CN116814483B

CN116814483B - 一株高效缺氧反硝化菌株及其应用

Info

Publication number: CN116814483B
Application number: CN202310709324.1A
Authority: CN
Inventors: 张心青; 杨传伦; 郭南南; 车树刚; 蔡倩倩; 田杰伟; 马春峰; 傅英旬; 郭中瑞
Original assignee: Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Current assignee: Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Priority date: 2023-06-15
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2024-07-16
Anticipated expiration: 2043-06-15
Also published as: CN116814483A

Abstract

本发明属于环境微生物及废水处理领域，具体涉及一株高效缺氧反硝化菌株及其应用。该菌株为一株脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)，在合适的条件下，对高氮废水具有高效的生物降解处理性能。可应用于高氮废水的生物强化处理，为降解废水生物处理系统中的高氮类物质提供帮助。

Description

一株高效缺氧反硝化菌株及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物及废水处理领域，具体涉及一株高效缺氧反硝化菌株及其应用。

背景技术

目前，世界面临的突出环境问题是，总氮排放量远远超出受纳水体的环境容量，氮素污染已超过有机物污染成为影响地表水水环境质量的首要指标，严重影响河流和饮用水水源地的水环境质量，直接影响污染减排工作的绩效，水质持续改善面临巨大挑战。

污水厂作为我国城市水体的重要补给水源，深度控氮迫切需求，很多污水处理厂进水COD浓度过低，C/N比不足，加重污水厂运行负担，影响污水处理系统运行效能，为保证出水总氮达标，常规污水深度脱氮技术强烈依赖外部碳源投加，运行成本高，碳源“投不起”成为污水处理厂和工业园区污水处理系统总氮减排的“卡脖子”问题。

目前，主要通过物理、化学法和生物法去除废水中的氮，但物理化学法存在处理效果欠佳、二次污染、成本较高的问题，且只适用于去除废水中的氨氮，而生物法不仅可以去除氨氮、还可以去除有机氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮，除氮的同时还伴随着能够去除废水中的有机物，降低水中的COD。传统生物脱氮一般需要经过三个阶段才能完成脱氮过程：氨化、硝化和反硝化，传统的生物脱氮工艺主要包括A/O工艺、A²/O工艺、氧化沟工艺以及由其改进形成的新工艺。但是出水氨氮和总氮的标准越来越高，传统的生物脱氮工艺跟不上节奏，还存在一些比较大的需要解决的问题。

因此，筛选出更好的具有缺氧反硝化功能的菌株来提高生物法处理氮元素的效率是有效解决目前生物脱氮效率的途径之一，为本领域提供降解效率高、环境耐受性好的用于缺氧反硝化的菌种具有重大意义。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明提供了一株高效缺氧反硝化菌株，该菌株为一株脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)，在合适的条件下，对高氮废水具有高效的生物降解处理性能。可应用于高氮废水的生物强化处理，为降解废水生物处理系统中的高氮类物质提供帮助。

首先，本发明公开一株高效缺氧反硝化菌株，该菌株为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26975。

所述缺氧反硝化菌株是由活性污泥中筛选获得，发明人对其进行了16SrDNA测序，并将该16SrDNA序列进行BLAST对比。经鉴定，在分子水平上确定为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。

本发明进一步公开了所述脱氮副球菌在生物脱氮方面的应用，尤其是在废水生物脱氮处理方面的应用。

进一步的，本发明公开了利用所述脱氮副球菌进行废水脱氮处理的方法，具体为将脱氮副球菌制备为菌剂投加到废水处理系统中。

所述菌剂可以为液体菌剂也可以为固体菌剂。

优选的，所述的液体菌剂的有效活菌数为2.0×10⁹-3.0×10⁹cfu/mL，所述固体菌剂的有效活菌数为1.0×10¹⁰-2.0×10¹⁰cfu/g。

优选的，所述菌剂投加量为每立方废水加入0.1-5L液体菌剂或50-100g固体菌剂。

优选的，所述废水处理系统调节其废水溶氧为0.3-0.8mg/L，pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃。

更优选的，所处理的废水初始总氮浓度≤1000mg/L，碳氮比≥3.6：1。

本发明还公开了所述脱氮副球菌的培养条件：培养温度为30～37℃，pH为7.0～7.5，好氧培养20～24h。

本发明进一步公开了所述脱氮副球菌菌剂的制备方法，具体步骤包括：

(1)菌种活化：取5-15μL冻存的脱氮副球菌接种于100mL的LB液体无菌培养基中，置于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将上述活化的菌种100mL转接到含有1000mL的LB液体无菌培养基中，于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将上述制备好的液体种子按照5％-10％(v/v)的接种量接种入装液量为60-70％的30L种子罐中扩大培养；无菌空气的通气比均为1:0.8-1.5，搅拌速度为160-220rpm，培养温度为30-35℃，发酵周期为18-24h；

(4)发酵罐发酵：将上述获得的种子液按5-10％v/v的接种量接入装液量为60-70％的2t发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同；发酵结束后菌体数量达到2.0×10⁹-3.0×10⁹cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂。

所述种子罐中培养基配方为：柠檬酸钠0.5-1.0％，硝酸钠0.2-0.5％，酵母粉0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.03-0.07％，硫酸亚铁0.001-0.002％，硫酸锰0.001-0.002％，水余量，pH7.0-7.4。

所述固体菌剂的制备方法如下：制备获得液体菌剂后，将上述发酵完成后的液体菌剂浓缩到原体积的三分之一，按照质量比添加4-10％的硅藻土与1.5-2.0％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂。

本发明的有益效果：

本发明的缺氧反硝化脱氮副球菌具有高效的高氮废水生物降解处理功能，在低碳氮比下的情况下，也可快速降解高氮，在温度30～37℃、pH7.0～7.5条件下缺氧处理48h内，对初始浓度为1000mg/L的总氮降解率能达到90％以上，大幅度降低了废水的处理成本，具有广阔的应用前景。

生物保藏信息

保藏时间：2023年03月31日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.26975；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

分类命名：脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)。

附图说明

图1为本发明脱氮副球菌的平板培养状态图；

图2为本发明实施例4中污水处理系统出水总氮浓度变化曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。除特殊说明外，以下实施例中均采用常规技术操作完成。

实施例1

菌株的获得：发明人由山东省滨州市某污水处理厂活性污泥取样，经过初筛和复筛得到一株高效降解总氮的菌。

初筛：采用液体菌液不同量接种与点接两种方式在溴百里酚蓝选择性培养基上进行，筛选出菌落周围有蓝色晕圈的菌落。溴百里酚蓝选择性培养基BTB：NaNO₂ 1g/L，CaCl₂0.2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，FeCl₃·6H₂O 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，琥珀酸钠8.6g/L，琼脂粉20g/L，1mL溴百里酚蓝，pH 7.0左右。

复筛：将初筛所得菌种进行富集和分离纯化培养，分别获得菌液。再分别接种至反硝化培养基中进行培养。采用检测总氮的方式验证反硝化效果。通过测定硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的浓度，了解纯化后菌株的脱氮能力，最终筛选出1株具有较强反硝化作用能力的缺氧反硝化菌。

菌株的鉴定：对所筛选得到的菌株的16S rDNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行Blast比对，确定为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)，保藏号：CGMCC No.26975。

对所筛选到的脱氮副球菌进行反硝化效果初步验证：

将菌株接种到已灭菌的100mL反硝化培养基中，在35℃，180r/min的恒温振荡器中活化18h，然后按照0.5％的接种量接种到已灭菌的反硝化培养基中，封口静置培养处理，24h取样，8000rpm离心5min，取上清液，测定培养前后培养液中总氮的含量(根据中华人民共和国国家环境保护标准HJ 636—2012)。

反硝化培养基组成为：NaNO₃ 2.42g/L(NO₃-N约400mg/L)，KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，pH 7.0，1％溴百里酚蓝指示剂1mL，121℃灭菌20min。

检测结果：反硝化培养基初始总氮含量为486mg/L，培养24h后，总氮剩余20mg/L，总氮降解95.88％。

实施例2

利用本发明菌株制备脱氮副球菌固体菌剂，具体制备方法如下：

第一步，将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃-25℃)活化4h-8h，活化时无需额外补加培养基；

第二步，将第一步的得到的单菌落接种至LB液体培养基(100ml)内，于35℃，185r/min的条件下过夜培养，得到一级种子液，将得到的一级种子液按照10％(V/V)接种至LB培养基中，同样条件下培养16h，获得二级种子液，并置于4℃保存；

第三步，将第二步得到的二级种子液按照1‰(V/V)接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制发酵温度为33±1℃，溶氧30％左右，培养20-30h，溶氧上升，pH下降，停止发酵即得到脱氮副球菌液体菌剂。

在本实施例中所得脱氮副球菌液体菌剂的活菌数为2.0×10⁹cfu/mL。

上述发酵培养基按质量百分比计为：豆粕6％，玉米淀粉6％，葡萄糖0.5％，碳酸钙0.3％，玉米浆干粉0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.1％，硫酸锰0.02％，聚醚消泡剂0.1％，pH7-7.5；高压灭菌121℃，30min后使用。

上述LB培养基由蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，121℃灭菌20min后使用。

在上述液体菌剂的基础上制备固体菌剂：

将上述发酵完成后的液体菌剂浓缩到原体积的三分之一，按照质量比添加8％的硅藻土与2％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂。所获得的菌剂含水率小于10％；经检测，其有效活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g。

实施例3

以实施例2制备的液体菌剂进行验证不同碳氮比下菌株在缺氧下的降解特性：按照3％(v/v)接种量接种至不同碳氮比的无机盐培养基中，缺氧体系加盖后摇匀体系，于30℃恒温静置培养，测定体系初始和培养24h后的总氮浓度。

反硝化无机盐培养基组成为：KH₂PO₄ 1.0g/L，FeSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，NaNO₃根据不同的总氮浓度及C/N比需求进行适量添加(氮源为硝酸钠，碳源为柠檬酸钠)，pH7.0，1％溴百里酚蓝指示剂1mL，121℃灭菌20min。

试验结果如表1-4所示：

表1碳氮比3000:600(5:1)无机盐培养基

表2碳氮比2400:1000(4.8:1)无机盐培养基

表3碳氮比1800:1000(3.6:1)无机盐培养基

表4碳氮比1200:1000(2.4:1)无机盐培养基

实验数据表明，缺氧条件下，当碳氮比在3.6:1及以上时，该菌株的反硝化效果均较好，初始总氮浓度500mg/L以内均能在24h内完全降解，初始总氮浓度1000mg/L内均能在24h达到85％以上的降解率。尤其当碳氮比达到4.8:1及以上时，初始总氮浓度1000mg/L内均能在24h达到90％以上的降解率。但碳氮比小于3.6:1甚至达到2.4:1时该菌株的反硝化效果显著降低，随着碳氮比的降低，菌株的综合反硝化效果有所降低。因此，该菌株缺氧反硝化在碳氮比3.6:1以上，初始总氮浓度1000mg/L及以下具有较好的效果。

实施例4本发明脱氮副球菌在高氮废水处理中的应用：

山东滨州沾化一皮革有限公司生产的废水COD为2000-4000mg/L，总氮970mg/L，盐度15000-20000mg/L，属于皮革行业高浓度废水，处理难度极大。配套污水处理站设计处理量1500m³/d，按照其原有方法进行废水处理，总氮去除率均40％左右，出水水质均达不到排放标准，改用本发明脱单副球菌菌剂进行废水处理。

将实施例2脱氮副球菌固体菌剂按照万分之一的用量投加，即一次性投加实施例2制备的固体菌剂150kg。

投加前首先将脱氮副球菌固体菌剂按照每升营养盐溶液接种0.1-5g固体菌剂的接种量进行接种活化，具体活化方法为：将称量好的固体菌剂按照上述比例首先接种于营养盐溶液中进行活化，活化条件为溶解氧2-4mg/L，pH7.5，温度30℃，曝气5h进行活化。

营养盐溶液：KH₂PO₄ 0.09g、K₂HPO₄ 0.22g、NaH₂PO₄ 0.26g、MgSO₄·7H₂O0.23g、CaCl₂ 0.28g、FeCl₃ 0.003g，pH值7.0～7.2，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

将活化好的菌剂加入到污水处理系统的缺氧池中，pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃，进行体系进出水指标的跟踪检测，结果如图2所示，随着运行天数的增加，出水各指标稳步下降，运行约7d后体系出水的各指标均能达标排放且处理效果稳定，总氮去除率稳定在97％以上，运行费用相比其在先降低了50％以上，实现了高盐高总氮皮革废水的高效处理。

实施例5脱氮副球菌液体菌剂应用

采集山东滨州某工厂废水池的含氮废水，检测水质指标：COD1890.5mg/L，总氮182.3mg/L，pH7.22。

分别设空白对照组和实验组，每组设置5个平行实验：空白对照组不做任何处理；实验组使用实施例2制备的液体菌剂，接种量为0.5％(v/v)接种至含氮废水中，缺氧体系加盖后摇匀体系，于30℃恒温静置培养，测定体系24h后的NO₃ ^--N和TN含量。

通过检测结果可以看出，24h后，菌剂组对总氮的去除率最高值在93％左右，脱氮率均高于90％，而对照组的总氮去除率均低于10％。说明液体菌剂对该废水具有显著的脱氮效果。

Claims

1.一株高效缺氧反硝化菌株，该菌株为脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26975。

2.权利要求1中所述的脱氮副球菌在废水生物脱氮处理方面的应用，其特征在于，所述废水初始总氮浓度≤1000 mg/L，碳氮比≥3.6：1；处理时调节其废水溶氧为0.3-0.8mg/L。

3.一种废水脱氮处理的方法，其特征在于，具体为将权利要求1中所述的脱氮副球菌制备为菌剂投加到废水处理系统中，所述废水初始总氮浓度≤1000 mg/L，碳氮比≥3.6：1；所述废水处理系统调节其废水溶氧为0.3-0.8mg/L。

4.根据权利要求3所述的废水脱氮处理的方法，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂。

5.根据权利要求4所述的废水脱氮处理的方法，其特征在于，所述的液体菌剂的有效活菌数为2×10⁹-3.0×10¹⁰cfu/mL，所述固体菌剂的有效活菌数为1.0×10¹⁰-2.0×10¹⁰cfu/g；所述菌剂投加量为每立方废水加入0.1-5L液体菌剂或50-100g固体菌剂。

6.根据权利要求3所述的废水脱氮处理的方法，其特征在于，所述废水处理系统调节其pH为7.0-8.0，温度控制在30-35℃。

7.一种脱氮副球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述脱氮副球菌为权利要求1所述的脱氮副球菌，具体步骤包括：

(3)种子罐发酵：将步骤（2）制备好的液体种子按照5％-10％（v/v）的接种量接种入装液量为60-70％的30L种子罐中扩大培养；无菌空气的通气比均为1:0.8-1.5，搅拌速度为160-220rpm，培养温度为30-35℃，发酵周期为18-24h；

(4)发酵罐发酵：将步骤（3）获得的种子液按5-10％v/v的接种量接入装液量为60-70％的2t发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；

所述种子罐中培养基配方为：柠檬酸钠 0.5-1.0％，硝酸钠0.2-0.5％，酵母粉0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.03-0.07％，硫酸亚铁0.001-0.002％，硫酸锰0.001-0.002％，水余量，pH7.0-7.4。

8.一种脱氮副球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述脱氮副球菌为权利要求1所述的脱氮副球菌，具体步骤包括：

(4)发酵罐发酵：将步骤（3）获得的种子液按5-10％v/v的接种量接入装液量为60-70％的2t发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同，将发酵完成后培养液出罐；

所述种子罐中培养基配方为：柠檬酸钠 0.5-1.0％，硝酸钠0.2-0.5％，酵母粉0.2-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.03-0.07％，硫酸亚铁0.001-0.002％，硫酸锰0.001-0.002％，水余量，pH7.0-7.4；

将上述发酵完成后的培养液浓缩到原体积的三分之一，按照质量比添加4-10％的硅藻土与1.5-2.0％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂。

9.根据权利要求7或8所述方法制备的液体菌剂或固体菌剂。