CN113025497B - 一种高效降解蒽醌类染料的菌株及其利用中药废渣提高脱色效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效降解蒽醌类染料活性蓝4的白腐真菌薄膜孔菌P5菌株。P5以土豆葡萄糖培养基，在160rpm，30℃条件下，对浓度为1000mg/L的活性蓝4染料24h脱色率为95％。P5对活性蓝4的最高耐受浓度为2500mg/L，并且P5可以适应宽泛的pH范围(4‑9)，盐离子浓度为10％的染料废水条件。同时，本发明利用中药栀子废渣显著提高P5对于染料活性蓝4的降解效率，在添加有(1％，m/v)栀子废渣的土豆葡萄糖液体培养基中，P5对活性蓝4的降解效率显著提高，其脱色率12h可以达到92％。并且在添加栀子废渣后，P5可以显著降低活性蓝4降解代谢产物的浓度以及降解废水的急性毒性。

Description

一种高效降解蒽醌类染料的菌株及其利用中药废渣提高脱色 效率的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高效降解蒽醌类染料的白腐真菌菌株，及其利用中药提取废渣提高其染料废水脱色效率的方法。

背景技术

目前，全球使用的合成染料约有1万多种，年生产能力达700，000吨，广泛应用于纺织、皮革、洗涤剂、药品和化妆品等众多工业生产领域，近几年对如合成染料的需求更是不断增长(Katheresan et al.,2018)。但目前70％的染料废水没有处理而直接排放到自然环境中，对人类的生态环境和健康造成了巨大的压力，因此急需对与工业染料废水进行处理，从而减少染料工业对人类环境所带来的压力(Varjani et al.,2020)。

工业合成染料根据其化学结构主要分为偶氮、蒽醌染料和三甲苯等，其中蒽醌类染料是用量第二大的染料。蒽醌类染料化学结构复杂，在水体环境中性质稳定，并且难以降解。同时，这种染料具有一定的生殖毒性和致癌性。因此，对蒽醌类染料废水的处理一直是工业染料废水处理的热点之一(Li et al.,2019)。

针对蒽醌类染料污水处理主要包括传统的物理化学处理方法，例如氧化修复、吸附、以及离子交换等。然而这些方法由于操作的复杂性以及相对处理效率较低、能源成本较高，因此这些处理方法实际效果仍十分有限(Tang et al.,2018)。生物处理主要是利用一些特殊的微生物直接对染料废水进行生物降解，具有高效绿色的特点。特别是微生物中的白腐真菌具有丰富的染料降解酶系(Gao et al.,2010)，包括木质素氧化酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、染料氧化酶(DyP)以及漆酶(Lac)等，这些氧化酶系具有宽泛的底物选择性，对染料具有较强降解能力(Jamee&Siddique,2019)。通过氧化作用可以破坏复杂的共轭体系，从而将染料逐步降解成无毒的小分子有机化合物，二氧化碳和水。同时，白腐真菌对染料废水本身具有较强的耐受能力，其培养条件也相对比较简单，因此是生物处理染料废水的重要菌种之一。

中国作为世界最大的中药消费国和生产国，每年都约有3000万吨的中药废渣固体废弃。目前，中药废渣的处理主要以填埋、堆放和焚烧等方式为主，不合理的处理方式导致其腐烂和分解后带来相应的环境污染问题，同时也形成了很大程度的资源浪费(Zhao&Zhou,2016)。因此对于中药废渣的循环利用是目前中药产业亟需解决的问题。现在，已有一些研究报道通过微生物利用中药废渣生产高价值产品，包括重组大肠杆菌利用甘草废渣生产琥珀酸，厌氧菌通过利用中药废渣产生甲烷气体等等(Wang et al.,2018；Xi et al.,2015)。中药废渣经过高温高压提取后，本身复杂的纤维结构已经被破坏，其含有大量可被微生物进一步利用的纤维素，木质素等等。而白腐真菌本身具有丰富的降解酶系，栀子废渣可作为额外的培养成份刺激其各种胞外酶系的表达，从而可进一步提高其染料降解效果，目前还未有通过白腐真菌利用中药废渣提高染料降解效果的研究报道。

目前，工业染料废水排放量大，对环境污染严重，其处理问题依然十分具有挑战性，同时，大量的中药废渣也造成巨大的环境压力和资源浪费。本研究通过筛选具有染料降解能力的白腐真菌，进一步利用中药废渣作为营养成份，不仅可以促进其胞外酶系的高表达从而提高其对染料废水的处理效果，同时也为中药废弃物的综合利用提供新的策略。

发明内容

本发明解决的技术问题是：本发明的目的是提供一种高效降解蒽醌类染料废水的菌株，及其利用中药废渣提高其脱色效率的一种方法。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：一种高效降解蒽醌类染料的菌株，保藏名称：薄膜孔菌P5(Antrodia malicola P5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2020年12月7日；保藏号为CCTCC M 2020865。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的菌株P5对活性蓝4染料废水生物降解的应用。

优选的，该方法包括以下步骤：

步骤(1)从土壤中分离获得蒽醌染料降解菌株,通过18srDNA鉴定为薄膜孔菌属，将其命名为P5,并进行菌株保藏，保藏号：CCTCC M 2020865；以P5为生产菌株，将新鲜菌丝通过无菌水洗下，接种于培养基中，在温度30℃、160rpm转速、培养48小时，获种子培养液；

步骤(2)摇床培养：将步骤(1)所述种子培养液接种于发酵培养基中，摇床中发酵2天；

步骤(3)在发酵两天的菌液中，加入浓度为1000mg/L的蒽醌类染料活性蓝4通过24h的生物降解处理，在595nm波长下进行吸光度测定，并计算其脱色率。

优选的，所述步骤(1)所述的培养基是土豆葡萄糖培养基。

优选的，所述步骤(2)的摇床培养，种子培养液接种至发酵培养基中的比例为5％(v/v)。

优选的，所述步骤(2)的发酵培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，pH自然。

优选的，所述步骤(2)的发酵培养基是中药药渣培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，栀子废渣1％，pH自然。

优选的，该方法包括以下步骤：

以P5为生产菌株，在土豆葡萄糖培养基平板活化2天，将新鲜菌丝用无菌水洗至土豆葡萄糖液体培养基中，30℃，160rpm/min震荡培养2天，获得种子培养液；将种子培养液以5％的接种比例转接到新鲜的土豆葡萄糖液体培养基中，30℃，160rpm/min震荡培养2天，对1000mg/L浓度的活性蓝染料，通过24h的生物降解处理，在595nm波长下进行吸光度测定，其活性蓝4的脱色率可以达到95％。

优选的，P5可以最高耐受2500mg/L的活性蓝4浓度；P5在pH范围为4-9的酸碱条件下，对1000mg/L的活性蓝4，24h脱色率为95％；同时P5可以耐受10％的盐离子浓度，对1000mg/L活性蓝4,24h脱色效率为95％。

10、一种高效降解蒽醌类染料的菌株在利用中药废渣提高脱色效率的方法，其特征在于:根据权利要求7所述的高效降解蒽醌类染料的菌株的应用，通过在土豆葡萄糖培养基中添加(1％，m/v)的栀子废渣，其中栀子废渣可以显著提高P5对于1000mg/L活性蓝4的脱色效率，在12h脱色率可以达到92％，栀子废渣的添加可以显著降低活性蓝4生物降解产物的浓度及其急性毒性。

本发明的有益效果：

1.本发明提供了一种高效降解蒽醌染料的菌株，该菌株为薄膜孔菌P5(Antrodiamalicola P5)，将其命名为薄膜孔菌P5，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020865，该菌株进行培养发酵的营养要求较低。

2.P5以土豆葡萄糖液体培养基，在160rpm,30℃震荡培养，对1000mg/L的活性蓝4染料脱色效率为95％，并且P5对活性蓝4的最高耐受浓度为2500mg/L,远高于其他白腐真菌对于染料的耐受能力。同时，P5在宽泛的pH范围(PH＝4-9)，以及10％的盐离子浓度条件下,依然可以保持高效的降解能力，24h的染料脱色率仍保持在95％。工业生产染料废水通常成分比较杂，会含有多种混合染料，同时含有5-10％的盐离子浓度，并且pH值的波动比较大，酸碱范围比较宽泛，大多数微生物无法适应工业废水生产环境或者生长状态比较差，因而造成微生物实际降解效果比较差。P5对不同的染料都具有较高的降解能力，因此可以适应混合染料的负责体系，同时P5可以耐受不同的pH值以及10％的盐离子浓度，并且对于活性蓝4的耐受能力达到2500mg/L，说明P5可以在较为苛刻的生长环境中正常生长并发挥降解作用，因此P5具有工业染料废水降解的应用价值。

3.通过在土豆葡萄糖培养基中添加(1％，m/v)的栀子废渣，可以有效提高P5对于蒽醌染料的脱色效率，在12h脱色率即可以达到92％左右。并且通过栀子废渣的添加可以促使P5菌体内部过氧化物酶系的高表达，显著降低活性蓝4降解产物的浓度及其代谢产物的急性毒性。

4.通过在土豆葡萄糖培养基中添加(1％，m/v)的不同碳源，包括果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖，并不能提高P5对活性蓝4染料的脱色效率。通过在土豆葡萄糖液体培养基中添加不同的氮源，包括黄豆粉、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵反而会降低P5对活性蓝4染料的脱色效率。(见图5)

5.通过在土豆葡萄糖培养基中添加(1％，m/v)的中药提取废渣，包括栀子废渣、黄芪废渣、甘草废渣、苦豆子废渣，其中栀子废渣可以显著提高P5对于1000mg/L活性蓝4的脱色效率，在12h脱色率可以达到95％。

6.通过比较转录组测序分析，栀子废渣可以显著提高白腐真菌P5细胞内多个过氧化物酶基因的表达水平，包括木质素氧化酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)、染料脱色酶(DyP)。结果显示栀子废渣对P5脱色效率的提高来自于多酶体系的整体协同作用。

7.栀子废渣的添加可以显著降低活性蓝4的生物降解代谢产物的浓度，同时通过发光费氏弧菌进行急性毒性测定，栀子废渣的添加可以显著降低活性蓝4生物降解产物浓度及其急性毒性。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1为P5对5种不同染料的脱色效率

图2为P5对不同浓度活性蓝4的脱色效率

图3为P5在不同盐离子环境下对活性蓝4的脱色效率

图4为P5在不同PH环境中对活性蓝4的脱色效率

图5为P5在不同碳源和氮源条件下活性蓝4的脱色效率

图6为中药提取废渣对P5脱色效率的影响

图7为栀子废渣的添加量对P5染料降解作用的影响

图8为活性蓝4降解产物的HPLC分析图

图9为P5对活性蓝4的降解途径推测

图10为P5对活性蓝4的降解作用可以有效降低其毒性

图11为P5利用栀子废渣提高其染料降解能力

本发明提供的薄膜孔菌P5(Antrodia malicola P5)已经于2020年12月7日提交中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCC NO：M2020865。

具体实施方式

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

降解蒽醌类染料菌株的筛选与菌种鉴定

该菌株分离来自南京中医药大学药用植物园土壤微生物，固体培养基为土豆葡萄糖琼脂培养基(马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂粉2％)，液体培养基为(马铃薯汁20％，葡萄糖2％)，经115℃，灭菌30min，在固体平板上菌丝呈放射状，菌丝茂盛，呈白色，不产孢子和色素。通过18sRNA同源性鉴定及系统发育分析，该菌株为薄膜孔菌属Antrodia malicola，将其命名为P5，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020865，

实施例2

P5对不同染料的脱色效率的测定。将P5接种于PDA平板，28℃培养2天，将新鲜菌丝用无菌水刮下至100ml PDB培养基中，28℃度，160rpm培养2天作为种子液，以5％比例转接于100ml新鲜PDB培养基，培养2天后，分别加入5种不同的常见合成染料各100mg，包括活性蓝4，孔雀绿，甲基橙，直接黑19，酸性红。以初始吸光度为A₀，每隔24h取样，记录相应的吸光度为A1,通过公式：脱色率＝A₀-A₁/A₀计算P5对不同染料的脱色效率。P5对5种不同染料的脱色效率见图1。其中对活性蓝4的脱色效率最高，经过24h脱色可以达到95％。实验结果表明P5具有宽泛的染料脱色能力，其中对蒽醌类染料活性蓝4的脱色效率最高。

实施例3

在PDB培养基中加入不同浓度的染料活性蓝4，考察P5对不同浓度活性蓝4的脱色能力。在PDB培养基中分别加入终浓度分别为1000mg/L,1500mg/L,2000mg/L,2500mg/L的活性蓝4染料，图2结果表明P5对1000mg/L的脱色效率最高，随着染料浓度的提供，P5脱色的效率也随之下降。但P5对活性蓝4的耐受能力较高，在2500mg/L的高浓度下依然可以对染料进行降解。

实施例4

工业染料废水通常含有一定的盐离子浓度，因此在PDB培养基中添加不同的盐离子浓度，从而考察P5在盐离子环境中对活性蓝4的降解能力。图3表明，P5在10％浓度下依旧可以对活性蓝4高效脱色，当盐离子浓度提高到20％，P5在24h的染料脱色能力降低至60％左右，说明P5可以最高耐受20％左右的盐离子浓度。

实施例5

通过调节PDB不同的pH值考察P5在不同pH环境下对活性蓝4的脱色效率，图4表明，P5可以耐受较为宽泛的pH环境，在pH4-9的范围下，P5都表现出高效的染料脱色能力。

实施例6

通过在PDB培养基中添加不同的碳源和氮源考察P5在不同营养条件下对活性蓝4的脱色效率。图5表明，在PDB中添加不同的碳源，包括果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖后，P5对活性蓝4的脱色率并没有提高，24h的染料脱色率保持为95％。同时在PDB培养基中添加不同的氮源，包括黄豆粉、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵后，P5对活性蓝4的脱色反而降低，实验结果表明加入分别加入四种氮源后，P5对活性蓝4在24h的脱色率都降至80％以下，额外的氮源摄入对于P5降解染料反而具有显著的负面作用，说明培养基中的C/N比对于P5降解染料具有显著影响。

实施例7

在PDB培养基中添加不同的中药提取废渣，考察不同的废渣是否能够提高P5对活性蓝4的脱色效率。将4种常见的中药材包括栀子，甘草，苦豆子，连翘切片后，加入10倍体积的甲醇超声提取3次，将提取后的药渣烘干至恒重，通过打粉机将其打磨成粉状制备成中药废渣。分别以1％，m/v的添加量加入100ml PDB培养基中，115℃，灭菌30分钟。将培养2天后的P5种子培养液转接至含有中药废渣的PDB培养基中，培养2天后分别加入100mg的活性蓝4染料，每隔12h取一次样品，图6表明，添加不同的中药废渣对于P5的染料降解能力具有不同的作用。添加连翘废渣后，P5的降解能力受到显著抑制，在12h的脱色率仅为27％，添加甘草废渣后，P5的降解能力基本没有变化与PDB培养条件下基本一致，都为49％左右，在添加苦豆子废渣的培养基中，P5脱色率有部分提高，12h脱色率为75％左右，在添加栀子废渣的培养基中，P5对活性蓝4的脱色效率显著提高，在12h就可以达到92％左右，比P5在PDB培养条件下的脱色效率几乎提高了一倍。

通过在PDB培养基中添加不同量的栀子废渣，考察栀子废渣添加量对P5脱色效率的影响，同时也考察了单纯添加栀子废渣是否对染料活性蓝4具有直接的吸附作用。图7表明，栀子废渣对活性蓝4的直接吸附率很小，在48小时有10％左右的吸附率，说明栀子废渣对于P5染料降解能力的提升来自生物化学反应，而不是物理吸附作用。同时栀子废渣的添加量从0.5-2g都表现出比较好的促进染料降解的作用。

通过比较转录组学分析栀子废渣对于P5降解染料的促进作用。以PDB培养基培养的P5菌体为空白组，以加入栀子废渣的PDB培养的菌体为样品组，在12h分别取菌体进行转录组测序和分析。在添加有栀子废渣的PDB培养基中，P5菌体的氧化酶表达量显著提高，其中木质素氧化酶的表达量提高最为明显，相比较于空白菌体，最高提高10.22倍，其次锰过氧化物酶的表达量最高提高5.10倍，漆酶的表达量最高提高3.16倍，染料降解酶的表达量最高提高4.25倍，见表1。这些氧化酶系已经报道直接参与蒽醌类染料的降解过程。通过栀子废渣的添加可以显著刺激P5氧化酶的表达，通过多酶体系的协同作用从而提高P5对于染料的降解能力。

表1栀子废渣对于P5过氧化物酶系表达量的影响

实施例8

栀子废渣的添加显著提高P5对活性蓝4的降解能力，通过对活性蓝4降解72h后的产物进行HPLC-HRMS分析，图8显示栀子废渣的添加可以显著降低活性蓝4降解中间产物的浓度，并且通过质谱分析，推测了活性蓝4的降解过程，如图9。

实施例9

通过费氏发光弧菌对活性蓝4降解产物的急性毒性进行测定，通过添加栀子废渣后，P5的氧化酶表达量更高，降解能力也随之提高，活性蓝4降解产物的浓度也更低，染料也被降解的更彻底。通过费氏弧菌的发光抑制率可显示降解产物的毒性，抑制率越高毒性越大。图10表明P5对活性蓝4的降解作用可以有效降低其毒性，并且添加栀子废渣后的降解产物毒性显著降低，在降解72h后活性蓝4的发光抑制率从65％左右减少到10％左右。因此栀子废渣的添加可以显著提高P5对染料的降解能力，并且降低染料废水的毒性。

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种降解蒽醌类染料的菌株在利用中药废渣提高脱色效率的方法，其特征在于: 包括以下步骤：

步骤（1）以P5为生产菌株，将新鲜菌丝通过无菌水洗下，接种于培养基中，在温度30℃、160 rpm转速、培养48小时，获种子培养液；

步骤（2）摇床培养：将步骤（1）所述种子培养液接种于发酵培养基中，摇床中发酵2天；

步骤（3）在发酵两天的菌液中，加入浓度为1000 mg/L的蒽醌类染料活性蓝4通过24h的生物降解处理，在595nm 波长下进行吸光度测定，并计算其脱色率；

所述的菌株为薄膜孔菌P5 (Antrodia malicola P5)， 保藏名称：薄膜孔菌P5(Antrodia malicola P5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2020年12月7日； 保藏号为CCTCC M 2020865；

所述步骤（2）的发酵培养基是中药药渣培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20%，葡萄糖2 %，栀子废渣1%， pH自然；通过在土豆葡萄糖培养基中添加1%（m/v）的栀子废渣，其中栀子废渣提高P5对于1000 mg/L活性蓝4的脱色效率，在12h脱色率达到92%，栀子废渣的添加降低活性蓝4生物降解产物的浓度及其急性毒性。

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