CN102559544A

CN102559544A - 低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌及分离培养方法

Info

Publication number: CN102559544A
Application number: CN2011104163678A
Authority: CN
Inventors: 于振滨; 李彦斌; 宋美芹; 张晶晶; 张旭; 熊欢欢
Original assignee: QINGDAO SPRING WATER TREATMENT CO Ltd
Current assignee: QINGDAO SPRING WATER TREATMENT CO Ltd
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌及分离培养方法，低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1 CGMCC No.5286，其具有在低温好氧条件下去除污水中氨氮的能力。实验结果表明：尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明的一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1 CGMCC No.5286在低温下，特别是在8-12℃的条件下，对氨氮去除有明显的强化作用，氨氮去除率提高了10％，出水氨氮浓度最高为4.8mg/L，优于一级A的出水标准(水温≤12℃时，一级A标准的控制指标为8mg/L)。

Description

低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌及分离培养方法

技术领域

本发明属于污水处理领域，涉及一株具有低温下去除污水中氨氮的假单胞菌及分离培养方法。

背景技术

低温对生物处理能力产生重大影响的原因是由于温度的降低影响了微生物的生长及代谢并使污水处理系统中微生物群系发生了改变。在温度下降过程中，中温菌的代谢活性逐渐下降，到一定温度时便失去活性，而适于低温环境的低温微生物的数量由于自身的生理特性及各种生态因子的抑制作用，在数量上无法达到优势菌群的地位，从而导致污水处理厂冬季出水水质下降。因此亟需一种能在低温好氧条件下去除污水中氨氮的菌株。

发明内容

本发明的目的是克服现有菌株低温脱氨氮效果不佳的不足，提供一种在低温条件下能去除污水中氨氮的假单胞菌。

本发明的第二个目的是提供一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法。

本发明的第三个目的是提供一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1 CGMCC No.5286，其具有在低温好氧条件下去除污水中氨氮的能力。

一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1 CGMCC No.5286在低温好氧条件下去除污水中氨氮的用途。

低温优选为8-12℃。

低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法，包括如下步骤：

(1)将第一种亚硝酸细菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸细菌培养液中，在8～12℃，连续培养4～6天，取出上清液，加入第二种亚硝酸细菌培养液，在8～12℃，连续培养4～6天，取出上清液，加入第三种亚硝酸细菌培养液，在8～12℃，连续培养4～6天，富集、驯化低温细菌；

(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20～30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10～30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20～40min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于亚硝酸细菌固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2～3周；

(4)从步骤(3)中的亚硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3-4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为亚黄-1，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

所述第一种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.0764g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g，加蒸馏水至1000mL。

所述第二种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.191g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g，加蒸馏水至1000mL。

所述第三种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.382g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g，加蒸馏水至1000mL。

所述亚硝酸细菌固体培养基由下述组分组成：NH₄Cl 0.0764g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。

实验结果表明：尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明的一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1 CGMCC No.5286在低温下，特别是在8-12℃的条件下，对氨氮去除有明显的强化作用，氨氮去除率提高了10％，出水氨氮浓度最高为4.8mg/L，优于一级A的出水标准(水温≤12℃时，一级A标准的控制指标为8mg/L)。

附图说明

图1为一种在低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌的驯化分离培养流程图。

图2为亚黄-1氨氮去除试验。

图3为假单胞菌细菌鉴定方法流程。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)将第一种亚硝酸细菌培养液放入小试SBR反应器中，将天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种所述第一种亚硝酸细菌培养液中，在10℃，连续培养5天，取出上清液，加入第二种亚硝酸细菌培养液，在10℃，连续培养5天，取出上清液，加入第三种亚硝酸细菌培养液，在10℃，连续培养5天，富集、驯化低温细菌；

(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡20min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置30min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于亚硝酸细菌固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养3周；

(4)从步骤(3)中的亚硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，滴入格里斯试剂变红的形态不同的单菌落，在亚硝酸细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为亚黄-1，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

实施例2

第一种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.0764g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g，加蒸馏水至1000mL。

实施例3

第二种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.191g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄0.01g，加蒸馏水至1000mL。

实施例4

第三种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.382g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g，加蒸馏水至1000mL。

实施例5

亚硝酸细菌固体培养基由下述组分组成：NH₄Cl 0.0764g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。

实施例6

格里斯试剂的配制

1、对氨基苯磺酸试剂(A液)：0.5克对氨基苯磺酸溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中，储于棕色瓶，冷藏备用。

2、α-萘胺试剂(B液)：0.5克α-萘胺加到20毫升蒸馏水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，储于棕色瓶，冷藏备用。

3、格里斯试剂的使用液：取等比例的A液与B液混合即可使用。

实施例7

本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.菌，具有以下微生物学特性：

1.形态学特性

在显微镜下观察，为杆状，长1.8μm，宽0.3μm；在亚硝酸细菌固体培养基上形成米白色菌落。

2.培养学特性

在10℃下，在亚硝酸细菌固体培养基中培养时，本发明的Pseudomonas sp.菌株具有以下特性。

表面光滑湿润，边缘整齐规则，个体微小呈圆形，菌体呈米白色。

3.生理特性

好氧条件下去除污水中氨氮的革兰氏阴性细菌，接触酶阳性、甲基红试验阴性、水解淀粉、液化明胶、不产生吲哚、生长pH值为6～8，生长温度5～30℃。

革兰氏

接触酶

甲基红

淀粉水解

明胶试验

吲哚试验

pH

温度

G^-

+

-

+

-

6～8

5～30

本发明细菌的16s序列鉴定

16SrDNA是细菌类原核生物在漫长的进化过程中十分保守的序列，在现代微生物的分类学中扮演着重要的角色，作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子，用16S rDNA进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

用16s序列进行细菌鉴定按图3进行。

图3中的牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.0～7.2

LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL。

本发明测得的16s序列如下所示：

ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAACCTAATACGTTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGAATGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGG

根据上述微生物学特性，本发明的菌株命名为亚黄-1，分类命名为假单胞菌(Pseudomonassp.)已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5286，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，并已存活。

实施例8

亚黄-1对污水中氨氮的降解效果

在1L的烧杯中，加入500mL第四种亚硝酸细菌培养液(初始氨氮浓度为30mg/L)，加入适量的亚黄-1，保持pH为7.5，测定72小时对氨氮的降解情况，结果如图2所示。

由图2可以看出，经72小时的降解，溶液中氨氮浓度为1.5mg/L，氨氮基本去除，去除率为95.0％，证明本发明中的亚黄-1对氨氮有良好的去除能力。

第四种亚硝酸细菌培养液组成：第一种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl0.1146g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄0.01g，加蒸馏水至1000mL。

实施例9

(1)将第一种亚硝酸细菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸细菌培养液中，在8℃，连续培养6天，取出上清液，加入第二种亚硝酸细菌培养液，在8℃，连续培养6天，取出上清液，加入第三种亚硝酸细菌培养液，在8℃，连续培养6天，富集、驯化低温细菌；

(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10～30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20～40min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10^-8为止；

(4)从步骤(3)中的亚硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

实施例10

(1)将第一种亚硝酸细菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸细菌培养液中，在12℃，连续培养4天，取出上清液，加入第二种亚硝酸细菌培养液，在12℃，连续培养4天，取出上清液，加入第三种亚硝酸细菌培养液，在12℃，连续培养4天，富集、驯化低温细菌；

(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10～30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20～40min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10^-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10^-8为止；

(3)选取梯度为10^-5～10^-8的菌悬液，分别取1mL接种于亚硝酸细菌固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2周；

(4)从步骤(3)中的亚硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

实验证明，实施例9和实施例10低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法分离培养的假单胞菌也有很好的去除氨氮的效果，去除率分别为94.6％和94.9％。

序列表

<110>青岛思普润水处理有限公司

<120>低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌及分离培养方法

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1450

<212>DNA

<213>Pseudomonas sp

<400>1

acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggatg aagagagctt gctctctgat 60

ttagcggcgg acgggtgagt aatgcctagg aatctgcctg gtagtggggg ataacgttcc 120

gaaaggaacg ctaataccgc atacgtccta cgggagaaag caggggacct tcgggccttg 180

cgctatcaga tgagcctagg tcggattagc tagttggtgg ggtaaaggct caccaaggcg 240

acgatccgta actggtctga gaggatgatc agtcacactg gaactgagac acggtccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgaaagcctg atccagccat 360

gccgcgtgtg tgaagaaggt cttcggattg taaagcactt taagttggga ggaagggttg 420

taacctaata cgttgcaatt ttgacgttac cgacagaata agcaccggct aacttcgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacga agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc 540

gcgtaggtgg ttcagcaagt tgaatgtgaa agccctgggc tcaacctggg aactgcatcc 600

aaaactactg agctagagta cggtagaggg tagtggaatt tcctgtgtag cggtgaaatg 660

cgtagatata ggaaggaaca ccagtggcga aggcgactac ctggactgat actgacactg 720

aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780

atgtcgacta gccgttggga tccttgagat cttagtggcg cagctaacgc attaagtcga 840

ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttacctgg ccttgacatg 960

ctgagaactt tctagagata gattggtgcc ttcgggaact cagacacagg tgctgcatgg 1020

ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt 1080

ccttagttac cagcacgtta tggtgggcac tctaaggaga ctgccggtga caaaccggag 1140

gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacggc cagggctaca cacgtgctac 1200

aatggtcggt acaaagggtt gccaagccgc gaggtggagc taatcccata aaaccgatcg 1260

tagtccggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagtcg gaatcgctag taatcgtgaa 1320

tcagaatgtc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380

agtgggttgc tccagaagta gctagtctaa ccgcaagggg gacggttacc acggagtgat 1440

tcatgactgg 1450

Claims

1.一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1 CGMCC No.5286，其具有在低温好氧条件下去除污水中氨氮的能力。

2.权利要求1的一种低温条件下去除污水中氨氮的假单胞菌(Pseudomonas sp.)亚黄-1CGMCC No.5286在低温好氧条件下去除污水中氨氮的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征是所述低温为8-12℃。

4.权利要求1的低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法，其特征是包括如下步骤：

(1)将第一种亚硝酸细菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸细菌培养液中，在8～12℃，连续培养4-6天，取出上清液，加入第二种亚硝酸细菌培养液，在8～12℃，连续培养4-6天，取出上清液，加入第三种亚硝酸细菌培养液，在8～12℃，连续培养4-6天，富集、驯化低温细菌；

5.根据权利要求4所述的低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法，其特征是所述第一种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.0764g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄0.01g，加蒸馏水至1000mL。

6.根据权利要求4所述的低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法，其特征是所述第二种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.191g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄0.01g，加蒸馏水至1000mL。

7.根据权利要求4所述的低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法，其特征是所述第三种亚硝酸细菌培养液由下述组分组成：NH₄Cl 0.382g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄0.01g，加蒸馏水至1000mL。

8.根据权利要求4所述的低温下去除污水中氨氮的假单胞菌的分离培养方法，其特征是所述亚硝酸细菌固体培养基由下述组分组成：NH₄Cl 0.0764g、乙酸钠2g、MgSO₄7H₂O 0.05g、K₂HPO₄0.2g、NaCl 0.12g、MnSO₄H₂O 0.01g、FeSO₄0.01g、琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。