CN103266068B - 一种氨氧化微生物的分离筛选方法 - Google Patents

一种氨氧化微生物的分离筛选方法 Download PDF

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本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种氨氧化微生物的分离筛选方法。将分离源在以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中富集培养；而后再经过显色平板和液体培养筛选得到具有氨氧化能力的菌株，收集的目标菌株用于污水处理，使其在有氧条件下氧化污水中的氨进行氨氧化反应；本发明选择具有代表性的曝气池活性污泥样品为分离源，采用创新的变色培养基，过程直观，方法简便。

Description

一种氨氧化微生物的分离筛选方法
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种氨氧化微生物的分离筛选方法。
背景技术
由于氮素对水生生物圈富营养化的严重影响，以及对水生生物具有毒性，废水氨氧化引起人们越来越多的关注，生物氨氧化技术是废水脱氮最为经济有效的方法，可以实现真正意义上的氮去除。传统生物氨氧化工艺是多数废水生物氨氧化处理的主要承担者，但仍存在着硝化速率低、工艺复杂、氨氧化效率低等缺点，投加氨氧化微生物有助于提高生物氨氧化反应速率，提高处理效率。因此，分离筛选具有良好活性的氨氧化微生物极为重要。
目前关于氨氧化菌的文献报道多集中在富集培养方面，关于硝化菌的分离筛选方面相关文献报道并不多，专利CN200910223298A申请公开一种自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法，但是在富集过程中并不直观，需要随时取出菌液进行分析NO3-生成情况，容易造成菌株流失。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便易行、快速有效的氨氧化微生物的分离筛选方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种氨氧化微生物的分离筛选方法，将分离源在以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中富集培养；而后再经过显色平板和液体培养筛选得到具有氨氧化能力的菌株，收集的目标菌株用于污水处理，使其在有氧条件下氧化污水中的氨进行氨氧化反应；
所述以氨氮为单一氮源的液体变色培养基配制过程如下：
将(NH4)2SO42～3g、KH2PO41～2g、Na2HPO4·12H2O10～12g、FeSO4·7H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.03g、溴百里酚兰40～80mg和酵母浸粉0.01～0.05g加入到1L无菌水中，pH为7.5～9.0；120～125度蒸汽灭菌15～20分钟后，放置冷却备用。
所述显色平板配制过程如下：将(NH4)2SO42g、FeSO4·7H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.03g、酵母浸粉0.05g、琼脂15～20g、溴百里酚兰40～80mg加入到1L蒸馏水中，pH为7.5～9.0，120～125度蒸汽灭菌15～20分钟后，放置冷却到50～80℃后，倒制平板冷却后备用。
具体筛选过程为：
1）取分离源加入到其5～10倍体积的无菌水中，使微生物混合均匀；取混合液1～10ml加入到100ml以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，以25～35℃，150～250转/分富集培养至培养液由蓝色变为橙红色，取1～10ml菌液再加入至新的氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，继续富集培养至培养液由蓝色变为橙红色；再取20～30ml菌液重复富集培养3～5次，待用；
2）将上述富集培养至橙红色的菌液用无菌水稀释至10-6～10-9各梯度；
3）分别取上述稀释的各个梯度浓度的菌液50～200ul于显色平板，于25～35℃培养箱中倒置培养，待出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在显色平板上划线纯化培养；
4）将划线纯化培养得到的深红色的菌落接种至AOM固体培养基（AOM平板），培养3～5天后挑取单菌落接种到AOM液体培养基中，在25～35℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，检测菌液在600nm波长检测光下吸光值，OD600值大于等于1，氨氮去除率（残留氨氮浓度/氨氮初始浓度）大于等于50%的菌株即为高活力氨氧化菌株。
取上述氨氮去除率大于50%的且OD600值最高的菌液，在AOM固体培养基上划线，平板在25～30℃培养3～5天后，挑取单菌落接种到液体培养基中，在25～30℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，取菌液200ul加入1.8ml的20%甘油水溶液中，-70℃冰箱保存。
所述分离源为城市污水处理厂曝气池污泥或含氨废水工厂曝气池污泥。
所述步骤2）取上述富集培养至橙红色的菌液1ml加入至9ml无菌水涡旋混匀稀释，取混匀后的菌液200ul备用；再取上述混匀后的菌液1ml，再加入9ml无菌水涡旋混匀稀释，取混匀后的菌液200ul备用；重复稀释6～9次使菌液最终浓度稀释到步骤1）富集培养液浓度的10-6-10-9。
所述步骤3）于25～35℃培养箱中倒置培养的平板上菌株出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在显色平板上划线；划线后的平板再于25～35℃培养箱中倒置培养5～7天，挑取深红色的单菌落继续在显色平板上划线培养，重复这一过程3～5次。
所述液体培养基为(NH4)2SO42～3g,K2HPO41～2g,Na2HPO4·12H2O10～12g溴百里酚蓝40～80mg，蒸馏水1000ml。该培养中富集或培养氨氧化菌株，培养基由蓝变红，且培养基红色深度与菌株氨氧化能力呈正比。
所述AOM液体培养基为：(NH4)2SO42～3g、NaCl0.3～0.5g、FeSO4·7H2O0.03～0.05g、K2HPO42～3g、MgSO4·7H2O0.03～0.05g、蒸馏水1000ml、pH8～9；
所述AOM固体培养基配制过程如下：(NH4)2SO42～3g、NaCl0.3～0.5g、FeSO4·7H2O0.03～0.05g、K2HPO42～3g、MgSO4·7H2O0.03～0.05g、2％琼脂、蒸馏水1000ml、pH8～9。
本发明所具有的优点：本发明选择具有代表性的曝气池活性污泥样品为分离源，采用创新的变色培养基，过程直观，方法简便，通过液体培养基富集培养，显色平板筛选，菌株的分离纯化，菌体在液体培养条件下脱氨情况检测四个步骤最终得到氨氧化微生物。具体在富集阶段采用变色培养基，培养基选用pH值在8左右的磷酸盐缓冲体系搭配酸碱指示剂溴百里酚兰，由于磷酸缓冲液和溴百里酚兰的解离常数和培养基pH值相近，该培养基颜色变化和pH变化呈线性，可以通过观察培养基颜色变化考察培养体系中pH的变化，而pH的变化是由培养体系中氨氧化转化为硝酸氮的效率决定的，pH变化大的体系氨氧化效率高，该方法简便直观。
具体实施方式
本发明首先选取污水中氨氮浓度在100～200mg/L的城市污水处理厂或工业废水处理的曝气池污泥样品为分离源，使用以氨氮为单一氮源的液体培养基富集培养分离源中的氨氧化微生物，通过观察培养基颜色变化，确定二次富集培养时间，经过3～5次富集培养获得大量数目的微生物；以显色平板对富集后的微生物进行分离筛选，通过菌株的颜色变化挑出菌落饱满颜色变化明显的的目的菌株；最后对初筛得到的目的菌株进行液体培养，以比色法检测菌液OD600值来比较菌株生长能力，最终得到生长性状良好氨氧化能力较强的氨氧化目标菌株。目标菌株可以在有氧条件下氧化污水中的氨进行氨氧化反应。
实施例1
1．取沈阳某污水处理厂曝气池污泥样品作为分离源，将样品块放入灭菌后的三角瓶中，再加入样品5～10倍体积的无菌水，使样品中微生物充分混合均匀；取混合液1～10ml加入100ml氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，在三角烧瓶中25～35℃，150～250转/分摇瓶培养；
2．观察培养液颜色由蓝色变为橙红色时，取10ml菌液加入新的氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，继续摇瓶培养；重复此步骤3次。
所述以氨氮为单一氮源的液体变色培养基为：(NH4)2SO43g、FeSO4·7H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.03g、KH2PO42.5g、Na2HPO4·12H2O10g、溴百里酚兰40mg和酵母浸粉0.01g，再用水定容至1L；pH为7.5，121度蒸汽灭菌15分钟后，放置冷却备用。
其中以氨氮为单一氮源的固体变色培养基，是在液体培养基的基础上加入2％琼脂。
3.待上述菌液培养5天后再次变为橙红色时取1ml，加入装有9ml无菌水的试管中涡旋混匀，取混匀后的菌液200ul备用；再取上述混匀后的菌液1ml，加入装有9ml无菌水的试管中涡旋混匀，取混匀后的菌液200ul备用；取混匀后的菌液如上依次梯度稀释，使最终菌液的浓度稀释到原培养后浓度的10-6～10-9；
4.取上述10-6、10-7、10-8、10-9依次梯度稀释对应的备用200ul的稀释液涂于显色固体平板(12cm)每个梯度涂5个平板。28℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长与情况，5天后平板上出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在显色平板上划线，28℃培养箱中倒置培养5天，挑取生长较好的红色较深的单菌落继续在显色平板上划线培养，重复这一过程4次，即得显色平板上划线纯化菌落。
5.挑选上述生长较好红色较深的菌落16株分别接种至AOM固体培养基，培养5天后挑取单菌落接种至AOM液体培养基中在试管内以28℃，200转/分，培养24小时，观察培养液出现明显浑浊后取200uL，加入装有1800uL20%甘油的冻存管中颠倒混匀后-70℃放置保存备用。
6.将上述培养于AOM固体培养基的每个菌株各取1环菌体接种AOM液体培养基。28℃200转/分摇瓶培养。5天后分光光度计检测菌液的OD600值，检测菌液中残留氨氮量计算降解率。OD600值大于等于1，氨氮降解率（培养基中残留氨氮浓度/培养基中氨氮初始浓度）大于等于50%的菌株有8株，菌株降解与生长数据如下：
菌株编号 1 2 3 4 5 6 7 8
菌液OD600 1.01 1.23 1.21 2.103 2.834 2.661 1.512 1.56
降解率（%） 52 62 65 85 100 100 72 75
所述AOM液体培养基为：(NH4)2SO42～3g、NaCl0.3～0.5g、FeSO4·7H2O0.03～0.05g、K2HPO42～3g、MgSO4·7H2O0.03～0.05g、蒸馏水1000ml、pH8～9；
所述AOM固体培养基配制过程如下：(NH4)2SO42～3g、NaCl0.3～0.5g、FeSO4·7H2O0.03～0.05g、K2HPO42～3g、MgSO4·7H2O0.03～0.05g、2％琼脂、蒸馏水1000ml、pH8～9。
7）上述筛选后菌株将氨氮去除率大于50%的且OD600值最高的菌液，在AOM固体培养基上划线，平板在25～30℃培养3～5天后，挑取单菌落接种到液体培养基中，在25～30℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，取菌液200ul加入1.8ml的20%甘油水溶液中，-70℃冰箱保存。
所述液体培养基中(NH4)2SO42～3g,K2HPO41～2g,Na2HPO4·12H2O10～12g溴百里酚蓝40～80mg，蒸馏水1000ml。
该培养中富集或培养氨氧化菌株，培养基由蓝变红，且培养基红色深度与菌株氨氧化能力呈正比。
实施例2
与实施例1不同之处在于，其所选用的样品为南方某颜料厂曝气池污泥。并按照具体分离筛选方式通过步骤1～5获得菌株16株，将所得16株菌株培养后用分光光度计检测菌液的OD600值，HPLC检测菌液中残留氨氮量计算降解率。OD600值大于等于1，氨氮降解率（培养基中残留氨氮浓度/培养基中氨氮初始浓度）大于等于50%的菌株有5株，菌株降解与生长数据如下：
菌株编号 1 2 3 4 5
菌液OD600 1.012 1.311 1.342 2.582 1.763
降解率（%） 53 62 65 100 76
实施例3
与实施例1、2不同之处在于，其所选用的样品为河北某氮肥厂曝气池污泥。并按照具体分离筛选方式通过步骤1～5获得菌株12株，将所得12株菌株培养后用分光光度计检测菌液的OD600值，HPLC检测菌液中残留氨氮量计算降解率。OD600值大于等于1，氨氮降解率（培养基中残留氨氮浓度/培养基中氨氮初始浓度）大于等于50%的菌株有3株，菌株降解与生长数据如下：
菌株编号 1 2 3
菌液OD600 1.112 1.211 1.842
降解率（%） 54 63 75

Claims (3)

1.一种氨氧化微生物的分离筛选方法，其特征在于：将分离源在以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中富集培养；而后再经过显色平板和液体培养筛选得到具有氨氧化能力的菌株，收集的目标菌株用于污水处理，使其在有氧条件下氧化污水中的氨进行氨氧化反应； 
所述以氨氮为单一氮源的液体变色培养基配制成分如下： 
将(NH4)2SO4 2～3g、KH2PO4 1～2g、Na2HPO4·12H2O 10～12g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.03g、溴百里酚兰40～80mg和酵母浸粉0.01～0.05g加入到1L无菌水中，pH为7.5～9.0； 
所述显色平板配制成分如下，将(NH4)2SO4 2g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.03g、酵母浸粉0.05g、琼脂15～20g、溴百里酚兰40～80mg加入到1L蒸馏水中，pH为7.5～9.0； 
所述分离源为城市污水处理厂曝气池污泥或含氨废水工厂曝气池污泥； 
具体筛选过程为： 
1)取分离源加入到其5～10倍体积的无菌水中，使微生物混合均匀；取混合液1～10ml加入到100ml以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，以25～35℃，150～250转/分富集培养至培养液由蓝色变为橙红色，取1～10ml菌液再加入至新的氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，继续富集培养至培养液由蓝色变为橙红色；再取20～30ml菌液重复富集培养3～5次，待用； 
2)将上述富集培养至橙红色的菌液用无菌水稀释至10-6～10-9各梯度； 
3)分别取上述稀释的各个梯度浓度的菌液50～200μl于显色平板，于25～35℃培养箱中倒置培养，待出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在显色平板上划线纯化培养； 
4)将划线纯化培养得到的深红色的菌落接种至AOM固体培养基，培养3～5天后挑取单菌落接种到AOM液体培养基中，在25～35℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，检测菌液在600nm波长检测光下吸光值，OD600值大于等于1，氨氮去除率大于等于50％的菌株即为高活力氨氧化菌株； 
所述AOM液体培养基为(NH4)2SO4 2～3g、NaCl 0.3～0.5g、FeSO4·7H2O 0.03～0.05g、K2HPO4 2～3g、MgSO4·7H2O 0.03～0.05g、蒸馏水1000ml、pH8～9； 
所述AOM固体培养基为：(NH4)2SO4 2～3g、NaCl 0.3～0.5g、FeSO4·7H2O 0.03～0.05g、K2HPO4 2～3g、MgSO4·7H2O 0.03～0.05g、2％琼脂、蒸馏水1000ml、pH8～9。 
2.按权利要求1所述的氨氧化微生物的分离筛选方法，其特征在于：取所述氨氮去除率大于50％的且OD600值最高的菌液，在AOM固体培养基上划线，平板在25～30℃培养3～5天后，挑取单菌落接种到液体培养基中，在25～30℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，取菌液200μl加入1.8ml的20％甘油水溶液中，-70℃冰箱保存； 
所述液体培养基为(NH4)2SO4 2～3g,K2HPO4 1～2g,Na2HPO4·12H2O 10～12g，溴百里酚蓝40～80mg，蒸馏水1000ml。 
3.按权利要求1所述的氨氧化微生物的分离筛选方法，其特征在于：所述步骤3)于25～35℃培养箱中倒置培养的平板上菌株出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在显色平板上划线；划线后的平板再于25～35℃培养箱中倒置培养5～7天，挑取深红色的单菌落继续在显色平板上划线培养，重复这一过程3～5次。 
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