CN113341043A - 一种基于代谢组学标志物推断水中尸体早期死后淹没时间的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于法医学和生物医药技术领域，尤其涉及代谢组学在推断水中尸体早期死后淹没时间的应用。所述用于水中尸体死后淹没时间推断的标志物为下述19种受死因影响较小的小分子代谢产物中的任意一种或一种以上的组合：肾上腺素、顺乌头酸、柠檬酸、1,2,3‑环丙烷三羧酸、核黄素、柠康酸、4‑乙酰丁酸、D‑氨基葡萄糖6‑磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、1‑甲基腺苷、3‑磷酸甘油酸、肌酸、肌肽、丙酮酸、β‑丙氨酸、1,5‑二氨基戊烷、泛酸、尿囊素及2‑二甲氨基鸟苷。本发明提供的基于代谢组学标志物推断水中尸体死后淹没时间的方法，能够方便准确地推断水中尸体早期PMSI，且大大降低了不同死因的影响及人为主观因素的判断误差，有望为法医学实践中案件侦破提供更有利的帮助。

Description

一种基于代谢组学标志物推断水中尸体早期死后淹没时间的 方法及其应用

技术领域

本发明属于法医学和生物医药技术领域，具体涉及一种用于推断水中尸体早期死后淹没时间的标志物筛选方法及其应用。

背景技术

死亡时间，也被称为死后间隔（PMI，postmortem interval），是指从尸体死亡到法医检查的时间间隔。死亡时间推断实质推断死后经过或间隔时间。准确推断PMI对确定案发时间、划定侦查范围以及案件性质的确定具有重要意义，是法医学鉴定中需要解决的重要问题之一。人体死亡后尸体所处的环境是影响死亡时间推断的重要因素。与陆地相比，水中环境更加复杂多变，因此准确推断水中尸体的死后经过时间变得更加困难。死后淹没时间（PMSI，postmortem submersion interval）是指死者从入水到被发现所经历的时间。国内外对水中尸体死后淹没时间的研究鲜见报道。前提已报道的研究提出了采用总体水中腐败分值（TADS，total aquatic decomposition score）结合累积度日（ADD，accumulateddegree day）的方法来推断水中尸体的PMSI，并且取得了良好的效果，该方法容易受到主观因素的影响，且不适用于早期水中尸体浸没时间的推断。由于机体死亡后血液循环停止，体内多种生化过程因缺氧而中断，细胞开始分解，导致多种代谢物含量发生了不可逆性的变化。近年来，越来越多的学者提出深入了解机体死后代谢过程的变化将有助于准确推断PMI。

代谢组学是一个新兴的组学技术应用领域，专门检测机体在疾病状态或者外界刺激状态下体内组织或体液中小分子代谢产物的变化情况。运用代谢组学技术检测可能为水中尸体的PMSI推断提供重要的参考信息。由于高通量的代谢组学检测会产生大量的高维数据，与基于单个或少数参数的分析方法相比，利用此数据提取各种代谢产物随PMSI变化的有效信息，进行随机森林（RF，random forest）人工智能的机器学习建模，对多变量进行综合分析并构建数学模型，将更加准确可靠地推断PMI。

综上所述，水中尸体早期PMSI推断研究相对少见，推断水中尸体死后早期淹没时间的方法是亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明克服了上述问题，并提供了一种基于血液代谢组学数据筛选用于推断水中尸体死后早期淹没时间的标志物的方法及其应用。利用水中尸体血液标本进行代谢组学检测，结合随机森林机器学习运算，筛选出若干受死因影响较小的代谢物指标并建立数学模型，验证了代谢组学标志物在推断水中尸体早期PMSI的可行性，并能够准确快速推断水中尸体的早期PMSI。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种基于尸体血液代谢组学数据推断水中尸体死后早期淹没时间的标志物，其特征在于，所述标志物包括如下19种小分子代谢产物中的任意一种或几种的组合：肾上腺素、顺乌头酸、柠檬酸、1,2,3-环丙烷三羧酸、核黄素、柠康酸、4-乙酰丁酸、D-氨基葡萄糖6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、1-甲基腺苷、3-磷酸甘油酸、肌酸、肌肽、丙酮酸、β-丙氨酸、1,5-二氨基戊烷、泛酸、尿囊素及2-二甲氨基鸟苷。

本发明还提供了一种上述的标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法的具体步骤包括：

步骤1、提取溺死组大鼠和死后抛尸入水组大鼠尸体的心血，随机分为训练集和测试集；

步骤2、将每个分析样本采用UHPLC-MS/MS对血液进行代谢组学分析，得到心血中各种代谢物的原始代谢指纹图谱；

步骤3、将训练集代谢组学检测数据导入R语言（version 3.6.1）中，借助randomForest包，以样本死后淹没时间为因变量，以各种代谢物为自变量，有放回地随机抽取训练集样本建立随机森林回归模型，最终得到模型的预测精度以及以IncNodePure为代谢物相对重要程度评估指标得到各自变量的相对重要程度排序；

步骤4、对随机森林回归模型进行交叉检验，以步骤3中建立的基于全部代谢物构建的回归模型误差为参考，以相同的回归模型误差为标准建立包含更少代谢物的模型的极简回归模型；

步骤5、为建立极简模型，根据各代谢物的相对重要程度，挑选并确定了19种对推断水中尸体死后淹没时间具有重要作用的标志物。

本发明还提供了一种如上所述的19种标志物构建极简回归模型，并用于推断水中尸体死后淹没时间的方法，具体方法如下：

步骤1、基于训练集各样本中筛选的19种标志物含量及死后淹没时间数据并导入到R语言中，借助randomForest包以样本死后淹没时间为因变量，以各标志物为自变量，有放回地随机抽取训练集样本建立随机森林的极简回归模型；

步骤2、将测试集各样本中对应的标记物含量输入到以上所述标志物构建的随机森林极简回归模型中，得到模型对各样本死后淹没时间的预测结果，并进行分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

（1）本发明提供了一种基于代谢组学标志物推断水中尸体死后淹没时间的方法，在自然河水中建立动物模型，模拟法医学实践中机体在淡水环境的自然腐败过程，有利于成果的转化。

（2）本发明提供了一种基于尸体血液代谢组学数据推断水中尸体死后早期淹没时间的标志物，所述19种标志物具有受死亡原因影响小、与死后水中淹没时间相关性密切、平行样指标含量差别小且表达相对稳定、在随机森林机器学习算法上对模型贡献度高的特点。

（3）本发明提供了一种基于代谢组学标志物推断水中尸体死后淹没时间的方法，利用代谢组学技术能够同时检测多种代谢物，这些代谢物能够解释复杂多变的过程，如死后腐败过程，帮助人们深入了解机体死亡后的微观变化。

（4）本发明提供了一种基于代谢组学标志物推断水中尸体死后淹没时间的方法，基于大量指标的综合分析方法比使用一个或几个指标的方法具有更高的预测能力，通过代谢组学技术检测样品中若干目标生物标志物的含量，结合机器学习算法能够方便准确地推断水中尸体早期PMSI，且大大降低了不同死因的影响，及人为主观因素的判断误差，有望为法医学实践中案件侦破提供更有利的帮助。

附图说明

图1是不同PMSI的尸体心血样本中代谢特征观察结果。

图2是以训练集样品建立PLS回归模型。

图3是对PLS回归模型进行了置换检验结果。

图4是推断PMSI的随机森林回归模型在测试集中验证的结果。

图5是对随机森林模型进行5重10折交叉检验结果。

图6是19种代谢组学标志物含量变化热图。

图7是基于19种代谢组学标志物的含量变化建立的回归模型的检验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造商建议的条件进行，为了使本领域普通技术人员获悉，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1。

1. 研究对象及分组。

训练集：取雄性SD大鼠80只，随机分为溺死组（D组，T1-40）和死后入水组（PS组，T41-80），每组40只。溺死组大鼠浸入河水（自然淡水水体）中溺死，死后入水组大鼠采取CO₂气体窒息处死后浸入河水中，实验期间河水温度为20-25℃。于死后浸没于水中的不同时间点（0h、6h、12h、18h及24h）提取心血（约200μL），每个时间点取8只大鼠尸体，取材后将样本立即放入液氮中，随后-80℃保存备检。

测试集：取雄性SD大鼠20只，随机分为溺死组（V1-10）和死后入水组(V11-20)，每组10只。按照上述方法将死亡的动物尸体浸入河水中，分别于死后0h、6h、12h、18h及24h提取心血，每个时间点2只大鼠，之后将样品置于-80℃保存备检。

2. 代谢物提取。

取心血样品100μL置于新EP管中，加入400μL质谱级甲醇沉淀蛋白，涡旋震荡，冰浴静置5 min，15000 g、4℃离心10 min，取100μL的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53%，并置于离心管中15000g、4℃离心10min，收集上清，上机进行分析。

从每个实验样本中取等体积样本混匀作为QC样本，用于平衡色谱-质谱系统和监测仪器状态，在整个实验过程中对系统稳定性进行评价。以53%甲醇水溶液代替实验样本作为空白样本，用于去除背景离子。QC样本和空白样本处理过程与实验样本相同。

3. 样本中代谢谱检测。

使用超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）系统检测样本中各代谢物的含量。

LC-MS/MS分析使用Vanquish UHPLC系统（Thermo Fisher）和Orbitrap QExactive系列质谱仪（Thermo Fisher）。

（1）仪器条件。

色谱条件如下：

色谱柱：Hyperil Gold column（C18）

柱温：40℃

流速：0.2 mL/min

正离子模式：流动相 A：0.1%甲酸

流动相 B：甲醇

负离子模式：流动相 A：5mM醋酸铵，pH 9.0

流动相 B：甲醇

色谱梯度洗脱程序如下表所示。

质谱条件：扫描范围选择m/z 100-1500；ESI源的设置如下：喷雾电压：3.2 kV；鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；离子传输管温度：320 ℃；极性：正离

子模式；负离子模式；MS/MS二级扫描为数据依赖型扫描。

代谢物鉴定：将原始数据（.raw）文件导入Compound Discoverer 3.1（CD）搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样本根据保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm 进行峰对齐，使鉴定更准确，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30%、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault和MassList数据库进行比对，用空白样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到各种代谢物的定性定量结果。

4.早期水中尸体心血样本代谢谱差异。

经过代谢谱检测及数据预处理，共检测到601种代谢物。首先利用鉴定到的所有代谢物进行PCA（principal component analysis）分析，以观察不同PMSI的尸体心血样本中代谢特征。

结果如图1所示，QC样本聚集良好，表明仪器检测稳定，所得结果可用于深入分析。在得分图中各时间组的样本有明显的分离趋势，说明不同时间点心血中代谢谱具有明显的差异，特别是0h组与其他时间组明显分离，说明在死亡过程中机体内代谢物发生了剧烈变化。12h、18h及24h组有较大程度重合，说明随PMSI延长，尸体中代谢谱变化速度下降。

随后将训练集各样本数据导入到R中，借助ropls包以死后淹没时间为因变量，各代谢物为自变量建立PLS回归模型（如图2所示）进一步区分不同PMSI，结果表明各时间组明显分离，重合现象明显降低，且随时间延长依次排列，说明各时间组代谢水平差异明显且代谢物整体变化具有良好时间规律性。为验证该模型是否过拟合，又对模型进行了置换检验（200次，如图3所示），结果表明Q2截距为负，该PLS回归模型未过拟合。

5.水中尸体早期PMSI推断模型的建立与验证。

以上的结果表明水中尸体心血中代谢物含量在死后早期持续变化，且具有良好的时间规律性。这些代谢物变化及差异能够为水中尸体早期PMSI推断提供重要的参考信息。为了验证上述想法，首先将训练集及测试集数据导入R语言中，借助randomForest包以样本死后淹没时间为因变量，各种代谢物为自变量，有放回地随机抽取训练集样本建立随机森林回归模型。然后将测试集各样本数据输入到模型中进行预测。最后将所得预测结果与真实值进行比较。结果表明该回归模型具有较高的准确性，如图4和表1所示，模型在测试集中的平均绝对误差（MAE，mean absolute error）为1.168小时，说明代谢组学可用于水中尸体早期PMSI推断，并且具有较高的准确性，对法医学实践具有重要的参考价值。

表1. 推断PMSI的随机森林回归模型在测试集中验证结果数据

。

6.筛选推断早期水中尸体PMSI的生物标志物。

通过分析水中尸体心血样本的代谢谱，获得了大量有效的信息，并证明了代谢组学在水中尸体早期PMSI推断中的可行性，但在实践中研究整个代谢谱需要大量的成本，且并不是所有的代谢物变化都与PMSI相关。接下来进一步精简、筛选对推断PMSI具有重要作用的指标体系，以此构建数学模型，进而提高推断PMSI的准确性，便于实际应用。对以所有代谢物构建的随机森林模型进行5重10折交叉检验如图5所示，结果表明该模型的预测误差随着模型中变量（代谢物）数目的增加呈现先下降后逐渐升高的趋势。在保障模型准确性的前提下，尽量减少体系中指标的数量，依据各代谢物的相对重要程度最终筛选到了19种代谢物（见表2）。根据热图可观察到19种代谢物含量随PMSI延长均呈单调性变化如图6所示，具有良好的时间规律性，是用于死后淹没时间推断的理想指标。

基于这19种代谢物的含量变化重新建立回归模型，并检验其准确性。首先

提取训练集及测试集各样本中标志物含量及死后淹没时间数据并导入到R语言中。然后借助randomForest包以样本死后淹没时间为因变量，以各标志物为自变量，有放回地随机抽取训练集样本重新建立随机森林回归模型。最后将测试集各样本中标记物含量输入到以19种代谢组学标志物构建的随机森林回归模型中，得到模型对各样本死后淹没时间的预测结果，并将预测结果与真实值进行比较（图7，表3）。结果表明以19种潜在生物标志物建立的简化模型其MAE为1.067小时，经配对t检验证实该模型结果与全代谢物模型的预测结果无统计学差异，表明这19种代谢物能够准确推断水中尸体早期PMSI。

表2. 筛选的19种生物标志物

。

表3.基于19种代谢物的含量变化建立回归模型的检验结果数据

。

综上所述，本发明通过对早期水中尸体心血样本进行代谢组学分析，证明了代谢组学技术在早期水中尸体死后淹没时间推断方面的可行性，进一步筛选了有望用于推断早期水中尸体死后淹没时间的生物标志物并验证了其准确性，这些结果能够为法医学实践提供参考，具有广阔的应用前景。

Claims (3)

1.一种基于尸体血液代谢组学数据推断水中尸体死后淹没时间的标志物，其特征在于，所述标志物包括如下19种小分子代谢产物中的任意一种或几种的组合：肾上腺素、顺乌头酸、柠檬酸、1,2,3-环丙烷三羧酸、核黄素、柠康酸、4-乙酰丁酸、D-氨基葡萄糖6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、1-甲基腺苷、3-磷酸甘油酸、肌酸、肌肽、丙酮酸、β-丙氨酸、1,5-二氨基戊烷、泛酸、尿囊素及2-二甲氨基鸟苷。

2.一种用于推断水中尸体死后淹没时间的标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法的具体步骤包括：

步骤1、提取溺死组大鼠和死后抛尸入水组大鼠尸体的心血，随机分为训练集和测试集；

步骤2、将每个分析样本采用UHPLC-MS/MS对血液进行代谢组学分析，得到心血中提取的代谢物的原始代谢指纹图谱；

步骤3、将训练集代谢组学检测数据导入R语言（version 3.6.1）中，借助randomForest包，以样本死后淹没时间为因变量，以各种代谢物为自变量，有放回地随机抽取训练集样本建立随机森林回归模型，最终得到模型的预测精度以及以IncNodePure为代谢物相对重要程度评估指标得到各自变量的相对重要程度排序；

步骤4、对随机森林回归模型进行交叉检验，以步骤3中建立的基于全部代谢物构建的回归模型误差为参考，以相同的回归模型误差为标准建立包含更少代谢物的模型的极简回归模型；

步骤5、为建立极简模型，根据各代谢物的相对重要程度，挑选并确定了19种对推断水中尸体死后淹没时间具有重要作用的标志物。

3.一种如权利要求1所述的19种标志物构建极简回归模型，并用于推断水中尸体死后淹没时间的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：

步骤1、基于训练集各样本中筛选的19种标志物含量及死后淹没时间数据并导入到R语言中，借助randomForest包以样本死后淹没时间为因变量，以各标志物为自变量，有放回地随机抽取训练集样本建立随机森林的极简回归模型；

步骤2、将测试集各样本中对应的标记物含量输入到以上所述标志物构建的随机森林极简回归模型中，得到模型对各样本死后淹没时间的预测结果，并进行分析。

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