CN108504720A - 沙门氏菌快速测试片检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物检验和食品生产环境卫生检测技术领域,尤其涉及沙门氏菌快速测试片检测方法以及其在食品生产领域中的应用。本发明检测方法包括前增菌、水化测试片、接种、结果观测、结果确认等步骤。与现有沙门氏菌检测方法相比,本发明方法具有操作简便(恒温培养、一步增菌)、结果准确、漏检率低、响应快速、检测用时短(用时2天)、适用面广等特点。本发明方法不仅适用于固体或液体类食品产品检测,同时还可用于对食品生产企业的生产环境和生产机器设备进行随机大批量检测和实时监控。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检验和食品生产环境卫生检测技术领域,尤其涉及沙门氏菌快速测试片检测方法以及其在食品生产领域中的应用。
背景技术
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,其病原体属肠杆菌科,系革兰氏阴性无荚膜、无芽孢的肠道杆菌。沙门氏菌最适繁殖温度为37℃,在20℃以上即能大量繁殖,在冰箱中可生存3-4个月。食用被沙门氏菌污染的食品,可使人发生食物中毒,产生恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒、腹泻、乏力、肌肉酸痛、视觉模糊、发热、躁动不安和嗜睡等症状,并引发胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病,平均致死率达到4.1%。据统计,在世界范围内各类细菌性食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首,美国每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染,我国内陆地区沙门氏菌感染也在各类细菌性食物中毒中居于首位。
基于上述原因,如何对沙门氏菌进行快速准确的检测对食品生产企业而言至关重要,因为其与食品安全息息相关。另外,沙门氏菌检测不仅仅针对食品产品本身,还应该包括对生产环境和生产设备的检测和监控;其检测对象也不限于成品,还应包括原料和各中间产品。因此,较为理想的检测方法应该具备操作简便、响应快速、检测用时短、结果准确、漏检率低、适用面广等特点。
然而,现有国家标准GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》主要针对固体或液体样品的检验,不适用于对车间等生产环境以及生产机器设备进行随机大批量的检测。另外,现有国标检验方法检测用时至少需要4-5天,检测周期过长,出结果慢,尚不能满足在食品生产过程中对沙门氏菌进行快速检测、实时监控的检验需求。
发明内容
为了克服现有沙门氏菌检测方法存在的上述缺陷,本发明在反复试验的基础上,建立了一种新的沙门氏菌快速测试片检测方法,并对各项培养及检测条件进行了筛选和优化,本发明方法不仅适用于固体或液体类食品产品检测,同时还可用于食品生产企业的生产环境和生产设备检测。
本发明沙门氏菌快速测试片检测方法,包括下述步骤:
(1)前增菌:称取37.0g沙门氏菌增菌肉汤基础培养基,将其加入到1L蒸馏水中,加热至80-90℃,充分搅拌直至其完全溶解后按照225ml/瓶的规格进行小瓶分装,将上述装有培养液的小瓶在121℃、98kPa热压灭菌15min,灭菌完毕后冷却至室温,然后向每瓶培养液中加入4.0-5.5ml杂菌生长抑制剂溶液,搅拌均匀即得到混合培养液,其中所述杂菌生长抑制剂溶液是将1.0g杂菌生长抑制剂溶解于400ml蒸馏水中制得的;
将检测样本置于无菌采样袋中,向其中加入225ml上述混合培养液,均质2-3min,40.5-42.5℃培养18-24h,即得到增菌液;
(2)水化测试片:将冻存的沙门氏菌测试片在室温下放置5min,然后掀起测试片上层膜,将2ml无菌水垂直滴在测试片底层薄膜的中央位置,将上层膜缓慢盖下,避免有气泡产生,室温避光静置1-2h,直至凝胶成型;然后在室温下水化测试片5-10min,并观察水化后测试片的颜色变化,当测试片颜色变为红色时,测试片水化完成;
(3)接种:掀起上述水化完成后的测试片的上层膜,使用已灭菌的10μl光滑接种环蘸取一满环上述增菌液,在测试片凝胶表面从上至下划线,获得分离菌落后将上层膜缓慢盖下,轻轻涂抹所述上层膜的上表面,排出接种区域的空气,然后将接种完成的测试片在40.5-42.5℃条件下培养22-26h;
(4)结果观测:培养完成后观察测试片上菌落的颜色及外围特征,并根据下述标准初步判定检测结果:
a.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阳性;
b.菌落呈红色、暗红色或褐色,但不带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阴性;
c.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有紫红色晕圈,判定为沙门氏菌阴性;
d.菌落呈蓝色、绿色、蓝绿色或黑色,判定为沙门氏菌阴性;
检测结果初步判定完成后,在判定为沙门氏菌阳性的测试片的上层膜上标记出推测阳性的菌落,至少标记出五个单独的假定阳性沙门氏菌菌落;
(5)结果确认:向上述假定阳性沙门氏菌菌落加入沙门氏菌确认反应片,在40.5-42.5℃条件下培养4-5h,观察菌落颜色变化,当菌落颜色由绿色变为蓝色、深蓝色或黑色,或者菌落周围产生蓝色沉淀环绕,判定为生化确认的沙门氏菌。
优选地,本发明检测方法中所述杂菌生长抑制剂为万古霉素、放线菌酮或重铬酸钾。
优选地,本发明沙门氏菌快速测试片检测方法,其第(1)步骤中将检测样本置于无菌采样袋中,向其中加入225ml所述混合培养液,均质3min,41.5℃培养24h。
优选地,本发明沙门氏菌快速测试片检测方法,其第(3)步骤中将接种完成的测试片在41.5℃条件下培养24h。
优选地,本发明检测方法中所述检测样本为固态食品、半固态食品、液态食品或海绵擦拭子。
进一步地,上述海绵擦拭子为无细菌吸附作用的海绵擦拭子。
作为一种优选,本发明沙门氏菌快速测试片检测方法,包括下述步骤:
(1)前增菌:称取37.0g沙门氏菌增菌肉汤基础培养基,将其加入到1L蒸馏水中,加热至85℃,充分搅拌直至其完全溶解后按照225ml/瓶的规格进行小瓶分装,将上述装有培养液的小瓶在121℃、98kPa热压灭菌15min,灭菌完毕后冷却至室温,然后向每瓶培养液中加入4.5ml放线菌酮溶液,搅拌均匀即得到混合培养液,其中所述放线菌酮溶液是将1.0g放线菌酮溶解于400ml蒸馏水中制得的;
将检测样本置于无菌采样袋中,向其中加入225ml上述混合培养液,均质3min,41.5℃培养24h,即得到增菌液;
(2)水化测试片:将冻存的沙门氏菌测试片在室温下放置5min,然后掀起测试片上层膜,将2ml无菌水垂直滴在测试片底层薄膜的中央位置,将上层膜缓慢盖下,避免有气泡产生,室温避光静置2h,直至凝胶成型;然后在室温下水化测试片5-10min,并观察水化后测试片的颜色变化,当测试片颜色变为红色时,测试片水化完成;
(3)接种:掀起上述水化完成后的测试片的上层膜,使用已灭菌的10μl光滑接种环蘸取一满环上述增菌液,在测试片凝胶表面从上至下划线,获得分离菌落后将上层膜缓慢盖下,轻轻涂抹所述上层膜的上表面,排出接种区域的空气,然后将接种完成的测试片在41.5℃条件下培养24h;
(4)结果观测:培养完成后观察测试片上菌落的颜色及外围特征,并根据下述标准初步判定检测结果:
a.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阳性;
b.菌落呈红色、暗红色或褐色,但不带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阴性;
c.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有紫红色晕圈,判定为沙门氏菌阴性;
d.菌落呈蓝色、绿色、蓝绿色或黑色,判定为沙门氏菌阴性;
检测结果初步判定完成后,在判定为沙门氏菌阳性的测试片的上层膜上标记出推测阳性的菌落,至少标记出五个单独的假定阳性沙门氏菌菌落;
(5)结果确认:向上述假定阳性沙门氏菌菌落加入沙门氏菌确认反应片,在41.5℃条件下培养5h,观察菌落颜色变化,当菌落颜色由绿色变为蓝色、深蓝色或黑色,或者菌落周围产生蓝色沉淀环绕,判定为生化确认的沙门氏菌。
此外,本发明还涉及上述沙门氏菌快速测试片检测方法在制备沙门氏菌检测试剂盒中的应用。
综上,本发明提供了一种沙门氏菌快速测试片检测方法,与现有沙门氏菌检测方法相比,本发明方法具有操作简便(恒温培养、一步增菌)、结果准确、漏检率低、响应快速、检测用时短(用时2天)、适用面广等特点。本发明方法不仅适用于固体或液体类食品产品检测,同时还可用于对食品生产企业的生产环境和生产机器设备进行随机大批量检测和实时监控。本发明方法的推广应用有助于食品生产企业快速排查和确认沙门氏菌污染,进行生产环境清洁度监控,并对确认沙门氏菌污染的环境取样点及时控制和整改,使食品安全得到有效保障。
附图说明
图1为利用本发明方法检测沙门氏菌所获得的测试片图片,图中显示沙门氏菌的检测结果为阳性。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例:车间环境沙门氏菌快速检测
(1)取样:2018年1月,本公司检测中心对生产车间环境的146个监控点进行现场取样,采用3M公司提供的有柄海绵擦拭子(自身无细菌吸附作用)对车间环境监控点进行涂擦,涂擦方法:涂擦面积30cm×30cm,上下左右涂擦,需要完全覆盖,不可以有任何遗漏。
(2)前增菌:因该环境样品属于低菌量样品,所以检测时只需一步增菌。
称取37.0g沙门氏菌增菌肉汤基础(SEB)培养基,将其加入到1L蒸馏水中,加热至85℃,充分搅拌直至其完全溶解后按照225ml/瓶的规格进行小瓶分装,将上述装有培养液的小瓶在121℃、98kPa热压灭菌15min,灭菌完毕后冷却至室温,然后向每瓶培养液中加入4.5ml放线菌酮溶液,搅拌均匀即得到混合培养液,其中放线菌酮溶液是将1.0g放线菌酮溶解于400ml蒸馏水中制得的,其作用是抑制杂菌生长;
将在环境取样点获得的检测样本海绵擦拭子标识记录编号,然后置于无菌采样袋中,向其中加入225ml上述混合培养液,均质3min,41.5℃培养24h,得到增菌液。
(3)水化测试片:将冻存的沙门氏菌测试片在室温下放置5min,然后掀起测试片上层膜,将2ml无菌水垂直滴在测试片底层薄膜的中央位置,将上层膜缓慢盖下,避免有气泡产生,室温避光静置2h,直至凝胶成型;然后在室温下水化测试片5-10min,并观察水化后测试片的颜色变化,当测试片颜色变为红色时,测试片水化完成;若测试片颜色变为橙色,则说明该测试片无法使用。
(4)接种:掀起上述水化完成后的测试片的上层膜,使用已灭菌的10μl光滑接种环(无锯齿边或扭曲)蘸取一满环上述增菌液,在测试片凝胶表面从上至下划线,划线时需缓慢操作,避免凝胶表面断裂,获得分离菌落后将上层膜缓慢盖下,轻轻涂抹所述上层膜的上表面,排出接种区域的空气,然后将接种完成的测试片在41.5℃条件下培养24h。着色面朝上水平放置,叠放片数不超过20片。
(5)结果观测:培养完成后观察测试片上菌落的颜色及外围特征,并根据下述标准初步判定检测结果:
a.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阳性;
b.菌落呈红色、暗红色或褐色,但不带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阴性;
c.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有紫红色晕圈,判定为沙门氏菌阴性;
d.菌落呈蓝色、绿色、蓝绿色或黑色,判定为沙门氏菌阴性;
检测结果初步判定完成后,在判定为沙门氏菌阳性的测试片的上层膜上标记出推测阳性的菌落,至少标记出五个单独的假定阳性沙门氏菌菌落。
(6)结果确认:向上述假定阳性沙门氏菌菌落加入沙门氏菌确认反应片,在41.5℃条件下培养5h,仅观察被标记的菌落颜色变化,当菌落颜色由绿色变为蓝色、深蓝色或黑色,或者菌落周围产生蓝色沉淀环绕,则判定为生化确认的沙门氏菌(参见附图1)。
本检测方法检测用时短,阴性样品的检测用时为48h,对阳性样品的检测及确认用时也不超过52h。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式和实施例,在本领域技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
Claims (8)
1.一种沙门氏菌快速测试片检测方法,其特征在于包括下述步骤:
(1)前增菌:称取37.0g沙门氏菌增菌肉汤基础培养基,将其加入到1L蒸馏水中,加热至80-90℃,充分搅拌直至其完全溶解后按照225ml/瓶的规格进行小瓶分装,将上述装有培养液的小瓶在121℃、98kPa热压灭菌15min,灭菌完毕后冷却至室温,然后向每瓶培养液中加入4.0-5.5ml杂菌生长抑制剂溶液,搅拌均匀即得到混合培养液,其中所述杂菌生长抑制剂溶液是将1.0g杂菌生长抑制剂溶解于400ml蒸馏水中制得的;
将检测样本置于无菌采样袋中,向其中加入225ml上述混合培养液,均质2-3min,40.5-42.5℃培养18-24h,即得到增菌液;
(2)水化测试片:将冻存的沙门氏菌测试片在室温下放置5min,然后掀起测试片上层膜,将2ml无菌水垂直滴在测试片底层薄膜的中央位置,将上层膜缓慢盖下,避免有气泡产生,室温避光静置1-2h,直至凝胶成型;然后在室温下水化测试片5-10min,并观察水化后测试片的颜色变化,当测试片颜色变为红色时,测试片水化完成;
(3)接种:掀起上述水化完成后的测试片的上层膜,使用已灭菌的10μl光滑接种环蘸取一满环上述增菌液,在测试片凝胶表面从上至下划线,获得分离菌落后将上层膜缓慢盖下,轻轻涂抹所述上层膜的上表面,排出接种区域的空气,然后将接种完成的测试片在40.5-42.5℃条件下培养22-26h;
(4)结果观测:培养完成后观察测试片上菌落的颜色及外围特征,并根据下述标准初步判定检测结果:
a.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阳性;
b.菌落呈红色、暗红色或褐色,但不带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阴性;
c.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有紫红色晕圈,判定为沙门氏菌阴性;
d.菌落呈蓝色、绿色、蓝绿色或黑色,判定为沙门氏菌阴性;
检测结果初步判定完成后,在判定为沙门氏菌阳性的测试片的上层膜上标记出推测阳性的菌落,至少标记出五个单独的假定阳性沙门氏菌菌落;
(5)结果确认:向上述假定阳性沙门氏菌菌落加入沙门氏菌确认反应片,在40.5-42.5℃条件下培养4-5h,观察菌落颜色变化,当菌落颜色由绿色变为蓝色、深蓝色或黑色,或者菌落周围产生蓝色沉淀环绕,判定为生化确认的沙门氏菌。
2.如权利要求1所述的沙门氏菌快速测试片检测方法,其中所述杂菌生长抑制剂为万古霉素、放线菌酮或重铬酸钾。
3.如权利要求1所述的沙门氏菌快速测试片检测方法,其特征在于第(1)步骤中将检测样本置于无菌采样袋中,向其中加入225ml所述混合培养液,均质3min,41.5℃培养24h。
4.如权利要求1所述的沙门氏菌快速测试片检测方法,其特征在于第(3)步骤中将接种完成的测试片在41.5℃条件下培养24h。
5.如权利要求1所述的沙门氏菌快速测试片检测方法,其特征在于所述检测样本为固态食品、半固态食品、液态食品或海绵擦拭子。
6.如权利要求5所述的沙门氏菌快速测试片检测方法,其中所述海绵擦拭子为无细菌吸附作用的海绵擦拭子。
7.如权利要求1所述的沙门氏菌快速测试片检测方法,包括下述步骤:
(1)前增菌:称取37.0g沙门氏菌增菌肉汤基础培养基,将其加入到1L蒸馏水中,加热至85℃,充分搅拌直至其完全溶解后按照225ml/瓶的规格进行小瓶分装,将上述装有培养液的小瓶在121℃、98kPa热压灭菌15min,灭菌完毕后冷却至室温,然后向每瓶培养液中加入4.5ml放线菌酮溶液,搅拌均匀即得到混合培养液,其中所述放线菌酮溶液是将1.0g放线菌酮溶解于400ml蒸馏水中制得的;
将检测样本置于无菌采样袋中,向其中加入225ml上述混合培养液,均质3min,41.5℃培养24h,即得到增菌液;
(2)水化测试片:将冻存的沙门氏菌测试片在室温下放置5min,然后掀起测试片上层膜,将2ml无菌水垂直滴在测试片底层薄膜的中央位置,将上层膜缓慢盖下,避免有气泡产生,室温避光静置2h,直至凝胶成型;然后在室温下水化测试片5-10min,并观察水化后测试片的颜色变化,当测试片颜色变为红色时,测试片水化完成;
(3)接种:掀起上述水化完成后的测试片的上层膜,使用已灭菌的10μl光滑接种环蘸取一满环上述增菌液,在测试片凝胶表面从上至下划线,获得分离菌落后将上层膜缓慢盖下,轻轻涂抹所述上层膜的上表面,排出接种区域的空气,然后将接种完成的测试片在41.5℃条件下培养24h;
(4)结果观测:培养完成后观察测试片上菌落的颜色及外围特征,并根据下述标准初步判定检测结果:
a.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阳性;
b.菌落呈红色、暗红色或褐色,但不带有黄色晕圈或气泡,判定为沙门氏菌阴性;
c.菌落呈红色、暗红色或褐色,并带有紫红色晕圈,判定为沙门氏菌阴性;
d.菌落呈蓝色、绿色、蓝绿色或黑色,判定为沙门氏菌阴性;
检测结果初步判定完成后,在判定为沙门氏菌阳性的测试片的上层膜上标记出推测阳性的菌落,至少标记出五个单独的假定阳性沙门氏菌菌落;
(5)结果确认:向上述假定阳性沙门氏菌菌落加入沙门氏菌确认反应片,在41.5℃条件下培养5h,观察菌落颜色变化,当菌落颜色由绿色变为蓝色、深蓝色或黑色,或者菌落周围产生蓝色沉淀环绕,判定为生化确认的沙门氏菌。
8.如权利要求1-7任一项所述的沙门氏菌快速测试片检测方法在制备沙门氏菌检测试剂盒中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180907 |