CN114778748B

CN114778748B - 一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法

Info

Publication number: CN114778748B
Application number: CN202210480890.5A
Authority: CN
Inventors: 吕世明; 陈逸敏; 宋旭琴; 谭艾娟
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114778748A

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，其步骤是：A、土壤样品进行处理：称取土壤样品，加入提取剂A涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取残留物并合并提取液，再加入净化剂B，涡旋振荡并离心，取上清液氮气吹干，残渣用体积比80：20的甲醇和含0.5%甲酸的5 mmol乙酸铵水溶液混合液溶解，经滤膜过滤，滤液供HPLC检测；所述的提取剂A是2%EDTA水：2%甲酸乙腈=1：4；所述的净化剂B是N‑丙基乙二胺（PSA）；B、HPLC分析；C、标准曲线法定量检测。本发明对仪器要求相对较低，方法操作简便，检测限低、灵敏度、准确度和精密度高。

Description

一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法

技术领域

本发明属于土壤安全监测技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法。

背景技术

盐酸氯苯胍(Robenidine)属胍基衍生物，分子结构式为C₁₅H₁₃CL₂N₅·HCL，主要用于预防和治疗兔和禽类球虫病的感染。对柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和变位艾美耳球虫等均有效果。其抗球虫机理是影响三磷酸腺苷，干扰球虫蛋白质代谢。中华人民共和国兽药典推荐禽类内服氯苯胍剂量为10～15mg/kg。因其良好的抗球虫病效果，一直作为饲料药物添加剂在养禽业中大量使用，研究表明，动物摄食后的盐酸氯苯胍超过80％会随粪便以原形排出，过程中不仅造成动物源性食品残留影响人体健康，还会在环境中残留(如土壤和水体)，对环境生态产生危害作用。我国食品安全兽药最高残留量规定盐酸氯苯胍的每日允许摄入量(ADI)为0-5μg/kg体重，在鸡皮肤和脂肪中最大残留限量值为200μg/kg，其他可食组织最大残留限量值为100μg/kg。可见，盐酸氯苯胍的残留问题越来越受到人们关注。

为更全面的评价盐酸氯苯胍残留风险，保障环境生态安全，提供一种可靠的定性和定量方法分析土壤中盐酸氯苯胍残留是非常必要的，但目前国内外未见土壤中氯苯胍残留检测相关报道，且大多数有关盐酸氯苯胍的检测是使用高效液相色谱串联质谱进行检测，对于仪器方面要求较高。如中国专利CN109709227B公开的是《高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法》。

因此有必要开发一种灵敏度高、操作方便、准确和快速测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的检测方法，本发明提供了一种基于高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法。目前，国内外未见有高效液相色谱测定土壤中氯苯胍残留方法的报道或专利申请。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种基于高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，该方法对仪器要求相对较低，方法操作简便，检测限低、灵敏度、准确度和精密度高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，其步骤是：

A、土壤样品进行处理：称取土壤样品，加入提取剂A涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取残留物并合并提取液，再加入净化剂B，涡旋振荡并离心，取上清液氮气吹干，残渣用体积比80：20的甲醇和含0.5％甲酸的5mmol乙酸铵水溶液混合液溶解，经滤膜过滤，滤液供HPLC检测；所述的提取剂A是2％EDTA水：2％甲酸乙腈＝1：4；所述的净化剂B是N-丙基乙二胺(PSA)；

B、HPLC分析条件：流动相：有机相为甲醇，水相为含0.5％甲酸的5mmol乙酸铵水溶液，洗脱梯度程序：起始梯度为体积浓度60％的甲醇，2-8min内增加到体积浓度90％的甲醇，10-11min内降低到体积浓度为40％的甲醇；紫外检测器发射波长为317nm，进样体积为50μL；

C、标准曲线法定量：采用外标法建立标准曲线，分别配制不同浓度的盐酸氯苯胍溶液，用高效液相色谱仪检测，以浓度对数为横坐标(x)，峰面积对数为纵坐标(y)，建立标准曲线，并据此计算样品浓度。

优选地，步骤A的滤膜孔径不大于0.22μm。

优选地，步骤B的色谱柱：C18(4.6×250mm,5μm)，柱温：25℃，流速为1mL/min。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)本发明采用高效液相色谱仪进行检测，对仪器要求相对较低，方法操作简便，检测限低、灵敏度、准确度和精密度高。

(2)本发明可用于土壤中盐酸氯苯胍的残留测定，进而用于氯苯胍在土壤中的残留消除规律研究和土壤环境质量评估。

附图说明

图1为实施例1不同提取剂对盐酸氯苯胍回收率的影响。

图2为实施例1不同剂量N-丙基乙二胺PSA净化剂对盐酸氯苯胍回收率的影响。

图3为实施例2中土壤中盐酸氯苯胍加标样品的HPLC色谱图。

图4为实施例3中土壤-鸡粪-盐酸氯苯胍模型中盐酸氯苯胍的HPLC的色谱图。

图5为实施例3中土壤-鸡粪-盐酸氯苯胍模型中盐酸氯苯胍的浓度变化。

具体实施方式

以下结合附图和较佳实施例，对本发明的具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

实施例1：一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法的优化

1、色谱条件的优化

将10μg/mL的盐酸氯苯胍通过注射泵注入到高效液相色谱仪中，通过上述目标物在不同发射波长和洗脱梯度的响应度选择合适的测试模式，结果表明，盐酸氯苯胍在317nm波长处响应最高，梯度洗脱时的响应面积较等度洗脱时大，因此盐酸氯苯胍在317nm和梯度洗脱模式下进行分析。

2、提取剂的筛选

通过土壤加标样品(10μg/g，n＝3)以盐酸氯苯胍的加标回收率来评价和筛选适用于提取和净化样品的提取剂和净化剂。

提取剂乙腈、2％乙酸乙腈、2％EDTA水：2％乙酸乙腈(1：1)、2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：1)、1.3％柠檬酸：1％磷酸氢二钠：3.7％EDTA、2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：2)、2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：3)、2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：4)和2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：5)，筛选结果见图1。由图1可见，加入EDTA后的回收率较未加入时提取率明显升高，其中使用2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：4)提取时，回收率最高，这可能是由于EDTA作为一种螯合剂，对土壤中的金属离子等进行螯合，从而提高了回收率。因此，最终优选2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：4)作为本实验的提取剂。

3、净化剂的筛选

在残留检测中，常用的净化剂有十八烷基硅烷键合硅胶ODS、N-丙基乙二胺PSA和多壁碳纳米管MWCNT15，有研究发现PSA可与金属离子产生鳌合作用，可以有效去除脂肪酸,有机酸,和一些极性色素及糖，因此，本实验选用N-丙基乙二胺PSA净化剂比较了不同剂量对净化效果的影响，以回收率作为评价标准，结果见图2。结果表明，不同剂量的净化剂回收率均大于90％，但20mg/mL时净化效果较差，杂质峰较多，100mg/mL时回收率无明显上升，从经济节约方面考虑，本实验最终选用50mg/mL N-丙基乙二胺PSA作为净化剂。

实施例2：一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，其步骤是：

A、称取1g土壤样品于15mL离心管中，加入盐酸氯苯胍标准溶液，使样品中盐酸氯苯胍的浓度分别为0.2、1和2μg/kg，加入5mL提取剂2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：4)，涡旋振荡30s，震荡提取30min，10000rpm离心20min，上清液体放于另一离心管中，残留物被重新提取一次，合并两次提取液于离心管中，加入0.50g PSA，涡旋振荡30s，10000rpm离心10min，上层液体转移到20mL的玻璃管中置45℃氮吹仪上，全部吹干后用体积比80：20的甲醇和含0.5％甲酸的5mmol乙酸铵水溶液混合液溶解残渣，8000rpm离心5min，取上清液过0.22μm的滤膜，用于HPLC分析。

B、HPLC分析条件：色谱柱：Extend-C18(4.6×250mm,5μm)，柱温：25℃，流速为1mL/min，流动相：有机相为甲醇，水相为含0.5％甲酸的5mmol乙酸铵水溶液，洗脱梯度程序：起始梯度为体积浓度60％的甲醇，2-8min内增加到体积浓度90％的甲醇，10-11min内降低到体积浓度为40％的甲醇，紫外检测器发射波长为317nm，进样体积为50μL。

C、土壤中盐酸氯苯胍的定量采用标准曲线法，其制备是通过标准溶液中盐酸氯苯胍定量离子的峰面积值y为纵坐标与盐酸氯苯胍的浓度值x(0.2～10μg/mL)为横坐标，绘制盐酸氯苯胍的标准曲线为y＝367.7x+21.864，r²＝0.9999。土壤中盐酸氯苯胍残留量的计算方法，将HPLC测定的样品中盐酸氯苯胍定量离子的峰面积值作为y带入盐酸氯苯胍标准曲线计算出盐酸氯苯胍的残留量x。

回收率(％)＝加标样品浓度测定÷加标浓度×100％

精密度包括日内精密度和日间精密度，日内精密度表示一天内相同添加浓度不同批次加标样品测定间的符合程度。日间精密度表示一周内连续制备并测定加标样品浓度计算日间精密度。

精密度＝标准偏差(SD)÷测定加标样品浓度的平均值×100％

以≥3倍的信噪比为方法的检测限，≥10倍信噪比为方法的定量限。

获得土壤中盐酸氯苯胍的加标色谱图见图3。土壤中盐酸氯苯胍的加标回收率、准确度和精密度见表1，检测限和定量限见表2。结果表明，目标物的回收率为93.20％～96.76％。土壤中盐酸氯苯胍的检测限和定量限分别为0.06μg/g和0.2μg/g。

表1.土壤中盐酸氯苯胍的准确度、回收率和精密度(n＝6)

表2.土壤中盐酸氯苯胍检测限和定量限

实施例3：一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法的应用。

将鸡粪、盐酸氯苯胍和土壤按照比例混合(20g/kg鸡粪/土壤)构建土壤-鸡粪-盐酸氯苯胍模型，在模型内均匀喷入盐酸氯苯胍标准溶液，使模型中盐酸氯苯胍的浓度为8mg/kg(盐酸氯苯胍/土壤)。建立模型后在1、3、5、10、15、30和45d按五点取样法收集土壤样品后-80℃冷冻保存，待分析，分析前将土壤解冻，土壤样品的测定步骤：

A、称取1g土壤样品于15mL离心管中，加入5mL提取剂2％EDTA水：2％甲酸乙腈(1：4)，涡旋振荡30s，震荡提取30min，10000rpm离心20min，上清液体放于另一离心管中，残留物被重新提取一次，合并两次提取液于离心管中，加入0.50g PSA，涡旋振荡30s，10000rpm离心10min，上层液体转移到20mL的玻璃管中置45℃氮吹仪上，全部吹干后用体积比80：20的甲醇和含0.5％甲酸的5mmol乙酸铵水溶液混合液溶解残渣，8000rpm离心5min，取上清液过0.22μm的滤膜，用于HPLC分析。

B、HPLC分析条件：色谱柱：Extend-C18(4.6×250mm,5μm)，柱温：25℃，流速为1mL/min，流动相：有机相为甲醇，水相为含0.5％甲酸的5mmol乙酸铵水溶液，洗脱梯度程序：起始梯度为体积浓度60％的甲醇，2-8min内增加到体积浓度90％的甲醇，10-11min内降低到体积浓度为40％的甲醇，紫外检测器发射波长为371nm，进样体积为50μL。

C、标准曲线法定量：采用实施例2中绘制的标准曲线，计算土壤-鸡粪-盐酸氯苯胍模型中的盐酸氯苯胍残留量。

通过测定模型中的土壤样品，发现在实际土壤样品中主要存在盐酸氯苯胍，获得的色谱图见图4和时间浓度数据见表3和图5。

表3.构建土壤-鸡粪-盐酸氯苯胍模型中盐酸氯苯胍的浓度

时间(d)	盐酸氯苯胍浓度(mg/kg)
		1	7.23
3	6.97
		5	6.27
10	5.74
		15	4.82
30	3.08
		45	2.03

综上所述，本发明可用于土壤中盐酸氯苯胍的残留测定，进而用于氯苯胍在土壤中的残留消除规律研究和土壤环境质量评估。本发明检测限低，灵敏度、准确度和精密度高。

以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，其特征在于：其步骤是：

A、土壤样品进行处理：称取土壤样品，加入提取剂A涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取残留物并合并提取液，再加入净化剂B，涡旋振荡并离心，取上清液氮气吹干，残渣用体积比80：20的甲醇和含0.5%甲酸的5 mmol乙酸铵水溶液混合液溶解，经滤膜过滤，滤液供HPLC检测；所述的提取剂A是2%EDTA水：2%甲酸乙腈=1：4；所述的净化剂B是50 mg/mL的N-丙基乙二胺PSA；

B、HPLC分析条件：流动相：有机相为甲醇，水相为含0.5%甲酸的5 mmol乙酸铵水溶液，洗脱梯度程序：起始梯度为体积浓度60%的甲醇，2-8 min内增加到体积浓度90%的甲醇，10-11 min内降低到体积浓度为40%的甲醇；紫外检测器发射波长为317 nm，进样体积为50 μL；

C、标准曲线法定量：采用外标法建立标准曲线，分别配制不同浓度的盐酸氯苯胍溶液，用高效液相色谱仪检测，以浓度对数为横坐标x，峰面积对数为纵坐标y，建立标准曲线，将HPLC测定的样品中盐酸氯苯胍定量离子的峰面积值作为y带入盐酸氯苯胍标准曲线计算出盐酸氯苯胍的残留量x。

2.如权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，其特征在于：所述步骤A的滤膜孔径不大于0.22μm。

3.如权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定土壤中盐酸氯苯胍残留量的方法，其特征在于：所述步骤B的色谱柱：4.6×250 mm,5μm的C18，柱温：25℃，流速为1 mL/min。