WO2022027118A1

WO2022027118A1 - Método automático de seleção molecular

Info

Publication number: WO2022027118A1
Application number: PCT/BR2021/050323
Authority: WO
Inventors: Rodrigo RAMOS CATHARINO; Anderson De Rezende Rocha; Luiz Claudio NAVARRO; Jeany DELAFIORI
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2022-02-10
Also published as: BR102020015916A2

Abstract

A presente invenção trata-se de um método automático para seleção molecular. O método proposto combina os dados de espectrometria de massas com análise computacional por inteligência artificial para geração de uma resposta final sobre uma condição de interesse, sendo a referida resposta final aplicável em análises clínicas, ambientais e bromatológicas, em indústrias de cosméticos e farmacêuticas.

Description

MÉTODO AUTOMÁTICO PARA SELEÇÃO MOLECULAR Campo da invenção

[ 001] A presente invenção trata-se de um método automático para seleção molecular a partir de dados obtidos de espectrometria de massas para seleção de uma característica de interesse .

[ 002] A presente invenção pode ser aplicada em análises clinicas , ambientais e bromatológicas , em indústrias de cosméticos e farmacêuticas .

Fundamentos da invenção :

[ 003] Entre as muitas tecnologias avançadas usadas para pesquisa molecular, a espectrometria de massas tem um papel importante devido à alta sensibilidade , capacidade de detectar uma gama de moléculas , especificidade molecular e flexibilidade para abordar muitos analitos variados em uma plataforma única . Ademais , esta tecnologia permite a análise de uma ampla variedade de classes moleculares em amostras biológicas e/ou quimicas .

[ 004] Os espectrômetros de massas são aparelhos muito precisos e com uma escala absoluta na determinação da massa molecular (ou melhor, massa/carga) de ions medidos pelo aparelho . No entanto, na medição das intensidades do sinal , são produzidas medidas em uma escala arbitrária, normalmente, denominada abundância, que varia de acordo com vários parâmetros de configuração como tempo de amostragem, regulagens no dispositivo de ionização e sensibilidade do aparelho que pode variar de amostra para amostra em função de vários fatores intrínsecos do processo de medida . [ 005] Atualmente, modelos que utilizam algoritmos de aprendizado de máquina e inteligência artificial para a interpretação de dados de espectrometria de massas estão cada vez mais presentes na literatura, porém, em sua maioria, apresentam como limitações a especificidade para estudos proteômicos e/ou são específicos para alguns tipos de ionização e equipamentos de espectrometria de massas ; em outras soluções , a utilização é acoplada a métodos cromatográficos na identificação de potenciais biomarcadores , o que representa uma limitação grande de tais métodos , pois exigem, a priori, a definição do número de biomarcadores a serem determinados e uso de padrões marcadores que possam ser rastreados posteriormente .

[ 006] A alternativa presente na literatura para contornar essa limitação consiste em usar uma substância de referência denominada padrão interno, cuja concentração é conhecida nas amostras, permitindo um ajuste posterior da escala espectral . Porém, esta técnica encarece o processo e muitas vezes torna-o inviável , pois a substância a ser escolhida como referência não pode interferir no processo bioquímico em análise .

[ 007] A maioria dos modelos disponíveis encontra-se publicada como artigos científicos caracterizando-se como ferramentas de busca de biomarcadores , ou seja, necessitam de conhecimentos em computação para serem aplicados na prática médica . Além disso, os modelos disponíveis não encontram de forma automática os biomarcadores utilizando modelagem matemática de redução de ruídos e alinhamento dos espectros, e não compreendem a auto validação e decisão baseada em dados necessária para aplicação como o próprio diagnóstico . Sendo estes métodos direcionados apenas à busca de biomarcadores , tem-se a necessidade de equipamentos com a alta resolução, em outras palavras , exigem espectrômetros de grande resolução na fase de aquisição dos dados .

[ 008] Em vista das limitações apresentadas , a presente invenção descreve um método automático para seleção molecular a partir de dados obtidos de espectrometria de massas para seleção de uma característica de interesse , o método podendo ser configurado para diferentes condições , alterando-se o conjunto de dados de entrada usados para treinamento do método . Dessa forma, o método da presente invenção pode ser adaptado para lidar com diferentes problemas de identificação com análise por espectrometria de massas .

[ 009] A forma unificada de atuação do método permite que haja a Multiplexação de Diagnósticos , ou seja, uma amostra coletada e seus espectros (replicatas da amostra) podem ser adquiridas uma única vez , mas podem ser utilizadas em diferentes análises bastando, para isso, a anotação correta, de modo a configurar o equipamento, às condições de interesse a serem analisadas durante a etapa de treinamento do método .

[ 0010]dicionalmente, o método proposto permite a utilização de diferentes espectrômetros de massas e não se exige que tais espectrômetros sejam de alta resolução como em alguns métodos encontrados na literatura . A razão para essa flexibilidade está na utilização de uma normalização pareada para a criação dos modelos de diagnóstico, permitindo que o método proposto não seja diretamente afetado pela mudança do espectrômetro de massas que é utilizado .

[ 0011] Ademais , a presente invenção utiliza uma metodologia para determinação dinâmica e recursiva de características mais efetivas ligadas à condição de interesse . Essa metodologia viabiliza a análise de espectros de maior alcance em escala de massa carga ( untargeted metabolomics) obtidos por ionização direta da amostra (sem cromatografia e inserção de padrões de referência) . Essa análise também permite a criação de características pareadas que viabilizam o modelo de análise espectral do teste de seleção a ser utilizado com dados provenientes de diferentes espectrômetros , inclusive , aqueles de menor custo e resolução .

Estado da técnica

[ 0012] O documento intitulado MZmine 2 : Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data (http://www.biomedcentral.com/1471-2105/11/395) descreve um método para o processamento inicial dos dados baseado na detecção de sinais e apresentação de uma solução de visualização de dados de espectrometria de massas , onde a seleção e identificação dos biomarcadores fica a cargo de um especialista humano . O método proposto analisa um vetor independente por vez enquanto a presente invenção faz uma análise agrupada (por cohort) , determinando de forma automática os ions relacionados às condições de interesse para serem aplicados em um sistema de diagnóstico . Além disso, o método da referida anterioridade não apresenta análise pareada capaz de isolar vieses específicos de aparelho e focar nas características que são independentes de aparelho de coleta, com isso, inviabilizando a sua aplicação em diferentes espectrômetros de massas .

[ 0013] Portanto, a referida anterioridade analisa individualmente as amostras e possui limitações quanto aos equipamentos que podem ser aplicados , pois em momento algum analisa um grupo de vetores e nem compara de forma pareada os candidatos a marcadores para normalização/robustez .

[ 0014] 0 documento US 8515680 , Analysis of transcriptomic data using similarity based modeling, descreve um método para diagnóstico baseado na modelagem da distribuição dos dados de condições de interesse utilizando modelagem auto-associativa e multivariada para identificar íons de uma condição de interesse . Os dados são modelados via distribuições de probabilidade/kernels, principalmente , a partir do método de regressão de Nadaraya-Watson, em que a decisão da presença de uma condição de interesse é feita via modelo de similaridade e limiar/ threshold.

[ 0015] Em contrapartida, a presente invenção não precisa assumir qualquer análise de distribuição dos dados de entrada, dessa forma, apresentando maior robustez a possíveis ruídos de entrada . Além disso , dado que a modelagem realizada no documento US 8515680 é feita por distribuições de probabilidade, ela é mais sensível a diferentes aparelhos e, consequentemente, não é robusta o suficiente para operar com dados provenientes de diferentes fontes, ao passo que a presente invenção não apresenta essa limitação .

[0016] Adicionalmente, a presente invenção também apresenta um aprendizado dinâmico capaz de atualizar o diagnóstico à medida que novos dados chegam, de modo que não depende de limiares ( thresholds) para se tomar decisões e as toma baseado na modelagem dos dados como um todo, considerando as condições de interesse . Essa abordagem facilita a aplicação da presente invenção para outras condições de interesse , ao passo que o método do documento US 8515680 precisaria recalcular os dados das distribuições dos dados e o limiar/ threshold de cada decisão . Finalmente, a análise pareada dos dados adiciona robustez a diferentes cenários de operação e determinação automática dos biomarcadores candidatos independentes da distribuição dos dados e do aparelho de captura.

[ 0017] O documento intitulado A Machine Learning Application Based in Random Forest for Integrating Mass Spectrometry-Based Metabolomic Data : A Simple Screening Method for Patients With Zika Virus (https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00031) apresenta um estudo da combinação de espectrometria de massas com o modelo de predição Random Forests para diagnóstico do virus da Zika . Apesar da referida anterioridade utilizar um método similar ao da presente invenção, ela não apresenta a análise de sinais e alinhamento de espectros e nem a análise pareada de características . Além disso , não compreende uso independente em campo como classificador e geração de relatórios . Sendo assim, não é capaz de gerar diagnósticos automáticos e que não estejam atreladas especificamente a determinados aparelhos .

[ 0018] O documento US 20190214145, Method and systems for creating and screening patient metaboli te profile to diagnose current medical condi tion , diagnose current treatment state and recommend new treatment regimen, descreve um método e sistema para a construção de um banco de dados de perfis de metabolites correlacionados com estados de doença e regimentos de tratamento , definindo o perfil de metabólitos de um paciente individual e, em seguida, examinando o perfil do paciente no banco de dados para recomendar possiveis regimes de tratamento eficazes . Porém, o referido método é direcionado para o uso da maconha no tratamento da dor, necessita de técnicas cromatográficas antes da análise por espectrometria de massas , não utiliza normalização pareada e nem análise de sinais . Não compreendendo um método gerador de diagnóstico automático e que seja independente de um modelo de equipamento de espectrometria de massas .

[ 0019] O documento US 8296247 , Combination machine learning algorithms for computer-aided detection , review and diagnosis, descreve um método para revisão de dados médicos e imagens para diagnóstico e decisão de tratamento, utilizando algoritmos de Aprendizado de Máquina . Porém, ao contrário da presente invenção, o referido método da anterioridade utiliza uma classificação e integração utilizando " type 2 fuzzy logic" e "Bayesian probability" e não especifico para os dados de espectrometria de massas e requer pré- processamentos específicos . [0020] O documento intitulado BioSunMS: a plug-in- based software for the management of patients Information and the analysis of peptide profiles from mass spectrometry (https://sourceforge.net/projects/biosunms/) apresenta a plataforma BioSunMS para o manejo de dados de pacientes e dados de espectrometria de massas para análise estatística e reconhecimento de padrões.

Diferentemente da presente invenção, o método da referida anterioridade utiliza algoritmos do tipo Support Vector

Machines (SVMs) para construção dos modelos, possui aplicação exclusiva para MALDI-TOF MS ou SELDI-TOF MS e proteômica clínica, não possui plataforma de produção de diagnóstico separada do desenvolvimento, não utiliza normalização pareada e nem análise de sinais e não compreende uso independente em campo como classificador e geração de diagnósticos.

[0021] O documento intitulado MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and interpretation (https://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xfatml) descreve a plataforma MetaboAnalyst para pré-tratamento de dados, visualização, estatística, reconhecimento e avaliação de padrões de dados metabolômicos. A plataforma utiliza o algoritmo Support Vector Machines (SVMs) e Random Forests (RFs), não possui métodos de produção de diagnóstico, não utiliza a normalização pareada e nem análise de sinais, não compreende uso independente em campo como classificador e geração de diagnósticos.

[0022] O documento intitulado The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote) omics data (http://www.perseus-framework.org) descreve uma plataforma para pré-tratamento de dados , visualização, estatística, reconhecimento e avaliação de padrões . Todavia, diferentemente da presente invenção, utiliza o algoritmo Support Vector Machines (SVMs ) , possui aplicação exclusiva para proteômica, com quantificação, não possui plataforma de produção de diagnóstico, não utiliza normalização pareada e nem análise de sinais , não compreende uso independente em campo como classificador e geração de diagnósticos .

[ 0023] O documento intitulado Metabolomics analysis for biomarker discovery : advances and challenges (https://www.researchgate.net/publication/233847779) apresenta uma gama de técnicas na área de identificação de biomarcadores . No entanto, esse documento trata de um estudo do estado da técnica e não um método em particular . Os métodos descritos no referido documento são baseados na modelagem da distribuição dos dados ou na análise estatística e multivariada dos mesmos para identificação de marcadores similarmente ao documento US 8515680 . Vale ressaltar que nenhuma das técnicas abordadas leva em consideração as mudanças nos dados de entrada e diferentes aparelhos de aquisição, conforme pode ser visto na Figura 3 do referido documento . A presente invenção, por outro lado, compreende um método que não utiliza análise estatística e multivariada dos dados , não depende de limiares de decisão, é robusta a mudanças nos dados de entrada e diferentes aparelhos de aquisição, pode ser atualizada com dados novos e é dinâmica em termos de permitir que o mesmo fluxo de ações possa ser usado para diferentes condições de interesse a partir de atualizações apenas nos dados de treinamento do método . Sendo assim, nenhuma das técnicas descritas no referido documento juntamente com os documentos citados anteriormente permitem vislumbrar um método similar ao da presente invenção, principalmente, no tocante à robustez a diferentes aparelhos condições de aquisição devido à etapa de alinhamento e pareamento de características e no sistema de diagnóstico dinâmico e adaptável a diferentes condições de interesse .

Breve descrição da invenção:

[ 0024] A presente invenção se insere no campo das tecnologias para seleção e identificação molecular, mais precisamente, em um método para processamento de informações de dados de espectrometria de massas para determinação de moléculas e, assim, gerar uma resposta automática .

[ 0025] O método proposto combina os dados de espectrometria de massas com análise computacional por inteligência artificial para geração de uma resposta final sobre uma condição de interesse, sendo que a referida resposta final compreende desde testes de seleção a controle de qualidade . Para isto, o método proposto compreende as seguintes etapas : uma etapa de modelagem, alinhamento e redução de ruido ; uma etapa de normalização ; etapa de aprendizado pela ferramenta de inteligência artificial ; seleção recursiva de características discriminantes ; filtragem probabilística; análise metabolômica e validação dos dados ; normalização em domínio das características pareadas e seleção recursiva das características pareadas . As características identificadas e validadas pelo método da presente invenção são utilizadas para avaliar uma condição de interesse .

Breve descrição das figuras :

[ 0026] A Figura 1 mostra um fluxograma do método proposto em sua configuração preferencial .

[ 0027] A Figura 2 mostra um exemplo de gráfico para identificação do sinal espectral .

[ 0028] A Figura 3 mostra a aplicação do método da presente invenção em sistemas de seleção em sua configuração preferencial . Onde A representa o espectrômetro de massa .

[ 0029] A Figura 4 mostra o gráfico para o método de determinação das características mais importantes em um exemplo de aplicação .

[ 0030] A Figura 5 mostra um exemplo de análise de distribuição para duas das características selecionadas , em que (A) apresenta uma característica com distribuição positiva para a condição, e (B) apresenta uma característica com distribuição negativa para a condição em um exemplo de aplicação .

[ 0031] A Figura 6 mostra um mapa de calor (heatmap) dos valores relativos das características pela taxa de acerto na classificação das amostras positivas e negativas . No canto superior esquerdo , têm-se as características com maior probabilidade de valores altos mostrados para as amostras positivas onde houve maior acerto do modelo, no canto inferior direito estão as características de maior probabilidade de valores altos nas amostras negativas , e as correspondentes com maior taxa de acerto , em um exemplo de aplicação .

[ 0032] A Figura 7 mostra o gráfico para o método de otimização do modelo de características pareadas em um exemplo de aplicação .

[ 0033] Figura 8 mostra os resultados da validação do método de seleção molecular gerado com as 13 características pareadas finais, correspondentes a 14 candidatos a biomarcadores em um exemplo de aplicação .

[ 0034] A Figura 9 mostra o gráfico de todos os ions identificados no método e suas correlações , identificando em laranja os finais utilizados no modelo de seleção resultante em um exemplo de aplicação . Essa representação baseada nas características escolhidas pelo método de aprendizagem de máquina e nas covariâncias dessas mesmas tem por objetivo mostrar um panorama das relações ajudando no processo de interpretação metabolômica das moléculas associadas .

Descrição detalhada da invenção :

[ 0035] A presente invenção trata-se de um método automático para seleção molecular a partir de dados obtidos de espectrometria de massas para seleção de uma característica de interesse .

[ 0036] 0 método automático de seleção molecular pode ser observado na Figura 1 . 0 método utiliza dados obtidos a partir de espectrômetros e compreende as seguintes etapas e subetapas :

(1) modelagem, alinhamento e redução de ruido dos dados :

( 1 . 1 ) extração dos sinais espectrais de cada replicata; (1.2) identificação das características espectrais presentes nas replicatas, sendo que valores de intensidade de sinal abaixo de 10 ppm em relação ao sinal de maior intensidade, ou seja 10^-5, são eliminados de forma automática;

(1.3) análise de sinais via distribuição Gaussiana e anotar as métricas de intensidade, largura do sinal, resolução e valor do m/z (massa/carga) ;

(1.4) alinhamento dos sinais superpostos na faixa espectral determinada pela resolução dos ions (m/z) em cada ponto do espectro e cada alinhamento de sinais constitui-se em uma característica espectral;

(1.5) redução do ruido: se a mediana das intensidades espectrais dos sinais nas replicatas da amostra for 0 (Zero) , essa característica é considerada como ruído;

- Obtenção vetores de características (la) ;

(2) normalização de domínio dos dados:

- Nesse ponto do processo, os vetores devem ser levados a um domínio de valores para as intensidades dentro de uma mesma escala para que seja possível a comparação de variáveis pelas etapas de aprendizagem de máquina. Para isso, utilizamos a normalização dividindo-se todos os elementos de cada vetor pelo seu valor máximo, obtendo-se, assim, intensidades no intervalo [0,1] e relativas à máxima intensidade do vetor. Outras normalizações podem ser utilizadas nesta etapa desde que mantenham as relações entre as intensidades de um mesmo vetor e levem os valores de todas as variáveis a uma escala comum.

- Formalmente, a normalização de soma 1 é dada por :

onde é o valor da variável j da amostra i do

conjunto representa o valor de

todas as variáveis da amostra i;

(3) criação do modelo de aprendizado com dados completos :

(3.1) criação do modelo matemático preditivo baseado em um algoritmo de classificação ou de regressão, em que os conjuntos de dados (datasets) são separados em subconjuntos evitando-se interseção e sobreposição; o treinamento é compreendido, pelo menos, por 10 rodadas, permutando-se os subconjuntos;

(3.2) avaliação da performance preditiva do modelo aplicado na etapa (3.1) com as métricas estatísticas decorrentes da avaliação dos resultados através de métricas de Exatidão, Sensibilidade, Especificidade, Precisão, Valor Preditivo Negativo, FIScore e/ou MCC (Matthews Correlation Coefficient) ;

(4) seleção recursiva de características discriminantes:

(4.1) identificação das características a partir da aplicação recursiva do algoritmo de aprendizagem de máquina; (4.2) avaliação de capacidade de predição para as características;

(5) filtragem probabilística de características discriminantes :

(5.1) avaliação probabilística das características determinantes :

- as que possuem uma maior probabilidade de ter valores aumentados - características positivas;

- as que possuem maior probabilidade de terem valores reduzidos para a condição de interesse - características negativas;

- obtenção das características putativas (5a) ;

(5.2) avaliação do modelo preditivo com as características putativas (5a) :

- Seja A = {A¹, A², ...,Aⁿ} um conjunto de amostras, rotuladas para a condição Y={y¹, y², ..., yⁿ}, onde y¹⁼[0,l] , sendo 1 para a condição satisfeita (amostra positiva) ou 0 para a não satisfeita (amostra negativa) ;

- Seja cada amostra

onde cada valor corresponde

aos valores da mesma em todas as amostras no conjunto A, medidas em uma escala arbitrária diferente em cada amostra Aⁱ, mas constante para todas as variáveis de cada amostra Aⁱ;

- define-se DeltaJ como:

caso contrário-. Δj(x_j) = 0

Onde Xj é o valor da variável j da amostra i do conjunto A,

é o rótulo da amostra i do conjunto A, yⁱ⁼[0,l] ; x_j é o conjunto de valores da variável j para todas as amostras do conjunto A;

A^p é o conjunto de amostras positivas em A, ou seja, rotuladas com y^p=l;

é a mediana dos valores j para todas as amostras do conjunto A^p;

P(x_j) é a função de distribuição de probabilidade acumulada (Cumulative Distribution Function, CDF, em inglês) dos valores x_j e x_j no conjunto A^p ;

A^Q é o conjunto de amostras negativas em A, ou seja, rotuladas com y^Q=l; é a mediana dos valores de variável j para

todas as amostras do conjunto A^Q;

Q(x_j) é a função de distribuição de probabilidade acumulada (CDF em inglês) dos valores x_j e x_j no conjunto A^Q;

(6) análise metabolômica e validação das características putativas (5a) associadas à condição de interesse:

(6.1) consulta a bancos de dados de metabolômica/lipidômica e antecedentes na literatura; e/ou

(6.2) confirmação experimental por espectrometria de massas sequencial; e/ou (6.3) validação por técnicas analíticas complementares (por exemplo, ensaios bioquímicos, ressonância magnética entre outros) ;

- Obtenção de características putativas metabolicamente validadas (6a) ;

(7) normalização em domínio das características putativas pareadas:

(7.1) pareamento das características validadas na sub-etapa (6.1) :

- Onde é o valor da variável j da amostra i do

conjunto

(7.2) normalização do pareamento para intervalo [0, 1] ;

- A etapa (7.1) produz um valor para as características no intervalo [-1, 1] , correspondendo à relação entre as variáveis A e B, -1 se B > A, 0 se A = B e que 1 caso A > B. O vetor de características com as mesmas nesse intervalo está já normalizado e pode ser usado nas etapas subsequentes pelos algoritmos de machine learning, porém para facilitar as análises e permitir a reutilização das funções utilizadas nas etapas anteriores que operam sobre características com valores no intervalo [0, 1] aplicamos uma segunda transformação de acordo com a fórmula abaixo:

- se o valor normalizado está no intervalo entre 0 e 1 para duas características A e B, se o valor for 0,5, as características têm igual intensidade no vetor;

- se o valor normalizado é menor que 0,5, então a característica B tem intensidade maior que A e, em particular, se o valor for 0, então a característica A tem valor 0;

- se o valor normalizado é maior que 0,5, a característica A tem maior intensidade que B e, em particular, se o valor normalizado é 1, então a característica B tem intensidade 0;

- Obtenção de características pareadas (7a) ;

(8) Seleção recursiva de características putativas pareadas :

(8.1) resubmissão das características pareadas (7a) à etapa (3) ;

(8.2) resubmissão das características pareadas (7a) à etapa (4) ; e

(8.3) resubmissão das características pareadas (7a) à etapa (5) ;

Obtenção de características putativas metabolomicamente validadas (8a) .

[0037] Antes do início do método, é importante ressaltar que as amostras a serem analisadas devem ter, pelo menos, um número amostrai significativo para a construção do modelo. Além disso, deve ser escolhidos tipos de amostras que mais representem a doença/condição/comorbidade a ser testada; essas podem, ou não, ser pré-processadas dependendo do equipamento utilizado .

[ 0038] Anterior à inserção no espectrômetro de massas (A) , é selecionado o método de preparo e ionização , realizado um planejamento experimental ( randomização das amostras , plano de distribuição da análise em lotes , definição do tempo de aquisição de dados , número de aquisições por amostra e limpeza) , e parametrização e otimização das condições do equipamento . Vale ressaltar que o equipamento em si não precisa ser pré-especifiçado , pois o método aqui proposto funciona independente de um aparelho em especifico .

[ 0039] Com os dados gerados pelo espectrômetro de massas (A) , inicia-se a etapa ( 1 ) do método de seleção molecular que compreende a modelagem, alinhamento e redução de ruido dos dados , compreendendo na subetapa (1 . 1 ) a extração dos sinais espectrais de cada replicata e na subetapa ( 1 . 2 ) , a identificação das características espectrais presentes nas replicatas de cada amostra . Nesta etapa, em cada replicata, valores de intensidade de sinal abaixo de 10 ppm em relação ao sinal de maior intensidade, ou seja 10^-5, são eliminados de forma automática . Entretanto , os valores limites são pré- definidos conforme cálculos executados dinamicamente de acordo com o sinal . Após esse procedimento, o sinal espectral passa pela subetapa ( 1 . 3 ) em que esse sinal é aproximado por uma análise de sinais via distribuição Gaussiana, ou outras técnicas de identificação de sinais espectrais (por exemplo, por amostragem aleatória por consenso, RANSAC) , de forma a anotar as métricas de intensidade, largura do sinal , resolução e valor do m/ z (massa/carga) representado . Com os sinais coletados em todas as replicatas de uma amostra, procede-se com a subetapa ( 1 . 4 ) de alinhamento dos sinais que se encontram superpostos na faixa espectral determinada pela resolução dos ions (m/z ) em cada ponto do espectro . Cada alinhamento de sinais constitui-se em uma característica espectral que , então, é verificada de acordo com as seguintes regras que estão relacionadas à subetapa ( 1 . 5 ) : i- Se a mediana das intensidades espectrais dos sinais nas replicatas da amostra for 0 (Zero) , essa característica é considerada como ruído, pois a maioria de suas replicatas não contém sinais nesse ponto espectral ; deste modo, há a redução do ruído . ii- Após a eliminação de características conforme a regra i , aplica-se a etapa ( 2 ) de normalização de soma 1 .

[ 0040] Os vetores de características ( la ) definidos na etapa 1 seguem para a etapa (2 ) do método de seleção molecular a qual refere-se à normalização de domínio dos dados que compreende a normalização dos vetores de características ( la) , de forma que possam ser processados pelos algoritmos de aprendizagem de máquina em uma etapa futura . A normalização (2 ) é feita dividindo-se as intensidades dos sinais pela soma de todos os sinais da replicata . Dessa forma, a soma de todas as intensidades normalizadas dos sinais em cada replicata é igual a 1 . Essa normalização faz com que cada sinal represente a probabilidade de encontrar um íon m/ z em cada replicata do espectro . Dado que as replicatas da mesma amostra deveriam ser iguais em termos de probabilidades de ions presentes nas amostras, exceto pelos ruídos de aquisição. E então faz-se o descarte de características que apresentem valores de erro quadrático médio (Root Mean Square Error, RMSE) superiores a um limite definido como valor aceitável para o ruído de uma característica.

[0041]Nesta etapa (2) , os vetores são normalizados de forma independente através de uma referência espectral. Para o caso de larga banda espectral e fluídos complexos, é utilizado preferencialmente a maior intensidade espectral como referência 1, dividindo-se todos os elementos de cada vetor pela intensidade máxima do vetor. Porém, outras normalizações podem ser utilizadas dependendo do fluido analisado (por exemplo, normalização por z-norm, w-norm, t-norm, normalização por algum valor de referência previamente conhecido, entre outras) dos componentes conhecidos presentes na amostra, como por exemplo o uso de um padrão interno, que não é necessariamente exigido.

[0042] A etapa (3) do método de seleção molecular refere-se ao aprendizado com dados completos, e compreende a subetapa (3.1) de criação de um modelo matemático preditivo baseado em um algoritmo de classificação ou de regressão, sendo a escolha do algoritmo dependente do contexto da resposta a ser obtida com os vetores completos, ou seja, com todas as características coletadas no processo de aquisição. Para a criação dos modelos (3.1) , os conjuntos de dados (datasets) são submetidos a um embaralhamento (shuffling) de dados de tal forma que os procedimentos de treinamento, validação e testes sejam feitos de acordo com as melhores práticas em ciência de dados , qual seja, a correta separação dos subconjuntos evitando-se interseção e sobreposição . 0 processo de treinamento é compreendido, pelo menos , por 10 rodadas . Esse número de replicações pode ser alterado sem prejuízos ao método .

[ 0043]Neste processo, é conduzida a subetapa (3 . 2 ) referente à avaliação da performance preditiva do modelo com as métricas estatísticas decorrentes da avaliação dos resultados através de métricas de Exatidão, Sensibilidade, Especificidade , Precisão, Valor Preditivo Negativo, FIScore e/ou MCC (Matthews Correlation Coefficient) , sendo apuradas pela validação em várias rodadas não só a média dessas métricas mas também seus respectivos desvios padrão para a avaliação da robustez na predição . Caso os resultados não sejam satisfatórios , procede-se em termos de robustez preditiva, replaneja-se a coleta de mais amostras e condições de representatividade . Dessa maneira, estabelece-se uma linha base (baseline) em termos de resultados e um controle de qualidade interna ao próprio método . Vale ressaltar que a presente etapa também pode ser realizada por diversos algoritmos de aprendizado de máquina em sua formulação tais como Random Forests, extreme Random Forests, Gradient Tree Boosting, ADA Tree Boosting e/ou PLS-DA.

[ 0044] etapa ( 4 ) do método de seleção molecular refere-se à seleção recursiva de características discriminantes , que compreende a subetapa ( 4 . 1 ) de identificação das características mais importantes , ou seja, mais discriminantes presentes nos dados amostrais com relação à condição de interesse a ser diagnosticada pelo teste em geração . O processo da subetapa ( 4 . 1 ) de identificação das características mais importantes é feito a partir da aplicação recursiva do algoritmo de aprendizagem de máguina e procede-se com a subetapa (4 . 2 ) de avaliação de sua capacidade de predição para as características utilizadas em cada iteração .

[ 0045] Em cada iteração recursiva, as características são avaliadas para cada algoritmo através de análises probabilisticas inerentes do algoritmo, denominadas funções de determinação de importância, e que permitem o descarte das características menos importantes em cada etapa . Esse processo de otimização utiliza como função de custo associada, pelo menos , uma das métricas de desempenho escolhidas (como por exemplo, Exatidão/Acurácia, Sensibilidade, Especificidade, Precisão, Valor Preditivo Negativo, FlScore e/ou MCC) . O resultado obtido é uma curva de avaliação da capacidade de predição das características para o algoritmo onde então são determinadas , normalmente, pelo ponto de máximo ou pelo ponto de inflexão da curva, as variáveis de maior importância para a construção do modelo preditivo final . A essas características é atribuído o nome de características discriminantes e os algoritmos utilizados na etapa (4 ) são os mesmos listados na etapa ( 3 ) .

[ 0046] Vale ressaltar que , para a utilização do algoritmo PLS como seletor de características mais discriminantes , é feita uma modificação no cálculo do VIP ( Variable Influence on Projection ou Variable Importance on Projection) em que esta é calculada utilizando-se apenas os pesos da matriz de mapeamento do espaço de características para o espaço de componentes . Para a implementação do método com uso de algoritmo PLS, o VIP é calculado usando um fator de regularização que utiliza a ordem de importância das componentes no espaço rotacionado . A VIP passa a ser uma média ponderada dos coeficientes das características pelo fator de regularização calculado por r = k^-u onde r é o fator de regularização, k é a ordem da componente PLS no ranking de componentes , e u é um expoente no intervalo de 0 a 1 .

[ 0047] A etapa ( 5 ) do método de seleção molecular refere-se à filtragem probabilistica de características discriminantes e compreende a subetapa ( 5 . 1 ) de avaliação probabilistica das características determinantes , isolando aquelas que possuem diferenças significativas em termos de probabilidades associadas à condição de interesse . Ou seja, são particularmente importantes as características que possuem uma maior probabilidade de ter valores aumentados - características denominadas positivas , e que vão determinar biomarcadores chamados up regulated para a condição de interesse, e as características que possuem maior probabilidade de terem valores reduzidos para a condição de interesse características negativas , que vão determinar biomarcadores chamados down -regulated .

[ 0048] As características selecionadas de acordo com o critério probabilistico são denominadas características putativas ( 5a) , pois são as candidatas a biomarcadores para compor o modelo final de seleção . Procede-se, então, à subetapa (5.2) de avaliação do modelo preditivo com as características putativas, validando sua capacidade de seleção para, então, passá-las à próxima etapa se aprovados em função das métricas de performance atingidas .

[0049] Para a avaliação probabilistica das características (5.2) são utilizadas métricas de comparação de distribuição de variáveis aleatórias (por exemplo, Kolmogorov-Smirnov) . Em particular, na implementação experimental da presente invenção é utilizado o teste de hipótese de Kolmogorov-Smirnov amostrai indicando que as distribuições não são iguais e, em seguida, é aplicada a métrica deltaJ descrita da seguinte forma:

- Seja A = {A¹, A², ...,Aⁿ} um conjunto de amostras, rotuladas para a condição Y={y¹, y² , . . . , yⁿ}, onde y¹= [ 0 , 1 ] , sendo 1 para a condição satisfeita

(amostra positiva) ou 0 para a não satisfeita (amostra negativa) ;

- Seja cada amostra

onde cada valor corresponde aos valores

da mesma em todas as amostras no conjunto A, medidas em uma escala arbitrária diferente em cada amostra Aⁱ, mas constante para todas as variáveis de cada

amostra Aⁱ. Define-se ΔJ como:

- Onde

é o valor da variável j da amostra i do conjunto é o rótulo da amostra i do

conjunto A, y¹⁼ [ 0 , 1 ] ; x_j é o conjunto de valores da variável j para todas as amostras do conjunto A; A^p é o conjunto de amostras positivas em A, ou seja, rotuladas com y^p=l; é a mediana dos valores j

para todas as amostras do conjunto A^p; P(x_j) é a função de distribuição de probabilidade acumulada (Cumulative Distribution Function, CDF, em inglês) dos valores x_j e x_j no conjunto A^p; A^Q é o conjunto de amostras negativas em A, ou seja, rotuladas com é a mediana dos valores de variável j para

todas as amostras do conjunto A^Q; Q(x_j) é a função de distribuição de probabilidade acumulada (CDF em inglês) dos valores x_j ∈ x_j no conjunto A^Q;

[0050] A etapa (6) do método de seleção molecular refere-se à análise metabolômica e validação das características putativas associadas à condição de interesse e compreende a subetapa de (6.1) de validação bioquímica das características associadas à condição de interesse através do uso de bancos de dados com informações moleculares para metabolômica e/ou lipidômica em que o referido banco de dados pode ser atualizado com novas informações presentes na literatura, com elucidação estrutural molecular para as características putativas propostas por alta resolução; e a subetapa (6.2) de realização de experimentos de espectrometria de massas sequencial (ms/ms) para confirmação estrutural, e/ou validação por técnicas analíticas complementares, conforme subetapa (6.3) , de modo que ao fim desta etapa seja gerado as características putativas metabolicamente validadas (6a) . Caso alguma característica putativa seja identificada como uma molécula sem significância para a condição de interesse, ela pode ser eliminada do rol de biomarcadores para a condição de interesse e, caso necessário, após essa eliminação, o método retorna para a etapa (2) para a substituição e verificação de novas características putativas. Além disso, esta etapa (6) compreende, alternativamente, a supervisão de um especialista ao método de Inteligência Artificial utilizado em um processo de sinergia em busca dos biomarcadores mais eficaz para se identificar a condição de interesse.

[0051] A etapa (7) do método de seleção molecular refere-se a normalização em domínio das características putativas pareadas e compreende a normalização pareada das características putativas metabolicamente validadas da subetapa (6.1) . A referida etapa (7) é a que confere ao presente método a independência de um determinado modelo de espectrômetro . Nesta etapa, as características putativas da subetapa (6.1) são combinadas em pares através da subetapa (7.1) , criando um padrão endógeno a cada espectro e independente da escala do aparelho, pois as características putativas pareadas (7a) medem a relação entre as intensidades das características duas a duas .

[0052] A normalização pareada é definida da seguinte maneira :

[ 0053] Onde é o valor da variável j da amostra i do

conjunto

[ 0054] A fórmula da normalização pareada, um dos pontos chaves da metodologia, é feita de tal forma que se possa identificar a relação entre as duas características pareadas ( 7a) e, também, apontar qual das duas é a maior delas , comparando-as por meio da subetapa (7 . 2 ) . Com a normalização pareada com valor no intervalo entre 0 e 1 para duas características A e B, se o valor for 0 , 5, as características têm igual intensidade no vetor . Se o valor normalizado é menor que 0 , 5, então a característica B tem intensidade maior que A e, em particular, se o valor for 0 , então a característica A tem valor 0 . Se o valor normalizado é maior que 0 , 5 , a característica A tem maior intensidade que B e, em particular, se o valor normalizado é 1 , então a característica B tem intensidade 0 .

[ 0055] O pareamento de características putativas positivas (aumentadas com a condição de interesse) com características putativas negativas (diminuídas com a condição de interesse ) amplifica essa relação de desigualdade probabilistica, criando características ainda mais discriminantes no modelo predito, favorecendo a seleção molecular de maior performance .

[ 0056] Matematicamente, utilizando-se o método DeltaJ, definido anteriormente, como avaliador das características putativas quanto à sua atuação na condição de interesse, tem-se a análise pareada como definida a seguir.

[0057] Sendo : Então pode-se dizer que o ΔJ

(DeltaJ) da variável normalizada cruzada Γ_t,_u variável normalizada, ou seja, tem as seguintes propriedades:

- Se X_t tem probabilidade alta de ter valores mais altos para a condição em teste, ou seja, ΔJ(X_t)>0, e X_u tem probabilidade alta de ter valores mais baixos para a condição em teste, ou seja, ΔJ(X_u)<0, então: ΔJ(Γ_t,_u) >o.

- Se X_t tem probabilidade alta de ter valores mais baixos para a condição em teste, ou seja, ΔJ(X_t)<0, e X_u tem probabilidade alta de ter valores mais altos para a condição em teste, ou seja, ΔJ(X_u)>0, então: ΔJ(Γ_t,_u)<0.

[0058] A etapa (8) do método de seleção molecular refere-se à seleção recursiva de características putativas pareadas (7a) e compreende a geração e avaliação do modelo preditivo final (8a) a ser liberado para o uso em seleção ou para avaliar, processos em outras áreas de conhecimento que tenham alguma condição de interesse como, por exemplo, em análises de controle de qualidade. Na referida etapa, utilizam-se as características putativas validadas (7a) pela metabolômica e normalizadas em pares na metodologia de determinação das características (pareadas) mais discriminantes, em que a referida etapa (8) compreende as subetapas (8.1) , (8.2) e (8.3) em submeter o modelo candidato final pelas avaliações contidas nas etapas (3) , (4) e (5) respectivamente. Sendo o modelo resultante (8a) , dessa etapa ( 8 ) , o modelo que deverá ser utilizado na seleção molecular (Figura 3 ) , por exemplo .

Exemplo de aplicação

[ 0059] Esta seção descreve uma aplicação detalhada do método na análise e geração de um modelo de seleção para uma condição específica . Para este caso, considera-se amostras espectrais de dois grupos de amostras rotuladas como Controle - negativas para a condição - e condição de interesse - positivas para a mesma .

[ 0060] Para o teste , foram coletadas 54 amostras de material biológico sendo divididas em 27 da classe controle e 27 da classe condição de interesse . As amostras foram preparadas e injetadas em um espectrômetro de massas em 10 leituras consecutivas gerando-se , dessa forma, 540 espectros . Para cada classe (Controle e Condição) foram adquiridos 290 espectros . Os espectros foram capturados na faixa de sinal de 300 a 1300 (m/ z ) com resolução variando entre 5 a 10 ppm nessa faixa no modo de ionização positiva .

[ 0061] Extraídos os dados dos espectros obtidos a partir dos espectrômetros de massas , as análises e a geração do método da presente invenção descrito nas etapas a seguir foram todas realizadas utilizando-se a solução proposta e software desenvolvido especialmente para implementação dos conceitos dessa invenção e registrado no INPI com certificado número BR512020001172 - 1 com datas de publicação e criação 05/06/2020 , expedido em 30/ 06/2020 , com titular UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP e autores LUIZ CLAUDIO NAVARRO; JEANY DELAFIORI ; RODRIGO RAMOS CATHARINO; e ANDERSON DE REZENDE ROCHA, os mesmos da presente invenção .

[ 0062] etapa 1 compreende a geração dos vetores de características a partir dos espectros adquiridos , passando-se por uma etapa de seleção e identificação dos sinais através de modelagem gaussiana, redução de ruídos com a eliminação de sinais díspares entre as replicatas e alinhamento dos sinais em características , segundo a resolução do equipamento em cada faixa; o que resulta em um conjunto de vetores organizados em uma matriz de dados a qual é referida de matriz dos vetores de características .

[ 0063] Ao final do processo de extração de características e aplicadas às regras de filtragem, conforme descrito na presente invenção , tem-se 129 ions de massa/carga (m/ z ) características com potencial de representatividade a serem então filtradas pelas técnicas de aprendizagem de máquina .

[ 0064] No presente exemplo, os processos de aprendizagem de máquina na geração e testes dos modelos foram realizados em 10 rodadas para a apuração das métricas de performance de predição, sendo os dados totais embaralhados em cada rodada e divididos em 70% das amostras no treinamento dos algoritmos e 30% das mesmas em cada classe para os testes de validação conforme indica a tabela . Todas as replicatas de cada amostra são mantidas sempre juntas na partilha dessas partições de treinamento e testes de validação .

[ 0065] Na etapa 2 , a matriz de características de 540 vetores por 129 características foi normalizada pela técnica máximo igual a 1 , em que todos os elementos de cada vetor são divididos pelo valor máximos dos elementos do vetor .

[ 0066 ] Em seguida, na etapa 3 , a avaliação da capacidade preditiva inicial e dos modelos a serem criados , foi executado o processo de aprendizagem e validação utilizando o algoritmo ADA Tree boosting e Randon Forest em 10 rodadas com as partições de treinamento e validação conforme descritos na descrição detalhada . A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos para o modelo inicial completo .

Tabela 1 - Resultados dos testes de validação do modelo preditivo completo

[ 0067 ] Na etapa 4 , utilizou-se o algoritmo ADA Tree

Boosting para as interações recursivas de otimização com as características ordenadas eliminando as de menor significância para o modelo preditivo (baseado na importância das variáveis provida pela análise das árvores do modelo) . Como função de custo para a avaliação do modelo, foi adotada a métrica Matthews Correlation Coefficient sendo cada iteração realizada com 10 rodadas e métrica avaliada por sua média e desvio padrão . O processo mostrado no gráfico da Figura 4 resultou na escolha de 22 características listadas na Tabela 2 , as quais produziram o melhor desempenho preditivo para a métrica MCC .

Tabela 2 - 22 características mais discriminantes determinadas pelo processo de otimização .

[ 0068 ] As Figuras 5 e 6 ilustram a etapa 5 . A Figura 5 apresenta a análise de duas características da lista de 22 selecionadas , indicando os respectivos ΔJ calculados conforme definido na descrição detalhada e o mapa de calor da Figura 6 mostra uma avaliação do modelo gerado com as 22 características mais discriminantes relacionando a probabilidade de valores mais altos nas amostras positivas e negativas com a taxa de acerto das amostras , o que ajuda a avaliação das características e sua elucidação durante a pesquisa metabolômica .

[ 0069 ] Na etapa 6, os 22 ions foram avaliados nos espectros , identificado as moléculas correspondentes através de metodologia metabolômica e sua relação com as vias metabólicas aumentadas e diminuídas conforme a maior probabilidade de aumento e diminuição na condição avaliada . Após a validação metabolômica, 19 delas foram selecionadas para a etapa posterior de construção do modelo de seleção a partir da otimização das características pareadas .

[ 0070 ] Na etapa 7 , os 540 vetores compostos de 19 elementos correspondentes aos ions de m/z selecionados na primeira fase do processo são normalizados de acordo com a definição de normalização pareada contida na presente invenção . Os 19 ions combinados 2 x 2 geram n = (19* 18 ) /2=171 características pareadas que passam a compor os vetores das amostras .

[ 0071 ] É feita então a filtragem de acordo com as regras de correlação e representatividade, ficando os vetores reduzidos a 71 características pareadas que passam então ao processo de geração do modelo de seleção otimizado .

[ 0072 ] Por fim, na etapa 8 , a matriz de características resultante da etapa anterior passa pelos mesmos procedimentos das etapas 3 , 4 e 5 resultando no modelo de seleção final .

[ 0073 ] A Tabela 3 apresenta os resultados com o modelo completo das 71 características iniciais (baseline para as pareadas) .

Tabela 3 - Resultados dos testes de validação do modelo preditivo completo das características pareadas .

[ 0074 ] A Figura 7 ilustra o processo de otimização sobre as características pareadas resultando em 14 variáveis pareadas que após a análise de distribuições resultou na escolha de 13 delas para o modelo final otimizado . Na Tabela 4 , são apresentadas as 13 características pareadas escolhidas com as correspondentes 14 características putativas identificadas na primeira fase . Tabela 4 - características pareadas mais discriminantes determinadas pelo processo de otimização e os m/z pareados correspondentes .

[ 0075 ] A Tabela 5 e a Figura 8 mostram os resultados finais da validação do classificador de seleção gerado utilizando-se o algoritmo Gradien t Tree Boosting (GDB) , o qual apresentou desempenho um pouco melhor para as características finais sendo então liberado para o uso com o software de diagnósticos .

Tabela 5 - Resultados dos testes de validação do modelo preditivo otimizado de características pareadas .

[ 0076 ] A Tabela 6 mostra os resultados do teste final (Etapa 8 ) antes da liberação do modelo para o sistema de seleção, indicando sua performance com um conj unto de amostras mantidas em separado e não utilizadas nas fases anteriores .

Tabela 6 - Resultados dos testes finais do modelo das características pareadas .

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método automático para seleção molecular caracterizado por ser realizado a partir de dados obtidos de espect romet ria de massas e compreender as etapas de:

(1) modelagem, alinhamento e redução de ruido dos dados:

(1.1) extração dos sinais espectrais de cada replicata;

(1.2) identificação das características espectrais presentes nas replicatas e eliminação automática de valores de intensidade de sinal abaixo de 10 ppm em relação ao sinal de maior intensidade (10- ⁵) ;

(1.3) análise de sinais via distribuição Gaussiana por métricas de intensidade, largura do sinal, resolução e valor do m/ z (massa/carga) ;

(1.4) alinhamento dos sinais superpostos na faixa espectral determinada pela resolução dos ions (m/z) em cada ponto do espectro e cada alinhamento de sinais resultando em uma característica espectral;

(1.5) redução do ruído se a mediana das intensidades espectrais dos sinais nas replicatas da amostra for 0 (Zero) ;

- Obtenção vetores de características (la) ;

(2) normalização de domínio dos dados:

- a normalização de soma 1 é dada por:

onde é o valor da variável j da amostra i do

conjunto representa o valor de

todas as variáveis da amostra i; (3) criação do modelo de aprendizado com dados completos:

(3.1) criação do modelo matemático preditivo:

- separação dos conjuntos de dados (datasets) em subconjuntos baseada em um algoritmo de classificação ou de regressão, evitando-se interseção e sobreposição; o treinamento é compreendido, pelo menos, por 10 rodadas, permutando-se os subconjuntos;

(3.2) avaliação da performance preditiva do modelo aplicado na etapa (3.1) com as métricas de Exatidão, Sensibilidade, Especificidade, Precisão, Valor Preditivo Negativo, FIScore e/ou MCC (Matthews Correlation Coefficient) ;

(4) seleção recursiva de características discriminantes:

(4.1) identificação das características a partir da aplicação recursiva do algoritmo de aprendizagem de máquina ;

(4.2) avaliação de capacidade de predição para as características;

(5) filtragem probabilistica de características discriminantes :

(5.1) avaliação probabilistica das características determinantes :

- as que possuem maior probabilidade de terem valores reduzidos para a condição de interesse - características negativas; obtenção das características putativas (5a) ; (5.2) avaliação do modelo preditivo com as características putativas (5a) :

- Seja A = {A¹, A², ... ,Aⁿ} um conjunto de amostras, rotuladas para a condição Y={y¹, y², ... , yⁿ}, onde yⁱ=[0, l] , sendo 1 para a condição satisfeita (amostra positiva) ou 0 para a não satisfeita (amostra negativa) ;

- Seja cada amostra onde cada

valor corresponde aos

valores da mesma em todas as amostras no conjunto A, medidas em uma escala arbitrária diferente em cada amostra Aⁱ, mas constante para todas as variáveis de cada amostra A^í;

- define-se DeltaJ como:

Onde é o valor da variável j da amostra i do

conjunto é o rótulo da amostra i do

conjunto ;

x_j é o conjunto de valores da variável j para todas as amostras do conjunto A;

A^p é o conjunto de amostras positivas em A, ou seja, rotuladas com y^p=l; é a mediana dos valores j para todas as

amostras do conjunto A^p; P (xj) é a função de distribuição de probabilidade acumulada (Cumulative Distribution Function, CDF, em inglês) dos valores x_j e x_j no conjunto A^p;

A^Q é o conjunto de amostras negativas em A, ou seja, rotuladas com y^Q=l;

é a mediana dos valores de variável j para todas as amostras do conjunto A^Q; é a função de distribuição de probabilidade

acumulada (CDF em inglês) dos valores x_j e x_j no conjunto A^Q;

(6.2) confirmação experimental por espect romet ria de massas sequencial; e/ou

(6.3) validação por técnicas analíticas complementares ;

- Obtenção de características putativas metabolicamente validadas (6a) ;

(7) normalização em dominio das características putativas pareadas :

(7.1) pareamento das características validadas na sub-etapa (6.1) :

- Onde é o valor da variável j da amostra i do

conjunto

(7.2) normalização do pareamento para intervalo [0, 1] :

- aplicação uma segunda transformação de acordo com a fórmula abaixo:

se o valor normalizado está no intervalo entre 0 e 1 para duas características A e B, se o valor for 0, 5, as características têm igual intensidade no vetor;

- se o valor normalizado é menor que 0, 5, então a característica B tem intensidade maior que A e, em particular, se o valor for 0, então a característica A tem valor 0;

- se o valor normalizado é maior que 0, 5, a característica A tem maior intensidade que B e, em particular, se o valor normalizado é 1, então a característica B tem intensidade 0;

- Obtenção de características pareadas (7a) ;

(8) Seleção recursiva de características putativas pareadas :

(8.1) resubmissão das características pareadas (7a) à etapa (3) ;

(8.2) resubmissão das características pareadas (7a) à etapa (4) ;

(8.3) resubmissão das características pareadas (7a) à etapa (5) ; e

- Obtenção de características putativas met abolomicamente validadas (8a) .