CN104232522B - 一种产羧甲基纤维素酶的Achromobacter xylosoxidans菌株 - Google Patents
一种产羧甲基纤维素酶的Achromobacter xylosoxidans菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从堆肥中分离筛选出来的能产纤维素酶的细菌7B，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013365。菌株7B为革兰氏阴性杆菌，在LB培养基上形成直径为0.5～1mm，光滑、湿润、有光泽、灰白色、边缘整齐的菌落。采用BIOLOG微生物鉴定系统和16s rDNA序列分析鉴定该菌株为Achromobacter xylosoxidans。采用CMC发酵培养基进行培养，可得到0.183U/mL的羧甲基纤维素酶活力，有望应用于纤维素酶的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及从牛粪堆肥样品中筛选、分离、纯化、得到的能产纤维素酶的木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans 7B。
背景技术
进入21世纪后，随着化石燃料的前景趋向枯竭、碳排放过量、环境污染和生态失衡等问题凸显，人们越来越将目光投向可再生的清洁新能源。木质纤维素，即是其中一种优良的资源。利用木质纤维素生产燃料乙醇成为一种极具潜力的清洁能源技术。木质纤维素在农业生产中储量丰富，但价值未得到深度发掘。据估计，全球纤维素生产量为6600-8800亿吨/年。我国作为农业大国，每年也产生大量的木质纤维素。可见，木质纤维素开发利用前景极其广阔。
木质纤维素的瓶颈之一就是廉价、高品质生物酶的缺乏。木质纤维素的主要成分包含纤维素、半纤维素和木质素，同时还可能含有少量的果胶、几丁质、硅酸盐等成分。其中，纤维素占比约为35-45％，为一类由葡萄糖分子通过β-1,4糖苷键连接形成的线状多聚葡萄糖。可以经由外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EC 3.2.1.4)和β-1,4-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，EC 3.2.1.21)的连续作用而降解成容易被应用发酵工业的单分子葡萄糖。挖掘在温和条件下将其水解的生物酶制剂，无论是对该资源的开发，还是对纤维素加工产业(纺织、造纸等)的技术改进，具有重要意义。纤维素酶可以按作用的最适pH条件划分为酸性纤维素酶和碱性纤维素酶。酸性纤维素酶指作用的最佳pH条件在酸性范围的一类纤维素水解酶，目前发现的主要由一些丝状真菌，如木霉、根霉等微生物产生，主要用于纤维素资源开发研究、饲料工业，以及纺织工业对棉料的表面处理。此类纤维素酶在商业化酶中占多数。
而碱性纤维素酶则指在碱性条件下能够催化裂解纤维素分子的一类水解酶。目前的研究表明，该类纤维素酶一般只有纤维素内切酶，即内切-β-1,4葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EC3.2.1.4，简称内切酶，EG或BGL)的活性，活力用羧甲基纤维素(CMC)为底物测定，为此也称之为羧甲基纤维素酶(CMCase)。由于碱性纤维素酶的作用pH在碱性范围内，与纺织物洗涤条件比较一致，能够在温和条件下作用于污渍附着的位点，却不会对衣物造成损害，所以，该酶类产品目前主要用于洗涤工业，为加酶洗涤产品的必需原料。至今为止，能够产生碱性纤维素酶的微生物多为细菌菌株，包括芽孢梭菌属、纤维单胞菌属、纤维弧菌属、混合纤维弧菌、芽孢杆菌属等的一些菌种，以及牛黄瘤胃梭菌、白色瘤胃球菌、溶纤维菌，热纤梭菌、解纤维梭菌、粪碱纤维单胞菌等菌种，国外该类酶的工业化生产主要以芽孢杆菌属的菌株(如Bacillus sp.KSM-635)为发酵菌种。国内的研究受制于缺乏碱性纤维素酶的高产菌株，鲜有大规模的发酵生产，挖掘新的微生物产纤维素酶菌株仍极为必要。
更为重要的是，生产中缺乏既有生产效益又具有环保附加效益的碱性纤维素酶生产菌株，可以在降解纤维素的同时，实现环境污染物的降解。为此，我们进行了一系列天然菌株的筛选工作。
发明内容
本发明的目的是从自然环境中分离筛选出一株新的产纤维素酶、具有一定环保效益的细菌菌株。
本发明提供的菌株是从堆肥中样品中分离得到一株具有纤维素酶生产能力的细菌7B。经鉴定，该菌株属于木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)，因而分类命名为Achromobacter xylosoxidans 7B。申请人于2013年8月8日将其保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典培养物保藏中心〔CCTCC〕，编号为：CCTCC NO：M2013365。
本发明除了要求保护上述的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B菌株外，还要求保护其在发酵生产羧甲基纤维素酶、制备降解纤维素的生物酶制剂以及降解水体污染物上的应用。
所述的发酵生产羧甲基纤维素酶包括酸性羧甲基纤维素酶和碱性羧甲基纤维素酶。
所述的发酵生产羧甲基纤维素酶产量最大的条件为：温度37℃，200rpm下摇瓶培养约60h。
所述的发酵生产酸性羧甲基纤维素酶的最适作用pH为4.0；所述的发酵生产碱性羧甲基纤维素酶的最适作用pH为8.6。
所述的碱性羧甲基纤维素酶的最适反应温度为60℃。
所述的水体污染物为乙苯、亚氨基二琥珀酸、硫丹以及工业COD。
本发明具有的突出的实质性特点和显著的进步是：
本申请人从自然界中成功分离筛选出了一种未报道的能产纤维素酶的新菌株，拓宽了纤维素酶生产菌株的选择范围，有利于推进木质纤维素降解利用中纤维素酶的进一步优化。本发明所提供的菌株为好氧的短杆状革兰氏阳性菌，在LB培养基上形成直径为0.5-1mm，光滑、湿润、有光泽、灰白色、边缘整齐的菌落。经实验证明，该菌株在有氧条件下，pH＝8，培养温度为30℃时生长最快。在最适产酶条件下最高酶活可达0.183U/mL，且主要呈现酸性纤维素酶活力。酸性CMC酶的最适作用pH为4.0，碱性CMC酶的最适作用pH为8.6。碱性CMC酶活力为酸性CMC酶活力的70％。所述的菌株对BTEX、IDS和硫丹的降解效率在70％以上。
附图说明
图1为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365最适生长pH的测定结果。其中，培养基采用LB培养基；培养条件：有氧条件下，30℃，200rpm摇瓶培养。
图2为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365最适生长温度的测定结果。注：培养基采用LB培养基；培养条件：pH为7.2，200rpm摇瓶培养。
图3为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365菌株生长曲线。注：培养基采用LB培养基；培养条件：pH8.0，30℃，200rpm摇瓶培养。
图4为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365产纤维素酶的时间曲线。其中，菌株用培养基含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na2CO3溶液调pH至8.0～9.0，在30℃，200rpm下摇瓶培养，接种量5％，定时测定发酵菌纤维素酶活力。CMC酶活力按QB2583-2003的方法测定，pH为8.0，以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基所需酶量为1个酶活单位。
图5为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365菌株所产纤维素酶的最适作用pH测定结果。pH 3-6用柠檬酸盐缓冲液，pH7-8用Tris-HCl缓冲液，pH 9-12使用Gly-NaOH缓冲液。缓冲液的浓度均为0.1mol/L。测定温度为42℃。以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基为1个酶活单位。
图6为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365菌株所产纤维素酶的最适作用温度测定结果。菌株用培养基含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl5g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na2CO3溶液调pH至8.0～9.0，在30℃，200rpm下摇瓶培养64小时，接种量5％，然后取发酵菌液按QB2583-2003的方法测定纤维素酶的CMC活力。以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基为1个酶活单位。
图7为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365菌株所产纤维素酶的耐热性测定结果。反应pH：8.0，保温时间为4h。
图8为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365菌株所产纤维素酶受常见金属离子影响测定结果。CK：对照，不加金属离子；金属离子浓度：0.5％；酶反应温度：50℃；反应pH：8.0。
图9为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO：M2013365对污染物的降解能力测定结果。EB：乙苯；IDS：亚氨基二琥珀酸；ED：硫丹。
具体实施方式
实施例1菌株筛选、分离与鉴定
第一步：采样
广西壮族自治区南宁市武鸣县郊堆肥样品。
第二步：初筛、复筛及纯化
取样品1g，加10ml无菌蒸馏水，充分振摇，静止30分钟，取上清液稀释105倍，涂布接种CMC-刚果红平板筛选培养基，30℃培养72h至菌落长出，挑取透明水解圈较大的菌落，接种CMC液体发酵培养基，37℃，200rpm摇瓶培养24h，测定培养液的碱性CMC酶活力。选取活力最高的培养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基培养，纯化菌株3次，最后得到1株产碱性纤维素酶的高产菌株，命名为Achromobacter xylosoxidans 7B，斜面和冷冻干燥保藏。
第三步：菌种鉴定
形态观察。LB培养基培养的菌体用革兰氏染色法进行显微观察，可见菌株7B为革兰氏阴性杆菌。在LB培养基上形成直径为0.5-1mm，光滑、湿润、有光泽、灰白色、边缘整齐的菌落。如图1和图2所示，菌株在有氧条件下，pH＝8，培养温度为30℃时生长最快。如图3所示，菌株在LB培养基中生长迅速，在约12h即结束对数期，60h OD600达到1.5，且在120h之内菌数不明显下降。
BIOLOG微生物鉴定系统的鉴定。用Biolog微生物鉴定系统进行。活化的菌株接种BUG培养基，接种量5％，33℃，200rpm培养24-48h，调整菌液浊度至5％，将菌液加入仪器的GENIII 96孔生化鉴定板，利用仪器的MicroStation读取鉴定板中各孔的颜色反应特征值，通过ML3 DC分析程序与数据库中细菌的生理生化数据进行匹配，根据7B菌株与数据库菌株之间匹配的概率、相似性和位距对7B菌株进行鉴定。最终将7B鉴定为菌株7B属Achromobacter xylosoxidans，其中，概率(Prob)为0.990，相似性(Sim)为0.842，距离(Dist)为2.129，结果可靠。
基于16s rDNA序列的分子鉴定。活化菌株接种LB培养基，接种量5％，37℃，200rpm培养8h至对数期，菌数2×108/mL以上。取培养液2mL，15000rpm×10min离心，弃上清液，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次，收集菌体细胞，使用天根细菌基因组DNA抽屉试剂盒提取DNA。以该基因组DNA为模板，采用通用引物27F/1492R，PCR扩增菌株的16S rDNA序列。50μL的反应体系含PCR缓冲液5μL，正、反向引物各1umol/L，Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.02mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U。反应条件为：95℃变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测、分离，然后用Agarose Gel DNAPurification Kit试剂盒切胶回收，用T4 ligase连接到pMD-18T载体上。将带有目的片段的载体通过转化E.coli DH5α菌株扩增培养后，选择阳性克隆提取质粒交上海生工测序。将测序得到的16s rDNA序列用NCBI的BLAST2.0进行同源分析(Nucleotide-NucleotideBlast)，搜索Genbank核酸数据库，根据比对结果对菌株进行分子鉴定。发现其与JQ923444.1一种木糖氧化无色杆菌有99％以上的相似度，因此将其鉴定为氧化木糖无色杆菌Achromobacter xylosoxidans。
综上，最终将该菌株鉴定为Achromobacter xylosoxidans。所得的16s rDNA序列如序列表1所示。
实施例2菌株产纤维素酶水平检测
根据图1和图2所示的生长的最适温度和pH，将菌株7B接种CMC发酵培养基培养，绘制产酶曲线，结果如图4所示。粗酶液制备方式为：活化菌株接种CMC发酵培养基，30℃，200rpm培养48h，取培养液，4℃下4000rpm离心10min，取上清液，加55％的(NH4)2SO4沉淀，4℃，10000rpm离心10min，收集沉淀，加入培养液同体积的pH 8.0，0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解。以CMC钠盐为底物，测定纤维素内切酶的活力，即CMC酶活力。酶反应体系含粗酶液0.5ml，CMC钠盐1％，0.1mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液2.0ml。50℃水浴反应60min，立刻用DNS法测定CMC水解所释放的葡萄糖量。以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基所需酶量为1个酶活单位。
结果显示该菌株的纤维素酶生产为同步发酵性。28h时产酶达到最高值为0.183U/mL，并在此后稳定的逐步降低。
将反应液的pH用缓冲液调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，测定不同pH下的CMC酶活力，用百分比表示测定结果。所用缓冲液分别为：pH 3-6用柠檬酸盐缓冲液，pH7.0-8.0用Tris-HCl缓冲液，pH 9-12使用Gly-NaOH缓冲液。缓冲液的浓度均为0.1mol/L。通过此操作测定酶液的最适作用pH。结果如图5所示，该菌株所产的纤维素酶既有酸性CMC酶的活力，又有碱性CMC酶的活力。酸性CMC酶的最适作用pH为4.0，碱性CMC酶的最适作用pH为8.6。碱性CMC酶活力为酸性CMC酶活力的70％。
依据以上方法分别测定酶液的最适作用温度、耐热能力和金属离子对酶液的作用。发现菌株所产碱性CMC酶活力的最适作用温度为60℃，温度低于55℃或高于65℃时酶活力均迅速下降，如图6所示，可见该酶液的作用温度范围非常窄。通过将酶液在50℃下保温测定酶液的耐热能力，结果如图7所示，可见酶活呈线性下降，保温1h酶活力下降超过35％，保温3h残留酶活只有22％，而保温4h酶活残留低于15％，表明该菌株所产的碱性纤维素内切酶的热稳定性较差。在测定酶活力时加入0.5％的各种金属离子，观察金属离子对菌株1A所产碱性CMC酶活力的影响，结果如图8所示，可见，Co2+、Mn2+、Ca2+3种离子对酶活有促进，Co2+和Mn2+分别使酶活力提高6.7％和7.1％。K+、Mg2+和Ni+3种离子对酶活力稍有抑制，K+和Ni+加入酶反应体系后分别使酶活力降低了4.7％、4.4％。Fe2+和Na+对酶的活力几乎没有影响。而Cu2+对菌株所产碱性CMC酶具有明显的抑制作用，使酶活力显著降低了46％。
实施例3对BTEX和难降解螯合剂的处理
本实施例在实验室水平进行。采用2％CMC纤维素的10倍稀释LB培养基模拟富含有机质的污水水体。分别以：添加0.02％的乙苯模拟BTEX污染的工业废水；添加0.1％IDS(亚氨基二琥珀酸)模拟难降解螯合剂污染水体；添加0.1％的硫丹模拟难降解农药污染水体。实验采用100mL培养液，接种量1％，30℃，转速180rmp摇瓶培养48小时。每4小时采样检测残留COD与污染物。其中，乙苯残留量的测定采用正己烷萃取+气象色谱分析法，其中色谱柱为HP-Innoax毛细管柱，柱温90℃，柱流量1mL/min，载气为N2；COD测定采用重铬酸钾氧化法；IDS残留测定采用350nm分光光度法。硫丹残留采用硫丹酶联免疫检测试剂盒(天津生物新品技术公司)测定。
通过图9可以看出，经过48h的培养，COD(Cr)降至约500mg/L的水平，清除率为85％；乙苯清除率82％；IDS清除率为78.8％；硫丹的清除率为73.3％。由于以上污染物均为自然污染(土壤和水体)中较难清除的，而本菌株可以在48h的培养时间里清除70％以上的污染物，具有较好的环境友好性。
Claims (6)
1.一种木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B，其保藏编号为CCTCCNO：M2013365。
2.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B在发酵生产羧甲基纤维素酶、制备降解纤维素的生物酶制剂以及降解水体污染物上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的水体污染物为乙苯、亚氨基二琥珀酸、硫丹。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵生产羧甲基纤维素酶包括酸性羧甲基纤维素酶和碱性羧甲基纤维素酶。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酸性羧甲基纤维素酶的作用pH为4.0；所述的碱性羧甲基纤维素酶的作用pH为8.6。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碱性羧甲基纤维素酶的反应温度为60℃。
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