在ADF培养基上生长的菌株制成甘油菌-80℃保存。

2、 Pseudomonas atacamensisSYM-6 的鉴定

（1）分子鉴定

对菌株SYM-6进行基因组DNA提取，然后进行16S rDNA的PCR扩增和测序。

PCR扩增所采用的引物为：

F8：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

F1541：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'

PCR扩增条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 90 s，30个循环；72℃10 min，4℃。对PCR扩增产物进行测序，测序结果如核苷酸序列表所示。

表1 生理生化鉴定结果

（2）形态鉴定

参见图1，菌株SYM-6在LB培养基上菌落不透明，圆形隆起，表面湿润光滑，灰白色，边缘整齐，不产色素。

生理生化鉴定结果如表1所示。

二、 Pseudomonas atacamensisSYM-6对盐度和pH的耐受性分析

1、盐度对菌株生长影响

以LB液体培养基为基础培养基，添加NaCl使培养基中NaCl含量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，将pH值均调至7，灭菌备用。供试菌株在LB液体培养基中28℃、180 r/min振荡培养12 h，调节菌悬液A₆₀₀=0.5±0.04后，转接100 µL到不同含盐量的培养基中，每处理3次重复，28℃、180 r/min振荡培养12 h，测定菌液在波长600 nm的吸光值。

由图2可知，在NaCl含量为1-6%的液体LB培养基中菌株均能生长，NaCl为1-5%时，菌株生长良好，NaCl含量达到6%时，该菌的生长受到严重抑制，在NaCl含量为7%的液体LB培养基中，该菌几乎不生长。

2、pH值对菌株生长的影响

配制LB液体培养基为基础培养基，调节培养基的pH值分别为7、8、9、10，灭菌备用。供试菌株在LB液体培养基中28℃、180 r/min振荡培养12 h，调节菌悬液A₆₀₀=0.5±0.04后，转接100 µL到不同pH值的培养基中，每处理3次重复，28℃、180 r/min振荡培养12 h，测定菌液在波长600 nm的吸光值。

由图3可知，在pH7-9的LB培养基中菌株均生长良好，当pH值达到10时，该菌几乎不生长。

三、菌株ACC脱氨酶活性的测定

将供试菌株SYM-6菌悬液接种到TSB液体培养基中，过夜培养，4℃离心收集菌体。用DF培养基洗涤3次，将菌体微量转移到ADF培养基中，28℃，180 r/min，培养2 d后，8000r/min离心收集菌体，用Tris-HCl（pH=7.6）洗涤3次，将菌体重悬于Tris-HCl（pH=8.0）缓冲液中，加入30 μL甲苯并在漩涡振荡器上振荡30 s以破碎细胞，吸取200 μL，剩余细胞提取物用作蛋白质含量的测定，在200 μL提取液中加入20 μL 0.5 mol/L ACC颠倒混匀，不添加ACC作为空白对照，30℃培养15 min。添加1 mL 0.56 mol/L HCl，高速离心，取1 mL上清液，加入800 μL 0.56 mol/L HCl混匀，再加入300 μL 2,4-二硝基苯肼颠倒混匀，30℃恒温培养30 min，加入2 mL 2 mol/LNaOH终止反应，540 nm测吸光值。

定量检测结果表明，菌株SYM-6的ACC脱氨酶活力为29.29 µmolα-KA/(mg Pr·h)。

四、菌株吲哚乙酸（IAA）合成能力的测定

将供试菌株SYM-6菌悬液接种到DF培养基中培养2 d，随之取其菌悬液的10%分别接于添加0、100、200和500 µg/mL色氨酸（L-Trp）的DF中，培养2 d，每个处理3次重复，进行菌株IAA合成量的测定。600 nm测吸光值。剩余菌悬液进行离心，取上清，添加2 mL S试剂，暗反应20 min，535 nm测混合液吸光值，用DF空白作为对照。

结果如图4，供试菌株的IAA合成量均随L-Trp浓度的增大而增加，在L-Trp浓度为0时，SYM-6具有合成IAA能力，合成量为6.62 μg/mL；在L-Trp浓度为100、200、500 μg/mL时，SYM-6合成IAA量分别为8.22、10.54、11.05 μg/mL。

五、菌株溶解无机磷能力的测定

定性测定：将供试菌株SYM-6点接在改良的PVK培养基上，30℃恒温培养3 d，观察菌落周围有无水解圈。

定量测定：菌株SYM-6在LB培养基28℃、180 r/min振荡培养过夜，10000 r/min离心3 min后，用去离子水将菌体重新悬起，转接入PVK液体培养基，28℃、180 r/min振荡培养5 d，1 mL菌液离心后，取50 µL上清加入2.5 mL钼锑抗显色剂，定容至25 mL，暗反应30min，测660 nm吸光度，每处理3次重复。

如图5所示，检测结果表明，菌株SYM-6的菌落周围能形成无色透明晕圈，说明菌株SYM-6具有溶解无机磷的能力，定量结果显示菌株SYM-6的溶磷量为274.39 μg/mL。

六、菌株产嗜铁素能力的测定

定性测定：将供试菌株SYM-6点接在CAS培养基，30°C恒温培养3 d，观察菌落周围有无橘黄色晕圈。

定量测定：菌株SYM-6在胰蛋白胨大豆肉汤培养基28°C、180 r/min振荡培养2 d，10000 r/min离心10 min后，取3 mL上清液加入3 mL CAS蓝色显色液，暗反应1 h，630 nm测吸光度，测得样品值为A，以不接菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基做空白对照，测得Ar值，每处理3次重复。

检测结果表明，如图6所示，菌株SYM-6的菌落周围均能形成橘黄色晕圈，说明菌株SYM-6具有分泌嗜铁素的能力，定量结果显示菌株SYM-6的A/Ar值为0.54。

七、菌剂SYM-6的盆栽实验

将菌剂SYM-6菌悬液接种于LB培养基中过夜培养，离心收集菌体，重悬于无菌水中，调节菌浓度A₆₀₀=0.5±0.04。挑选饱满、大小一致、无病害的健康紫花苜蓿种子，进行表面消毒，75%乙醇浸泡3 min后，无菌水冲洗3次，然后将种子浸于2%次氯酸钠溶液中30 s，再用无菌水冲洗5次，将表面杀菌的种子用菌悬液处理，对照组只用无菌水处理，室温培养至种子萌发后，种于盆中。

供试盐碱土壤采自黑龙江省农科院兰西基地，每盆装750 g土，种16粒发芽的种子，每处理设4次重复。实验组每7 d浇一次菌悬液，对照组浇等量无菌水。温室23℃、光照16小时、黑暗8小时培养，适当补充水分。评价盐碱胁迫环境下接种菌剂SYM-6对紫花苜蓿的促生效果，种植60 d后，测定紫花苜蓿的株高、根长、地上鲜/干重以及地下鲜/干重（表2，图7）。

表2 盆栽实验中促生菌SYM-6对苜蓿生物量的影响

结果表明，与不接菌处理的对照（CK）相比，菌剂SYM-6接种后使得紫花苜蓿株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重分别提高了33.91%、29.02%、51.23%、54.55%、61.73%和66.67%。

七、接种菌剂SYM-6对紫花苜蓿生理指标的影响

1、紫花苜蓿根系活力

将0.1 g根尖样品放入10 mL烧杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸缓冲液等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1-3 h，此后加入1 mol/L的硫酸2 mL，以停止反应。与此同时做一组空白实验，先加硫酸，再加根样品，操作方法同上，然后把根取出，吸干水分加入3-4 mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提取三苯基甲腙。将红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤三次，都移入试管，最后加乙酸乙酯定容至10 mL，用分光光度计485nm波长下比色，以空白实验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC的还原量，每处理3次重复。

2、紫花苜蓿可溶性蛋白含量

将0.1 g速冻的植物组织研磨后加入2 mL蒸馏水摇匀，3000 r/min离心10 min，吸取上清1 mL，加入考马斯亮蓝5 mL，充分摇匀放置3 min，在595 nm下测吸光值，1 mL蒸馏水加5 mL考马斯亮蓝为对照调零，每处理3次重复。

3、紫花苜蓿过氧化氢（H₂O₂）含量

0.1 g速冻的植物组织研磨后加入5 mL 4℃预冷的丙酮，摇匀后，4000 r/min离心10 min，取上清1 mL，加入100 μL硫酸钛和200 μL浓氨水，6000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL丙酮洗涤2次，旋涡震荡后5000 r/min离心10 min，直到去除绿色色素，向沉淀中加入2 mL2 mol/L硫酸，完全溶解沉淀后，415 nm波长下测吸光值，丙酮调零，每处理3次重复。

4、紫花苜蓿超氧阴离子自由基（O^2-）含量

将0.1 g速冻的植物组织研磨后加入2 mL 4℃预冷的PBS7.8摇匀后，4℃ 12000r/min离心10min，取0.5 mL上清液加入0.5 mL PBS7.8和1 mL盐酸羟胺，以0.5mL PBS7.8加入0.5 mL PBS7.8和1 mL盐酸羟胺为对照调零，25℃保温1 h，加入1 mL对氨基苯磺酸和1mL α-萘胺，25℃保温20 min，530 nm波长下测吸光值，以PBS组调零，每处理3次重复。

表3 盆栽实验中促生菌SYM-6对紫花苜蓿生理指标的影响

结果表明，与不接菌的对照组（CK）相比，菌剂SYM-6使紫花苜蓿根系活力显著提高，可溶性蛋白的含量显著增加，组织中H₂O₂和O^2-的含量显著降低。

所以，该菌应用包括：

所述 Pseudomonas atacamensisSYM-6 具有耐盐碱的能力。

所述 Pseudomonas atacamensisSYM-6 具有合成ACC脱氨酶的能力。

所述 Pseudomonas atacamensisSYM-6 具有合成IAA、嗜铁素、溶解无机磷的能力。

所述 Pseudomonas atacamensisSYM-6 对盐碱胁迫紫花苜蓿植株有促生作用。

所述 Pseudomonas atacamensisSYM-6 有缓解紫花苜蓿植株盐碱胁迫的能力。

总结

本发明公开了一株 Pseudomonas atacamensisSYM-6，属于植物内生菌资源利用领域。菌株 Pseudomonas atacamensisSYM-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23575。本发明 Pseudomonas atacamensisSYM-6具有耐盐碱、合成ACC脱氨酶、合成IAA、合成嗜铁素和溶解无机磷的能力。同时，菌剂SYM-6接种可以显著促进盐碱胁迫下紫花苜蓿的生长、提高其根系活力和可溶性蛋白含量。此外，菌剂SYM-6接种后显著降低了紫花苜蓿中过氧化氢和超氧阴离子自由基含量，缓解盐碱胁迫对紫花苜蓿的负面影响。本发明 Pseudomonas atacamensisSYM-6对促进盐碱胁迫下紫花苜蓿生长具有重要意义，适于作为农业菌剂加以开发利用。

Claims (6)

1.一株紫花苜蓿耐盐碱内生假单胞菌SYM-6，其特征在于，其分类命名为Pseudomonasatacamensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.23575；该菌株能够耐盐碱；该菌株能够合成ACC脱氨酶，能将ACC作为唯一氮源，并将其分解；该菌株能够合成吲哚乙酸；该菌株能够合成嗜铁素；该菌株具有溶磷能力。

2.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在制备盐碱胁迫下促进植物生长的制剂的应用。

3.权利要求1所述的耐盐碱的Pseudomonas atacamensis SYM-6在促植物生长的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制剂为耐盐碱的制剂；抑制ACC积累的制剂、促进吲哚乙酸合成的制剂、促进嗜铁素合成的制剂、促进溶解无机磷的制剂中的一种或几种。

5.权利要求2所述的耐盐碱的Pseudomonas atacamensis SYM-6在制备缓解紫花苜蓿盐碱胁迫，并促进其生长的制剂的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

Images