CN107576745A

CN107576745A - 甲壳类水产品中4‑己基间苯二酚的hplc‑ms/ms检测方法

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Publication number: CN107576745A
Application number: CN201710932942.7A
Authority: CN
Inventors: 叶素丹; 郝云彬; 阙斐; 陈岭; 冯文婕
Original assignee: Zhejiang Economic & Trade Polytechnic
Current assignee: Zhejiang Economic & Trade Polytechnic
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明涉及化学物质检测技术领域，具体而言，涉及一种甲壳类水产品中4‑己基间苯二酚的HPLC‑MS/MS检测方法，包括：使用乙腈和二氯甲烷的混合溶液提取待检测样品中残留的4‑己基间苯二酚，提取液旋转蒸发至近干后用二氯甲烷溶解，固相萃取柱净化，用流动相溶解，通过高效液相色谱质谱联用系统进行检测。本发明建立了合适的样品提取、净化、浓缩的前处理方法，确保分析测定时样品基质干扰最少；并对色谱质谱条件进行优化，最终确定了外标法定量。本方法的定量限为4μg/kg，在各个浓度的加标回收率均在70％以上。

Description

甲壳类水产品中4-己基间苯二酚的HPLC-MS/MS检测方法

技术领域

本发明涉及化学物质检测技术领域，具体而言，涉及一种甲壳类水产品中4-己基间苯二酚的HPLC-MS/MS检测方法。

背景技术

南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)，学名凡纳滨对虾。我国有很多地区养殖南美白对虾，其中杭州市南美白对虾养殖面积2013年为10.3万亩，2013年全市南美白对虾总产量达到3.4万吨，是杭州市最大宗、支柱性水产养殖产品之一。

南美白对虾含有蛋白质、微量元素及生理活性等丰富营养物质，其特有呈味物质所产生的口味与人们的最佳味觉非常吻合，味道鲜美，但甲壳类极易黑变。其在捕获后，由于体内的多酚氧化酶(PPO)加速其一系列生化反应，在壳体上产生黑色素沉淀，即形成黑点。壳上的黑点严重影响外观，同时也制约着它的商品价值。多酚氧化酶天然地存在甲壳内和甲壳下面的组织中，这种酶在冷冻、冰贮和解冻期间仍然保持着活性。

目前国内一般使用焦亚硫酸钠抑制其黑变，但是在使用过程中极易造成SO₂超标，严重影响加工制品的质量和安全性。

对于虾蟹等甲壳类黑变抑制剂，欧洲和美国使用4－己基间苯二酚(4-Hexylresorcinol，以下简称4-HR)复合物来作为抑制剂，其可有效的抑制海水甲壳类体内多酚氧化酶的活性，同时起到保鲜的效果，而且在允许使用的范围内被认为是一种对人体安全性的添加剂。4-己基间苯二酚美国辉瑞公司最早研发出主要成分为4-HR的、应用于虾类保鲜防黑变的产品“虾鲜宝”；我省也有企业已经在国内首先开始生产销售主要成份为4-HR的虾类防黑变保鲜剂。欧盟、美国等国家和地区对4-HR在虾肉中残留有限量规定，使用此标准因其检出限低可以有效的检出虾肉中低含量的4-HR，从而能有效控制虾产品质量和安全性。

国内外报道检测4-HR检测方法的文献主要有高效液相色谱法和气相色谱法两种。查阅到Liquid chromatographic determination of the processing aid 4-hexylresorcinol in shrimp(J Of Anal Chem.1991 Nov-Dec；74(6):1003-5)，Determination of 4-hexylresorcinol in shrimp by liquid chromatography withfluorescence detection.(J.AOAC Int.2000 Jan-Feb；83(1):241-4)，Determination of4-hexylresorcinol in crab meat.(J AOAC Int.1998 Mar-Apr；81(2):488-91.)和高效液相色谱荧光检测法测定虾中的4-己基间苯二酚等文献。但以上方法都存在一定的不足。气相色谱(GC-FID)检出限不能完成满足标准的需要，液相色谱荧光检测法在检出限上可以满足要求，但是由于其定性的能力不足，所以在某种程度上存在着一定的缺陷。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲壳类水产品中4-己基间苯二酚的HPLC-MS/MS检测方法，所述的方法灵敏度和准确度稿，精密度好。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种甲壳类水产品中4-己基间苯二酚的HPLC-MS/MS检测方法，包括：

使用乙腈和二氯甲烷的混合溶液提取待检测样品中残留的4-己基间苯二酚，提取液旋转蒸发至近干后用二氯甲烷溶解，固相萃取柱净化，用流动相溶解，通过高效液相色谱质谱联用系统进行检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明以液相色谱串联质谱为工具，系统的研究了4-HR的检测方法。高效液相色谱法稳定性高，重现性好，而且液相色谱仪在食品安全检测实验室已经普及。本发明建立了合适的样品提取、净化、浓缩的前处理方法，确保分析测定时样品基质干扰最少；并对色谱质谱条件进行优化，最终确定了外标法定量。本方法的定量限为4μg/kg，在各个浓度的加标回收率均在70％以上，完全可以满足GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定的4-HR在虾中1mg/kg的残留限量的要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为1.0μg/kg南美白对虾样品加标色谱图；

图2为4.0μg/kg南美白对虾样品加标色谱图。

具体实施方式

优选的，如上所述的方法，所述甲壳类水产品包括虾、蟹。

优选的，如上所述的方法，所述乙腈和二氯甲烷的混合溶液中乙腈和二氯甲烷的体积比为7:(2～4)；

更优选的，所述乙腈和二氯甲烷的混合溶液中乙腈和二氯甲烷的体积比为7:3；

优选的，所述使用乙腈和二氯甲烷的混合溶液提取待检测样品中残留的4-己基间苯二酚的具体步骤包括：

将所述检测样品与乙腈和二氯甲烷的混合溶液按1g：9mL～11mL的比例进行混合，更优选1g：10mL；匀浆超声处理后离心，得到上清液；再重复上述步骤1次，合并提取液。

优选的，如上所述的方法，所述固相萃取柱为氨基固相萃取柱；

更优选的，所述氨基固相萃取柱由硅胶键合氨丙基得到。

优选的，如上所述的方法，所述的氨基固相萃取柱在使用前用水溶性有机溶剂活化；

更优选的，所述的水溶性有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、丙酮、氨水甲醇溶液中的一种或多种；

更优选的，所述水溶性有机溶剂选自甲醇和丙酮的混和溶液。

优选的，如上所述的方法，所述的氨基固相萃取柱所用的洗脱液为非极性有机溶剂；

更优选的，所述非极性有机溶剂为正己烷。

优选的，如上所述的方法，所述高效液相色谱所用的色谱柱为C18液相色谱柱；

更优选的，所述C18液相色谱柱的内径和长度为1.5mm～3.0mm×50mm～100mm；

更优选的，所述C18液相色谱柱的内径和长度为2.1mm×75mm。

优选的，如上所述的方法，所述C18液相色谱柱的柱温为35℃～40℃；

柱温也可以选择36℃、37℃、38℃或39℃。

优选的，如上所述的方法，进行所述高效液相色谱时，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；

流动相A为1.5～2.5m mol/L的乙酸铵水，流动相B为甲醇。

优选的，如上所述的方法，所述梯度洗脱的程序为：

0～3.5min时，流动相A 5～15vt％，流动相B 85～95vt％进行洗脱；

3.5～3.6min时，逐渐增加流动相A的比例，减小流动相B的比例，至流动相A 35～45vt％，流动相B 55～65vt％后继续洗脱1.2～1.6min；

优选的，0～3.5min时，流动相A 10vt％，流动相B 90vt％进行洗脱；

3.5～3.6min时，逐渐增加流动相A的比例，减小流动相B的比例，至流动相A40vt％，流动相B 60vt％后继续洗脱1.4min；

优选的，流速为0.3～0.5mL/min，更优选0.4mL/min；

优选的，初始有机相比例为50％～70％，更优选60％；

优选的，进样量为8μL～12μL，更优选10μL。

优选的，如上所述的方法，所述质谱的条件为：

离子源：电喷雾离子源；扫描极性：负离子扫描；扫描方式：多反应监测；离子喷雾电压：3.2～3.8kV；雾化气：氮气，流速2.0～4.0L/min；干燥气：氮气，流速13～17L/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：240℃～260℃；加热模块温度：380℃～420℃；

更优选的，所述质谱的条件为：

离子源：电喷雾离子源；扫描极性：负离子扫描；扫描方式：多反应监测；离子喷雾电压：3.5kV；雾化气：氮气，流速3.0L/min；干燥气：氮气，流速15L/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：250℃；加热模块温度：400℃。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例

一、检测技术方案

1适用范围

以虾类等水产品(虾、蟹)为基质，确定了4-己基间苯二酚(4-HR)残留量的超高效液相色谱串联质谱的测定方法。

2检测原理

以乙腈和二氯甲烷(7+3)提取样品中残留的4-己基间苯二酚，提取液旋发至近干后用二氯甲烷溶解，氨基固相萃取柱净化，用流动相溶解，进入质谱联用仪，外标法定量。

3样品预处理

3.1提取

称取5g(精确到0.01g)样品置于50mL离心管中，加入10mL乙腈二氯甲烷溶液，高速组织捣碎机匀浆2min，盖塞，旋涡混匀1min，超声提取10min，8500r/min离心5min，取上清液转入100mL旋转蒸发瓶中，重复上述操作一次。合并提取液于45℃下旋发至近干，取7.5mL二氯甲烷分三次超声溶解，每次2.5mL。

3.2净化

将待净化液依次转移至固相萃取柱中。用6mL正己烷淋洗，吹固相小柱至近干，用6mL甲醇丙酮溶液洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物用1mL流动相溶解，过微孔滤膜，供液相色谱测定。

4色谱和质谱条件

4.1液相系统条件：

色谱柱：C18柱(Shim-pack GIS，2.1×75mm，2μm)；

柱温：40℃；

流动相：梯度洗脱程序见表1；

流速：0.4mL/min；

进样量：10μL。

初始有机相比例：60％

表1 梯度洗脱程序

时间(min)	2mmol/L乙酸铵水	甲醇(％)
			3.00	10	90
3.50	10	90
			3.60	40	60
5.00	Stop

4.2质谱系统条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

扫描极性：负离子扫描；

扫描方式：多反应监测(MRM)；

离子喷雾电压：3.5kV；

雾化气：氮气3.0L/min；

干燥气：氮气15L/min；

碰撞气：氩气；

DL温度：250℃；

加热模块温度：400℃。

去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)和碰撞室出口电压(CXP)见表2。

表2 MRM优化参数

4.3标准工作曲线的绘制

用流动相将4-己基间苯二酚标准溶液(3.10)稀释成为0.05μg/mL、0.50μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、系列标准工作液，供高效液相色谱分析。

4.4色谱分析

分别注入10μL 4-己基间苯二酚标准工作溶液及样品溶液于液相色谱质谱仪中进行分析。根据4-己基间苯二酚标准品的保留时间定性，外标法定量。标准品谱图见下。

5空白试验

除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

6结果计算

样品中4-己基间苯二酚的残留量按公式(1)计算，计算结果需扣除空白值。结果保留2位有效数字。

式中：

X——试样中4-己基间苯二酚的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

C——试样溶液中4-己基间苯二酚的含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；

C₀——空白试验中4-己基间苯二酚的含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；

m——试样质量，单位为克(g)；

V——试样溶液体积，单位为毫升(mL)。

7方法灵敏度、准确度和精密度

灵敏度

本方法检出限为0.001mg/kg，定量限为0.040mg/kg。

准确度

本方法添加浓度为0.040mg/kg～2.0mg/kg时，回收率为80％～110％。

精密度

本方法批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤15％。

二、主要技术参数及实验条件的确定

1、样品提取方法的优化

根据相似相溶原理，实验中采用甲醇，乙腈、丙酮、二氯甲烷和乙腈的混合溶液作为水产品中4-HR的提取溶剂。实验结果表明，当选用乙腈+二氯甲烷(7:3)的混合溶剂，提取次数为两次。实验过程不会出现提取溶剂分层，回收率高且稳定。故选用该混合溶剂作为样品的提取溶剂。表3是提取次数对回收率的影响(加标浓度200μg/kg)。从表3可以看出，用混和溶剂20mL萃取2次的方法，综合来说可达在满足实验要求的情况下减少操作复杂程度。

表3 萃取次数对回收率的影响

2、色谱柱的选择

本项目为使得超高效液相色谱多使用C18柱，实验选用C18柱可将4-HR与样品基质完全分离，流动相见表1，相对于普通的液相色谱柱，2.1×75mm的短柱可以使出峰时间大大提前。

3、柱温的选择

考察了柱温(20～45℃)对4-HR保留时间和峰高的影响，结果表明随着柱温的升高，4-已基间苯二酚的保留时间和峰高变化不明显。考虑到流动相的粘度，确定色谱柱的柱温为35℃。

4、流动相的选择

液相色谱质谱仪使用的流动相一般有一定的规律，根据本项目的液相色谱质谱仪的特点，项目组研究出流动相如表1所示。

5、净化方法的选择

氨基柱是由硅胶键合氨丙基得到，兼具极性吸附作用和弱阴离子交换作用，可通过极性吸附(非极性有机溶液)达到保留作用，在与正己烷等非极性溶剂进行预处理时，能与带有-OH的官能团分子形成氢键，而正己烷作为洗脱溶剂可以增强非极性相互作用保留目标化合物。4-HR几乎不溶于水和弱酸性化合物，因此本实验使用氨基固相萃取柱作为净化柱。活化和洗脱使用甲醇和丙酮混和溶液，正己烷淋洗。

6、质谱条件的确定

根据文献报道，通过全扫描确定4—HR的定性和定量离子对，根据本公司仪器型号(岛津LCMS－8040)的特点进行优化，具体的条件见表2。

7、标准溶液的有效期确定

准确配制浓度为1mg/mL标准储备液，贮存于4℃冰箱中密封保存。临用前，取此储备液，用流动相稀释成所需浓度的标准工作液。根据不同时间周期内标准系列浓度点相对应的峰面积的变化，选择稳定可靠的标准储备液的有效期期限。由实验数据(表2)确定标准储备液的有效期为一个月。

表4 不同贮存时间周期内标准系列浓度点的峰面积变化

8、方法确认

1)准确度和精密度

确定方法后，以4种甲壳类动物南美白对虾、海捕虾、梭子蟹和花蟹(经检测无4-HR残留)进行加标回收和重复性实验，以考察本方法的准确度和精密度。

准确度和批次内精密度实验方案为：

分别称取18份阴性的南美白对虾、海捕虾、梭子蟹和花蟹样品各5.00g，4-HR的加标浓度分别为10μg/kg、200μg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg，每个浓度为6个平行样品。4种水产样品均按此操作。具体实验数据见表3。从实验结果可知，在加标量为10μg/kg、200μg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg时，回收率大于70％，批内相对标准偏差小于10％，该方法回收率和精密度完全可以满足药残检测的要求。

批间精密度的实验方案为：

每天分别取6份阴性南美白对虾、海捕虾、梭子蟹和花蟹样品分别进行添加水平为10μg/kg、200μg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg的加标回收率测定，连续测定三天，计算批间精密度。批间精密度结果见表4，由实验结果可知各添加水平批间相对标准偏差均小于10％。

2)方法的检出限、定量限及线性范围

⑴检出限

标准制订小组所使用的液相色谱串联质谱仪品牌和型号为岛津LCMS－8040，加标浓度为1.0μg/kg时，通过仪器所附带工作站软件的重复测定，加标色谱峰信噪比为8，大于3，完全达到检出限的要求。图1为加标色谱图和信噪比报告。

⑵定量限

加标浓度为4.0μg/kg时，通过仪器所附带工作站软件的重复测定，加标色谱峰信噪比为11.1，大于10，达到检测方法定量限的要求。故确定方法定量限为4.0μg/kg。图2为加标色谱图和信噪比报告。

⑶线性范围

配制4-HR的工作曲线浓度系列为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.50μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL系列标准工作液，以峰面积为纵坐标，以4-HR的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算相关系数。实验结果表明：4-HR在0.01μg/mL–20.0μg/mL浓度范围内呈线性关系，相关系数0.9995，回归方程Y＝17.97120X-4.35698e^-3。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种甲壳类水产品中4-己基间苯二酚的HPLC-MS/MS检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙腈和二氯甲烷的混合溶液中乙腈和二氯甲烷的体积比为7:(2～4)；

将所述检测样品与乙腈和二氯甲烷的混合溶液按1g：9mL～11mL的比例进行混合，匀浆超声处理后离心，得到上清液；再重复上述步骤1次，合并提取液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相萃取柱为氨基固相萃取柱；

优选的，所述氨基固相萃取柱由硅胶键合氨丙基得到。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的氨基固相萃取柱在使用前用水溶性有机溶剂活化；

优选的，所述的水溶性有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、丙酮、氨水甲醇溶液中的一种或多种；

优选的，所述水溶性有机溶剂选自甲醇和丙酮的混和溶液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的氨基固相萃取柱所用的洗脱液为非极性有机溶剂；

优选的，所述非极性有机溶剂为正己烷。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱所用的色谱柱为C18液相色谱柱；

优选的，所述C18液相色谱柱的内径和长度为1.5mm～3.0mm×50mm～100mm；

更优选的，所述C18液相色谱柱的内径和长度为2.1mm×75mm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述C18液相色谱柱的柱温为35℃～40℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱时，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；

流动相A为1.5～2.5m mol/L的乙酸铵水，流动相B为甲醇。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

0～3.5min时，流动相A5～15vt％，流动相B 85～95vt％进行洗脱；

优选的，流速为0.3～0.5mL/min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱的条件为：

离子源：电喷雾离子源；扫描极性：负离子扫描；扫描方式：多反应监测；离子喷雾电压：3.2～3.8kV；雾化气：氮气，流速2.0～4.0L/min；干燥气：氮气，流速13～17L/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：240℃～260℃；加热模块温度：380℃～420℃。