RU2294373C2 - Способ определения лизоцимной активности биологических объектов - Google Patents
Способ определения лизоцимной активности биологических объектов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2294373C2 RU2294373C2 RU2005103265/13A RU2005103265A RU2294373C2 RU 2294373 C2 RU2294373 C2 RU 2294373C2 RU 2005103265/13 A RU2005103265/13 A RU 2005103265/13A RU 2005103265 A RU2005103265 A RU 2005103265A RU 2294373 C2 RU2294373 C2 RU 2294373C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- culture
- lysozyme
- lysozyme activity
- tarasevich
- gisk
- Prior art date
Links
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims abstract description 59
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 59
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 claims abstract description 38
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 35
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 241000545753 Unio pictorum Species 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 241000217383 Anodonta cygnea Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу определения лизоцимной активности биологических объектов, и может быть использовано для оценки антимикробного иммунитета организма, экологической толерантности организмов к факторам окружающей среды. Способ предусматривает выращивание тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Тарасевича на жидкой питательной среде при температуре 27°С до оптической плотности 3,2-3,4. Подвергают лиофильной сушке. Из выращенной тест-культуры готовят суспензию, которую вносят в исследуемый биологический объект. После чего проводят вычисление лизоцимной активности биологического объекта по известному методу. Изобретение позволяет получить более точные, достоверные и сопоставимые сведения об уровне лизоцимной активности в биологическом объекте. 3 табл., 1 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины и экологии, в частности к микробиологии и микроэкологии, а именно к способам определения лизоцима.
В частности, способ предназначен для определения уровня лизоцимной активности тканей, биологических жидкостей с целью оценки уровня антимикробной защиты организмов.
Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в бактериологических, экологических и иммунологических лабораториях, решающих вопросы оценки антимикробного иммунитета организма, а также оценки экологической толерантности организмов к факторам окружающей среды.
В настоящее время накоплено достаточно много материала о широком распространении антимикробного фермента - лизоцима у беспозвоночных, позвоночных животных и человека, у микроорганизмов (О.В.Бухарин, Н.В.Васильев, 1974; В.М.Подборнов, А.Бердыев, 1991; Э.Купер, 1980).
Присутствие данного фермента связывают с проявлением естественной резистентности организмов, особенно к грамположительным бактериям (О.В.Бухарин, Н.В.Васильев, 1974). Кроме того, в работах Г.Н.Соловых (1995), Г.П.Алехиной (1996), Н.В.Немцевой (1998) показано, что лизоцим является одним из наиболее важных факторов, принимающих участие в формировании гидробиоценозов, а также может быть одним из факторов адаптации организмов в биоценозе, и поэтому оценка уровня лизоцимной активности биологических объектов дает представление о резистентности организма или биоценоза к неблагоприятным факторам окружающей среды, как биотической, так и абиотической природы. В связи с этим, разработка методов определения уровня лизоцимной активности для оценки уровня резистентности организмов к факторам среды или возбудителям болезней является актуальной.
В основе общепринятых методов определения лизоцимной активности лежит способность экстрактов тканей, жидкостей организма (слюна, кровь, лимфа) лизировать in vitro суспензию клеток чувствительного штамма Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича. По уровню лизоцимной активности биологических объектов можно судить о степени защиты организмов к микробной нагрузке в биоценозе или в организме. Поэтому для точной оценки уровня лизоцимной активности различных биологических объектов необходима стандартизация используемого индикаторного микроорганизма Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Анализ фактического материала, касающегося определения лизоцимной активности, затрудняется разнообразием методик, используемых различными авторами, тем более что многие из них имеют полуколичественный характер, а поэтому не дают точной оценки уровня лизоцимной активности.
Все это свидетельствует об актуальности разработки весьма чувствительных количественных методов определения уровня активности лизоцима.
Уровень техники
Известен «Способ выделения комплекса литических ферментов» (авторское свидетельство №1755581 от 20.08.1995), в котором используется суспензия лиофилизированных клеток Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для определения бактериологической активности в выделенном комплексе ферментов. С этой целью используют 2 мл лиофилизированных клеток Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича в 0,01 М Трис-буфере рН 8,4-8,5 с концентрацией 0,5-0,6 ед оптической плотности (ФЭК - 56М, δкюв 3 мм, с/ф №6), прогретой в течении 10 мин, при 37°C, добавляют 0,1 мл пробы, смесь инкубируют 5 мин, при 37°С.
Недостатком данного способа является то, что в нем предполагается стандартизация используемой лиофилизированной индикаторной культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича только по оптической плотности (мутности).
Известно, что такая форма стандартизации используемой культуры весьма субъективна: культуру тестового микроорганизма постепенно смешивают с разбавителем. Полученную взвесь микроорганизмов интенсивно встряхивают, добиваясь полного и равномерного распределения клеток. При визуальном несоответствии мутности приготовленной суспензии ее доводят добавлением разбавителя. После каждого вносимого изменения суспензию тщательно встряхивают, т.е. приготовленная суспензия, используемая для определения, неточная и сугубо субъективная, зависящая от восприятия исследователя. Кроме того, такую сугубо субъективную стандартизацию необходимо проводить перед каждым определением бактериологической активности, поэтому получаемые результаты в разных сериях эксперимента не являются сопоставимыми, т.к. имеют разную степень достоверности из-за использования нестандартизированной лиофилизированной культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича в каждой серии определения.
В данном способе нет указаний о том, с какой фазы роста взяты клетки микроорганизма Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для приготовления суспензии, не указаны оптимальные условия выращивания культуры. Кроме того, не указан штамм Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича и откуда он получен, что также является помехой в стандартизации микроорганизмов.
Вследствие чего, результаты нескольких серий опытов могут значительно отличаться между собой и не дают точных результатов.
Известен турбидиметрический метод определения активности лизоцима (К.А.Каграманова, З.В.Ермольева, 1966). Метод (прототип) основан на способности лизоцима, добавленного к ацетоновому порошку тест-бактерий Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, лизировать последних в одном и том же временном интервале. Для регистрации изменений оптической плотности суспензии используют пробирочный электрофотокалориметр с рабочей длиной волны 570 нм.
Тест-культуру Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича выращивают в течении 48 часов при 37°С на агаре Хоттингера, суспендируют в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, трижды отмывают дистиллированной водой, четырежды - ацетоном на холоду и высушивают при комнатной температуре. Полученный порошок можно длительно хранить при 4-6°С. Однако недостатком использования ацетонового порошка тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича является высокая агрегированность бактериальных клеток, а следовательно, достаточно низкая степень дисперсности суспензии клеток (ее неоднородность) и снижение чувствительности клеток к бактериолитическому действию лизоцима. Все это ведет к снижению точности и эффективности количественного определения уровня лизоцимной активности (табл.1).
Таблица 1. Пример использования ацетонового порошка тест-культуры М.lysodeikticus для определения лизоцимной активности яичного лизоцима.
| Ацетоновый порошок тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича | Яичный лизоцим | Контроль | ||
| 1 серия | 2 серия | 1 серия | 2 серия | |
| Dнач | 0,780 | 0,545 | 0,663 | 0,641 |
| Dконеч | 0,571 | 0,366 | 0,640 | 0,620 |
| ΔD (30 мин) | 0,209 | 0,179 | 0,023 | 0,021 |
| ед.а. | 6,97 | 5,97 | - | - |
В табл.1 показано использование одного и того же ацетонового порошка для определения лизоцимной активности. В качестве объекта исследования был взят коммерческий препарат яичного лизоцима фирмы «Ферейн». Как видно из таблицы, уже на первом этапе определения начальной оптической плотности одна и та же суспензия клеток тест-культуры, приготовленная с использованием ацетонового порошка микрококка, дала разные результаты (0,780 - 1 серия; 0,545 - 2 серия). Естественно, что на дальнейших этапах определения эта разница прослеживалась. И, как результат, две серии опыта, параллельно проведенные с использованием одной и той же ацетонированной тест-культурой Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, дали разные данные об уровне активности фермента: 6.97 ед.а. и 5,97 ед.а., что наглядно подтверждает невысокую точность и достоверность данного способа. Кроме того, при использовании ацетонового порошка тест-культуры наблюдается падение оптической плотности и в контрольных пробах, что также является одним из доказательств неточности данного способа.
Другим серьезным недостатком данного метода является его трудоемкость и длительность выполнения, что обусловлено необходимостью построения калибровочной кривой для количественной характеристики активности лизоцима в растворах с неизвестной концентрацией белка, а также тем, что калибровочную кривую необходимо строить перед проведением каждой серии исследований, данный процесс является длительным по времени, достаточно трудоемок и во многом зависит от имеющегося опыта исследователя.
Кроме того, в способе также нет указаний о том, с какой фазы роста взяты клетки микроорганизма Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для приготовления суспензии и не указаны оптимальные условия выращивания культуры.
Эти недостатки заставляют искать более точные, чувствительные и менее трудоемкие способы определения уровня лизоцимной активности.
Новизной заявляемого способа является то, что он направлен на повышение точности определения уровня лизоцимной активности из-за использования культуры, находящейся в одной фазе роста бактериальных клеток, и на сопоставимость полученных в разных сериях определения результатов.
Существенным отличием предлагаемого способа является то, что перед процессом лиофилизации культуру Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича выращивают на жидкой питательной среде при 27°С до оптической плотности 3,2-3,4, что соответствует фазе логарифмического роста микроорганизма - 11-ый час выращивания, что приводит к ее стандартизации.
1. Нами изменены условия культивирования индикаторной культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, выращивание культуры при 37°С приводит к достаточно быстрому лизису клеток микрококка и, следовательно, он не может быть использован для определения уровня лизоцимной активности. Нами предложена более оптимальная температура для его роста -27°С (Дж. Хоулт, 1997).
2. Для получения массы бактериальных клеток, подвергающихся лиофилизации, культура выращивается на жидкой питательной среде - мясопептонный бульон (МПБ) - где ее рост идет более равномерно.
3. Работая с биологическими объектами и определяя уровень лизоцима, содержащегося в тканях и жидкостях объекта, крайне важно, чтобы погрешность при измерении уровня лизоцимной активности была минимальной, а это возможно лишь при использовании высокостандартизированной индикаторной культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Поэтому перед культивированием Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича нами была построена кривая роста данной культуры и установлено, что фаза логарифмического роста наступает через 6 часов после засева на среду и заканчивается на 13-ом часу культивирования (чертеж). А как известно, находясь в фазе логарифмического роста, интенсивно растущие клетки бактерий наиболее чувствительны к внешним воздействиям, которым можно считать и биотический фактор - лизоцим. Для лиофилизации нами берется жидкая культура с оптической плотностью 3,2-3,4: данная оптическая плотность достигается на 11-ом часу выращивания. Поэтому нами рекомендовано использовать для лиофилизации массу бактериальных клеток, находящихся в одной фазе - фазе логарифмического роста, а именно взятых на 11-ом часу культивирования культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Подводя итог данному разделу описания изобретения, следует указать, что заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.
Пример конкретного выполнения
Соответственно, при реализации способа фотометрического определения лизоцимной активности с использованием стандартизированой лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича характеристика действий, порядка их выполнения и условий осуществления представляется следующим образом:
На первом этапе осуществляется стандартизация и приготовление лиофилизированной культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича:
1. 100 μl клеток живой культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича с исходной плотностью 0,015 вносят в жидкую питательную среду (МПБ) и выращивают при 27°С на ротационном шейкере УМТВ-12-250 при перемешивании 100-150 об/мин.
2. На 11-ом часу культивирования культуру снимают с шейкера. Выращенную жидкую культуру вносят в ампулы по 1,5 мл.
3. Лиофилизацию осуществляют в лабораторном сублиматоре ОЕ-960 (Венгрия). Лиофилизированную культуру Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича хранят в холодильниках при температуре 4-12°С.
На втором этапе полученную стандартизированную лиофилизированную тест-культуры используют для приготовления суспензии необходимой для определения лизоцимной активности:
Для фотометрического определения уровня лизоцимной активности используют суспензию клеток лиофилизнрованной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича с оптической плотностью 0,6-0,62.
Для этого ампулу со стандартизированной лиофилизированной тест-культурой разводят в 7,5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,0 (т.к. в ампулу помещалась жидкая тест-культура с оптической плотностью 3,2-3,4 объемом 1,5 мл, то разведением ампулы в 5 раз - доведением объема до 7,5 мл - получаем необходимую для измерения оптическую плотность 0,6-0,62).
На третьем этапе проводят измерение уровня лизоцимной активности исследуемых объектов:
1. К 1 мл исследуемого препарата добавляют 6 мл приготовленной для измерения суспензии с оптической плотностью 0,6-0,62 (в целях уменьшения расхода материала для кювет объемом 3 мл предлагается следующее соотношение: 0,4 мл (400 μl) исследуемого препарата и 2,4 мл приготовленной для измерения суспензии.
2. Сразу же измеряют начальную оптическую плотность и после 30-минутного инкубирования при 37°С - конечную оптическую плотность. Измерение проводят при длине волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм с использованием спектрофотометра СФ-46.
3. Изменение оптической плотности вычисляем по формуле:
ΔD=Dконеч-Dнач
4. Параллельно с опытом ставится контроль, который содержит 1 мл 0,1 М фосфатного буфера (вместо исследуемого препарата) и 6 мл приготовленной для измерения суспензии лиофилизированной культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
На четвертом этапе проводят определение содержания (концентрации) белка в исследуемых объектах: содержание (концентрацию) белка в исследуемых объектах измеряют по методу Лоури (Lowry et al., 1951), который сочетает в себе биуретовую реакцию и реакцию Фолина (на S-содержащие аминокислоты - тирозин и триптофан).
Используемые реактивы: 2% раствор карбоната натрия, приготовленный на 0,1 М растворе гидроксида натрия (реактив 1); 0,5% раствор сульфата меди. приготовленный на 1% растворе цитрата натрия (реактив 2); реактив 3 (1 мл реактива 1 смешивают с 50 мл реактива 2), готовят непосредственно перед употреблением; реактив Фолина-Чокальтеу.
Ход определения: исследуемый объект объемом 0,4 мл (400 μl) смешивают с 2 мл реактива 3 и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Добавляют 0,2 мл (200 μl) реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивают и через 30-40 минут измеряют оптическую плотность при 750 нм на спектрофотометре или на фотоэлектрокалориметре.
На пятом этапе проводится вычисление уровня лизоцимной активности исследуемых объектов с использованием величины - удельная единица активности (у.ед.а).
За единицу лизоцимной активности (ед.а.) исследуемого препарата принимают такое его количество, которое вызывает снижение величины начальной оптической плотности суспензии клеток тест-культуры на 0,001 за 1 минуту:
ΔD - изменение оптической плотности,
τ(инкубирования) - время инкубирования (в минутах).
Поскольку исследуемые биологические жидкости различаются по содержанию белка, то значение уровня лизоцимной активности в единицах активности (ед.а.) не может отражать истинную активность лизоцима, содержащегося в исследуемых препаратах. Поэтому необходим пересчет уровня лизоцимной активности с учетом количества (содержания) белка в исследуемых препаратах. В связи с чем, мы используем общеизвестную формулу определения активности ферментов - удельную единицу активности (у.ед.а.), которую выражают в ед.а./мг белка (авторское свидетельство №1811854 от 30.04.1993) и рассчитывают по формуле:
или подставив в формулу (2) формулу (1), можно получить формулу (3)
[Б] - концентрация белка в исследуемом объекте (мг/мл).
В качестве примера для расчета уровня лизоцимной активности взяты экстракты жаберной ткани двустворчатых моллюсков вида Unio pictorum и Anodonta cygnea с одинаковым значением ΔD, но отличающиеся по содержанию белка:
| Пример расчета лизоцимной активности экстракта жаберной ткани двустворчатого моллюска Unio pictorum | Пример расчета лизоцимной активности экстракта жаберной ткани двустворчатого моллюска Anodonta cygnea |
| ΔD - 0,329 | ΔD - 0,329 |
| τ(инкубирования) - 30 минут | τ(инкубирования) - 30 минут |
| [Б] - 4,5 мг/мл | [Б] - 10,4 мг/мл |
| ед.а. = 0,329/0,001×30 мин; | ед.а. = 0,329/0,001×30 мин; |
| ед.а. = 0,329/0,03; | ед.а. = 0,329/0,03; |
| ед.а. = 10,97 | ед.а. = 10,97 |
| у.ед.а. = 0,94/4,5 мг/мл; | у.ед.а. = 10,94/ 10,4 мг/мл; |
| у.ед.а. = 2,44 ед.а./мг белка | у.ед.а. = 1,05 ед.а./мг белка |
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Для опытного обоснования факта использования стандартизированной лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для определения лизоцимной активности были проведены две серии сравнительных экспериментов по использованию ацетонированной и лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для определения лизоцимной активности препаратов лизоцима различного происхождения: яичного лизоцима и лизоцима моллюсков Unio pictorum. Результаты исследований представлены в таблицах 2, 3.
Пример 1. Результаты использования лиофилизированной и ацетонированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для определения активности яичного лизоцима.
| Таблица 2. | ||||||
| Яичный лизоцим | Яичный лизоцим | Контроль | ||||
| Тест-культура Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича | лиофилизиров. (1 серия) | лиофилизиров. (2 серия) | ацетониров. (1 серия) | ацетониров. (2 серия) | лиофилизиров. | ацетониров. |
| Dнач | 0,605 | 0,62 | 0,545 | 0,780 | 0,6 | 0,663 |
| Dконеч | 0,385 | 0,397 | 0,366 | 0,571 | 0,597 | 0,640 |
| ΔD (30 мин) | 0,220 | 0,223 | 0,179 | 0,209 | 0,003 | 0,023 |
| ед.а. | 7,33 | 7,43 | 5,97 | 6,97 | - | - |
| [Б] (мг/мл) | 1 | 1 | 1 | 1 | - | - |
| у.ед.а. (ед.а./мг белка) | 7,33 | 7,43 | 5,97 | 6,97 | - | - |
Из цифровых данных таблицы 2 видно, что при использовании стандартизированной лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича уже на первом этапе определения начальной оптической плотности результаты двух серий опыта незначительно отличаются между собой (0,605 и 0,62), и как результат - незначительные различия в уровне активности лизоцима: 7,33 ед./мг белка (1 серия) и 7,43 ед. мг белка (2 серия). В то время как при использовании ацетонированной тест-культуры результаты сильно отличаются (0,545 и 0,780), что, естественно, ведет к различию в оценке уровня активности данного препарата: 5,97 ед. мг белка (1 серия) и 6,97 ед./мг белка (2 серия).
Пример 2. Результаты использования стандартизированной лиофилизированной и ацетонированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича для определения активности лизоцима моллюска Unio pictorum.
| Таблица 3. | ||||||
| Лизоцим моллюска Unio pictorum | Лизоцим моллюска Unio pictorum | Контроль | ||||
| Тест-культура Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича | лиофилизиров. (1 серия) | лиофилизиров. (2 серия) | ацетониров. (1 серия) | ацетониров. (2 серия) | лиофилизиров. | ацетониров. |
| Dнач | 0,6 | 0,62 | 0,702 | 0,521 | 0,62 | 0,641 |
| Dконеч | 0,44 | 0,456 | 0,570 | 0,419 | 0,616 | 0,620 |
| ΔD (30 мин) | 0,16 | 0,164 | 0,132 | 0,102 | 0,004 | 0,021 |
| ед.а. | 5,33 | 5,46 | 4,4 | 3,4 | - | - |
| [Б] (мг/мл) | 0,23 | 0,23 | 0,23 | 0,23 | - | - |
| у.ед.а. (ед.а./мг белка) | 23,2 | 23,7 | 19,1 | 14,7 | - | - |
Для подтверждения достоверности результатов опытов была проведена оценка уровня активности лизоцима моллюска Unio pictorum. Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что при использовании стандартизированной лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича уже на первом этапе определения начальной оптической плотности результаты двух серий опыта незначительно отличаются между собой (0,6 и 0,62), и как результат - незначительные различия в оценке уровня активности препарата: 23,2 ед./мг белка (1 серия) и 23,7 ед./мг белка (2 серия). В то время как при использовании ацетонированной тест-культуры результаты сильно отличаются (0,702 и 0,521), что, естественно, ведет к различию в оценке уровня активности исследуемого препарата: 19,1 ед./мг белка (1 серия) и 14,7 ед./мг белка (2 серия).
Кроме того, оптическая плотность в контрольных пробах суспензии ацетонированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича значительно изменялась (0,023 и 0,021), а в контрольных пробах лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича изменения были незначительны (0,003 и 0,004), что еще раз подтверждает преимущества заявляемого способа.
Таким образом, использование стандартизированной лиофилизированной тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича дает более точные, достоверные и сопоставимые сведения об уровне лизоцимной активности исследуемых биологических объектов.
Литература
1. Алехина Г.П. Лизоцимная и антилизоцимная активность альгофлоры в водных биоценозах. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Оренбург, 1996. - 24 с.
2. Бухарин О.Б., Васильев Н. В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. - Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1974. - 208 с.
3. Ежов В.А., Троицкая Л.В., Рухлова Л.П., Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Г.В., Комарова Г.В., Синявина О.С., Жбанова В.И. Способ выделения комплекса литических ферментов. /Авт. Свидетельство №1755581 от 20 августа 1995, Бюл. №23.
4. Каграманова К.А., Ермольева З.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима. // Антибиотики. - 1966. - Т.11, №10. - С.9117-9119.
5. Купер Э. Сравнительная иммунология. - М.: Мир, 1980. - 422 с.
6. Немцова Н.В. Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов. // Автореф. дисс. доктора мед. наук. - Челябинск, 1998. - 38 с.
7. Определитель бактерий Берджи. // Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П., Стейли Дж., Уилльямса С. - М.: Мир, 1997. - Т.2, с.539.
8. Подборнов В.М., Бердыев А. Защитные механизмы иксодоидных клещей и их прокормителей. - Ашхабад: Ылым, 1991. - 240 с.
9. Соловых Г. Н. Система лизоцим-антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов. // Автореф. дисс. доктора биол.наук. - Челябинск, 1995. - 216 с.
10. Щербакова Л.Н., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Лизонец М.Н., Толстых П.И., Брюсов П.Г. Способ получения текстильного материала с иммобилизированными ферментами. /Авт.свидетельство №1811854 от 30 апреля 1993, Бюл. №16.
Claims (1)
- Способ определения лизоцимной активности биологических объектов, предусматривающий использование тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм № 2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича и вычисление лизоцимной активности, отличающийся тем, что используют тест-культуру Micrococcus lysodeicticus штамм № 2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, выращенную на жидкой питательной среде при температуре 27°С до оптической плотности 3,2-3,4 и подвергнутую лиофилизации.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005103265/13A RU2294373C2 (ru) | 2005-02-08 | 2005-02-08 | Способ определения лизоцимной активности биологических объектов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005103265/13A RU2294373C2 (ru) | 2005-02-08 | 2005-02-08 | Способ определения лизоцимной активности биологических объектов |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005103265A RU2005103265A (ru) | 2006-07-20 |
| RU2294373C2 true RU2294373C2 (ru) | 2007-02-27 |
Family
ID=37028357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005103265/13A RU2294373C2 (ru) | 2005-02-08 | 2005-02-08 | Способ определения лизоцимной активности биологических объектов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2294373C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469095C2 (ru) * | 2011-04-05 | 2012-12-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Способ определения активности лизоцима в слезной жидкости у детей раннего возраста |
| RU2786802C1 (ru) * | 2022-06-30 | 2022-12-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости |
| EP4458353A1 (en) | 2023-05-04 | 2024-11-06 | SkyLab AG | Anticariogenic synergetic composition for oral care |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1028334A1 (ru) * | 1981-03-20 | 1983-07-15 | Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии Им.Н.Ф.Гамалеи | Способ получени лизоцима |
| SU1041934A1 (ru) * | 1982-02-11 | 1983-09-15 | Московская Ордена Трудового Красного Знамени Ветеринарная Академия Им.К.И.Скрябина | Способ выделени лизоцима из молозива |
| SU1143778A1 (ru) * | 1983-04-08 | 1985-03-07 | Центральный Ордена Ленина Институт Усовершенствования Врачей | Способ определени содержани лизоцима |
| RU2170932C1 (ru) * | 2000-02-07 | 2001-07-20 | Сторожук Петр Григорьевич | Способ определения активности лизоцима слюны |
-
2005
- 2005-02-08 RU RU2005103265/13A patent/RU2294373C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1028334A1 (ru) * | 1981-03-20 | 1983-07-15 | Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии Им.Н.Ф.Гамалеи | Способ получени лизоцима |
| SU1041934A1 (ru) * | 1982-02-11 | 1983-09-15 | Московская Ордена Трудового Красного Знамени Ветеринарная Академия Им.К.И.Скрябина | Способ выделени лизоцима из молозива |
| SU1143778A1 (ru) * | 1983-04-08 | 1985-03-07 | Центральный Ордена Ленина Институт Усовершенствования Врачей | Способ определени содержани лизоцима |
| RU2170932C1 (ru) * | 2000-02-07 | 2001-07-20 | Сторожук Петр Григорьевич | Способ определения активности лизоцима слюны |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КАГРАМАНОВА К.А, ЕРМОЛЬЕВА З.В., Сравнительная характеристика методов определения лизоцима, Антибиотики, М., Медицина, 1966, T.11, №10, с.9117-9119. БУХАРИН О.В., ВАСИЛЬЕВ Н.В., Лизоцим и его роль в медицине, Томск, 1974, с.32-41. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469095C2 (ru) * | 2011-04-05 | 2012-12-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Способ определения активности лизоцима в слезной жидкости у детей раннего возраста |
| RU2786802C1 (ru) * | 2022-06-30 | 2022-12-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости |
| EP4458353A1 (en) | 2023-05-04 | 2024-11-06 | SkyLab AG | Anticariogenic synergetic composition for oral care |
| WO2024227855A1 (en) | 2023-05-04 | 2024-11-07 | SkyLab AG | Anticariogenic synergetic composition for oral care |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005103265A (ru) | 2006-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107314980B (zh) | 动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法 | |
| CN103237900B (zh) | 用于检测和定量微生物的方法 | |
| Büngener et al. | Fatal Streptococcus suis septicemia in an abattoir worker | |
| JPS58502082A (ja) | 細菌及び菌類の検出のための方法及び試薬 | |
| Singh et al. | Evaluation of biomass | |
| Kühn et al. | The PhP RS system. A simple microplate method for studying coliform bacterial populations | |
| CA2723402A1 (en) | Method for characterising the biological activity of helminth eggs, in particular trichuris eggs | |
| RU2294373C2 (ru) | Способ определения лизоцимной активности биологических объектов | |
| ITVR970122A1 (it) | Metodo colorimetrico per valutare la sensibilita' dell'helicobacter py lori a sostanze antimicrobiche e kit per attuare tale metodo | |
| CN100547388C (zh) | 一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法及试剂 | |
| CN111157463B (zh) | 血浆中乙酰螺旋霉素含量的检测方法 | |
| CN108277290A (zh) | 金黄色葡萄球菌干粉化lamp快速检测试剂盒 | |
| BROVKO et al. | Quantitative assessment of bacterial contamination of raw milk using bioluminescence | |
| Fung | Overview of rapid methods of microbiological analysis | |
| RU2820323C1 (ru) | Способ автоматизированного определения концентрации активного лизоцима в биологических образцах | |
| KR20170125232A (ko) | 포도당 측정기를 이용한 미생물 기반 항생제 간이 검사법 | |
| WO2022167597A1 (en) | Automatic phagogram | |
| RU2686337C1 (ru) | Способ определения противомикробной активности цельной сыворотки и фракции её антимикробных пептидов | |
| CN113324963A (zh) | 一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器及其在检测四环素类抗生素中的应用和检测方法 | |
| RU2778997C1 (ru) | Питательная среда для дифференциации парагемолитических вибрионов | |
| RU2325645C1 (ru) | Способ определения содержания бактериальных эндотоксинов с использованием тал-теста, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов | |
| Patel et al. | Techniques for Detection and Enumeration of Microorganisms in Seafood | |
| RU2688117C1 (ru) | Способ оценки про- и антимикробных свойств проб | |
| CN110117532A (zh) | 一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法 | |
| CN118731121B (zh) | 一种基于纳米毛细管的pH传感器的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070209 |