JP2007212235A - マンノース・グルコース同時測定方法 - Google Patents
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Abstract
一般的な装置を用いて、安価に、マンノースとグルコースを同時に測定する方法を提供すること。
【解決手段】
試料中の単糖を標識し、HPLCの一般的なシステムによりマンノースとグルコースを同時に測定する。
【選択図】 図7
Description
(1)試料中の単糖を標識化し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することからなる、試料中のグルコースと試料中のマンノースを同時に測定する方法。
(2)上記(1)の方法において、HPLCのシステムが低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有し、低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖を検出し、高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖を検出することを特徴とする方法。
(3)上記(1)または(2)の方法において、単糖の還元末端を化学的に標識化する蛍光試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする方法。
(4)上記(1)から(3)のいずれかの方法において、単糖の還元末端をアミノベンジル化またはアミノピリジル化する標識化試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする方法。
(5)標識化試薬が4−アミノ安息香酸エチルエステル(ABEE)であることを特徴とする上記(4)の方法。
(6)上記(2)から(5)のいずれかの方法において、低感度の検出器が紫外光検出器であり、高感度の検出器が蛍光検出器であることを特徴とする方法。
(7)試料が被験対象から採取された体液である、上記(1)から(6)のいずれかの方法。
(8)上記(1)から(7)のいずれかの方法に使用するキットであって、内部標準物質を含有する試薬および単糖の蛍光標識に必要な試薬を含む、前記キット。
(9)上記(1)から(7)のいずれかの方法により、被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースを測定することを含む、糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法。
方法
試薬:試薬は別途記述していないかぎり和光純薬から特級品を購入した。
サンプル:健康なイヌ3匹から静脈血の血清を得た。早朝空腹時と食後1時間30分後に採血を行った。血液採取についてはシリンジもしくは真空管採血後、30分程度放置後、遠心分離し上澄み液を血清とし、分析までは−20℃で保存した。
標準溶液としてマンノース溶液2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320μmol/l、グルコース溶液0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64mmol/lの8点を調製した。
内部標準物質としてL-ラムノースとD-キシロースをそれぞれマンノースとグルコースに対して用いた。内部標準溶液として分析時にL-ラムノースを1280μmol/l、D-キシロースを80mmol/lになるよう4.8mol/l過塩素酸溶液に溶解した。なお、この内部標準溶液は除タンパク溶液も兼ねている。
マイクロチューブに標準溶液またはサンプル(血清)100μlと、内部標準溶液12.5μlを入れ(つまり4.8mol/l過塩素酸溶液をサンプル100に対して12.5添加)、除タンパクのため試験管振盪機で10秒間混和後、遠心分離(13,000G、4℃、20分間)をおこなった。上清を別のマイクロチューブに10μl移し、そこに4-アミノ安息香酸エチルエステル(ABEE)標識化試薬(生化学工業製)を40μl添加し、試験管振盪機で5秒間混和してから80℃1時間保った後、放冷した。これを遠心分離(13,000G、4℃、10秒間)し蒸留水200μl、クロロホルム200μlを添加し、試験管振盪機で10秒間混和後、遠心分離(13,000G、4℃、5分間)し、上清10μlをHPLC分析に供した。
HPLC(島津製作所製)のシステムは送液ポンプ(LC-20AD)2台、オートサンプラー(SIL-20AC)、カラムオーブン(CTO-20AC)紫外可視分光光度計検出器(SPD-20A)、分光蛍光検出器(RF-10A XL)、コントローラー(LC solution)で構成した。カラムには逆相カラムであるHonenpak C18(生化学工業製、Code 800445)を用い、流速1ml/minでカラム温度30℃にて、分析をおこなった。紫外可視分光光度計検出器、分光蛍光検出器は直列に接続し、紫外可視分光光度計検出器では標識化グルコースと内部標準物質の標識化キシロースを分析し、分光蛍光検出器では標識化マンノースと内部標準物質の標識化ラムノースを分析した。紫外可視分光光度計検出器の検出波長は305nmとした。分光蛍光検出器は励起波長305nm、蛍光波長360nmで検出した。0.2mol/lホウ酸カリウム緩衝液(pH8.9)/アセトニトニル(93/7、V/V)、0.02%TFA溶液/アセトニトリル(50/50 、V/V)をそれぞれ溶液A、溶液Bとし、移動相として使用した。溶液Aは分離のために35分間流し、次に溶液Bをカラムの洗浄のために5分間流した。次の試料の分析前には平衡化のために溶液Aを10分間流した。
上述したイヌ血清サンプルを用い、血清中グルコースを酵素法であるグルコースC-IIテストワコーによって測定し、上述したHPLC分析法での測定結果と相関を取った。(表1、図4)
結果
図1(a),(b)に、マンノース検量線とグルコース検量線を示す。
実施例1のサンプルをイヌ血清に代えて、正常ネコ血清と糖尿病ネコ血清を用いた他は、実施例1と同様の実験操作を行って、ネコ血清中のマンノースとグルコースを定量した。図5に、糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラム、図6に、糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムを示す。
Claims (9)
- 試料中の単糖を標識化し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することからなる、試料中のグルコースと試料中のマンノースを同時に測定する方法。
- HPLCのシステムが低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有し、低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖を検出し、高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖を検出することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 単糖の還元末端を化学的に標識化する蛍光試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 単糖の還元末端をアミノベンジル化またはアミノピリジル化する標識化試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 標識化試薬が4−アミノ安息香酸エチルエステル(ABEE)であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 低感度の検出器が紫外光検出器であり、高感度の検出器が蛍光検出器であることを特徴とする、請求項2から5のいずれかに記載の方法。
- 試料が被験対象から採取された体液である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から7のいずれかに記載の方法に使用するキットであって、内部標準物質を含有する試薬および単糖の蛍光標識に必要な試薬を含む、前記キット。
- 請求項1から7のいずれかに記載の方法により、被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースを測定することを含む、糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法。
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