CN111499689B - 抗衰老小肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗衰老小肽及其制备方法和应用，属于天然活性成分技术领域。该抗衰老小肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。抗衰老小肽，对D‑半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型具有保护作用，且通过实验进一步验证了其具有较好的抗衰老活性，可广范用于延缓衰老产品中。

Description

抗衰老小肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然活性成分技术领域，特别是涉及一种抗衰老小肽及其制备方法和应用。

背景技术

鹿骨为鹿科动物梅花鹿或马鹿的骨骼，营养物质丰富。由于中国东北养殖着数量可观的各种鹿，鹿骨可以被广泛的用来研究，从鹿骨中提取鹿骨肽成为一条可行性道路。近年来有大量研究证实，鹿骨多肽可延缓衰老，并有祛风除湿之功效对四肢疼痛有明显临床疗效，对人体无毒副作用，具有水溶性强、活性高等特点，可作为天然活性蛋白多肽的可靠来源。

众所周知，衰老是生命必然经历的复杂过程，它是一种退行性的变化，也是一种不可逆的变化，它涉及到机体的不同细胞、组织。如今社会人口老龄化越来越严重，有数据显示：截至2017年末，中国60岁以上的人口己经占全国人口比例的17.3％，而且预计该比例在未来的三十年中将会提高一倍。衰老不仅直接导致各器官功能发生障碍，而且还是促使许多疾病发生的催化剂。而且随着人口的老龄化，认知功能障碍等与年龄相关性疾病的发病率越来越高，给个人、家庭及社会带来巨大的压力。

衰老不可以避免，然而延缓衰老却是可能的，因此，如何延缓衰老成为当今研究的重点，以及亟待攻克的难题。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种抗衰老小肽，该多肽具有抗衰老的作用，且为小分子肽类成分，易于机体吸收利用。

一种抗衰老小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述抗衰老小肽，为11个氨基酸组成的小肽，其氨基酸序列为GPPGPMGPPGL，对D-半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型具有保护作用，且通过实验进一步验证了其抗衰老活性，可广范用于延缓衰老产品中。

在其中一个实施例中，所述多肽由鹿骨提取得到。

本发明还公开了一种编码权利要求1所述多肽的表达基因，所述表达基因的序列为：

A)由编码SEQ ID NO:1所示氨基苷酸的核苷酸序列构成；或者

B)与A)的核苷酸序列编码相同序列的肽段，但因遗传密码的简并性而与A)的核苷酸序列不同的序列；或者

C)对上述A)或B)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

本发明还公开了一种表达载体，为具有上述表达基因的表达载体。如质粒、大肠杆菌等，可利用生物工程制备生产上述抗衰老小肽。

本发明还公开了上述抗衰老小肽的制备方法，包括以下步骤：

脱脂脱钙：将鹿骨粉碎后，以石油醚进行脱脂处理，随后以盐酸进行脱钙处理；

提取：将经脱脂脱钙处理的鹿骨以水为溶剂，加热提取得提取液，在提取液中加入硫酸铵沉淀蛋白，离心取沉淀蛋白，蒸馏水复溶后透析除盐，冻干，得到鹿骨蛋白；

酶解：取上述鹿骨蛋白，先以胃蛋白酶酶解，再以胰蛋白酶酶解，得到鹿骨粗多肽；

分离纯化：将上述鹿骨粗多肽上样于Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱，以水为流动相进行粗分离；再上样于DEAE-32纤维素离子交换层析柱，以NaCl溶液梯度洗脱进行再分离；最后以Superdex30凝胶柱为固定相，水为流动相进行分离纯化，即得。

在其中一个实施例中，所述提取步骤中，将经脱脂脱钙处理的鹿骨置于水中，在90-100℃，料液比为1:8-12的条件下提取2-4h，重复提取2-4次，合并提取液；在提取液中加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度为饱和硫酸铵的80％，3.0×10³-5.0×10³r/min离心5-15min，将沉淀用蒸馏水复溶，使用3500±500Da透析袋透析除盐，冻干得到鹿骨蛋白粉末。

在其中一个实施例中，所述酶解步骤中，胃蛋白酶酶解条件为：底物浓度为3-5％，温度为36-38℃，pH值为1.8-2.2，酶用量为5000-7000U/g；

胰蛋白酶酶解条件为：底物浓度为3-5％，温度为36-38℃，pH值为7.5-8.5，酶用量为5000-7000U/g。

在其中一个实施例中，所述分离纯化步骤中，将上述鹿骨粗多肽上样于SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，以蒸馏水平衡3个柱体积后继续用蒸馏水洗脱5个柱体积，在280nm处检测，按照保留时间得到组分DBP-1、DBP-2、DBP-3、DBP-4；

取上述DBP-3组分上样于DEAE-32纤维素离子交换层析柱，以0.1M Tirs-HCl缓冲液平衡3个柱体积，随后依次用0.1M、0.3M、0.5M的NaCl溶液梯度洗脱，每个浓度的洗脱液洗脱3个柱体积，在280nm检测，按照保留时间由小到大得到组分DBP-3-Ⅰ、DBP-3-Ⅱ；

取上述保留时间大的组分DBP-3-Ⅱ，上样至Superdex30柱，以pH8.0的磷酸盐缓冲溶液平衡，再以水为洗脱液，洗脱3个柱体积，在220nm检测，收集0.1-0.5柱体积部分洗脱液，回收溶剂，即得。

本发明还公开了上述的抗衰老小肽在用于制备具有抗衰老作用药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述抗衰老作用为对PC12细胞的保护作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种抗衰老小肽，对D-半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型具有保护作用，且通过实验进一步验证了其具有较好的抗衰老活性，可广范用于延缓衰老产品中。

并且，上述抗衰老小肽作为仅有11个氨基酸的小分子肽，可不经过分解，直接以小肽的形式被吸收和为细胞所利用，克服了常规蛋白类药物由于吸收过程导致无法保持活性的缺陷。

附图说明

图1为Sephadex G-50分离鹿骨肽洗脱图；

图2为DEAE-32分离鹿骨肽洗脱图；

图3为Superdex 30分离鹿骨肽洗脱图；

图4为鹿骨肽的MS/MS谱图；

图5为图4质谱图中氨基酸碎片峰示意图；

图6酶解后鹿骨粗肽对D-半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型的保护作用；

图7鹿骨粗肽、DBP-1、DBP-2、DBP-3及DBP-4对D-半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型的保护作用；

图8DBP-3-Ⅱ对D-半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型的保护作用；

图9为鹿骨肽序列对D-半乳糖诱导的PC12细胞衰老模型的保护作用；

图10为水迷宫实验观察鹿骨肽对D-半乳糖衰老模型小鼠的影响；

图11为跳台实验观察鹿骨肽对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠的影响；

图12为避暗实验观察鹿骨肽对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠的影响；

图13为鹿骨肽对小鼠外周血中MOD水平、SOD活性的影响；

图14为鹿骨肽对小鼠血清中IL-6和TNF-α水平。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售购得。

实施例中浓度单位“M”表示mol/L。

实施例1

一种抗衰老小肽，从鹿骨中提取，为鹿骨肽，按照以下方法制备：

1、前处理。

用清水洗净剔除肉、筋膜、骨膜等非骨成分后的鹿骨(来源：马鹿的腿骨)，并将其粉碎至1cm²左右碎片，在室温下干燥。

2、脱脂脱钙。

将鹿骨碎片浸泡在石油醚中24h，料液比为1g:4mL，浸泡结束取出，室温下挥干，即得脱脂鹿骨。

将脱脂鹿骨置于0.5M HCl中脱钙12h，每3h换液一次，再用双蒸水洗去残余的HCl，室温干燥得到脱脂脱钙骨。

3、提取。

将脱脂脱钙骨置于蒸馏水中，在95℃，料液比为1g:10mL的条件下提取3h，反复提取3次，合并3次提取液。并在鹿骨蛋白提取液中缓慢加入硫酸铵，使其终浓度为饱和硫酸铵的80％，4.0×10³r/min离心10min，将沉淀用蒸馏水复溶，3500Da透析袋透析除盐，冻干得到鹿骨蛋白粉末。

4、酶解。

分别选用胃、胰蛋白酶酶解蛋白进行酶解(胃蛋白酶：Genview；胰蛋白酶：Genview)，底物(即步骤3得到鹿骨蛋白)浓度为4wt％，温度为37℃，pH值为2.0，酶用量为6000U/g的条件下进行胃蛋白酶酶解；调节pH至8.0终止胃蛋白酶酶解并开始胰蛋白酶酶解，底物(即步骤3得到鹿骨蛋白)浓度为4wt％，温度为37℃，酶用量为6000U/g，冻干后得到鹿骨粗多肽。

5、鹿骨多肽的分离纯化与合成

5.1、Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱

利用蒸馏水平衡Sephadex G-50凝胶柱3个柱体积后上样，再用蒸馏水作为洗脱液洗脱5个柱体积(共600ml)，收集洗脱液，再用紫外可见光分光光度计在280nm处检测，得到4个鹿骨多肽组分DBP-1、DBP-2、DBP-3、DBP-4，如图1所示。

图1中横坐标为收集管数，每管体积为6mL，纵坐标为紫外吸光度，即DBP-3组分为第50-60号管，即2.5-3个柱体积段洗脱液。

5.2、DEAE-32纤维素离子交换层析柱

利用0.5M HCl和0.5M NaOH活化DEAE-32纤维素，并装柱。用0.1M Tirs-HCl作为平衡缓冲液平衡3个柱体积(共225ml)，取组分DBP-3上样后，依次分别用0.1M、0.3M、0.5M的NaCl溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，收集洗脱液，以紫外检测器在280nm处监测监控，按照保留时间从小到大，依次得到两个鹿骨多肽组分DBP-3-Ⅰ、DBP-3-Ⅱ，如图2所示。

图2中横坐标为收集管数，每管体积为1.5mL，纵坐标为紫外吸光度，DBP-3-Ⅱ组分为第50-60号管，约1-1.2个柱体积段洗脱液。

5.3、Superdex30凝胶柱

取上述鹿骨粗多肽组分DBP-3-Ⅱ，在

^TMpure蛋白质层析纯化系统上安装的Superdex30柱上进行进一步分离。平衡液为磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，洗脱液为蒸馏水，洗脱3个柱体积，AKTA蛋白纯化仪按峰面积自动收集洗脱液，得到分离后的鹿骨多肽DBP-3-Ⅱ-1(约0.1-0.5个柱体积段洗脱液)，如图3所示，即为本发明的抗衰老小肽(鹿骨肽)。

图3中横坐标为洗脱体积，纵坐标为紫外吸光度。

6、鹿骨肽序列的鉴定

取上述组分DBP-3-Ⅱ-1使用毛细管高效液相色谱仪和电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪通过LC-MS/MS方法进行鉴定，并基于经典的Edman降解法原理通过蛋白质N端测序鉴定得到肽序列为GPPGPMGPPGL(SEQ ID NO:1)，质谱图如图4-5所示。

其中，a2峰m/z为127.0866，y1峰m/z为132.1019，b2峰m/z为155.0815，y2峰m/z为189.1234，b3峰m/z为252.1343，y3峰m/z为286.1761，b4峰m/z为309.1557，y4峰m/z为383.2289，b5峰m/z为406.2085，y5峰m/z为440.2504，b6峰m/z为537.249，b7峰m/z为594.2704，b8峰m/z为691.3232，y9峰m/z为822.4178，b10峰m/z为845.3974。

实施例2

取上述实施例1得到各多肽组分进行PC12细胞实验研究。

1、D-半乳糖浓度的筛选。

用DMEM培养基稀释D-半乳糖使其细胞给药浓度为100、200、300、400、500mM五个不同浓度，设置正常对照组和D-Gal模型组，每组设3个复孔。损伤结束后，每孔各加20μL MTT(5mg/mL)，4h后将上清液吸出，加入150μL DMSO，摇匀，37℃放置10min，酶标仪490nm处测定吸光度值。损伤组吸光度值与正常对照组的比值即为细胞活力值。

结果表明在D-半乳糖浓度为300mM时，PC12细胞损伤程度到达43.27％，造模成功。

2、鹿骨多肽组分的筛选及其抗衰老能力的验证。

2.1鹿骨粗多肽活性。

取900μg/mL、1800μg/mL、3600μg/mL浓度的酶解后鹿骨粗多肽进行细胞实验，对D-半乳糖损伤后的PC12细胞进行给药，观察细胞活力。

结果如图6所示，给药组细胞活力明显比模型损伤组升高，且表现出剂量依赖性，在浓度为3600μg/mL时细胞活力达到最高值77.41％，证明鹿骨粗多肽具有抗衰老能力。

2.2Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱分离出各组分活性。

取900μg/mL、1800μg/mL、3600μg/mL浓度的DBP-1、DBP-2、DBP-3、DBP-4组分对D-半乳糖损伤后的PC12细胞进行给药，观察细胞活力。

结果如图7所示，DBP-1、DBP-2、DBP-3、DBP-4对D-半乳糖造模后的PC12细胞均有保护作用，且DBP-3对PC12细胞的保护作用更强。同时，DBP-3对PC12细胞的保护作用优于鹿骨粗多肽。

2.3DEAE-32纤维素离子交换层析各组分活性。

取900μg/mL、1800μg/mL、3600μg/mL浓度的DBP-3-Ⅰ、DBP-3-Ⅱ组分对D-半乳糖损伤后的PC12细胞进行给药，观察细胞活力。

结果如图8所示，DBP-3-Ⅰ、DBP-3-Ⅱ对D-半乳糖造模后的PC12细胞均有保护作用，且DBP-3-Ⅱ对PC12细胞的保护作用更强。同时，DBP-3-Ⅱ对PC12细胞的保护作用优于鹿骨粗多肽。

2.4Superdex凝胶层析后鹿骨肽活性。

将通过Superdex凝胶层析得到的鹿骨多肽纯品，配制不同浓度，具体为0.25μM、0.5μM、1μM、2μM4个浓度的鹿骨肽。对用D-半乳糖造模成功的PC12细胞进行给药，观察鹿骨肽对D-半乳糖造模后的PC12细胞的保护作用。

结果如图9所示，所有浓度鹿骨肽均对D-半乳糖造模的PC12细胞具有保护作用，与其他浓度鹿骨肽相比，1.0μM的鹿骨肽对PC12细胞保护作用最强。

实施例3

动物实验研究。

衰老包括人为干预衰老和自然衰老，由于自然衰老周期长，所以一般选择人为干预衰老进行实验。在人为干预衰老造模中，D-半乳糖-小鼠衰老模型更容易造模成功，并且小鼠身体机能表现明显，因此，本实施例选用实施例1制备得到的抗衰老小肽(鹿骨肽)，以D-半乳糖-小鼠衰老模型进行实验。

1、实验方法。

小鼠雌雄各半，随机分4组，每组10只，清洁级。

空白组(CON)：双蒸水灌胃，生理盐水进行皮下注射；

模型组(MOD)：双蒸水灌胃，350mg/(kg·d)D-Gal皮下注射；

阳性药组：600mg/(kg·d)吡拉西坦灌胃，350mg/(kg·d)D-Gal皮下注射；

鹿骨肽组：5mg/(kg·d)鹿骨肽灌胃，350mg/(kg·d)D-Gal皮下注射。

每天进行灌胃及皮下注射，连续10周，第9周给药后30min进行跳台实验、避暗实验，第10周进行Morris水迷宫实验，末次给药后禁食24h，摘眼球取血，按照试剂盒说明书测定血液中的SOD和MDA的含量及IL-6和TNF-α水平。

其中，跳台实验方法如下：将小鼠放入左上方带有高4.5cm，直径9.5cm的安全台的有机玻璃箱内，箱底铺有铜制电栅，作为刺激电极。小鼠遭电击后逃到安全台上，再从台上下来，以双足接触电栅再遭电击视为错误反应，记录3分钟内的潜伏期和错误次数，24h后重测验一次，以实验2d的潜伏期和错误次数和来衡量其学习记忆的能力。

壁暗实验方法如下：将小鼠按序号放入明室，打开连接暗室的开关，使小鼠充分适应避暗仪环境后，将小鼠放回饲养笼，实验时关闭连接明暗室的开关，将小鼠放入明室，放置好小鼠后，打开明暗室开关和电击开关，当其进入暗室就会受到电网地板的持续电击，小鼠从实验开始到第一次受到电击的时间即为避暗潜伏期。在实验结束后，记录每只小鼠在5min受到电击的总次数，即为避暗错误次数。

Morris水迷宫方法如下：定位航行实验:将平台随机放置在水迷宫四象限中的其中一个象限的中间位置，平台不得高出水面，位于水下2cm左右，不得再移动平台位置。实验开始后，如果小鼠能找到平台，仪器会自动记录小鼠找到平台的时间，停止计时，实验结束。如果小鼠2min还找不到平台，将小鼠放在平台上15-30s，记录没有找到平台的小鼠的潜伏期为120s。在定位航行实验结束之后，进行空间探索实验，小鼠在平台上停留30s后移走平台，开始实验，记录小鼠在120s的空间探索实验中的穿越平台次数及在目标象限所停留的时间。

2、实验结果。

2.1动物形态。

与空白组比较，模型组脱毛严重，毛无光泽，皮肤肌肉松弛，反应力和行动力迟缓，证明造模成功。

2.2水迷宫实验

水迷宫实验结果如图10所示，其中，A为定位航行结果图，B为空间探索实验结果，#:p<0.05,表示与CON组比较差异显著；*:p<0.05表示与MOD组比较差异显著。

结果显示，随着实验天数的增加，各组小鼠找到平台时间逐渐缩短。

与空白组(CON组)比较，模型组(MOD组)小鼠在训练第6天找到平台时间明显增加(p<0.05)。与模型组相比，鹿骨肽组小鼠找到平台潜伏期明显缩短(p<0.05)。在空间探索过程中，与空白组比较，模型组小鼠穿越平台，停留次数明显缩短(p<0.05)。与模型组相比，鹿骨肽组小鼠在平台所在象限的停留时间显著延长(p<0.05),穿越平台次数明显增加(p<0.05)。

2.3跳台实验

跳台实验结果如图11所示，其中，A为各组小鼠跳台潜伏期情况，B为各组小鼠跳台错误次数情况；#:p<0.05,表示与CON组比较差异显著；*:p<0.05表示与MOD组比较差异显著。

结果显示，实验第一天，与空白组比较，模型组小鼠错误次数明显增加(p<0.05)；与模型组比较，鹿骨肽组小鼠的错误次数减少(p<0.05)。实验第二天，空白组比较，模型组小鼠潜伏期明显缩短(p<0.05)；与模型组比较，鹿骨肽组小鼠潜伏期明显延长(p<0.05)，见图10。

2.4避暗实验

避暗实验结果如图12所示，其中，A为各组小鼠避暗潜伏期情况，B为各组小鼠避暗错误次数情况，#:p<0.05,表示与CON组比较差异显著；##:p<0.05,表示与CON组比较差异极显著；*:p<0.05表示与MOD组比较差异显著。

结果显示，实验第二天，各组避暗潜伏期第二天均比第一天延长，与空白组比较，模型组小鼠潜伏期明显缩短(p<0.05)。与模型组比较，鹿骨肽组小鼠潜伏期明显延长(p<0.05)。各组避暗错误次数第二天均比第一天减少，与空白组比较，模型组小鼠5min内错误次数明显增加(p<0.05)；与模型组比较，鹿骨肽组小鼠错误次数显著减少(p<0.05)。

2.5生化指标实验

MDA和SOD检测结果如图13所示，其中，A为鹿骨肽对MDA水平的影响；B为鹿骨肽对SOD活性的影响；#:p<0.05,表示与CON组比较，##:p<0.05,表示与CON组比较差异极显著；*:p<0.05表示与MOD组比较，**:p<0.05表示与MOD组比较差异极显著。

结果显示，与空白组相比，模型组小鼠血清MDA含量增加，SOD活力下降，具有统计学意义(P<0.05)。鹿骨肽组小鼠与模型组小鼠比较血清SOD升高，MDA含量下降，具有统计学意义(p<0.05)。

IL-6、TNF-α检测结果如图14所示，其中，A为小鼠血清中IL-6水平；B为小鼠血清中TNF-α水平；##:p<0.05,表示与CON组比较差异极显著；**:p<0.05表示与MOD组比较差异极显著。

结果显示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织中的IL-6、TNF-α水平明显降低(p<0.05,p<0.01)；与模型组相比，鹿骨肽组的IL-6、TNF-α水平明显升高(p<0.05,p<0.01)。

上述结果表明，本发明的抗衰老小肽，对PC12细胞具有较强的保护作用，且在动物实验研究中，无论是从动物行为模型表现，或是生化指标来看，均有不俗的抗衰老作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北华大学

<120> 抗衰老小肽及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu

1 5 10

Claims (5)

1.一种抗衰老小肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述小肽的表达基因，其特征在于，所述表达基因的序列为：

A）由编码SEQ ID NO:1所示氨基苷酸的核苷酸序列构成；或者

B）与A）的核苷酸序列编码相同序列的肽段，但因遗传密码的简并性而与A）的核苷酸序列不同的序列。

3.一种表达载体，其特征在于，为具有权利要求2所述的表达基因的表达载体。

4.权利要求1所述的抗衰老小肽在用于制备具有抗衰老作用药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗衰老作用为对PC12细胞的保护作用。

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