CN109369570B - 一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用，属于小分子荧光探针技术领域。该探针的分子式为C6H2N3O2BrS，具有如下所示结构：
Figure DDA0001889914570000011
本发明设计的Cys荧光探针，制备简单、合成路线成熟，并实现了Cys的专一性快速检测，抗其它分子干扰能力强。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和离体生物细胞内Cys分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。

Description

一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
半胱氨酸(Cys)属于天然氨基酸的一种，在人体内生理机能方面起着重要的生物化学作用，主要包含：生物催化、蛋白质修饰和针对外源物质进行解毒作用等生理作用。体内Cys含量的不足非常容易诱发多种疾病的产生，如：当Cys在体内含量不足时，可能会诱发儿童发育缓慢、头发褪色、水肿、疲乏、肝脏受到损伤、肌无力、肥胖以及皮肤病等众多疾病。所以，该生物活性小分子在人体内的作用非常关键；对生物体内Cys的含量进行检测有着非常重要的理论和实践意义。
近年来，一些传统的Cys检测方法主要包括：高效液相法、电泳法、电化学分析法、紫外可见光谱法、傅立叶转换红外光谱法、质谱分析法等，但是这些方法难以实现实时监测。而近年来随着有机小分子荧光探针的长足发展，该类检测方法显示出了优越的特点，比如：灵敏度高、操作简便、重现性好、膜透性好、原位检测等优点，这使得该方法逐渐成为疾病诊断领域不可或缺的检测方法，已被越来越多地应用于多种复杂生物、环境样品中的活性小分子Cys的可视化分析及成像研究。因此，构建新型的小分子荧光探针应用于Cys的成像分析和研究中具有非常重要的科学意义和应用价值。
在生物体内，存在着大量的不同类型的干扰离子或分子，尤其是需要对同类氨基酸具有选择性，如：HCy和GSH。因此，构建在复杂体系内能够专一性的对体内Cys进行识别是探针分子设计的关键所在，也就是说探针分子应该具有较好的专一性。这也就是目前分子探针存在的普遍问题——专一性较差，本专利通过对探针分子的构建，利用电子效应来提高化合物对Cys的响应速度，实现了针对Cys的专一性检测。
发明内容
结合小分子荧光探针在专一性识别Cys方面存在的科学问题，本发明通过分子设计，构建了一种具有响应快和选择性高的Cys荧光探针。本发明所采用的技术方案是：
一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针，其分子式为C6H2N3O2BrS，具有如下所示结构：
Figure BDA0001889914550000021
一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针的制备方法，探针的合成通过一步进行，包括以下步骤：将化合物1(0.34mmol，100.0mg)溶解于浓硝酸(68％，5.0mL)中，回流2h，然后倒入10.0mL冰水中过滤得粗产品，柱层析分离得到所述探针(NBDS-Cys)，化合物1的结构式如下所示：
Figure BDA0001889914550000022
本发明所述探针化合物(NBDS-Cys)的合成路线如下：
Figure BDA0001889914550000023
本发明所述探针化合物(NBDS-Cys)的响应机理如下：
Figure BDA0001889914550000024
本发明所述识别半胱氨酸的小分子荧光探针，可用于水环境与离体生物细胞体系中Cys的传感分析；所述的传感分析包含荧光分析和成像分析。
本发明的优点：(1)合成简单，且后处理过程相对简单；(2)本发明实现了Cys分子探针的专一性快速检测，抗其它分子干扰能力强，尤其是可以专一性识别Cys。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和生物细胞内Cys分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的Cys分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例一探针(NBDS-Cys)的1H NMR图谱；
图2是本发明探针(NBDS-Cys)在Cys加入前后溶液的颜色变化，a)探针(NBDS-Cys)在Cys加入前后的颜色变化，b)探针(NBDS-Cys)在Cys加入前后在紫外灯照射(365nm)下的颜色变化；
图3是本发明探针(NBDS-Cys)，以PBS:DMSO(4:1)为溶剂465nm为激发光，探针(NBDS-Cys)(10μM)随着Cys逐渐加入荧光强度变化情况；
图4是本发明探针(NBDS-Cys)，以PBS:DMSO(4:1)为溶剂465nm为激发光，探针(NBDS-Cys)(10μM)，Cys(20eq.)随时间变化的荧光强度谱图；
图5是本发明探针(NBDS-Cys)选择性柱状图数据，以PBS:DMSO(4:1)为溶剂465nm为激发光，探针(NBDS-Cys)(10μM)对不同离子和分子的选择性柱状谱图：a)1:Cys；2:GSH；3:Hcy；4:Ala；5:Arg；6:Asp；7:Glu；8:His；9:Ile；10:Phe；11:Ser；12:Thr；13:Trp；14:Val；b)1:Cys；2:GSH；3:Hcy；4:Al3+；5:Ca2+；6:Co2+；7:Cu2+；8:Mg2+；9:S2-；10:SO3 2-；11:Ni2+；12:Zn2+；
图6是本发明探针(NBDS-Cys)应用与细胞中对内源性Cys进行荧光成像，其中，a)探针浓度为20μM加入到HeLa细胞中培养0.5h后明场图，b)a)的荧光成像图，c)将a)和b)成像图叠加；d)将1mM的NEM加至育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养1h，然后加入20μM探针孵育0.5h，明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；e)将d)用蓝光进行激发观得到成像图；f)将d)和e)成像图叠加；g)将600μM的Cys加至育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养1h，然后加入20μM探针孵育0.5h，明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；h)将g)用蓝光进行激发观得到成像图；i)将g)和h)成图像叠加。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
实施例1
探针化合物(NBDS-Cys)的合成：
Figure BDA0001889914550000041
将化合物1(0.34mmol，100.0mg)溶解于浓硝酸(68％，5.0mL)中，回流2h，然后倒入冰水(10.0mL)中过滤得粗产品，用硅胶柱进行分离得到探针化合物(NBDS-Cys)，硅胶颗粒大小为200-300目，产率为60％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.59(d,J＝8.0Hz,1H),δ8.28(d,J＝8.0Hz,1H)。该探针的1H NMR图谱见图1。
实施例2
探针化合物(NBDS-Cys)随Cys加入前后及在紫外灯照射(365nm)下的可视化研究：
取探针(NBDS-Cys，10mg)溶于DMF的溶液中，观察其在Cys加入前后溶液的颜色变化，a)探针(NBDS-Cys)在Cys加入前后的颜色变化，b)探针(NBDS-Cys)在Cys加入前后在紫外灯照射(365nm)下的颜色变化。颜色变化如图2所示。
实施例3
探针化合物(NBDS-Cys)随Cys加入当量的增加荧光谱图的变化：
取实施例1制备的探针(NBDS-Cys)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量(0-100eq.)的Cys标准溶液，用PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.5)与DMSO体积比为4:1的溶液稀释至3mL，测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图3可见，随着Cys加入当量的增加荧光逐渐增强。
实施例4
探针化合物(NBDS-Cys)随时间变化的荧光谱图的变化：
从实施例3中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入·Cys(10eq.)标准溶液，用DMSO/PBS(4:1,v/v)稀释至3mL(10μM)，测量其荧光性质。荧光光谱如图4所示。由图3可见，加入探针(NBDS-Cys)后，直接加入Cys，随时间的增加荧光强度迅速达到最大，实现了Cys的快速检测。
实施例5
探针化合物(NBDS-Cys)对不同离子的选择性：
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的Cys标准溶液，20min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由图5可以发现，其他干扰离子对探针化合物(NBDS-Cys)的荧光几乎没有影响，而Cys溶液的加入使探针化合物(NBDS-Cys)的荧光显著增强。因此，该探针可以针对Cys进行专一性检测。
实施例6
探针化合物(NBDS-Cys)荧光探针对细胞内源性Cys荧光成像：
我们将本发明探针应用与HeLa细胞中对内源性的Cys进行荧光成像应用(图6)具体操作步骤如下：a)将20μM探针DMF溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；b)将a)用蓝光进行激发观得到成像图；c)将a)和b)图成像叠加；d)将1mM的NEM加至育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养1h，然后加入20μM探针孵育0.5h，明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；e)将d)用蓝光进行激发观得到成像图；f)将d)和e)图成像叠加；g)将600μM的Cys加至育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养1h，然后加入20μM探针孵育0.5h，明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；h)将g)用蓝光进行激发观得到成像图；i)将g)和h)图成像叠加；说明此荧光探针可以对内源性的Cys进行荧光成像。
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (1)

1.一种快速专一性识别半胱氨酸的小分子荧光探针的应用，其特征在于，小分子荧光探针分子式为C6H2N3O2BrS，具有如下所示结构：
Figure 956457DEST_PATH_IMAGE001
；用于水环境与离体生物细胞体系中Cys的传感分析；所述的传感分析包 含荧光分析和成像分析。
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