JPWO2012124609A1 - 糖鎖蛍光標識方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、糖鎖を簡便に蛍光標識する方法と、それに用いる糖鎖捕捉担体を提供することを目的とする。本発明により、糖鎖を捕捉するための一級アミノ基を有する担体において、前記一級アミノ基で糖鎖を捕捉、回収、精製し、担体から捕捉された糖鎖を遊離させ、かつ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上の芳香族アミンで構成される蛍光物質で糖鎖を標識する糖鎖蛍光標識方法が提供される。
Description
本発明は、糖鎖分子を回収、分離、精製し、測定のために蛍光標識する糖鎖蛍光標識方法であって、糖鎖分子を捕捉する糖鎖捕捉担体と、前記糖鎖の標識方法に関する。
本願は、２０１１年３月１１日に、日本に出願された特願２０１１−０５３８９７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１１年３月１１日に、日本に出願された特願２０１１−０５３８９７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。
そのため近年糖鎖構造を迅速、簡便に、かつ精度高く解析する方法が求められるようになり、高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)、核磁気共鳴法、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）、質量分析法、レクチンアレイ法などの多種多様の方法により糖鎖解析が行われている。これら種々の手法を用いて糖鎖を解析するためには、あらかじめ生体試料中に含まれるタンパク質、ペプチド、脂質、核酸などと糖鎖を分離・精製することが必要である。また、ＨＰＬＣやＣＥは分離の良さ、再現性の良さ、定量性、感度の高さなどと言った点から広く用いられる手法であるが、高い感度を得るために糖鎖の還元末端を還元アミノ化法等により標識化する必要がある。しかしながら、これら糖鎖の精製や標識化は時間と工数がかかり、一度に多量の試料を調製するのは困難を要していた。
糖鎖を蛍光標識して解析する方法は、種々開発されている（例えば特許文献１、２、３）。しかしながら、その標識化効率は１００％ではなく、１つのサンプルに標識された糖鎖とされていない糖鎖が混在していた。この状況はＨＰＬＣやＣＥを用いて蛍光検出している際は大きな問題とならないが、質量分析法により糖鎖を分析する際にピークが複雑化するという問題点があった。また、標識化効率が悪い場合、ＨＰＬＣやＣＥによる分析においても、感度が低下するという問題が生じる可能性があった。
本発明は、糖鎖を簡便に効率よく蛍光標識する方法を提供することを目的とする。
このような目的は、下記（１）〜（７）に記載の本発明により達成される。
（１）糖鎖を蛍光標識する方法であって、濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の芳香族アミンで構成される蛍光物質と糖鎖を反応させ標識することを特徴とする糖鎖蛍光標識方法。
（２）芳香族アミンの芳香環部分が、ベンゼン環、ピレン環、ナフタレン環、アクリドン環、フルオレセイン環、ダンシル環、クマリン環、アクリジン環、またはこれらのいずれかの誘導体である、（１）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（３）芳香族アミンで構成される蛍光物質の励起波長が３３０〜７５０ｎｍである、（１）または（２）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（４）芳香族アミンで構成される蛍光物質の発光波長が４２０〜７８０ｎｍである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（５）前記芳香族アミンを有する蛍光物質が、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，２−Ａｍｉｎｏ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ、及び前記芳香族アミンを有する蛍光物質のいずれかの誘導体から選ばれる少なくとも一種類の蛍光物質である（１）〜（４）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（６）糖鎖捕捉担体を用いて糖鎖を捕捉、精製した後、前記糖鎖捕捉担体より糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を前記芳香族アミンで構成される蛍光物質で糖鎖を標識するものである（１）〜（５）のいずれか１項に記載の糖鎖の蛍光標識方法。
（７）前記糖鎖捕捉担体が下記の（化１）で表される構造を有するポリマー粒子である（６）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（８）前記糖鎖捕捉担体が下記の（化２）で表される構造を有するポリマー粒子である（６）または（７）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（ｍ，ｎは前記と同じ意味である。）
（９）前記糖鎖が、生体由来物質である（１）〜（８）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（１０）前期糖鎖が、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、およびリポ多糖の中のいずれかに結合した糖鎖、または遊離の糖鎖である（１）〜（９）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法に用いられるキット。
（１）糖鎖を蛍光標識する方法であって、濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の芳香族アミンで構成される蛍光物質と糖鎖を反応させ標識することを特徴とする糖鎖蛍光標識方法。
（２）芳香族アミンの芳香環部分が、ベンゼン環、ピレン環、ナフタレン環、アクリドン環、フルオレセイン環、ダンシル環、クマリン環、アクリジン環、またはこれらのいずれかの誘導体である、（１）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（３）芳香族アミンで構成される蛍光物質の励起波長が３３０〜７５０ｎｍである、（１）または（２）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（４）芳香族アミンで構成される蛍光物質の発光波長が４２０〜７８０ｎｍである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（５）前記芳香族アミンを有する蛍光物質が、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，２−Ａｍｉｎｏ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ、及び前記芳香族アミンを有する蛍光物質のいずれかの誘導体から選ばれる少なくとも一種類の蛍光物質である（１）〜（４）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（６）糖鎖捕捉担体を用いて糖鎖を捕捉、精製した後、前記糖鎖捕捉担体より糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を前記芳香族アミンで構成される蛍光物質で糖鎖を標識するものである（１）〜（５）のいずれか１項に記載の糖鎖の蛍光標識方法。
（７）前記糖鎖捕捉担体が下記の（化１）で表される構造を有するポリマー粒子である（６）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（８）前記糖鎖捕捉担体が下記の（化２）で表される構造を有するポリマー粒子である（６）または（７）に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（９）前記糖鎖が、生体由来物質である（１）〜（８）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
（１０）前期糖鎖が、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、およびリポ多糖の中のいずれかに結合した糖鎖、または遊離の糖鎖である（１）〜（９）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法に用いられるキット。
本発明によれば、糖鎖分子を簡便に効率よく蛍光標識することが可能となる。
本発明は、糖鎖をＨＰＬＣや質量分析測定によって分析するための糖鎖標識方法に関するものである。特に、糖鎖捕捉担体上に糖鎖を捕捉・精製後、糖鎖を遊離し蛍光物質により糖鎖を標識する方法である。また本発明は、本発明の糖鎖標識方法に使用されるキットにも関する。
糖鎖を蛍光試薬で標識する方法には、還元アミノ化法という方法が一般的に使用される。糖鎖試料にアミノ基を有する蛍光試薬を加え、糖鎖還元末端に形成されるアルデヒド基と蛍光試薬のアミノ基とを反応させ、形成されたシッフ塩基を還元剤により還元する事で糖鎖の還元末端に蛍光標識が導入される。
糖鎖標識の効率を上げるために、本発明では、蛍光試薬濃度を上げ、反応機会を上げることにより、より蛍光標識糖鎖の収率を上げることを目的に発明された。
具体的には、以下の通りである。
（糖鎖について）
本発明において用いる糖鎖は、特に限定するものではないが、血液、体液や組織抽出物などの生体由来物質でもあっても、化学合成により生成された糖鎖化合物であってもよい。
また、含まれる糖鎖が、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、およびリポ多糖の中のいずれかに結合した糖鎖、または遊離の糖鎖から選ぶことができる。
本発明において用いる糖鎖は、特に限定するものではないが、血液、体液や組織抽出物などの生体由来物質でもあっても、化学合成により生成された糖鎖化合物であってもよい。
また、含まれる糖鎖が、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、およびリポ多糖の中のいずれかに結合した糖鎖、または遊離の糖鎖から選ぶことができる。
（糖鎖標識）
糖鎖を標識する方法としては、芳香族アミンを作用させて、還元アミノ化反応により糖鎖を前記標識化合物に結合させる方法が挙げられる。
糖鎖を標識する方法としては、芳香族アミンを作用させて、還元アミノ化反応により糖鎖を前記標識化合物に結合させる方法が挙げられる。
使用する標識試薬は芳香族アミンであれば特に限定するものではないが、下記のアミノ基を含む物質からなる群から選ぶことが、好ましい。
例として２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅが挙げられ、中でも２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄが、試薬としての入手、反応の簡便性から効果的である。また、標識試薬としての機能が維持される限りにおいて、これらの誘導体もまた好ましく用いられる。
例として２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅが挙げられ、中でも２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄが、試薬としての入手、反応の簡便性から効果的である。また、標識試薬としての機能が維持される限りにおいて、これらの誘導体もまた好ましく用いられる。
芳香族アミンとして２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄを用いる場合、一般的な条件では０．３５ｍｏｌ／Ｌで使用されるが、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の濃度、好ましくは１．４ｍｏｌ／Ｌ以上で使用することにより、標識効率を向上させることが可能となる。ただし、濃度が３ｍｏｌ／Ｌを超えると、反応に使用されなかった芳香族アミンを除去するのが困難になるため、最も好ましい濃度は１．４ｍｏｌ／Ｌ以上３ｍｏｌ／Ｌ以下である。
また、液量に関して、糖鎖を捕捉する担体として粒子を用いた場合、通常は粒子が浸る程度の液量、例えば、５ｍｇの粒子に対して５０μＬであるが、容量を倍量の１００μＬにすることにより、標識効率を上げることができる。液量は１００μＬを超えても良いが、反応に使用されなかった芳香族アミンを除去するのが困難になるため、５ｍｇの粒子に対しては１００μＬ〜２００μＬの間になるよう調整するのが好ましい。
（還元アミノ化反応による標識方法）
具体的には、2-Aminobenzamideによる標識の場合、精製された糖鎖が入った反応容器に1.4 M 2-Aminobenzamid, 1 M sodium cyanoborohydrideの濃度になるように３０％酢酸／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた溶液１００ μＬを加え、３０〜７０℃で１〜１０時間反応する事で達成される。
具体的には、2-Aminobenzamideによる標識の場合、精製された糖鎖が入った反応容器に1.4 M 2-Aminobenzamid, 1 M sodium cyanoborohydrideの濃度になるように３０％酢酸／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた溶液１００ μＬを加え、３０〜７０℃で１〜１０時間反応する事で達成される。
（糖鎖捕捉担体について）
糖鎖は液相で反応させることも可能であるが、以下に説明する糖鎖捕捉担体を用いることにより、糖鎖の精製、回収、蛍光試薬による標識を連続的に行うことが可能となる。
糖鎖は液相で反応させることも可能であるが、以下に説明する糖鎖捕捉担体を用いることにより、糖鎖の精製、回収、蛍光試薬による標識を連続的に行うことが可能となる。
（糖鎖捕捉担体について）
前記糖鎖捕捉担体は、糖鎖を捕捉するための反応性の一級アミノ基をその表面に有する担体であり、前記一級アミノとしてオキシルアミノ基またはヒドラジド基を有することが望ましい。これは、酵素やカップリング試薬などの非存在下においても糖鎖還元末端であるアルデヒド基と反応し結合可能であるから好適である。
前記糖鎖捕捉担体は、糖鎖を捕捉するための反応性の一級アミノ基をその表面に有する担体であり、前記一級アミノとしてオキシルアミノ基またはヒドラジド基を有することが望ましい。これは、酵素やカップリング試薬などの非存在下においても糖鎖還元末端であるアルデヒド基と反応し結合可能であるから好適である。
前記糖鎖捕捉担体は、下記一般式〔化１〕の構造を有する粒子であることが好ましい。
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
また、前記担体は、水溶液や有機溶媒に不溶性の担体であることがのぞましく、材質は特に限定するものではないが、ガラスや耐有機溶剤性に優れた樹脂、例えばシリコン、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等を選ぶことができる。
前記担体は、下記一般式〔化２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子であることが好ましい。
（ｍ，ｎは前記と同様である。）
前記糖鎖捕捉担体の形態は、特に限定するものではないが、粒子またはプレート状の形態であることが好ましい。糖鎖ライブラリーを作製するためには、同時に多数の試料を処理する可能性があり、その際には、カラムに粒子を充填したものを使用する事で連続的な処理が可能である。また、マルチウェルプレートであれば同時に多検体を処理することが可能である。マルチウェルプレートとしては、６、１２、２４，４８、９６，３８４ウェルなどのマルチウェルプレートを適宜使用することが出来る。
式〔２〕の担体以外では、粒子の材料として無機物質を用いることができる。前記粒子を構成する無機物質としては、粒子状のものを用いることができ、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたものを使用することが出来る。
また、粒子としたときの形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下の粒子であることが好ましい。この場合の平均粒径は光学顕微鏡視野において観察される各粒子の直径を計測することにより求めたものである。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離、フィルターなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルターによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。
本発明において、担体上に固定化される糖鎖は、特に限定するものではないが、血液、体液や組織抽出物などの生体由来物質でもあっても、化学合成により生成された糖鎖化合物であってもよい。
また、含まれる糖鎖は、遊離の糖鎖あるいは、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖のいずれかに結合した糖鎖から選ばれる。
また、含まれる糖鎖は、遊離の糖鎖あるいは、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖のいずれかに結合した糖鎖から選ばれる。
（糖鎖捕捉について）
前記糖鎖捕捉担体を用いた糖鎖還元末端と一級アミノ基の結合反応の条件の一具体例は、ｐＨが２〜７、反応温度が５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃、より好ましくは７０〜８５℃、反応時間が１５〜１２０分である。最も好ましい条件はｐＨ３〜６、反応温度が８０℃、反応時間が１時間である。
ｐＨが３未満、または７を越える場合は中間体であるイミン体の生成が遅くなるため、捕捉効率が落ちる。反応温度は、５０℃未満の場合、反応効率が著しく悪化する場合があり、糖鎖を十分に捕捉することができない。反応は、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。これは、溶媒が蒸発するにつれて溶液濃度が無限濃縮されることにより十分な反応を起こさせることが目的である。
また、反応温度が９０℃を超える場合は、糖鎖自身に悪影響を及ぼすと共に、担体がプラスチックの場合は種類によって変形、溶融を発生することがある。
反応時間が３０分より短い場合は十分な結合反応が得られない場合があり、糖鎖を十分に捕捉することが出来ない。また９０分を超えた反応は、更なる糖鎖の捕捉は見られず時間をかけただけの効果がない。
前記糖鎖捕捉担体を用いた糖鎖還元末端と一級アミノ基の結合反応の条件の一具体例は、ｐＨが２〜７、反応温度が５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃、より好ましくは７０〜８５℃、反応時間が１５〜１２０分である。最も好ましい条件はｐＨ３〜６、反応温度が８０℃、反応時間が１時間である。
ｐＨが３未満、または７を越える場合は中間体であるイミン体の生成が遅くなるため、捕捉効率が落ちる。反応温度は、５０℃未満の場合、反応効率が著しく悪化する場合があり、糖鎖を十分に捕捉することができない。反応は、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。これは、溶媒が蒸発するにつれて溶液濃度が無限濃縮されることにより十分な反応を起こさせることが目的である。
また、反応温度が９０℃を超える場合は、糖鎖自身に悪影響を及ぼすと共に、担体がプラスチックの場合は種類によって変形、溶融を発生することがある。
反応時間が３０分より短い場合は十分な結合反応が得られない場合があり、糖鎖を十分に捕捉することが出来ない。また９０分を超えた反応は、更なる糖鎖の捕捉は見られず時間をかけただけの効果がない。
（夾雑物の除去について）
糖鎖を捕捉した状態の糖鎖捕捉担体は、夾雑物を取り除くために洗浄する必要がある。
ここで、洗浄液に用いられる溶液としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類；水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。
前記の糖鎖を捕捉した担体は、洗浄により、精製原料中の糖鎖以外の夾雑物を簡単に除去することが可能で、糖鎖のみを担体ごと回収することができる。
洗浄方法としては、粒子の場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
糖鎖を捕捉した状態の糖鎖捕捉担体は、夾雑物を取り除くために洗浄する必要がある。
ここで、洗浄液に用いられる溶液としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類；水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。
前記の糖鎖を捕捉した担体は、洗浄により、精製原料中の糖鎖以外の夾雑物を簡単に除去することが可能で、糖鎖のみを担体ごと回収することができる。
洗浄方法としては、粒子の場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
具体的には、遠沈管やチューブに粒子を入れ、洗浄液を加え、振とうの後、遠心操作により粒子を沈殿させて、上清を除去する操作を繰り返すことにより洗浄する。
例えば、遠心チューブ内に粒子を入れ、洗浄液を加え、粒子を自然沈降、または、遠心分離により強制的に沈降させた後、上清を除去する操作を繰り返すことで洗浄することができる。前記洗浄操作は３〜６回行うことが好ましい。
プレートの場合は、各ウェル内に洗浄液を分注、吸引除去を繰り返すことで簡便に洗浄することができる。また、必要に応じてプレートを遠心可能な遠心分離機を用いても良い。
例えば、遠心チューブ内に粒子を入れ、洗浄液を加え、粒子を自然沈降、または、遠心分離により強制的に沈降させた後、上清を除去する操作を繰り返すことで洗浄することができる。前記洗浄操作は３〜６回行うことが好ましい。
プレートの場合は、各ウェル内に洗浄液を分注、吸引除去を繰り返すことで簡便に洗浄することができる。また、必要に応じてプレートを遠心可能な遠心分離機を用いても良い。
また、チューブ状の容器であって、底面部に、液体透過可能で前記粒子が不透過な孔径を有するフィルターを装着するフィルターチューブを用いることも可能である。前記フィルターチューブに粒子を入れて使用することで、洗浄に要した洗浄液を、フィルターを介して除去することが可能となり、前記の遠心操作後の上清除去の工程が必要なくなり、作業性の向上を図ることができる。
また、６〜３８４穴のマルチウェルプレートの底部に前記フィルターを装着したものが各種市販されており、これらのプレートを用いることでハイスループット化することが可能である。特に９６穴マルチウェルプレートは、溶液分注機器、吸引除去システム、およびプレートの搬送システム（例えばベックマンコールター社のBiomekシリーズ）が開発されており、ハイスループット化に最適であり、この自動機を用いて一連の作業を行ってもよい。
また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖捕捉物質以外の物質を除去してもよい。
また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖捕捉物質以外の物質を除去してもよい。
カラムに糖鎖捕捉担体を充てんし、糖鎖捕捉反応から標識までを連続的にカラムで処理してもよい。これにより、大量の糖鎖精製および標識が可能となる。
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（糖鎖サンプルの調整）
ウシ血清由来ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、Ｉ５５０６）１ ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７−０２８７５）５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３−０２１５２）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）によってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、１−３６５−１９３）による処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
（糖鎖サンプルの調整）
ウシ血清由来ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、Ｉ５５０６）１ ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７−０２８７５）５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３−０２１５２）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）によってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、１−３６５−１９３）による処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
（糖鎖捕捉担体による糖鎖精製）
糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有する粒子５ｍｇ（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ））、住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０３）が入ったディスポカラムに上記糖鎖溶液２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にて粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にて粒子を洗浄した。
糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有する粒子５ｍｇ（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ））、住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０３）が入ったディスポカラムに上記糖鎖溶液２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にて粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にて粒子を洗浄した。
続いて、粒子の入ったディスポカラムに超純水２０μLおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１．５時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。
（糖鎖標識）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．７Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．７Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
（余剰２ＡＢの除去）
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、シリカカラム (ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット付属品)に添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリルにてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
（標識化糖鎖の検出）
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミノカラム（Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０）を用いて励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍにて測定した。
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、シリカカラム (ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット付属品)に添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリルにてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
（標識化糖鎖の検出）
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミノカラム（Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０）を用いて励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍにて測定した。
＜実施例２＞
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
（糖鎖標識）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ１．４Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ１．４Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
＜実施例３＞
下記、糖鎖の標識以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
下記、糖鎖の標識以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
（糖鎖標識）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ２．８Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ２．８Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
＜実施例４＞
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
（糖鎖標識）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ１．４Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液２００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ１．４Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液２００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
＜比較例１＞
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調製、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
（糖鎖標識）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液１００μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
＜比較例２＞
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調整、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
下記、糖鎖の標識工程以外の工程である糖鎖サンプルの調整、糖鎖捕捉担体による糖鎖精製、余剰２ＡＢの除去、標識化糖鎖の検出は実施例１と同様にして行った。
（糖鎖標識）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ１．４Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液５０μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ１．４Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液５０μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
上記検討で得られたＨＰＬＣチャートの代表例を図１に示す。また、実施例１、実施例２、実施例３および比較例１で得られたピークの総面積をグラフにしたものを図２に示す。一般的に使用されている０．３５Ｍよりも濃度が高くなるにつれて得られるピーク面積値が大きくなった。
続いて、実施例２、実施例４及び比較例２で得られたピークの総面積をグラフにしたものを図３に示す。溶液量が５０μＬよりも多くなるにつれて得られるピーク面積値が大きくなった。
上記の結果から、糖鎖捕捉担体を用いて糖鎖を捕捉、精製した後、糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を芳香族アミンで構成される高濃度（０．５ｍｏｌ／Ｌ以上）の蛍光物質で糖鎖を標識する、本願の糖鎖の蛍光標識方法は、優れた効果を有することが明らかになった。
続いて、実施例２、実施例４及び比較例２で得られたピークの総面積をグラフにしたものを図３に示す。溶液量が５０μＬよりも多くなるにつれて得られるピーク面積値が大きくなった。
上記の結果から、糖鎖捕捉担体を用いて糖鎖を捕捉、精製した後、糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を芳香族アミンで構成される高濃度（０．５ｍｏｌ／Ｌ以上）の蛍光物質で糖鎖を標識する、本願の糖鎖の蛍光標識方法は、優れた効果を有することが明らかになった。
本発明により、簡便に糖鎖を回収、精製し、芳香族アミンによる糖鎖標識を実施でき、前記糖鎖を提供することが可能となった。
Claims (11)
- 糖鎖を蛍光標識する方法であって、
濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の芳香族アミンで構成される蛍光物質と糖鎖を反応させ標識すること
を特徴とする糖鎖蛍光標識方法。 - 芳香族アミンの芳香環部分が、ベンゼン環、ピレン環、ナフタレン環、アクリドン環、フルオレセイン環、ダンシル環、クマリン環、アクリジン環、またはこれらのいずれかの誘導体である、請求項１に記載の糖鎖蛍光標識方法。
- 芳香族アミンで構成される蛍光物質の励起波長が３３０〜７５０ｎｍである、請求項１または２に記載の糖鎖蛍光標識方法。
- 芳香族アミンで構成される蛍光物質の発光波長が４２０〜７８０ｎｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
- 前記芳香族アミンを有する蛍光物質が、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，２−Ａｍｉｎｏ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ、及び前記芳香族アミンを有する蛍光物質のいずれかの誘導体から選ばれる少なくとも一種類の蛍光物質である請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
- 糖鎖捕捉担体を用いて糖鎖を捕捉、精製した後、前記糖鎖捕捉担体より糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を前記芳香族アミンで構成される蛍光物質で糖鎖を標識するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖鎖の蛍光標識方法。
- 前記糖鎖捕捉担体が下記の（化１）で表される構造を有するポリマー粒子である請求項６に記載の糖鎖蛍光標識方法。
［化１］
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。） - 前記糖鎖捕捉担体が下記の（化２）で表される構造を有するポリマー粒子である請求項６または７に記載の糖鎖蛍光標識方法。
［化２］
（ｍ，ｎは前記と同じ意味である。） - 前記糖鎖が、生体由来物質である請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
- 前期糖鎖が、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、およびリポ多糖の中のいずれかに結合した糖鎖、または遊離の糖鎖である請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の糖鎖蛍光標識方法に用いられるキット。
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