CN113324963A - 一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器及其在检测四环素类抗生素中的应用和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器及其在检测四环素类抗生素中的应用和检测方法。该生物传感器源自赤子爱胜蚓的体腔液，该体腔液在370nm激发下发出绿色荧光，荧光发射峰位于520nm，并会在四环素类抗生素的作用下发生猝灭。本发明同时还公开了该生物传感器在选择性检测四环素类抗生素方面的应用。检测过程中随着加入的四环素类抗生素浓度的增加，520nm处的发射峰的荧光强度降低，由此根据荧光的猝灭程度可以检测出样品中四环素类抗生素的含量。本发明提供的检测四环素类抗生素的方法与传统方法相比，具有高选择性、高灵敏性且生物学无毒且相容的优点。

Description

一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器及其在检测四环素类抗生 素中的应用和检测方法

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器及其制备方法，以及该生物传感器用于检测四环素类抗生素的方法。

背景技术

四环素类抗生素是一类广谱抗生素，它通常对大多数细菌都具有良好的抑菌灭菌效果，因此被广泛运用于医治多种疾病，也可以被用作兽药，起到促进动物生长和预防疾病等作用。但近些年来，四环素类抗生素在畜禽养殖过程中的违规滥用现象十分严重，从而导致它们充斥于在动物源性食物中。此外，在畜禽养殖过程中，部分四环素类抗生素不能被动物吸收，以母体的形式排至体外，在土壤及淡水环境中积累，且很难降解，并且有可能转化为更具潜在毒性的物质，这会危及环境资源，还会导致细菌和有害微生物产生抗性基因，这是对生态系统和人体健康的潜在威胁。

目前，已经报道了许多关于四环素类抗生素的分析及检测方法，如微生物法、酶联免疫吸附法、液相及其联用技术等。但这些方法存在一定的局限性，微生物分析方法快速、廉价、操作简便，但灵敏度低，特异性差。酶联免疫吸附法和液相及其联用技术分析方法具有高灵敏度和良好的特异性。仪器分析方法准确，但需要昂贵的设备和复杂的样品预处理过程，对操作人员的要求较高。环境样品中抗生素的检测难点在于抗生素种类繁多且浓度常处于痕量水平，环境基质复杂，前处理方法繁琐，检测方法灵敏性低等。

基于上述问题，开发一种高灵敏度、高准确性、低成本的检测手段是保证抗生素残留检测的关键。荧光分析法具有成本低、响应快、专一性强和准确度高等优点。近年来，已经合成了各种荧光探针用于四环素类抗生素的检测，但是尚未有研究报道利用从蚯蚓中提取的荧光物质用于四环素类抗生素的检测。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器及其在四环素类抗生素检测中的应用，能够快速有效的对样品中的四环素进行检测。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种蚯蚓体腔液在四环素类抗生素检测中的应用。

进一步地，蚯蚓体腔液为荧光物质，且会在四环素类抗生素的作用下发生猝灭。

进一步地，四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素或强力霉素。

一种蚯蚓体腔液的提取方法，包括以下步骤：

(1)将10％乙醇、0.01MPBS缓冲液和2.5g/L的EDTA混合，配制得到刺激液；上述成分的浓度均为其在刺激液中的终浓度；

(2)将成年的赤子爱胜蚓称重洗涤擦干后，放入装有与蚯蚓等体积的刺激液的培养皿中，收集蚯蚓排出的体腔液并-80℃冷冻保存备用。

上述方法制备的蚯蚓体腔液的生物传感器具有稳定光学性能，通过高光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察蚯蚓体腔液，发现观察蚯蚓体腔液含有两种细胞，其中只有颗粒细胞具有自发荧光，荧光强度与囊泡大小呈正比，在不同的激发下，能够发出紫色、绿色、黄色和红色的荧光，说明它具有激发依赖性。

此外所述生物传感器高选择性、高灵敏度性地分析检测四环素类抗生素，当加入的四环素类抗生素浓度的增加，蚯蚓体腔液在520nm处的发射峰的荧光强度降低，由此根据荧光的猝灭程度达到检测四环素类抗生素的目的。

一种用于四环素类抗生素检测的生物传感器，其是基于蚯蚓体腔液制备而成。

一种通过蚯蚓体腔液检测四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：

(1)将待检样品预处理，以10000r/min离心后收集上清液，然后加入四环素类抗生素溶液；

(2)权1或权2所述的蚯蚓体腔液以10000r/min离心10min，收集上清液，然后将其与步骤(1)加标后的溶液等体积混合，孵育1min后，于370nm的激发条件下测定荧光光谱，并记录位于520nm处的荧光强度，并计算相对荧光强度；

进一步地，标准曲线的构建过程如下：

(1)配置浓度为250μmol/L的四环素类抗生素标准溶液，用pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液和双蒸水将四环素类抗生素稀释为0.5μmol/L、0.75μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L，以及75μmol/L；

(2)取出-80℃冷冻备用的蚯蚓体腔液，10000r/min的条件下离心10min，随后收集上层溶液作为蚯蚓体腔液检测液；

(3)分别将1mL上述不同浓度的四环素类抗生素溶液与1mL蚯蚓体腔液检测液混合摇匀；

(4)选择在370nm的激发下测定蚯蚓体腔液检测液和不同浓度四环素类抗生素反应后的荧光光谱，记录位于520nm处的荧光强度，根据计算加入的四环素类抗生素浓度的含量和相对应光强度变化值之间的关系建立四环素类抗生素检测的标准曲线，得到蚯蚓荧光检测四环素类抗生素体系的检测范围及线性方程。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的蚯蚓体腔液的提取方法简单、绿色。

2、本发明提供的以蚯蚓体腔液构成的生物传感器具有良好的光学性能，自发荧光，可以作为荧光探针直接检测四环素类抗生素。

3、本发明提供的蚯蚓体腔液作为荧光探针直接检测四环素类抗生素与传统检测方法相比，不需要昂贵的仪器和专业培训的人员来进行操作即可检测。同时较其他使用化学材料检测抗生素的荧光法相比，该生物传感器直接提取于生物，不需要繁琐的合成，检测过程简单、省时省力且无污染。

附图说明

图1为蚯蚓体腔细胞在激光共聚焦显微镜下的成像；

图2为蚯蚓体腔细胞在成像流式细胞仪的散点图；

图3为蚯蚓体腔细胞中不同颗粒度的颗粒细胞的荧光图像；

图4为蚯蚓体腔液检测不同浓度四环素抗生素的荧光发射光谱图；

图5为蚯蚓体腔液检测四环素抗生素的线性关系图；

图6为不同溶液pH与蚯蚓体腔液检测四环素抗生素的关系图；

图7为蚯蚓体腔液检测四环素抗生素的选择性柱状图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

一种基于蚯蚓体腔液的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将10％乙醇、0.01MPBS缓冲液和2.5g/L乙二胺四乙酸(EDTA)混合配制得到刺激液。

(2)将成年的赤子爱胜蚓称重洗涤擦干，放入装有与蚯蚓等体积的刺激液的培养皿中。

(3)将排出的体腔液用移液枪收集至离心管中，-80℃冷冻备用。

实施例2

将实施例1提取制备的蚯蚓体腔液生物传感器使用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察(图1-3)。结果显示，蚯蚓体腔液含有两种细胞，其中只有颗粒细胞具有自发荧光，荧光强度与囊泡大小呈正比，在不同的激发下，能够发出紫色、绿色、黄色和红色的荧光，说明它具有激发依赖性。

实施例3

将实施例1制备的蚯蚓体腔液的生物传感器检测四环素类抗生素，包括以下步骤：

(1)先配置好250μmol/L的四环素类抗生素标准溶液，用PBS缓冲液(pH＝7.2-7.4)和双蒸水将四环素类抗生素稀释为以下浓度：0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75μmol/L。

(2)取出-80℃冷冻备用的蚯蚓体腔液，10000r/min的条件下离心10min，随后收集上层溶液作为蚯蚓体腔液检测液。

(3)分别将1mL上述不同浓度的四环素类抗生素溶液与1mL蚯蚓体腔液检测液混合摇匀，1min后开始在不同激发波长下扫描荧光光谱，测量450-650nm范围内的荧光光谱，以获得与最强荧光强度对应的最佳发射波长。

(4)选择在370nm的激发下测定蚯蚓体腔液检测液和不同浓度四环素类抗生素反应后的荧光光谱，记录位于520nm处的荧光强度，根据计算加入的四环素类抗生素浓度的含量和相对应光强度变化值之间的关系建立四环素类抗生素检测的标准曲线，得到蚯蚓荧光检测四环素类抗生素体系的检测范围及线性方程。(图4-5)。

实施例4

分别配制pH为2-8的PBS-EDTA缓冲液，调整其缓冲范围，优化反应体系中的pH。向荧光比色皿中添加蚯蚓体腔液检测液和四环素类抗生素，在370nm的激发下记录发射光谱中520nm处的荧光强度，并计算相对荧光强度，观察不同pH下相对荧光强度的大小。从实验结果中可以看出，检测体系在酸性范围内荧光强度偏低，到达中性条件时趋于稳定，可以适用于较宽的pH范围，本申请选择四环素类抗生素测定pH条件为中性(7.2-7.4)(图6)。

实施例5

分别配制200μmol/L浓度的不同抗生素溶液，包括四环素(TC)、阿奇霉素(AZM)、金霉素(CTC)、庆大霉素(GM)、氨苄青霉素(AMP)、土霉素(OTC)、羧苄青霉素钠(CB)、氯霉素(CHL)、链霉素(STR)、氧氟沙星(OFX)、强力霉素(DOX)、环丙沙星(CIP)和氟苯尼考(FFC)。向荧光比色皿中添加蚯蚓体腔液检测液和不同浓度四环素类抗生素，在370nm的激发下记录发射光谱中520nm处的荧光强度，并计算相对荧光强度，观察不同抗生素对蚯蚓荧光提取液的猝灭作用，以此比较蚯蚓荧光提取液对四环素类抗生素的选择性检测。如图7，与其他抗生素相比，只有四环素类抗生素的相对荧光强度较高，说明只有四环素类抗生素可以猝灭蚯蚓荧光提取液，因此，利用蚯蚓荧光提取液特异性检测四环素类抗生素是可行的。

实施例6

为了评估本发明实施例提供的检测四环素类抗生素方法的实用性，对实际水环境中四环素进行了加标回收。本发明实施例在各参数最优条件下，检测了河水、湖水、正常人血清中四环素的浓度。

包括以下步骤：

(1)将人血清样品以10000r/min的转速下离心3次，每次10min。将上清液稀释60倍并加入指定量的四环素(5μmol/L、25μmol/L、75μmol/L)，获得人血清样品待检测液；

(2)河水和湖水经10000r/min离心，然后收集上清液，最后透过微孔滤膜，加入指定量的四环素(5μmol/L、25μmol/L、75μmol/L)，分别获得河水、湖水样品待检测液；

(3)采用本发明实施例提供的检测四环素类抗生素的方法，在370nm的激发下记录发射光谱中520nm处的荧光强度，并计算相对荧光强度，然后结合实施例3中的标准曲线拟合出的线性方程，计算出实际样品中的四环素类抗生素的浓度，检测结果如表1所示，表明使用该方法的样品回收率范围在97.4％-102.6％，RSD值不足4％，符合实际定量测定标准，由此说明本发明本发明实施例提供的方法能有效应用于四环素类抗生素的检测。

表1实际样品中四环素的检测(n＝5)

Claims (7)

1.一种蚯蚓体腔液在四环素类抗生素检测中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蚯蚓体腔液为荧光物质，且会在四环素类抗生素的作用下发生猝灭。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素或强力霉素。

4.一种蚯蚓体腔液的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将10～20％乙醇、0.01～0.1MPBS缓冲液和2.0～3.0g/L的EDTA混合，配制得到刺激液；

(2)将蚯蚓称重洗涤擦干后，置于刺激液中，收集蚯蚓排出的体腔液并于-80℃冷冻保存备用。

5.一种用于四环素类抗生素检测的生物传感器，其特征在于，其是基于蚯蚓体腔液制备而成。

6.一种通过蚯蚓体腔液检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将待检样品预处理，以8000～10000r/min离心后收集上清液，然后加入四环素类抗生素溶液；

(2)将权4或权5的蚯蚓体腔液以8000～10000r/min离心10～15min，收集上清液，然后将其与步骤(1)加标后的溶液等体积混合，孵育1～5min后，于370nm的激发条件下测定荧光光谱，记录位于520nm处的荧光强度，并计算相对荧光强度；

(3)然后根据构建的标准曲线和线性方程，即可计算出待检样品中四环素类抗生素的加标回收浓度。

7.根据权利要求6所述的通过蚯蚓体腔液检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述标准曲线的构建过程如下：

(1)配置浓度为250μmol/L的四环素类抗生素标准溶液，用pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液和双蒸水将四环素类抗生素稀释为0.5μmol/L、0.75μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L，以及75μmol/L；

(2)取出-80℃冷冻备用的蚯蚓体腔液，10000r/min的条件下离心10min，随后收集上层溶液作为蚯蚓体腔液检测液；

(3)分别将1mL上述不同浓度的四环素类抗生素溶液与1mL蚯蚓体腔液检测液混合摇匀；

(4)选择在370nm的激发下测定蚯蚓体腔液检测液和不同浓度四环素类抗生素反应后的荧光光谱，记录位于520nm处的荧光强度，根据计算加入的四环素类抗生素浓度的含量和相对应光强度变化值之间的关系建立四环素类抗生素检测的标准曲线，得到蚯蚓荧光检测四环素类抗生素体系的检测范围及线性方程。

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