CN110161151A - 一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法 - Google Patents

一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通过检测肌酐和1‑甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法，属于法医学技术领域。本发明的通过检测肌酐和1‑甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法，包括实验动物心血和骨骼肌中肌酐和1‑MH含量检测方法开发，水中尸体动物模型建立，检测水中尸体心血和骨骼肌中肌酐和1‑MH的含量，绘制出肌酐降解曲线和1‑MH生成曲线，通过曲线推断水中尸体浸没时间5个步骤。本发明的方法简洁快速、可重复性强、准确率高。

Description

一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间 的方法
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法。
背景技术
准确的推断死亡时间在刑事侦查方面有重要的意义，死后24小时内的早期死亡时间推断方法已经日趋完善，如根据尸温推断死亡时间，根据早期尸体现象推断死亡时间，根据体液的离子浓度进行推断，或者根据生物大分子在尸体中的降解规律进行推断等。晚期死亡时间的推断难度较大，目前的研究主要集中于根据尸体晚期腐败现象进行推断。法医昆虫学根据嗜尸性昆虫的生长规律进行推断。随着高通量测序技术的发展，死亡微生物组学研究通过研究尸体不同部位微生物群落的演替过程，越来越受到法医工作者的重视。
水中尸体由于其特殊的保存环境，尸体腐败过程受到水体环境、水温、水流冲击、水生生物等一系列条件的影响，使得一些传统的推断死亡时间的方法不再适用，需要借助特殊的方法来推断死后浸没时间(PMSI)。
沈敏等用豚鼠尸体产生的乙醇和正丁醇含量判断溺死时间。于晓军等用水中尸体软组织生物力学形状的时序性变化推断死亡时间。Reijnen，Guido等通过对水中尸体的腐败情况进行评分来推测死亡时间。Byard，RW等也探讨了腐败对于淡水河流中尸体死后经过时间的影响。然而，目前采用的根据尸体沉浮时间和水中尸体现象来粗略推断晚期死亡时间的方式，随着死后时间的延长，受气温、水温、自溶、腐败等众多体内外因素的影响，作出准确的死亡时间推断更加困难。
在日常进行的法医解剖尸检案例中，检测出了一种水中尸体特有的小分子物质1-甲基海因(1-methylhydantoin，1-MH)又称1-甲基乙内酰脲，化学名称1-甲基-2，4-咪唑啉二酮，其结构式如图1所示。文献报道1-MH是肌酐在厌氧微生物参与下的降解产物，其生成机制如图2所示。同时，1-MH具有分子结构比较稳定，色谱行为良好。
刘俊亭等在离体骨骼肌1-甲基海因的相对含量变化中描述了早期的实验研究在河水中培养家兔离体骨骼肌，能够检测出1-MH，且其含量随着骨骼肌浸泡时间的延长呈现幂函数关系，但是其动物模型相对于实际水中尸体案例并不精确，不能够全面的模拟水中尸体的整体腐败行为；检测方法的灵敏度有待提高；且仅仅关注了1-MH产生情况的单一生物指标，其方法存在误差。
因此，研制开发一种更快速准确的推断水中尸体浸没时间的方法是亟待解决的新课题。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法。本发明中的方法通过用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS/MS)检测大鼠水中尸体动物模型心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的含量，建立不同水体温度下肌酐和1-MH含量与水中尸体浸没时间的数学模型，从而实现通过检测肌酐和1-MH含量来推断水中尸体浸没时间的方法。该方法快速、简便，能够准确的推断死亡时间，在刑事侦查方面有重要的意义。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法，包括如下步骤。
(1)实验动物心血和骨骼肌中肌酐和1-MH含量检测方法开发；
(2)建立不同温度和水体环境下水中尸体动物模型；
(3)用(1)中建立的方法检测(2)中建立的模型的水中尸体心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的含量；
(4)根据(3)中水中尸体心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的含量，绘制出肌酐降解曲线(C肌酐-PMSI曲线)和1-MH生成曲线(C1-MH-PMSI曲线)；
(5)通过(4)中得到的C肌酐-PMSI曲线和C1-MH-PMSI曲线推断水中尸体浸没时间。
所述(1)中实验动物心血和骨骼肌中肌酐和1-MH含量检测方法的建立：购置肌酐、1-MH对照品，建立高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)检测方法，采用的检测方法条件如下：Agilent 1260-6420三重串联四级杆液质联用仪；色谱柱：Agilent Zorbax SB C18(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：0.1％甲酸溶液：乙腈-(30：70v/v)；流速0.20mL/min；进样体积1μL；ESI离子源正离子模式；干燥气温度350℃；干燥气流速10L/min；雾化器压力50psi；毛细管出口电压180V；碰撞电压30V；多反应监测(MRM)模式；肌酐检测的离子对为m/z 114.0→86.2，m/z 114.0→44.2；1-MH检测的离子对为m/z 115.1→87.0，m/z 115.1→44.0；样品处理过程：取大鼠心血100μL或将0.1g大鼠骨骼肌匀浆后加入500μL乙腈，混合3min，用高速离心机1 3000r/min离心10min，取上清液200μL进样分析。
所述(2)中不同温度和水体环境下水中尸体动物模型建立如下：将实验用大鼠分为自然淡水环境死后抛尸入水组和自然淡水控温死后抛尸入水组。在平均气温为25℃左右(夏季)条件下，取雄性SD大鼠90只，随机分为15组，每组6只。用颈椎脱位的方法处死大鼠，在自然淡水环境中将大鼠分别放置24、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204h后捞出进行解剖取材，并用全自动温湿度记录仪连续采集实验能过程中水体温度和附近的气温。浸泡过程中逐一打捞解剖取大鼠心血、肝、脾、肺、肾、双腿腓肠肌(骨骼肌)、玻璃体液，并于-80℃保存检材；自然淡水控温死后抛尸入水组是将河水放置于大型塑料容器中，并用空调控制水温在25℃，将大鼠颈椎脱位处死后在恒温条件下浸泡。实验动物数目、分组情况和取材时间点同自然淡水环境组。浸泡过程中逐一打捞解剖取大鼠心血、肝、脾、肺、肾、双腿腓肠肌(骨骼肌)、玻璃体液，并于-80℃保存检材。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
1、检测方法简洁快速，取材后检测时间在10min之内。
2、该方法可重复性强，适合所有配备液质联用仪的办案单位进行检测。
基于本方法的精度、准确性、稳定度均较高，说明本发明的方法可重复性强。能够适用于不同法医检验实验室，不同仪器间的平行检测，均具有良好的重现性。
3、可使用的检材包括心血、骨骼肌等生物样品，适合不同的案情需要进行取材。
4、该方法推断水中尸体经过时间准确率高，且适用于0～180h(0～7.5d)时间范围内的PMSI推断。
附图说明
图1是1-甲基海因的化学结构图。
图2是肌酐向1-甲基海因的转化示意图。
图3是肌酐和1-MH的典型色谱质谱图。
图4是控温死后抛尸入水组肌酐降解曲线和1-MH生成曲线(即C1-MH-PMSI曲线，平均水温25℃，黑色为肌酐，红色为1-MH)。
图5是自然淡水死后抛尸入水组肌酐降解曲线和1-MH生成曲线(即C1-MH-PMSI曲线，7月沈阳平均水温25℃，黑色为肌酐，红色为1-MH)。
具体实施方式
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1实验动物心血和骨骼肌中肌酐和1-MH含量方法开发及方法学验证。
(1)仪器与试药。
1.1仪器与参数设置。
1260-6420三重串联四级杆液质联用仪(美国Agilent公司)；数据采集采用MassHunter B.07.00工作站(美国Agilent公司)；涡旋混合仪(德国IKA公司)；高速离心仪(德国赛默飞世尔科技有限公司)。
1.2试剂与材料。
标准品：肌酐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G1704016，纯度≥99.0％)；1-甲基海因(Sigma-Aldrich公司，批号：STBF9322V，纯度≥98％)；甲巯咪唑(Sigma-Aldrich公司，内标，纯度≥99％)。
(2)方法与结果。
2.1色谱-质谱条件。
2.1.1色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB C18(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相:0.1％甲酸溶液：乙腈-(30:70v/v)；流速0.20mL/min；柱温30℃；进样体积5μL。
2.1.2质谱条件采用ESI离子源正离子模式；干燥气温度350℃；干燥气流速10L/min；雾化器压力50psi；多反应监测(MRM)模式。肌酐检测的离子对为m/z 114.0→86.2，m/z114.0→44.2；1-MH检测的离子对为m/z115.1→87.0，m/z 115.1→44.0。甲巯咪唑检测的离子对为m/z 115→42.1。
2.2溶液制备。
2.2.1对照品储备液。
精密称取肌酐、1-甲基海因对照品适量，分别置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制成约含对照品各1mg·mL-1的储备液。
2.2.2内标储备液及工作液。
精密称取甲巯咪唑(内标)适量，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制成约1mg·mL-1的内标储备液。精密量取内标储备液，临用前用甲醇稀释成质量浓度为1μg·mL-1的内标工作液。
2.2.3线性范围工作液制备。
将对照品储备液用甲醇逐级稀释，制成肌酐浓度分别为0.1、2.0、10.0、20.0、100.0、200.0μg·mL-1的标准对照品线性范围工作液，及1-甲基海因的浓度分别为0.2、2.0、10.0、20.0、100.0、200.0μg·mL-1的标准对照品线性范围工作液。
2.3标准系列样品及质控样品的制备。
分别精密量取“2.2.3”项下系列对照品工作液10μL，加入90μL空白血浆中，或加入0.09g大鼠骨骼肌匀浆液，制成含肌酐质量浓度为0.01、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0μg·mL-1的标准系列样品，及含1-甲基海因质量浓度为0.02、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0μg·mL-1的标准系列样品。
精密量取对照品工作液适量，置于100μL空白血浆中，制成低、中、高3个浓度水平的质控(QC)样品，使得低浓度在LLOQ的2倍，中浓度点为线性的中间浓度，高浓度为线性最高浓度的75％。
2.4样品预处理。
取大鼠心血100μL或将0.1g大鼠骨骼肌匀浆，置于1.5mL离心管中，加入1μg·mL-1内标工作液10μL，后加入500μL沉淀剂[乙腈/甲醇(4:1v/v)]，涡旋混合3min，用高速离心机1 3000r/min离心10min，取上清液200μL进样分析，进样体积5μL。
2.5方法验证。
2.5.1线性范围与最低定量限(LLOQ)。
取“2.3”项下的标准系列样品，按照“2.4”项下方法进行处理，按照“2.1”项下的色质谱条件进行检测。分别以标准系列样品中肌酐和1-甲基海因的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，以样品中被分析物的质量浓度(X)为横坐标，进行线性回归。得到血中肌酐的线性回归方程为Y＝2777.2X+576.36(R2＝0.9988)，在0.01～20.0μg·mL-1范围内线性关系良好，LLOQ为10ng·mL-1；肌肉中肌酐的线性回归方程为Y＝523.01X+2367.1(R2＝0.9994)，在0.01～20.0μg·mL-1范围内线性关系良好，LLOQ为10ng·mL-1。血中1-甲基海因的线性回归方程为Y＝62.674X+3.3466(R2＝0.9989)，在0.02～20.0μg·mL-1范围内线性关系良好，LLOQ为20ng·mL-1；肌肉中1-甲基海因的线性回归方程为Y＝25.878X+13.748(R2＝0.9996)，在0.02～20.0μg·mL-1范围内线性关系良好，LLOQ为20ng·mL-1。
2.5.2精密度与准确度。
用空白大鼠血浆或者大鼠骨骼肌匀浆配制低、中、高3个质量浓度质控样品各6份，按照“2.4”项下方法进行处理，按照“2.1”项下的色质谱条件进行检测，分别考察日内和日间精密度与准确度，结果见表1和表2。结果表明，对各化合物，低、中、高3个质量浓度的日间和日内RSD均小于10％。
基于本方法的精度、准确性、稳定度均较高，说明本发明的方法可重复性强。能够适用于不同法医检验实验室，不同仪器间的平行检测，均具有良好的重现性。
2.5.3回收率和基质效应。
配制低、中、高3个浓度的质控样品，每个浓度平行制备6份，按“2.4”项下方法处理后进行分析，记录待测物与内标的响应比值为C。空白大鼠血浆或者大鼠骨骼肌匀浆处理后添加对照品工作液，配制低、中、高3个浓度的溶液，每个浓度平行制备6份，同法进行分析，记录待测物与内标的响应比值为B。同浓度的对照品工作液，不经处理直接进样，同法进行分析，记录待测物与内标的响应比值为A。基质效应用B/A×100％进行计算，提取回收率用C/A×100％进行计算。结果发现，3个浓度的质控样品之间的基质效应无明显差异，不影响检测。肌酐和1-甲基海因的回收率均在90％～110％之间，结果见表1和表2。
表1.心血中肌酐和1-MH的方法学验证
表2.骨骼肌中肌酐和1-MH的方法学验证
2.5.4稳定性考察。
分别考察样品在室温条件下储存24h的短期稳定性，以及经3次冷冻-解冻循环后的稳定性，采用冻融样品与新鲜制备的样品对照获得。血浆样品中被分析物的稳定性均在低、中、高3个浓度下考察。结果见表1和表2，血浆样品在上述条件下均保持稳定，RSD<10％。
采用上述方法测定大鼠心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的典型色谱图见图3。实施例2通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法。
具体包括以下步骤：
(1)建立不同温度和水体环境下大鼠水中尸体动物模型。
将实验用大鼠分为自然淡水环境死后抛尸入水组和自然淡水控温死后抛尸入水组。在平均气温为25℃左右(夏季)条件下，取雄性SD大鼠90只，随机分为15组，每组6只。用颈椎脱位的方法处死大鼠，在自然淡水环境中将大鼠分别放置24、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204h后捞出进行解剖取材，并用全自动温湿度记录仪连续采集实验能过程中水体温度和附近的气温。浸泡过程中逐一打捞解剖取大鼠心血、肝、脾、肺、肾、双腿腓肠肌(骨骼肌)、玻璃体液，并于-80℃保存检材。
自然淡水控温死后抛尸入水组是将河水放置于大型塑料容器中，并用空调控制水温在25℃，将大鼠颈椎脱位处死后在恒温条件下浸泡。实验动物数目、分组情况和取材时间点同自然淡水环境组。浸泡过程中逐一打捞解剖取大鼠心血、肝、脾、肺、肾、双腿腓肠肌(骨骼肌)、玻璃体液，并于-80℃保存检材。(2)绘制水中尸体肌酐降解曲线(C肌酐-PMSI曲线)和1-MH生成曲线(C1-MH-PMSI曲线)。
采用“实施例1”中建立的肌酐和1-MH检测方法，检测所取动物检材骨骼肌中肌酐和1-MH的含量，结果见表3和表4。通过origin 8.0软件绘制出肌酐降解曲线(C肌酐-PMSI曲线)和1-MH生成曲线(C1-MH-PMSI曲线)，见图4和图5。
表3. 7月河水骨骼肌中1-mh和肌酐的含量
表4.恒温25℃骨骼肌中1-mh和肌酐含量
经图表分析可知：①在平均水温25℃条件下，尸体入水后24-168h范围内。肌酐和1-MH的含量与PMSI(尸体死后浸没时间)呈现函数关系。
②随着PMSI(死后浸没时间)的延长，腓肠肌中肌酐含量逐渐升高，相应的下游1-MH含量也逐渐升高，二者都呈现波动上升趋势。因骨骼肌的自溶和腐败会产生肌酐，同时肌酐会在微生物作用下转化为1-MH，故图谱可见肌酐含量是波浪式升高。1-MH也会降解为下游产物，其含量也是波浪式升高。
(3)通过得到的C1-MH-PMSI曲线推断水中尸体浸没时间。
针对特定温度水体中未知水中尸体浸没时间的大鼠尸体，可以取其心血或后腿腓肠肌根据上述方法检测1-MH的含量。将含量值带入建立的C1-MH-PMSI曲线的纵坐标，从而可以通过拟合的方程计算出水中尸体浸没时间PMSI。
本方法通过用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS/MS)检测大鼠水中尸体动物模型心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的含量，建立不同水体温度下肌酐和1-MH含量与水中尸体浸没时间的数学模型，从而实现通过检测肌酐和1-MH含量来推断水中尸体浸没时间。该方法快速、简便，能够准确的推断水中尸体浸没时间，在刑事侦查方面有重要的意义。
对比例1。
现有的推断水中尸体浸没时间的方法主要包括利用水中尸体腐败现象综合评分进行推断，利用尸蜡形成程度进行推断，利用水生昆虫生长规律进行推断等。
对同一批次的大鼠水中尸体模型的水中尸体腐败现象综合评分、尸蜡形成程度和水生昆虫生长规律本发明的方法共同进行检测发现，上述现有技术的方法对于PMSI的推断存在±12h以上的误差，本发明的方法对于PMSI的推误差能够控制在±6h以内，更具有精准性。

Claims (3)

1.一种通过检测肌酐和1-甲基海因含量推断水中尸体浸没时间的方法，包括如下步骤：
（1）实验动物心血和骨骼肌中肌酐和1-MH含量检测方法开发；
（2）建立不同温度和水体环境下水中尸体动物模型；
（3）用（1）中建立的方法检测（2）中建立的模型的水中尸体心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的含量；
（4）根据（3）中水中尸体心血和骨骼肌中肌酐和1-MH的含量，绘制出肌酐降解曲线（C肌酐-PMSI曲线）和1-MH生成曲线（C1-MH-PMSI曲线）；
（5）通过（4）中得到的C1-MH-PMSI曲线推断水中尸体浸没时间。
2.根据权利要求1所述的推断水中尸体浸没时间的方法，其特征在于，所述（1）中实验动物心血和骨骼肌中肌酐和1-MH含量检测方法的建立，包括以下步骤：购置肌酐、1-MH对照品，建立高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）检测方法，采用的检测方法条件如下：Agilent 1260-6420 三重串联四级杆液质联用仪；色谱柱：Agilent Zorbax SB C18（2.1mm × 50 mm， 1.8 μm）；流动相： 0.1 % 甲酸溶液：乙腈 - ( 30：70 v/v)；流速0.20 mL/min；进样体积 1 μL； ESI离子源正离子模式；干燥气温度 350 ℃；干燥气流速 10 L/min；雾化器压力 50 psi；毛细管出口电压 180 V；碰撞电压 30 V ；多反应监测 (MRM) 模式；肌酐检测的离子对为m/z 114.0→86.2，m/z 114.0→44.2；1-MH检测的离子对为m/z 115.1→87.0，m/z 115.1→44.0；样品处理过程：取大鼠心血100 μL或将0.1 g大鼠骨骼肌匀浆后加入500 μL乙腈，混合3 min，用高速离心机1 3000 r/min离心10 min，取上清液200 μL进样分析。
3.根据权利要求1所述的推断水中尸体浸没时间的方法，其特征在于，所述（2）中不同温度和水体环境下水中尸体动物模型建立，包括以下步骤：将实验用大鼠分为自然淡水环境死后抛尸入水组和自然淡水控温死后抛尸入水组；在平均气温为25 ℃左右（夏季）条件下，取雄性SD大鼠90只，随机分为15组，每组6只；用颈椎脱位的方法处死大鼠，在自然淡水环境中将大鼠分别放置24、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204 h后捞出进行解剖取材，并用全自动温湿度记录仪连续采集实验能过程中水体温度和附近的气温；浸泡过程中逐一打捞解剖取大鼠心血、肝、脾、肺、肾、双腿腓肠肌（骨骼肌）、玻璃体液，并于-80℃保存检材；自然淡水控温死后抛尸入水组是将河水放置于大型塑料容器中，并用空调控制水温在25 ℃，将大鼠颈椎脱位处死后在恒温条件下浸泡；实验动物数目、分组情况和取材时间点同自然淡水环境组；浸泡过程中逐一打捞解剖取大鼠心血、肝、脾、肺、肾、双腿腓肠肌（骨骼肌）、玻璃体液，并于-80℃保存检材。
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