CN101215597B - 蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN101215597B CN2007100328336A CN200710032833A CN101215597B CN 101215597 B CN101215597 B CN 101215597B CN 2007100328336 A CN2007100328336 A CN 2007100328336A CN 200710032833 A CN200710032833 A CN 200710032833A CN 101215597 B CN101215597 B CN 101215597B
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Abstract

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法，涉及利用微生物的特异性酶对微生物进行检测鉴定的方法。所述的试剂盒，包括有：显色培养基基础成分，培养基增补剂，抗生素溶液和样品稀释液。使用该试剂盒进行蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测的方法包括用试剂盒中的成分配制显色培养基，现按规定流程将样品涂布在显色培养基上，观察，再进行结果分析。本发明提供的显色生化检测方法和试剂盒可对食品和环境中蜡样芽孢杆菌进行全面、系统、准确的检测和鉴定，检测灵敏，周期短、可操作性强，适用于处理大通量的样本，可以广泛应用到食品卫生、环境监测等领域。

Description

蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明发明涉及一种微生物的检测方法，具体地说，涉及一种利用微生物的特异性酶对微生物进行快速检测鉴定的试剂盒及检测方法。
背景技术
“民以食为天”，食品食人类赖以生存的物质基础，食品安全是关系人类健康和社会发展的重大问题。近年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生，尤其以沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌等引起的食源性疾病最为突出。据统计，发达国家每年约有1/3的人患食源性疾病，美国每年约有7600万例食原性疾病患者，食源性疾病已成为国内外普遍关心的问题。
蜡样芽孢杆菌是一种常见的食源性致病菌，自然界中分布甚广，常存在于食品、海产品、空气和水中，极易在食品加工、运输、贮存、销售过程中通过不卫生的原料、用具和手污染。我国近两年食源性疾病监测网的资料显示，蜡样芽孢杆菌是仅次于致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌的又一重要致病菌。据调查，米饭、肉类制品、乳制品、蔬菜、水果的带菌率高达20％-77％。蜡样芽孢杆菌食物中毒在国外早有报道。近些年，我国各地也间有报道，并呈现上升趋势，中毒事件以在学校集体食堂、家庭、饮食服务单位等地发生居多。
目前认为蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒主要由该菌产生的肠毒素所致，其次是该菌感染，菌量和毒素量成正比。蜡样芽孢杆菌有产毒素和不产毒素两类，前者在适宜条件下会产生肠毒素，肠毒素又分为耐热性呕吐型和不耐热性腹泻型之分，前者主要在米饭类食品中形成，食后引起呕吐型肠胃炎，后者则在各种食物中均可产生，食后致腹泻型肠胃炎。我国引起食物中毒的食品大多与米饭或淀粉类制品有关，而在欧美一些国家大多由甜点心、肉饼、色拉等引起。呕吐型肠胃炎潜伏期一般仅数小时，症状有恶心、呕吐、头晕等，腹泻型肠胃炎一般发作在食后10-12小时，以腹痛、腹泻症状为主，偶有呕吐及发热。蜡样芽孢杆菌食物中毒有一定的季节性，以6-10月份居多，夏季最高，春秋次之。由于该菌污染食品后主要分解糖类，而食品没有明显的腐败变质现象，除有时稍有发粘、口味不爽外，感观基本正常，因此误食中毒的几率较大。
在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、AOAC、ISO、GB等标准对蜡样进行检测，包括甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，整个过程一般需要3-5天，且操作复杂，已不能满足微生物快速准确检测的现实需要，且在MYP平板上蜡样芽孢杆菌容易扩散影响计数，因此，迫切需要建立新的快速检测技术和方法。
近年来，聚合酶链反应(PCR)、免疫学等方法的应用，使蜡样芽孢杆菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术也存在一定缺陷，比如技术要求较高，需要专业的技术人员进行操作，检测费用昂贵等。PCR方法需要先进行细菌富集，不能区分活菌和死菌，容易产生假阳性；免疫学方法还需要制备高纯度的抗体，因此这些技术很难满足企业和政府监管部门对大批食品样本检测需要。
发明内容
本发明的目的是针对以上不足，从生物化学的角度出发，提出一种利用蜡样芽孢杆菌特异性酶对其进行快速检测的试剂盒及检测方法。
本发明在分析蜡样芽孢杆菌特异性生化反应的基础上，筛选出细菌特异性酶，然后通过在分离培养基上加入细菌特异性酶的显色底物，研制出显色培养基，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴定，同时结合高效的样本前处理技术，由此开发出蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒及检测方法，用于蜡样芽孢杆菌的快速诊断和监控，可大大节省检测成本和时间，具有更广泛的应用前景。
本发明的目的通过如下技术方案来实现：
所提出的蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒，包括有：
(1)显色培养基基础成分，其配方为：蛋白胨8-12g，胰蛋白胨4-6g，酵母粉7-9g，磷酸盐2.5-3.5g，丙酮酸钠9～11g，氯化镁0.8-1.2g，显色底物X-GLU 0.35～0.55g，琼脂11～13g，Na2CO31～2g，pH7.0±0.2；
(2)培养基增补剂：Tween80；
(3)抗生素溶液：经过膜过滤除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml，内含100,000IU的硫酸多粘菌素B；
(4)样品稀释液：0.85％灭菌生理盐水。
使用上述的试剂盒进行蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测的方法如下：
(1)配制显色培养基：
称取显色培养基基础成分43.65-58.25g，溶于1000ml蒸馏水，然后加入培养基增补剂Tween800.1-0.3ml，震荡，混合均匀，121℃高压灭菌15min，冷却至40～50℃，加入抗生素溶液，混匀后倒平板，备用；
(2)按以下流程进行样品检测：
将25g样品加到225ml样品稀释液中，配成1∶10样品检测液，然后依次进行10倍梯度稀释，配成10-2、10-3浓度的样品稀释液，吸取10-1-10-3 3种浓度菌液各100ul，分别涂布显色培养基，36±1℃培养24h，观察；
(3)结果分析：
36±1℃培养24h后，观察显色培养基上是否长出直径3mm～5mm、边缘略整齐的蓝绿色菌落，若有则样品检测结果为阳性，否则为阴性。
本发明的技术可行试验：
1、本发明的显色培养基特异性试验：
按上述技术方案配制本发明的显色培养基，对比培养基为MYP；
将近等比例混合蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌，然后用0.85％灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取10-4-10-5cfu浓度的混合菌液100ul，分别涂布于本发明的显色培养基和MYP，观察。
结果及分析：
将混合菌液涂布平板后，在本发明的显色培养基上，蜡样芽孢杆菌呈现直径3-5mm的蓝绿色菌落；蕈状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等或不显色或被抑制；单增李斯特菌呈现直径小于1mm的蓝色菌落，但生长较差，且菌落形态和颜色与蜡样芽孢杆菌有明显区别；表明基础对蜡样芽孢杆菌具有较高的特异性。
而混合菌液涂布MYP平板后，由于蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌形态和生化特点相似，二者无法区分，可见，本发明的显色培养基比传统MYP的特异性好。
2、本发明的显色培养基的灵敏度试验：
将蜡样芽孢杆菌复苏后，用接种环挑取1环，加入到10ml 0.85％灭菌生理盐水中配成原液，然后依次进行10倍梯度稀释，取10-4-10-6浓度菌液各100ul，分别涂布在本发明的显色培养基和MYP计数，每个平板重复3次，36±1℃培养18-24h，比较两种培养基的灵敏度。
蜡样芽孢杆菌纯菌液涂布各平板结果如表1，对30-300之间的菌落数进行方差分析(P＞0.05)，表明本发明的显色培养基和MYP平板上生长的菌落数没有显著差异，两种培养基可以达到相同的检测限和灵敏度。
表1蜡样芽孢杆菌在各培养基上的菌落数
10-4     10-5     10-6
本发明显色培养基MYP   163±1.85140±2.03     9±1.9710±2.08     --
3、本发明的蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测方法(以下简称“显色检测法”)与传统检测方法的比较试验：
(1)从食堂、超市和市场采集畜禽肉、蔬菜等实际样品62份，采用传统方法和本发明的蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测方法两种不同的检测过程进行蜡样芽孢杆菌检测，检测结果为阳性的样本用法国生物梅里埃细菌鉴定系统-API50CHB生化试剂条进行验证。
国标法：样本-0.85％生理盐水稀释-涂布MYP平板-粉红色带晕环菌落-菌落纯化-生化鉴定。
显色检测法：样本-0.85％生理盐水稀释-涂布显色培养基-直径3-5mm的蓝绿色菌落。
分别挑取显色培养基上的蓝色菌落和MYP平板上的粉红色晕环菌落，接种到50CHB/E培养液中，震荡混匀，配成浓度为2麦氏单位的菌悬液，然后接种到50CHB鉴定条中(包括50个生化反应管，每管加50ul菌液)，37℃培养24-48h，观察结果。
结果分析
62份实际样品中，两种方法都检出了2份疑似样品(牛肉和凉拌腐竹)，用法国生物梅里埃细菌鉴定系统-API50CHB生化试剂条对疑似的菌落进行最终鉴定，结果表明，两种方法分离出的疑似菌落均为蜡样芽孢杆菌，显色检测法与国标法检测结果一致。以下为API试剂条的验证结果。
①牛肉样品
显色培养基上的蓝绿色菌落和MYP平板上的粉红色晕环菌落经API50CHB生化试剂条验证结果表2所示：
表2API生化试剂条读取结果
  管号   试验代码     底物成分 反应结果     管号     试验代码   底物成分   反应结果
HKB cereus     MYP   HKB cereus   MYP
  0     控制 -     -     25     ESC   七叶灵柠檬酸铁   +   +
  1   GLY     甘露醇 -     -     26     SAL   水杨苷   +   +
  2   ERY     赤藻糖醇 -     -     27     CEL   D-纤维二糖   +   +
  3   DARA     D-阿拉伯糖 -     -     28     MAL   D-麦芽糖   +   +
  4   LARA     L-阿拉伯糖 -     -     29     LAC   D-乳糖   -   -
  5   RIB     D-核糖 +     +     30     MEL   D密二糖   -   -
  6   DXYL     D-木糖 -     -     31     SAC   D-蔗糖   -   -
  7   LXYL     L-木糖 -     -     32     TRE   D-海藻糖   +   +
  8   ADO     D-侧金盏花醇I - -     33     INU   菊粉   -   -
  9   MDX     甲基-βD-吡喃木糖苷 - -     34     MLZ   D-松三糖   -   -
  10   GAL     D-半乳糖 -     -     35     RAF   D-棉籽糖   -   -
  11   GLU     D-葡萄糖 +     +     36     AMD   淀粉   +   +
  12   FRU     D-果糖 +     +     37     GLYG   糖原   +   +
  13   MNE     D-甘露糖 -     -     38     XLT   木糖醇   -   -
  14   SBE     L-山梨糖 -     -     39     GEN   D-龙胆二糖   -   -
  15   RHA     L-鼠李糖 -     -     40     TUR   D-土伦糖   -   -
  16   DUL     卫茅醇 -     -     41     LYX   D-来苏糖   -   -
  17   INO     肌醇 -     -     42     TAG   D-塔格糖   -   -
  18   MAN     甘露醇 -     -     43     DFUC   D-岩藻糖   -   -
  19   SOB     山梨醇 -     -     44     LFUC   L-岩藻糖   -   -
  20   MDM     甲基-αD-吡喃甘露糖苷 -     -     45     DARL   D-阿拉伯醇   -   -
  21   MDG     甲基-αD-吡喃葡萄糖苷 +     +     46     LARL   L-阿拉伯醇   -   -
  22   NAG     N-乙酰葡萄糖胺 +     +     47     GNT   葡萄糖酸钾   -    -
  23   AMY     苦杏仁苷 +     +     48     2KG   2酮基-葡萄糖酸钾   -    -
  24   ARB     ARBULIN +     +     49     5KG   5酮基-葡萄糖酸钾   -    -
注：两种培养基上分离的疑似菌落生化反应基本一致，在细菌鉴定系统的读取结果鉴定都是蜡样芽孢杆菌(符合率94.3％)。
②凉拌腐竹
凉拌腐竹通过两种方法检测，在显色培养基上呈现的蓝绿色菌落，同时在MYP平板上呈现的粉红色晕环菌落，经API50CHB生化试剂条验证结果表3所示：
表3API生化试剂条读取结果
    管号   试验代码     底物成分 反应结果     管号   试验代码     底物成分   反应结果
HKB cereus     MYP   HKB cereus    MYP
    0     控制 -     -     25   ESC     七叶灵柠檬酸铁   +     +
    1   GLY     甘露醇 -     -     26   SAL     水杨苷   +     +
    2   ERY     赤藻糖醇 - -     27   CEL     D-纤维二糖   +     +
    3   DARA     D-阿拉伯糖 - -     28   MAL     D-麦芽糖   +     +
    4   LARA     L-阿拉伯糖 - -     29   LAC     D乳糖   -     -
    5   RIB     D-核糖 +     +     30   MEL     D-密二糖   -     -
    6   DXYL     D-木糖 -     -     31   SAC     D-蔗糖   -     -
    7   LXYL     L-木糖 -     -     32   TRE     D-海藻糖   +     +
    8   ADO     D-侧金盏花醇I - -     33   INU     菊粉   -     -
    9   MDX     甲基-βD-吡喃木糖苷 -     -     34   MLZ     D-松三糖   -     -
    10   GAL     D-半乳糖 -     -     35   RAF     D-棉籽糖   -     -
    11   GLU     D-葡萄糖 +     +     36   AMD     淀粉   +     +
    12   FRU     D果糖 +     +     37   GLYG     糖原   +     +
    13   MNE     D-甘露糖 -     -     38   XLT     木糖醇   -     -
    14   SBE     L-山梨糖 -     -     39   GEN     D-龙胆二糖   -     -
    15   RHA     L-鼠李糖 -     -     40   TUR     D-土伦糖   -     -
    16   DUL     卫茅醇 -     -     41   LYX     D-来苏糖   -     -
    17   INO     肌醇 -     -     42   TAG     D-塔格糖   -     -
    18   MAN     甘露醇 -     -     43   DFUC     D-岩藻糖   -     -
    19   SOB     山梨醇 -     -     44   LFUC     L-岩藻糖   -     -
    20   MDM     甲基-αD-吡喃甘露糖苷 -     -     45   DARL     D-阿拉伯醇   -     -
    21   MDG     甲基-αD-吡喃葡萄糖苷 -     -     46   LARL     L-阿拉伯醇   -     -
    22   NAG     N-乙酰葡萄糖胺 +     +     47   GNT     葡萄糖酸钾   -     -
    23   AMY     苦杏仁苷 -     -     48   2KG     2酮基-葡萄糖酸钾   -     -
    24   ARB     ARBULIN +     +     49   5KG     5酮基-葡萄糖酸钾   -     -
注：两种培养基上分离的疑似菌落生化反应也是一致的，在细菌鉴定系统的读取结果鉴定都是蜡样芽孢杆菌(符合率93％)。
以上的试验结果表明，两种方法检出的蜡样芽孢杆菌是一致的，说明使用蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测方法对实际样品中的蜡样芽孢杆菌进行检测是可行的。而且，相比而言，显色试剂盒法的检测时间更短，整个检测确证过程可在24-40h内报告结果；而传统MYP平板上由于蜡样芽孢杆菌和其它芽孢杆菌颜色都呈现粉色带晕环，因此还要对疑似菌落进一步纯化和生化鉴定，整个检测过程至少需要3-5天。
本发明的有益技术效果：
本发明通过筛选蜡样芽孢杆菌特异性酶及显色底物，开发出蜡样芽孢杆菌的显色培养基，克服了传统培养基培养时间长的缺点；在此基础上建立了蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒以及以该试剂盒为基础的一套系统的蜡样芽孢杆菌显色生化快速检测方法，提高了检测效率；所建立的蜡样芽孢杆菌显色生化快速检测方法和试剂盒，可对食品和环境中蜡样芽孢杆菌进行全面、系统、准确的检测和鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明提供的显色生化检测方法和试剂盒配置简单，易于产业化生产，检测灵敏，周期短、可操作性强，适用于处理大通量的样本，可以广泛应用到食品卫生、环境监测等领域。
附图说明
图1显示显色培养基的特异性测试结果。
图中，蜡样芽孢杆菌呈现直径3-5mm左右的蓝色菌落，其他菌株呈现无色菌落或几乎不能生长。
图2、图3分别显示显色培养基的灵敏度测试结果中蜡样芽孢杆菌在显色培养基和MYP平板上的生长状况。
具体实施方式
实施例1
显色生化快速检测试剂盒检测米饭中的蜡样芽孢杆菌。
1.检测试剂盒组成
(1)显色培养基基础成分：蛋白胨8g，胰蛋白胨4g，酵母粉7g，磷酸盐2.5g，丙酮酸钠9g，氯化镁0.8g，显色底X-GLU0.35g，琼脂11g，Na2CO3 1g，pH7.0±0.2；
(2)培养基增补剂：Tween80；
(3)抗生素溶液：
经过膜过滤除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml：内含硫酸多粘菌素B(100,000IU)；
(4)样品稀释液：0.85％灭菌生理盐水。
2.配制显色培养基：
称取显色培养基基础成分43.65g，溶于1000ml蒸馏水，然后加入Tween800.1ml，震荡，混合均匀。121℃高压灭菌15min，冷却至40～50℃，加入抗生素溶液，混匀后倒平板，备用。
3.人工污染样品：
从集体食堂收集剩米饭，称取25g米饭样品，将100-1000cfu蜡样芽孢杆菌加入25g样品中，模拟实际样品混合2h。
4.样品检测流程：
用移液管吸取100ml样品稀释液，涂布HKB cereus，36±1℃培养18-24h，计数，观察记录菌落大小、颜色和形态。
5.结果分析：
人工污染米饭样品检测结果表明，涂布显色平板培养18-24h，蜡样芽孢杆菌在显色培养基上呈现边缘略整齐、直径3-5mm蓝绿色菌落。显色培养基可以检出1-10cfu蜡样芽孢杆菌。
实施例2
显色生化快速检测试剂盒检测市场猪肉样品。
1.试剂盒组成：
(1)显色培养基基础成分：蛋白胨10g，胰蛋白胨5g，酵母粉8g，磷酸盐3g，丙酮酸钠10g，氯化镁1g，显色底X-GLU0.4g，琼脂12g，Na2CO31.5g，pH7.0±0.2；
(2)培养基增补剂：Tween80；
(3)抗生素溶液：经过膜过滤除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml：内含硫酸多粘菌素B(100,000IU)；
(4)样品稀释液：0.85％灭菌生理盐水。
2.配制显色培养基：
称取显色培养基干粉50.9g，溶于1000ml蒸馏水，然后加入Tween80 0.2ml，震荡，混合均匀。121℃高压灭菌15min，冷却至40～50℃，加入抗生素溶液，混匀后倒平板，备用。
3.样品检测过程：
无菌称取25g猪肉，剪碎，加入到盛有225ml 0.85％生理盐水的三角瓶中，配成10-1样品稀释液。按10倍梯度稀释法，依次制备10-2、10-3浓度样品稀释液。用移液管分别吸取10-1、10-2、10-3浓度样品稀释液各100ul，涂布显色培养基HKB cereus，36±1℃培养18-24h，观察记录菌落颜色和形态。
4.结果分析：
36±1℃培养18-24h后，在HKB cereus上未长出边缘略整齐、直径3mm-5mm的蓝绿色菌落。猪肉样品中未检出蜡样芽孢杆菌，因此，样品检测的阴性结果可以在24h报告出。
实施例3
显色生化快速检测方法检测超市凉拌菜(腐竹)。
1.试剂盒组成
(1)显色培养基基础成分：蛋白胨12g，胰蛋白胨6g，酵母粉9g，磷酸盐3.5g，丙酮酸钠11g，氯化镁1.2g，显色底X-GLU 0.55g，琼脂13g，Na2CO3 2g，pH7.0±0.2；
(2)培养基增补剂：Tween80；
(3)抗生素溶液：
经过膜过滤除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml：内含硫酸多粘菌素B(100,000IU)；
(4)样品稀释液：0.85％灭菌生理盐水。
2.配制显色培养基：
称取显色培养基干粉58.25g，溶于1000ml蒸馏水，然后加入Tween80 0.3ml，震荡，混合均匀，调节pH7.0±0.2，121℃高压灭菌15min，冷却至40～50℃，加入抗生素溶液，混匀后倒平板，备用。
3.样品检测过程：
无菌称取25g凉拌腐竹，剪碎，加入到盛有225ml 0.85％生理盐水的三角瓶中，配成10-1样品稀释液。按10倍梯度稀释法，依次制备10-2、10-3浓度样品稀释液。用移液管分别吸取10-1、10-2、10-3浓度样品稀释液各100ul，涂布接种显色培养基HKB cereus，36±1℃培养18-24h，观察记录菌落颜色和形态。
4.结果分析：
36±1℃培养18-24h后，在HKB cereus呈现直径3mm-5mm的蓝绿色菌落，经革兰氏染色、镜检、卵黄分解试验判定为蜡样芽孢杆菌。用50CHB/E培养液将蓝色菌落配成2麦氏单位的菌悬液后，接种50CHB生化试剂条，37℃培养24～48h，后观察生化反应结果，并将数据输入细菌鉴定系统中读取结果，结果表明，该菌为蜡样芽孢杆菌，符合率为93％(前面已有生化反应结果)。由此可以看出，用此显色快速检测试剂盒检测实际样品后，阳性样品的结果可以在40h报告出。

Claims (1)

1.一种蜡样芽孢杆菌特异性显色生化快速检测试剂盒，其特征在于包括有：
(1)显色培养基基础成分，其配方为：蛋白胨8-12g，胰蛋白胨4-6g，酵母粉7-9g，磷酸盐2.5-3.5g，丙酮酸钠9～11g，氯化镁0.8-1.2g，显色底物X-GLU 0.35～0.55g，琼脂11～13g，Na2CO31～2g，pH 7.0±0.2；
(2)培养基增补剂：Tween80；
(3)抗生素溶液：经过膜过滤除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml，内含100,000IU的硫酸多粘菌素B；
(4)样品稀释液：0.85％灭菌生理盐水。
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