JPH06113887A - 生菌数推定方法 - Google Patents
生菌数推定方法Info
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- JPH06113887A JPH06113887A JP4296408A JP29640892A JPH06113887A JP H06113887 A JPH06113887 A JP H06113887A JP 4296408 A JP4296408 A JP 4296408A JP 29640892 A JP29640892 A JP 29640892A JP H06113887 A JPH06113887 A JP H06113887A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高精度で低コスト、しかも、検査時間が短時
間で済む枯草菌および乳酸菌の生菌数推定方法を提供す
る。 【構成】 本発明の方法ではグラム陽性菌のうち、枯草
菌と乳酸菌に特化して、その生菌数の測定を行う。特定
の液体選択培地で培養するので、微生物種が枯草菌と乳
酸菌に限定される。本発明の方法によれば、検体の培養
後に培地を除去し、得られた菌体を生理食塩水と混合
し、この混合液にＡＯ−１０蛍光標識を添加し、その
後、この混合液の蛍光強度を測定する。これにより、培
地由来の蛍光が皆無となる。このため、短時間培養した
だけでも、極めて鋭敏な蛍光検出が可能となる。結果的
に検出時間の大幅な短縮が実現される。
間で済む枯草菌および乳酸菌の生菌数推定方法を提供す
る。 【構成】 本発明の方法ではグラム陽性菌のうち、枯草
菌と乳酸菌に特化して、その生菌数の測定を行う。特定
の液体選択培地で培養するので、微生物種が枯草菌と乳
酸菌に限定される。本発明の方法によれば、検体の培養
後に培地を除去し、得られた菌体を生理食塩水と混合
し、この混合液にＡＯ−１０蛍光標識を添加し、その
後、この混合液の蛍光強度を測定する。これにより、培
地由来の蛍光が皆無となる。このため、短時間培養した
だけでも、極めて鋭敏な蛍光検出が可能となる。結果的
に検出時間の大幅な短縮が実現される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生菌数の推定方法に関す
る。更に詳細には、本発明は枯草菌または乳酸菌の生菌
数推定方法に関する。
る。更に詳細には、本発明は枯草菌または乳酸菌の生菌
数推定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、微生物種の同定は、バージー(Ber
gey)のマニュアルなどに従い、培養物の形態学的および
生理学的性質を調べることにより行われている。一方、
生菌数はサンプル（検体）を１０-1，１０-2，・・・，
１０-n倍に等倍希釈し、この希釈液の一定量を寒天平板
培地上に塗抹接種し、一定時間（例えば、２４〜４８時
間）培養した後、この寒天平板上に出現したコロニー数
に希釈倍率を乗じることにより求められていた。
gey)のマニュアルなどに従い、培養物の形態学的および
生理学的性質を調べることにより行われている。一方、
生菌数はサンプル（検体）を１０-1，１０-2，・・・，
１０-n倍に等倍希釈し、この希釈液の一定量を寒天平板
培地上に塗抹接種し、一定時間（例えば、２４〜４８時
間）培養した後、この寒天平板上に出現したコロニー数
に希釈倍率を乗じることにより求められていた。
【０００３】しかし、このような全くの手作業による微
生物検査法では、２〜５日間の検査期間と、かなりの熟
練技術とを必要とし、また、技術者あるいは検査員によ
る測定差が生じることも知られている。更に、大量の培
地およびシャーレの使用およっ熟練技術者の高い人件費
のため、検査に要する費用も非常に高いものになってい
る。
生物検査法では、２〜５日間の検査期間と、かなりの熟
練技術とを必要とし、また、技術者あるいは検査員によ
る測定差が生じることも知られている。更に、大量の培
地およびシャーレの使用およっ熟練技術者の高い人件費
のため、検査に要する費用も非常に高いものになってい
る。
【０００４】微生物種の同定、生菌数の測定などの微生
物検査は、臨床検査、食品検査、医薬品検査などの部門
で必須であり、迅速化、省人化、自動化に対するニーズ
は高い。特に、臨床検査部門では各種の自動化機器の開
発が行われている。例えば、５０rpm で回転している寒
天平板培地に、サンプル液を中心から外側に向かって塗
抹するプレータ、塗抹された寒天培地を培養し、コロニ
ーの形成された平板培地をHe-Ne レーザでコロニー計数
するスパイラルシステム社のスパイラルシステム、各種
の基質が入ったカートリッジを用い、比色法で微生物種
の同定、比濁吸光法による薬剤感受性試験を自動で行え
るAuto Microbic System, MS-II, Avantage などのシス
テム、カートリッジの代わりにマイクロプレートを用い
たダイナテック社のMIC-2000システムなどが、アメリカ
を中心に開発されている。
物検査は、臨床検査、食品検査、医薬品検査などの部門
で必須であり、迅速化、省人化、自動化に対するニーズ
は高い。特に、臨床検査部門では各種の自動化機器の開
発が行われている。例えば、５０rpm で回転している寒
天平板培地に、サンプル液を中心から外側に向かって塗
抹するプレータ、塗抹された寒天培地を培養し、コロニ
ーの形成された平板培地をHe-Ne レーザでコロニー計数
するスパイラルシステム社のスパイラルシステム、各種
の基質が入ったカートリッジを用い、比色法で微生物種
の同定、比濁吸光法による薬剤感受性試験を自動で行え
るAuto Microbic System, MS-II, Avantage などのシス
テム、カートリッジの代わりにマイクロプレートを用い
たダイナテック社のMIC-2000システムなどが、アメリカ
を中心に開発されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの機器
の大部分は尿路感染などの微生物検査に用いられている
に過ぎず、食品検査のようなサンプルが混濁物であるこ
とが多い場合には測定が不可能であり、また、十分な精
度が得られなかった。更に、何れの方法も、２４〜４８
時間の培養時間を必要とするので、迅速測定が困難であ
る。このため、現場の切実なニーズに十分応えられる段
階には達していない。また、これらの自動機器、測定方
法に関する研究は、臨床医学分野、医用工学分野などで
盛んに行われているが、実用化されているものは極めて
少ない。
の大部分は尿路感染などの微生物検査に用いられている
に過ぎず、食品検査のようなサンプルが混濁物であるこ
とが多い場合には測定が不可能であり、また、十分な精
度が得られなかった。更に、何れの方法も、２４〜４８
時間の培養時間を必要とするので、迅速測定が困難であ
る。このため、現場の切実なニーズに十分応えられる段
階には達していない。また、これらの自動機器、測定方
法に関する研究は、臨床医学分野、医用工学分野などで
盛んに行われているが、実用化されているものは極めて
少ない。
【０００６】従って、本発明の目的は、広範な分野で使
用でき、高精度かつ低コストで、更に、検査時間が数時
間程度で済む、グラム陽性菌、特に、枯草菌または乳酸
菌の生菌数推定方法を提供することである。
用でき、高精度かつ低コストで、更に、検査時間が数時
間程度で済む、グラム陽性菌、特に、枯草菌または乳酸
菌の生菌数推定方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記目的は、トリプチカ
ーセペプトン２．５ｇ／ｌ，フィトンペプトン０．５ｇ
／ｌ，ＮａＣｌ５．０ｇ／ｌおよびアズレオナム(Aztre
onam) ０．２５ｍｇ／ｌからなる、ｐＨ７．３±０．１
の枯草菌用液体選択培地でサンプル中の枯草菌のみを所
定の時間、好気的に培養し、培養後、遠心分離あるいは
濾過して培地を除き、菌体を生理食塩水と混合し、この
混合液にアクリジンオレンジ−１０−ドデシルブロミド
（以下「ＡＯ−１０」という）を添加し、その後、この
混合液の蛍光強度を測定し、枯草菌について予め作成さ
れた生菌数と該生菌数に対応する蛍光強度との検量線に
前記測定値を当てはめることにより達成される。
ーセペプトン２．５ｇ／ｌ，フィトンペプトン０．５ｇ
／ｌ，ＮａＣｌ５．０ｇ／ｌおよびアズレオナム(Aztre
onam) ０．２５ｍｇ／ｌからなる、ｐＨ７．３±０．１
の枯草菌用液体選択培地でサンプル中の枯草菌のみを所
定の時間、好気的に培養し、培養後、遠心分離あるいは
濾過して培地を除き、菌体を生理食塩水と混合し、この
混合液にアクリジンオレンジ−１０−ドデシルブロミド
（以下「ＡＯ−１０」という）を添加し、その後、この
混合液の蛍光強度を測定し、枯草菌について予め作成さ
れた生菌数と該生菌数に対応する蛍光強度との検量線に
前記測定値を当てはめることにより達成される。
【０００８】乳酸菌の場合は、液体選択培地として、バ
クトプロテアーゼペプトン１０ｇ／ｌ，バクト肉エキス
１０ｇ／ｌ，バクト酵母エキス５ｇ／ｌ，ブドウ糖２０
ｇ／ｌ，トウイーン８０１ｇ／ｌ，クエン酸アンモニウ
ム２ｇ／ｌ，酢酸ナトリウム５ｇ／ｌ，硫酸マグネシウ
ム・７Ｈ2 Ｏ０．２ｇ／ｌ，硫酸マンガン０．０５ｇ／
ｌ，リン酸２カリウム２ｇ／ｌからなるｐＨ６．２±
０．２の混合物（以下、「Ｂ培地」という）を使用し、
前記枯草菌と同じ手順で処理することにより生菌数を求
めることができる。
クトプロテアーゼペプトン１０ｇ／ｌ，バクト肉エキス
１０ｇ／ｌ，バクト酵母エキス５ｇ／ｌ，ブドウ糖２０
ｇ／ｌ，トウイーン８０１ｇ／ｌ，クエン酸アンモニウ
ム２ｇ／ｌ，酢酸ナトリウム５ｇ／ｌ，硫酸マグネシウ
ム・７Ｈ2 Ｏ０．２ｇ／ｌ，硫酸マンガン０．０５ｇ／
ｌ，リン酸２カリウム２ｇ／ｌからなるｐＨ６．２±
０．２の混合物（以下、「Ｂ培地」という）を使用し、
前記枯草菌と同じ手順で処理することにより生菌数を求
めることができる。
【０００９】
【作用】前記のように、本発明の方法ではグラム陽性菌
のうち、枯草菌と乳酸菌に特化して、その生菌数の測定
を行う。特定の液体選択培地で培養するので、微生物種
が枯草菌と乳酸菌に限定される。本発明の方法によれ
ば、検体の蛍光測定前に培地を除去するので、培地由来
の蛍光が皆無となる。このため、短時間培養しただけで
も、極めて鋭敏な蛍光検出が可能となる。結果的に検出
時間の大幅な短縮が実現される。
のうち、枯草菌と乳酸菌に特化して、その生菌数の測定
を行う。特定の液体選択培地で培養するので、微生物種
が枯草菌と乳酸菌に限定される。本発明の方法によれ
ば、検体の蛍光測定前に培地を除去するので、培地由来
の蛍光が皆無となる。このため、短時間培養しただけで
も、極めて鋭敏な蛍光検出が可能となる。結果的に検出
時間の大幅な短縮が実現される。
【００１０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００１１】先ず、検量線の作成について説明する。説
明の便宜のために、枯草菌について説明する。(1) 菌株の培養 枯草菌の菌株は理化学研究所微生物系統保存施設より分
譲されたバチルス ズブチリス(Bacillus subtilis) JC
M1465 を使用した。菌株の保存は、寒天斜面培地に植菌
し、３７℃で２４時間培養したあと、４℃の低温で保存
した。菌株の植え継ぎは一ケ月毎に行った。実験に使用
する際には、寒天斜面培地から寒天平板培地に植菌して
３７℃で２４時間培養したあと、４℃の低温で保存した
コロニー状の菌株を用いた。寒天平板培地の菌株の植え
継ぎは二週間毎に行った。
明の便宜のために、枯草菌について説明する。(1) 菌株の培養 枯草菌の菌株は理化学研究所微生物系統保存施設より分
譲されたバチルス ズブチリス(Bacillus subtilis) JC
M1465 を使用した。菌株の保存は、寒天斜面培地に植菌
し、３７℃で２４時間培養したあと、４℃の低温で保存
した。菌株の植え継ぎは一ケ月毎に行った。実験に使用
する際には、寒天斜面培地から寒天平板培地に植菌して
３７℃で２４時間培養したあと、４℃の低温で保存した
コロニー状の菌株を用いた。寒天平板培地の菌株の植え
継ぎは二週間毎に行った。
【００１２】(2) 培地の調製 トリプチカーセペプトン：２．５ｇ／ｌ，フィトンペプ
トン：０．５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ：５．０ｇ／ｌ，および
アズレオナム：０．２５ｍｇ／ｌの組成になるように各
成分を蒸留水に攪拌して溶かし、ｐＨを７．３±０．１
の範囲内に調整し、壜に分注した後、冷凍保存した。培
養に使用する際には、冷凍した前記液体培地を水浴で溶
かし、培養する容器に入れ、蓋をして、オートクレーブ
により１２０℃、２０分間の滅菌を行った。なお、本発
明で使用する“アズレオナム”は米国スクイブ社で開発
されたモノバクタム系抗生物質であり、大腸菌およびサ
ルモネラに対して特異的な抗菌活性を示すが、枯草菌に
対しては殆ど活性を持たない。従って、この培地に検体
を接種し、培養して、コロニーが出現すれば、それは枯
草菌によるものと推定できる。
トン：０．５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ：５．０ｇ／ｌ，および
アズレオナム：０．２５ｍｇ／ｌの組成になるように各
成分を蒸留水に攪拌して溶かし、ｐＨを７．３±０．１
の範囲内に調整し、壜に分注した後、冷凍保存した。培
養に使用する際には、冷凍した前記液体培地を水浴で溶
かし、培養する容器に入れ、蓋をして、オートクレーブ
により１２０℃、２０分間の滅菌を行った。なお、本発
明で使用する“アズレオナム”は米国スクイブ社で開発
されたモノバクタム系抗生物質であり、大腸菌およびサ
ルモネラに対して特異的な抗菌活性を示すが、枯草菌に
対しては殆ど活性を持たない。従って、この培地に検体
を接種し、培養して、コロニーが出現すれば、それは枯
草菌によるものと推定できる。
【００１３】(3) 枯草菌の培養 前記(2) で得られた液体培地４０ｍｌの充填されたバイ
アルに前記(1) で培養した種菌を移植し、３７℃、２０
０ｒｐｍで振盪培養し、最大菌数となるまで増殖させ
た。
アルに前記(1) で培養した種菌を移植し、３７℃、２０
０ｒｐｍで振盪培養し、最大菌数となるまで増殖させ
た。
【００１４】(4) 培地の除去 最大菌数まで増殖した菌液４０ｍｌを遠心分離（３００
０ｒｐｍ，２０分間）にかけ、上澄液である培地を全て
除き、菌を生理食塩水４０ｍｌに懸濁した。
０ｒｐｍ，２０分間）にかけ、上澄液である培地を全て
除き、菌を生理食塩水４０ｍｌに懸濁した。
【００１５】(5) 生菌数の計数 サンプルを１０-1，１０-2，・・・，１０-n倍に等倍希
釈し、この希釈液の５０μｌを寒天平板培地上に塗沫接
種し、２４時間培養した後、この寒天平板上に出現した
コロニー数に希釈倍率を乗じることにより、懸濁生理食
塩水中に含まれている生菌数を計数した。
釈し、この希釈液の５０μｌを寒天平板培地上に塗沫接
種し、２４時間培養した後、この寒天平板上に出現した
コロニー数に希釈倍率を乗じることにより、懸濁生理食
塩水中に含まれている生菌数を計数した。
【００１６】(6) 各菌液濃度に希釈 菌濃度１０3 個／ｍｌから１０9 個／ｍｌの間で１０個
／ｍｌ毎に菌液を作成した。
／ｍｌ毎に菌液を作成した。
【００１７】(7) 蛍光プローブの添加 菌液２９８０μｌに対し蛍光プローブ２０μｌを添加
し、よく攪拌し、１０分間静置した。
し、よく攪拌し、１０分間静置した。
【００１８】(8) 蛍光強度測定 各菌液濃度の検体についてそれぞれ蛍光強度を日立電子
エンジニアリング社製の分光蛍光光度計ＦＰ−７７０で
測定し、生菌数と蛍光強度の関係を示す特性曲線（検量
線）を作成する。
エンジニアリング社製の分光蛍光光度計ＦＰ−７７０で
測定し、生菌数と蛍光強度の関係を示す特性曲線（検量
線）を作成する。
【００１９】本発明で使用する蛍光プローブは下記の化
１で示されるアクリジンオレンジ−１０−ドデシルブロ
ミド（以下「ＡＯ−１０」という）である。この化合物
の分子量は５１４．５９である。
１で示されるアクリジンオレンジ−１０−ドデシルブロ
ミド（以下「ＡＯ−１０」という）である。この化合物
の分子量は５１４．５９である。
【化１】
【００２０】ＡＯ−１０は水溶液中では蛍光が弱く、有
機溶媒中で強い蛍光を示すため、疎水場蛍光プローブと
して使用できる他に、膜のラベル等の幅広い応用が期待
されている。極大励起波長は４９０ｎｍ、極大蛍光波長
は５３０ｎｍ付近である。また、ＡＯ−１０は水に難溶
性であるため、試料への添加にはジメチルスルホキシド
（以下「ＤＭＳＯ」という）に一度溶解してから目的の
濃度に調整し、これを試料に少量加えるという方法を採
ることが好ましい。例えば、市販されている粉末状のＡ
Ｏ−１０（要冷蔵）を約５ｇ秤量し、１００ｍｌのメス
フラスコに移してＤＭＳＯでメスアップし、約１×１０
-4モル／ｌのＡＯ−１０ＤＭＳＯ溶液を調製する。この
ＡＯ−１０ＤＭＳＯ溶液をエッペンドルフチューブに分
注し、アルミホイルでくるんで遮光し、冷凍保存する。
冷凍保存してあるＡＯ−１０ＤＭＳＯ溶液を室温で溶解
し、ピペットマン、エッペンドルフチューブを用い、目
的の濃度になるようにＤＭＳＯで希釈して実験に使用す
る。
機溶媒中で強い蛍光を示すため、疎水場蛍光プローブと
して使用できる他に、膜のラベル等の幅広い応用が期待
されている。極大励起波長は４９０ｎｍ、極大蛍光波長
は５３０ｎｍ付近である。また、ＡＯ−１０は水に難溶
性であるため、試料への添加にはジメチルスルホキシド
（以下「ＤＭＳＯ」という）に一度溶解してから目的の
濃度に調整し、これを試料に少量加えるという方法を採
ることが好ましい。例えば、市販されている粉末状のＡ
Ｏ−１０（要冷蔵）を約５ｇ秤量し、１００ｍｌのメス
フラスコに移してＤＭＳＯでメスアップし、約１×１０
-4モル／ｌのＡＯ−１０ＤＭＳＯ溶液を調製する。この
ＡＯ−１０ＤＭＳＯ溶液をエッペンドルフチューブに分
注し、アルミホイルでくるんで遮光し、冷凍保存する。
冷凍保存してあるＡＯ−１０ＤＭＳＯ溶液を室温で溶解
し、ピペットマン、エッペンドルフチューブを用い、目
的の濃度になるようにＤＭＳＯで希釈して実験に使用す
る。
【００２１】添加されたＡＯ−１０は枯草菌または乳酸
菌と特異的に結合し、菌数に応じた蛍光強度を示す。す
なわち、ＡＯ−１０自体は蛍光を発せず、枯草菌または
乳酸菌と結合した場合だけ蛍光を発するので、本発明の
方法における蛍光プローブとして使用できる。
菌と特異的に結合し、菌数に応じた蛍光強度を示す。す
なわち、ＡＯ−１０自体は蛍光を発せず、枯草菌または
乳酸菌と結合した場合だけ蛍光を発するので、本発明の
方法における蛍光プローブとして使用できる。
【００２２】枯草菌の場合、ＡＯ−１０の添加量は１×
１０-8〜１×１０-4モル／ｌの範囲内であることが好ま
しい。本発明者等の実験によれば、Ａ培地を生理食塩水
と置き換えて、かつ、ＡＯ−１０の添加濃度が２×１０
-6モル／ｌ以下ならばバックグランドを下げることがで
きることが発見された。従って、培養液を３０００ｒｐ
ｍ、２０分間の遠心分離にかけて菌体を沈降させ、上澄
液である培地を取り除き、新たに生理食塩水を加えて得
た懸濁液に濃度１×１０-6モル／ｌとなるようにＡＯ−
１０を添加して生菌数と蛍光強度の関係を調べた。結果
を図１に示す。図示されているように、培地を除いた場
合、ＡＯ−１０濃度１×１０-6モル／ｌで生菌数１０5
〜１０8 個／ｍｌの間で蛍光強度との比例的な相関が得
られた。
１０-8〜１×１０-4モル／ｌの範囲内であることが好ま
しい。本発明者等の実験によれば、Ａ培地を生理食塩水
と置き換えて、かつ、ＡＯ−１０の添加濃度が２×１０
-6モル／ｌ以下ならばバックグランドを下げることがで
きることが発見された。従って、培養液を３０００ｒｐ
ｍ、２０分間の遠心分離にかけて菌体を沈降させ、上澄
液である培地を取り除き、新たに生理食塩水を加えて得
た懸濁液に濃度１×１０-6モル／ｌとなるようにＡＯ−
１０を添加して生菌数と蛍光強度の関係を調べた。結果
を図１に示す。図示されているように、培地を除いた場
合、ＡＯ−１０濃度１×１０-6モル／ｌで生菌数１０5
〜１０8 個／ｍｌの間で蛍光強度との比例的な相関が得
られた。
【００２３】比較例として、培地を取り除かないでＡＯ
−１０を２×１０-5モル／ｌ加えた場合の蛍光強度と生
菌数の相関関係を調べた。結果を図１に併せて示す。図
示されているように、培地を含む場合、生菌数が１０6
個／ｍｌ以上にならなければ生菌数と蛍光強度の比例関
係が得られない。
−１０を２×１０-5モル／ｌ加えた場合の蛍光強度と生
菌数の相関関係を調べた。結果を図１に併せて示す。図
示されているように、培地を含む場合、生菌数が１０6
個／ｍｌ以上にならなければ生菌数と蛍光強度の比例関
係が得られない。
【００２４】本発明の方法では、高菌濃度において蛍光
色素の量が菌の量に対して十分でなくなり、高菌濃度で
の比例が得られなくなるが、より低菌濃度の１０5 個／
ｍｌから生菌数と蛍光強度の比例関係が得られるように
なる。その結果、培地を含む場合に比べ、短時間の培養
で生菌数の推定が可能になる。
色素の量が菌の量に対して十分でなくなり、高菌濃度で
の比例が得られなくなるが、より低菌濃度の１０5 個／
ｍｌから生菌数と蛍光強度の比例関係が得られるように
なる。その結果、培地を含む場合に比べ、短時間の培養
で生菌数の推定が可能になる。
【００２５】乳酸菌(Lactobacillus casei) JCM1171 に
ついても前記枯草菌と同様に処理した。乳酸菌の場合、
ＡＯ−１０の添加量は１×１０-8〜１×１０-4モル／ｌ
の範囲内であることが好ましい。本発明者等の実験によ
れば、Ｂ培地を生理食塩水と置き換えて、かつ、ＡＯ−
１０の添加濃度が２×１０-6モル／ｌ以下ならばバック
グランドを下げることができることが発見された。従っ
て、培養液を３０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離にか
けて菌体を沈降させ、上澄液である培地を取り除き、新
たに生理食塩水を加えて得た懸濁液に濃度１×１０-7モ
ル／ｌとなるようにＡＯ−１０を添加して生菌数と蛍光
強度の関係を調べた。結果を図２に示す。図示されてい
るように、培地を除いた場合、ＡＯ−１０濃度が１×１
０-7モル／ｌで生菌数１０4 〜１０7 個／ｍｌの間で蛍
光強度との比例的な相関が得られた。
ついても前記枯草菌と同様に処理した。乳酸菌の場合、
ＡＯ−１０の添加量は１×１０-8〜１×１０-4モル／ｌ
の範囲内であることが好ましい。本発明者等の実験によ
れば、Ｂ培地を生理食塩水と置き換えて、かつ、ＡＯ−
１０の添加濃度が２×１０-6モル／ｌ以下ならばバック
グランドを下げることができることが発見された。従っ
て、培養液を３０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離にか
けて菌体を沈降させ、上澄液である培地を取り除き、新
たに生理食塩水を加えて得た懸濁液に濃度１×１０-7モ
ル／ｌとなるようにＡＯ−１０を添加して生菌数と蛍光
強度の関係を調べた。結果を図２に示す。図示されてい
るように、培地を除いた場合、ＡＯ−１０濃度が１×１
０-7モル／ｌで生菌数１０4 〜１０7 個／ｍｌの間で蛍
光強度との比例的な相関が得られた。
【００２６】比較例として、培地を取り除かないでＡＯ
−１０を３×１０-6モル／ｌ加えた場合の蛍光強度と生
菌数の相関関係を調べた。結果を図２に併せて示す。図
示されているように、培地を含む場合、生菌数が１０5
個／ｍｌ以上にならなければ生菌数と蛍光強度の比例関
係が得られない。従って、乳酸菌についても、枯草菌の
場合と同様な結論が導かれる。
−１０を３×１０-6モル／ｌ加えた場合の蛍光強度と生
菌数の相関関係を調べた。結果を図２に併せて示す。図
示されているように、培地を含む場合、生菌数が１０5
個／ｍｌ以上にならなければ生菌数と蛍光強度の比例関
係が得られない。従って、乳酸菌についても、枯草菌の
場合と同様な結論が導かれる。
【００２７】本発明者らが更に研究を続けた結果、ＡＯ
−１０はグラム陽性菌に対しては生菌数と蛍光強度の間
に比例的な相関関係が得られるが、グラム陰性菌（例え
ば、大腸菌、サルモネラ菌およびクレブシエラ菌など）
ではそのような相関は得られないことが分かった。グラ
ム染色法とは、菌体の細胞表層の構造の違いからくる染
色性の違いによって分類したものであるから、ＡＯ−１
０のこのような結果は、菌体の細胞表層の違いから起こ
ると考えられる。
−１０はグラム陽性菌に対しては生菌数と蛍光強度の間
に比例的な相関関係が得られるが、グラム陰性菌（例え
ば、大腸菌、サルモネラ菌およびクレブシエラ菌など）
ではそのような相関は得られないことが分かった。グラ
ム染色法とは、菌体の細胞表層の構造の違いからくる染
色性の違いによって分類したものであるから、ＡＯ−１
０のこのような結果は、菌体の細胞表層の違いから起こ
ると考えられる。
【００２８】以下、具体例により本発明の方法を実証す
る。 実施例１ 納豆から採取した菌数未知の枯草菌と思われる検体をＡ
培地の液体培地４０ｍｌが充填されたバイアルに入れ、
３７℃、２００ｒｐｍで５時間振盪培養した。その後、
３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄液（培地）
を除き、菌体を生理食塩水４０ｍｌに懸濁させた。この
懸濁液にＡＯ−１０を１×１０-6モル／ｌ添加し、１０
分間静置した。その後、ＦＰ−７７０型分光蛍光光度計
で蛍光強度を測定した。この蛍光強度に対応する生菌数
を図１の検量線から求めたところ、８．５×１０7 個で
あった。同じ検体について前記(5) の従来の手作業によ
る生菌数計数方法で求めた生菌数は８．２×１０7 個で
あった。これにより、本発明の生菌数推定方法の信頼性
が確認できる。
る。 実施例１ 納豆から採取した菌数未知の枯草菌と思われる検体をＡ
培地の液体培地４０ｍｌが充填されたバイアルに入れ、
３７℃、２００ｒｐｍで５時間振盪培養した。その後、
３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄液（培地）
を除き、菌体を生理食塩水４０ｍｌに懸濁させた。この
懸濁液にＡＯ−１０を１×１０-6モル／ｌ添加し、１０
分間静置した。その後、ＦＰ−７７０型分光蛍光光度計
で蛍光強度を測定した。この蛍光強度に対応する生菌数
を図１の検量線から求めたところ、８．５×１０7 個で
あった。同じ検体について前記(5) の従来の手作業によ
る生菌数計数方法で求めた生菌数は８．２×１０7 個で
あった。これにより、本発明の生菌数推定方法の信頼性
が確認できる。
【００２９】実施例２ 乳酸菌飲料から採取した菌数未知の乳酸菌と思われる検
体をＢ培地の液体培地４０ｍｌが充填されたバイアルに
入れ、３７℃で５時間静止培養した。その後、３０００
ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄液（培地）を除き、
菌体を生理食塩水４０ｍｌに懸濁させた。この懸濁液に
ＡＯ−１０を１×１０-7モル／ｌ添加し、１０分間静置
した。その後、ＦＰ−７７０型分光蛍光光度計で蛍光強
度を測定した。この蛍光強度に対応する生菌数を図２の
検量線から求めたところ、２．５×１０6 個であった。
同じ検体について前記(5) の従来の手作業による生菌数
計数方法で求めた生菌数は２．７×１０6 個であった。
これにより、本発明の生菌数推定方法の信頼性が確認で
きる。
体をＢ培地の液体培地４０ｍｌが充填されたバイアルに
入れ、３７℃で５時間静止培養した。その後、３０００
ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄液（培地）を除き、
菌体を生理食塩水４０ｍｌに懸濁させた。この懸濁液に
ＡＯ−１０を１×１０-7モル／ｌ添加し、１０分間静置
した。その後、ＦＰ−７７０型分光蛍光光度計で蛍光強
度を測定した。この蛍光強度に対応する生菌数を図２の
検量線から求めたところ、２．５×１０6 個であった。
同じ検体について前記(5) の従来の手作業による生菌数
計数方法で求めた生菌数は２．７×１０6 個であった。
これにより、本発明の生菌数推定方法の信頼性が確認で
きる。
【００３０】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法では
グラム陽性菌のうち、枯草菌と乳酸菌に特化して、その
生菌数の測定を行う。特定の液体選択培地で培養するの
で、微生物種が枯草菌と乳酸菌に限定される。本発明の
方法によれば、検体の蛍光測定前に培地を除去するの
で、培地由来の蛍光が皆無となる。このため、短時間培
養しただけでも、極めて鋭敏な蛍光検出が可能となる。
結果的に検出時間の大幅な短縮が実現される。
グラム陽性菌のうち、枯草菌と乳酸菌に特化して、その
生菌数の測定を行う。特定の液体選択培地で培養するの
で、微生物種が枯草菌と乳酸菌に限定される。本発明の
方法によれば、検体の蛍光測定前に培地を除去するの
で、培地由来の蛍光が皆無となる。このため、短時間培
養しただけでも、極めて鋭敏な蛍光検出が可能となる。
結果的に検出時間の大幅な短縮が実現される。
【図１】枯草菌の蛍光強度と生菌数の関係を示す検量線
である。
である。
【図２】乳酸菌の蛍光強度と生菌数の関係を示す検量線
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 遠藤 勲 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 長棟 輝行 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 浅間 一 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 辨野 義己 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 石井 忠浩 東京都日野市平山一丁目６番５号 (72)発明者 春日 里佳 東京都千代田区大手町二丁目６番２号 日 立電子エンジニアリング株式会社内
Claims (8)
- 【請求項１】 トリプチカーセペプトン２．５ｇ／ｌ，
フィトンペプトン０．５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ５．０ｇ／ｌ
およびアズレオナム(Aztreonam) ０．２５ｍｇ／ｌから
なる、ｐＨ７．３±０．１の枯草菌用液体選択培地でサ
ンプル中の枯草菌のみを所定の時間、好気的に培養し、
培養後、遠心分離あるいは濾過して培地を除き、菌体を
生理食塩水と混合し、この混合液にアクリジンオレンジ
−１０−ドデシルブロミドを添加し、その後、この混合
液の蛍光強度を測定し、枯草菌について予め作成された
生菌数と該生菌数に対応する蛍光強度との検量線に前記
測定値を当てはめることにより枯草菌の生菌数を推定す
る方法。 - 【請求項２】 液体培地における培養は振盪培養により
行われる請求項１の方法。 - 【請求項３】 アクリジンオレンジ−１０−ドデシルブ
ロミドは１×１０-8〜１×１０-4モル／ｌの範囲内の濃
度で使用される請求項１の方法。 - 【請求項４】 アクリジンオレンジ−１０−ドデシルブ
ロミドは１×１０-7〜２×１０-6モル／ｌの濃度で使用
される請求項３の方法。 - 【請求項５】 バクトプロテアーゼペプトン１０ｇ／
ｌ，バクト肉エキス１０ｇ／ｌ，バクト酵母エキス５ｇ
／ｌ，ブドウ糖２０ｇ／ｌ，トウイーン８０１ｇ／ｌ，
クエン酸アンモニウム２ｇ／ｌ，酢酸ナトリウム５ｇ／
ｌ，硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ０．２ｇ／ｌ，硫酸マ
ンガン０．０５ｇ／ｌ，リン酸２カリウム２ｇ／ｌから
なるｐＨ６．２±０．２の乳酸菌用液体選択培地でサン
プル中の乳酸菌のみを所定時間、嫌気的に培養し、培養
後、遠心分離あるいは濾過して培地を除き、菌体を生理
食塩水と混合し、この混合液にアクリジンオレンジ−１
０−ドデシルブロミドを添加し、その後、この混合液の
蛍光強度を測定し、乳酸菌について予め作成された生菌
数と該生菌数に対応する蛍光強度との検量線に前記測定
値を当てはめることにより乳酸菌の生菌数を推定する方
法。 - 【請求項６】 液体培地における培養は静止培養により
行われる請求項５の方法。 - 【請求項７】 アクリジンオレンジ−１０−ドデシルブ
ロミドは１×１０-8〜１×１０-4モル／ｌの範囲内の濃
度で使用される請求項５の方法。 - 【請求項８】 アクリジンオレンジ−１０−ドデシルブ
ロミドは１×１０-8〜２×１０-7モル／ｌの濃度で使用
される請求項７の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4296408A JPH06113887A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | 生菌数推定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4296408A JPH06113887A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | 生菌数推定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113887A true JPH06113887A (ja) | 1994-04-26 |
Family
ID=17833163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4296408A Pending JPH06113887A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | 生菌数推定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06113887A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
| CN111562210A (zh) * | 2020-06-16 | 2020-08-21 | 北京挑战农业科技有限公司 | 一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法 |
-
1992
- 1992-10-08 JP JP4296408A patent/JPH06113887A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
| CN111562210A (zh) * | 2020-06-16 | 2020-08-21 | 北京挑战农业科技有限公司 | 一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法 |
| CN111562210B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-01-03 | 北京挑战农业科技有限公司 | 一种前包被饲用微生态制剂产品中活菌数的检测方法 |
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