CN109851660A - 一种治疗老年痴呆症的多肽及其疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗老年痴呆症的多肽及其疫苗，属于蛋白质工程技术领域。该多肽药物选自以下氨基酸序列中的至少任意一种：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。该多肽药物可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，具有广泛的临床应用价值。

Description

一种治疗老年痴呆症的多肽及其疫苗

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种治疗老年痴呆症的多肽及其疫苗。

背景技术

老年痴呆症或称老年性阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是世界性老年人的常见病，占人类死亡原因的第4位，是由巴伐利亚的神经病理学家阿尔茨海默于1907年首先发现，并以其名字命名。AD是一种弥漫性中枢神经退行性疾病，以进行性认知障碍、智力衰退和人格改变为特征，伴有大脑淀粉样蛋白Aβ1-42沉积、神经纤维缠结、神经元丢失和缓慢的炎性病理特征。AD的病因及发病机制尚不十分清楚，在临床上可表现为进行性记忆功能受损、认知功能紊乱及行为状况改变。尤其AD生前缺乏客观有效指标。目前市面上的治疗老年痴呆病的药物还没达到十分令人满意的结果。

据美国Decision Resources公司专业的医疗产业市场调查报告称，2019年阿尔茨海默病防治药物用量在法国、德国、意大利、日本、英国和美国将增长3倍。现在中国，AD病人约有1000万，平均每年增加30万。而中国人口逐渐步入老龄化，这个数字只可能是最保守的估计。AD给个人、家庭及社会带来极其不良的影响，加重了家庭和社会的经济负担。

目前治疗AD的药物主要有(1)乙酰胆碱酶抑制剂(Acetyl cholinesteraseinhibitors，AChEIs)；(2)NMDA拮抗剂；(3)其它Semagacestat(LY450139)、ACC-001等；疗效均见一般。目前开发的人单克隆抗体主要是为了清除脑内的β-淀粉样蛋白，虽然预防甚至是逆转阿尔茨海默病的进程。但经试验后发现不安全，存在很大的副作用。

人类约有40-60多种疾病与体内有毒的垃圾蛋白积累有关。这些内源性有毒的垃圾蛋白是由蛋白质错误折叠引起的，这类疾病被称为蛋白质错误折叠病(proteinmisfolding disease，蛋白质构象病，或变构病)。一般情况下，自身蛋白没有免疫抗原性，天然蛋白构象主要由α-螺旋和无规卷曲组成，具有完整一级结构的多肽或蛋白质，只有当其折叠形成正确的三维空间结构才可能具有正常的生物学功能。一旦蛋白质形成了错误的空间结构，将丧失其生物学功能，还会形成有毒的垃圾蛋或引起相关疾病，如:神经退行性疾病，II型糖尿病，动脉粥样硬化症(CAA)，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，淀粉样蛋白病(Systemic amyloidosis)，脊髓小脑共济失调(Spinocerebellar ataxia)，动脉粥样硬化症(CAA)，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease，HD)，朊蛋白病(prion disease)，家族性肌萎缩侧索硬化症(familialamyotrophic lateral sclerosis，ALS)，肺气肿(emphysema,α1-antitrypsindeficiency)等。绝大多数内源性有毒的垃圾蛋白是由β-折叠不断增加形成的，α-螺旋/β-折叠的结构转换导致疏水基团暴露而亲水基团埋在蛋白质内部，引起蛋白质分子之间形成交叉的β-折叠结构。蛋白质由于变构而变形扭转，暴露出一些在变构前并未显现的氨基酸序列(可以作为抗原决定簇)，也可通过疫苗刺激，使机体产生针对自身成分的抗体，清徐体内有毒的垃圾蛋白，从而预防或治疗人类蛋白质构象病。为了达到预防和治疗的目标，可用联合免疫治疗(UIT)方法预防和治疗包括阿尔茨海默病(AD)的蛋白质变构病。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗老年痴呆症的多肽及其疫苗。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种治疗老年痴呆症的多肽，其包括以下氨基酸序列中的任意一种：

1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

3)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

4)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

5)如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

6)如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

7)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

8)如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

9)如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

10)如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的实施方式，所述多肽为由如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10中任一种所示的氨基酸序列的取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。

本发明还提供了一种治疗老年痴呆症的多肽疫苗，所述多肽疫苗包含如上所述的多肽。

作为本发明优选的实施方式，所述多肽疫苗还包括载体；所述载体为热休克蛋白、牛血清白蛋白类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素、霍乱类毒素、钥孔血兰素、白喉毒素、突变白喉毒素、灭活脊髓灰质炎疫苗、伤寒VI多糖疫苗、麻疹病毒F蛋白、沙眼衣原体、大肠杆菌、血清蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白、甲状腺球蛋白中的一种或两种以上联合使用。

作为本发明优选的实施方式，所述多肽疫苗还包括佐剂，所述佐剂为福氏佐剂、氢氧化铝佐剂、Quil A、热休克蛋白、牛血清白蛋白、明矾、肠毒素佐剂中的一种或两种以上联合使用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明所述的多肽或多肽疫苗可以作为类淀粉状蛋白沉积抑制剂，类淀粉状蛋白沉积抑制剂API竞争性结合抑制β-淀粉样蛋白形成，能够有效预防引起老年斑的β-淀粉样蛋白形成和聚积，通过鼻腔给药、静脉注射或脑室注射单独使用或共同使用于患有老年痴呆症病的小鼠，均显示出良好的效果，可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，为联合使用多种药物提供可能性，具有广泛的临床应用价值。

具体实施方式

实施例一：固相多肽合成法合成多肽

以下所用到的试剂均从吉尔生化(上海)有限公司购买；

1、取二氯树脂1.5g，加入到用DCM浸泡过的反应柱中，用DCM15ml浸泡30min使树脂充分膨胀，以活化待用；

2、称取Fmoc-Cys(Acm).OH 0.31g于DCM中溶解，再加入DIEA0.5ml混合加入反应容器中，吹N₂反应2hr，将反应液过滤、加入MeOH 5ml封闭反应1hr后，用DCM异丙醇DMF各洗涤3次；

3、脱除氨基保护基：加入约15ml20％呱啶的DMF溶液反应5min，过滤，再加入15ml反应20min后用异丙醇洗涤树脂2次，DMF洗涤树脂3次；

4、肽健的形成：称取0.55gFmoc-Trp(600)-OH，0.35g TBTU以DMF溶解，与0.6mlHoBt(2mol/L)0.2ml DIEA混合加入盛有树脂；N端是乙酰化，C端是氨基化，用MBHA树脂，注意在使用DCM时，在此之前不可以在反应釜中添加DIPF(去保护试剂)；反应不能超过85℃；

5、合成反应完后，切割，冰乙醚沉淀，置冰箱2hr，离心收集，经HPLC分离纯化，冷冻干燥，成品存-80℃冰箱保存，HPLC纯化，柱层析，肽纯度50％w/w 95％，准备多肽标记及修饰技术，特别是荧光标记(FAM，FITC)，和生物素标记技术。

实施例二：固相多肽合成法合成多肽

多肽合成仪采用美国AB1431A型，多肽固相合成，树脂的选择及活化处理，从吉尔生化(上海)有限公司购买。

多肽合成其实就是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从羧基端(C端)向氨基端(N端)合成。固相合成多肽的基本原理是：以不溶性高分子树脂作为固相载体，首先在固相载体上以共价键连接一个含有被封闭基团保护的氨基的氨基酸，然后以三氟乙酸作为脱保护剂，脱掉氨基的保护基，这样在固相载体上就连接上了第一个氨基酸。将上了保护基的第二个氨基酸的羧基通过用过量的活化羧基组分活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体上的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复“缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合”操作，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后用三氟乙酸将合成好的多肽从树脂上切割下来。

1、材料：

2-Cl-Trt树脂(美国Aldrich公司)；HMP resin，FMOC-AA，FMOC-L-LYS(Boc)-OH[9-芴甲氧羰基(叔丁氧羰基)左旋赖氨酸，美国Aldrich公司]；FMOC-L-ALA-OH(9-芴甲氧羰基左旋丙氨酸，美国Aldrich公司)；FMOC-L-PRO-OH(9-芴甲氧羰基左旋脯氨酸，美国Aldrich公司)；MeOH(甲醇，上海巴斯夫)；NMP，DMF(N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫)；20％哌啶-DMF(20％哌啶-N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫)；DCM(二氯甲烷，中国医药集团上海化学试剂公司)；HCTU(6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯，上海A.R.吉尔生化有限公司)；HOBt(1-羟基苯并三氮唑，上海A.R.吉尔生化有限公司)；1％TFA/DCM(1％三氟乙酸/二氯甲烷，上海A.R.吉尔生化有限公司)；DIEA(N，N-二异丙基乙胺，上海A.R.吉尔生化有限公司)。Piperidine，HOBT，DCC，TFA，EDT，500mL单口烧瓶(北京兴运玻璃仪器制品厂)；磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)；磁子(北京市化玻供应公司)；温度计(北京兴运玻璃仪器制品厂)；气球；布氏漏斗(北京兴运玻璃仪器制品厂)；滤纸；抽滤瓶(北京兴运玻璃仪器制品厂)；洗瓶；岛津瓶(日本岛津公司)；LC-MS液质联用仪(LC-20AD，LCMS-2010EV，日本岛津公司)；缓冲球(上海贝凯生物化工设备有限公司)；旋转蒸发仪(BC-R203上海贝凯生物化工设备有限公司)。铝箔；冰；微波盒。

固相载体是将固相合成与其他合成技术分开来的最显著的区别，能用于多肽合成的固相载体必须满足以下的要求：⑴载体必须空间位阻小，便于溶剂的渗透，使其可以在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；⑵载体上必须有足够的反应位点，能使氨基酸共价连接在这些位点上，并在合成反应结束后，裂解这种共价键，以使得每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用；⑶另外载体必须在合成中表现为反应惰性，对合成过程中的物理和化学条件稳定。固相法合成多肽的高分子载体(树脂)主要有三类：聚丙烯酰胺类树脂、交联聚苯乙烯类树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物。只有将这些树脂导入反应基团，才能直接连上第一个上了保护基的氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又将这些树脂及树脂衍生物分为羧基树脂、氯甲基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。

2、FMOC固相合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂作为固相载体，用的是2-Cl-Trt树脂。其步骤是：

第一步：将2-Cl-Trt树脂(1.00g，1.00mmol)和DIEA(516mg，4.00mmol)加入到无水的DCM(20mL)中混合，然后将FMOC-L-LYS(Boc)-OH(1.40g，3.00mmol)溶于无水的DCM(30mL)中，在0℃条件下，将后者加入到前者中，在室温下搅拌5小时。最后，将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物中加入含有20％的哌啶-DMF(30mL)，在室温下搅拌过夜，以脱掉FMOC保护基。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(30mL)，DCM(30mL)洗涤三次，干燥后得到产物A1，滤液呈黄色，滤液加水有白色沉淀产生。

第二步：将FMOC-L-ALA-OH(933mg，3.00mmol)加入到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol)和DIEA(516mg，4.00mmol)的混合液在0℃条件下加入其中，并在室温下搅拌30min。将产物A1(1.00mmol)溶于DMF(30mL)后加入到上述反应液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反应完成，则将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。称10～20mg吸附在树脂上的样品于微量离心管中，用1％TFA/DCM清洗树脂，抽滤。将滤液进行浓缩，若残渣不溶于甲醇中则采取ELSD来检测反应是否完成。将上述所得产物中加入含有20％的哌啶-DMF(30mL)中，在室温下搅拌过夜。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)，DCM(50mL)洗涤三次，干燥后得到产物A2。

第三步：将FMOC-L-PRO-OH(3.00mmol)加入到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol)和DIEA(516mg，4.00mmol)的混合液在0℃条件下加入其中，并在室温下搅拌30min。将产物A2(1.00mmol)溶于DMF(30mL)后加入到上述反应液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反应完成，则将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物加入含有20％的哌啶-DMF(30mL)中，在室温下搅拌过夜。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)洗涤三次，DCM(50mL)洗涤两次，干燥后得到产物A3。

第四步：制备产物A4，A5的反应过程与制得A3的操作方法相同。

第五步：将TFA(1％，10mL)加入到无水DCM(20mL)中，混合后产物A5加入到其中，在室温下搅拌1h。将反应液进行抽滤，然后滤液用与无水DCM(20mL)混合的20％DIEA来中和，测酸碱值，溶液浓缩后既得终产物。

第六步：用LC-MS液质联用仪来检测。色谱条件：流动相(90％甲醇+10％水)；流速(0.2mL/min)；扫描时间(4min)；离子源模式：电喷雾电离(ESI)，正离子模式；质量分析器：三重四级杆。方法：各阶段均取适量产物于微量离心管中，用甲醇稀释后混匀。取适量于岛津瓶中，送检，进样量为1μL。2经HPLC分离纯化、冷冻干燥。成品存-80℃冰箱保存。准备多肽标记及修饰技术，特别是荧光标记(FAM，FITC)和生物素标记技术。

实施例三:采用基因重组合成多肽

利用基因工程技术利用益生菌和酵母分泌生产本发明的多肽药物，并利用酸奶、固体饮料、啤酒等方法将利用益生菌和酵母在肠道内生长繁殖连续不断地分泌生产各种疾病预防和治疗性多肽药。应用基因工程技术构建益生菌和酵母多肽药和疫苗载体，将抗原基因和细胞因子基因克隆到益生菌和酵母质粒上。经益生菌和酵母转化后筛选出含有表达目的基因的多肽药产品作为种子多肽药冻存保种，种子多肽药放大培养。

实施例四，多肽疫苗的生产

Aβ肽，或Tau抗原+载体蛋白，Balb/c mice，sc.100ug，2wks，肽+IFA，3wks，单独100ug肽，体内，从血，脾，淋巴，骨髓，分离独特免疫抗体的B细胞---骨髓瘤细胞或转化细胞融合--产生永生化的抗体细胞系。体外，从血、脾、淋巴、骨髓、分离免疫的B细胞，加10％人血浆的RPM1-1640，在培养基中将B细胞暴露于抗原7-14天，B cell+SPAZ-4异种杂交细胞融合，在37℃用40-50％MW1000-4000的聚乙二醇处理细胞约5-10min，从融合杂交细胞分离选择杂交体，(HAT，AH)的培养基中扩增。

与载体相连:aa肽短小没有免疫原性，因此免疫原性肽可结合载体蛋白，gly-gly载体相连:类毒素，可以加适量磷酸铝和氢氧化铝即成吸附精制类毒素，以长时间刺激机体，产生更高滴度抗体，增强免疫效果。所述载体为热休克蛋白、牛血清白蛋白类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素、霍乱类毒素、钥孔血兰素、白喉毒素、突变白喉毒素、灭活脊髓灰质炎疫苗、伤寒VI多糖疫苗、麻疹病毒F蛋白、沙眼衣原体、大肠杆菌、血清蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白、甲状腺球蛋白中的一种或两种以上联合使用。

选用安全佐剂(1.5ug/ul)：无Th1免疫反应，这是指在免疫过程中一种与抗原同时注射或预先注射，能非特异地增强或改变机体对抗原免疫反应性的物质。由于佐剂能增强抗原表面面积，并能延长抗原在体内保留时间，使抗原与淋巴系统细胞有充分接触时间，所以它有多种作用：(1)把无抗原性的物质转变为有效的抗原；(2)增强循环抗体的水平或产生更有效的保护性免疫；(3)改变所产生的循环抗体的类型；(4)增强细胞介导的超敏反应的能力；(5)产生实验性自身免疫或其他类型的变态性疾病；(6)保护抗原(特别是DNA，RNA)不受体内酶的分解。以1mg/ml浓度肽，(将80ug/ml肽)与CFA佐剂混合，并在施用之前将溶液在4℃下转动过夜，以使肽吸附于微粒。所述佐剂为福氏佐剂、氢氧化铝佐剂、Quil A、热休克蛋白、牛血清白蛋白、明矾、肠毒素佐剂中的一种或两种以上联合使用。

效果验证实验

阳性药物：脑复康片(吡拉西坦片，生产厂家：湖北华中药业有限公司，批号：20060812，0.4g/片，人用量为4.8g/kg/d)

实验动物：SAMP8早衰老小鼠，SAMR1正常小鼠，雌雄各半，18-22g，7月龄。

实验仪器：电子天平(型号：AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；天然药物分离纯化器(BUCHI Syncore)；小鼠跳台仪(XZC-5Q型，山东省医学科学院设备维修供应站)；Y型水迷宫。

数据统计：各组的数据用SD X±表示，采用单因素方差检验进行分析。两组间用t检验进行分析。

对比实验一:鼻腔给药对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响

各取本发明实施例一制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在所述药物中分别加入5倍，10倍，15倍，20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组(0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药，记录各组的生长存活期，结果见表1。

表1鼻腔给药对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响

组别	生长存活期(天)
		正常对照组(SAMR1)	88**
药物阳性对照	52*
		实验组1	57**
实验组2	56**
		实验组3	53*
实验组4	53**
		对照组	45

*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01

实验结论：实验结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的生长存活期实验结果比对照组有显著差异(P<0.05)，说明用药后小鼠的生存能力提高了。实验组1(原液1)的生长存活期实验结果稍比药物阳性对照组，实验组2，3，4(原液2，3，4)好。

对比实验二:鼻腔给药同时在实验动物头部身上使用特殊的40-60Hz闪光的LED灯光对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响。

各取本发明实施例一制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在所述药物中分别加入5倍，10倍，15倍，20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组(0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药。同时在实验动物头部身上使用特殊的40-60Hz闪光的LED灯光照射每晚3次，每次1小时，记录各组的生长存活期，结果见表2。

表2注射对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响

组别	生长存活期(天)
		正常对照组(SAMR1)	88**
药物阳性对照	54*
		实验组1	59**
实验组2	55**
		实验组3	53*
实验组4	56**
		对照组	48

*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01

实验结论：实验结果表明同时使用特殊的40-60Hz闪光的LED灯光照射和药物，阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的生长存活期实验结果比对照组有显著差异(P<0.05)，说明用药和同时LED灯光照射后小鼠的生存能力提高了。实验组1(原液1)的生长存活期实验结果稍比药物阳性对照组，实验组2，3，4(原液2，3，4)好。特殊的40-60Hz闪光的LED灯光可穿透头皮和颅骨到达大脑的内部，可以使大脑内的中间神经元同步激活从而使到大脑的伽马振荡得到增强，从而达到有效预防和治疗脑中枢神经系统包括老年痴呆症病的目的。

对比实验三:注射对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响

各取本发明实施例一制备的得到用于老年期痴呆的多肽疫苗0.5mg，在所述药物中分别加入5倍、10倍、15倍、20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水0.5ml/100g腹腔注射)、药物阳性对照组(0.72g/kg腹腔注射)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水0.5ml/100g腹腔注射)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上腹腔注射，小鼠以腹腔注射的方式连续给药20天，0.5ml/100g的剂量腹腔注射，以后观察小鼠停药后生长至死亡，记录每只小鼠的生长存活期，将同组内10只小鼠的生长存活期的平均值作为该组的最终结果，结果见表3。

表3注射对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响

组别	生长存活期(天)
		正常对照组(SAMR1)	93**
药物阳性对照	56*
		实验组1	59**
实验组2	57**
		实验组3	56*
实验组4	53**
		对照组	48

实验结论：实验结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的生长存活期实验结果比对照组有显著差异(P<0.05)，说明用药后小鼠的生长存活能力提高了。实验组1(原液1)的生长存活期实验结果稍比药物阳性对照组，实验组2，3，4(原液2，3，4)好。

对比实验四:

各取本发明实施例一制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在上述药物中分别加入5倍,10倍,15倍,20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组(0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药，每天一次，第20天训练。于训练前1小时给与药物。每批实验各组有1只小鼠给药，平行操作，以此类推。训练时将第一批的5只小鼠分别放入跳台仪的5个格子内，先适应环境3分钟，然后通电，小鼠受电击后，多数跳上跳台，逃避电击。动物多数再次跳下平台时以小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应，训练5分钟，并记录5分钟内触电次数，24小时后重新测试，以潜伏期及触电次数为观察指标记录测试成绩，结果见表4。

表4跳台实验结果

组别	训练成绩(错误次数)	潜伏期(秒)	测验成绩(错误次数)
				正常对照组(SAMR1)	3.0±1.7**	248.3±100.6**	1.2±0.9**
药物阳性对照	9.0±2.3	159.6±110.9*	3.4±1.2**
				实验组1	8.2±3.6	168.3±120.8*	4.6±2.5*
实验组2	10.0±2.5	159.6±110.6*	3.6±2.1*
				实验组3	8.0±2.6	163.6±130.6*	3.2±3.1*
实验组4	9.3±3.1	174.3±120.4*	4.3±2.6*
				对照组	13.9±2.6	102.6±120.3	9.9±3.6

*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01

实验结论：实验结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的跳台实验结果比对照组有显著差异(P<0.05),说明用药后小鼠的学习记忆能力提高了。实验组2(原液1)的跳台实验结果稍比药物阳性对照组好但比实验组1,3,4(原液1,3,4)好。

对比实验五:对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠Y型水迷宫实验的影响

各取本发明实施例一制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在所述药物中分别加入5倍,10倍,15倍,20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组(0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药。于20天给药后1h开始进行Y型水迷宫训练。小鼠放在水温27±2℃、水深10cm的Y型水迷宫中，一侧有平台，以小鼠在15秒内抵达平台为正确反应，抵达平台后休息10秒再重复训练，每只小鼠共训练10次，计算其正确反应率，24小时后测试其记忆保持情况，48小时后测试其记忆巩固情况。将同组内10只小鼠的正确反应率的平均值作为该组的最终结果，结果见表5。

表5 Y型水迷宫实验结果

*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01

实验结论：实验结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的Y型水迷宫实验结果比对照组有显著差异(P<0.05),说明用药后小鼠的学习记忆能力提高了。实验组4(原液4)的Y型水迷宫实验结果稍比药物阳性对照组差但比实验组1,2,3(原液1,2,3)好。

综上所述，本发明所述的多肽或多肽疫苗通过鼻腔给药、静脉注射或脑室注射单独使用或共同使用于患有老年痴呆症病的小鼠，均显示出良好的效果，可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，为联合使用多种药物提供可能性，具有广泛的临床应用价值。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 横琴欣健生物科技研究院有限公司

<120> 一种治疗老年痴呆症的多肽及其药物和制备方法

<130> 2018.06.21

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工合成

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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Xaa Xaa Glu Phe Arg His Asp Xaa

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<212> PRT

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Xaa Xaa Lys Leu Val Phe Phe Ala Xaa Xaa

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Xaa Xaa Lys Leu Pro Phe Phe Asp Val Gly

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Xaa Xaa Gly Pro Met Val Gly Xaa Xaa Xaa

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<213> 人工合成

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Xaa Xaa Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly

20 25

Claims (5)

1.一种治疗老年痴呆症的多肽，其特征在于：所述多肽包括以下氨基酸序列中的任意一种：

1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

3)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

4)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

5)如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

6)如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

7)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

8)如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

9)如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

10)如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的治疗老年痴呆症的多肽，其特征在于：所述多肽为由如SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.10中任一种所示的氨基酸序列的取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。

3.一种治疗老年痴呆症的多肽疫苗，其特征在于：所述多肽疫苗包含如权利要求1或2任一项所述的多肽。

4.根据权利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于：所述多肽疫苗还包括载体；所述载体为热休克蛋白、牛血清白蛋白类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素、霍乱类毒素、钥孔血兰素、白喉毒素、突变白喉毒素、灭活脊髓灰质炎疫苗、伤寒VI多糖疫苗、麻疹病毒F蛋白、沙眼衣原体、大肠杆菌、血清蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白、甲状腺球蛋白中的一种或两种以上联合使用。

5.根据权利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于：所述多肽疫苗还包括佐剂，所述佐剂为福氏佐剂、氢氧化铝佐剂、Quil A、热休克蛋白、牛血清白蛋白、明矾、肠毒素佐剂中的一种或两种以上联合使用。