RU2213747C2

RU2213747C2 - Пептид, обладающий противоопухолевой, протекторной и нормализующей активностью, и фармацевтическая композиция

Info

Publication number: RU2213747C2
Application number: RU2001125031/04A
Authority: RU
Inventors: И.А. Костанян; М.В. Астапова; С.М. Драницына; А.П. Богачук; Е.В. Наволоцкая; И.Л. Родионов; В.М. Липкин
Original assignee: Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Костанян Ирина Александровна; Астапова Мария Вячеславовна; Драницына Светлана Михайловна; Богачук Анна Пайзеновна; НАВОЛОЦКАЯ Елена Витальевна; Родионов Игорь Леонидович; Липкин Валерий Михайлович
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2003-10-10
Also published as: WO2000053626A1

Abstract

Изобретение относится к новому соединению - пептиду общей формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg, обладающему биологической активностью индуцирования дифференциации и ингибирования пролиферации клеток раковых образований и активностью протекторного и нормализующего действия в отношении процессов жизнедеятельности клетки млекопитающего, полученному методом твердофазного пептидного синтеза путем последовательного наращивания пептидной цепи и имеющему следующие свойства: мол. м. 714+1 Да; изоэлектрическая точка 7,18; рН-стабильность в интервале рН от 2,0 до 9,0; термостабильность в интервале температур от 0 до +50^oС; гомогенность 99,8%; растворимость в воде; физиологическом растворе и в буферных растворах рН 2,0-9,0; неиммуногенный, нетоксичный и фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента указанный пептид в эффективном количестве. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 9 ил.

Description

Область техники
Изобретение относится к области получения биологически активных веществ, оказывающих подавляющее воздействие на развитие раковых клеток и обладающих протекторным и нормализующим воздействием в отношении процессов жизнедеятельности клетки и организма млекопитающего, а именно к получению пептидов, и создания на их основе фармацевтических композиций для применения в медицине.

Предшествующий уровень техники
Проблема создания веществ, биологическая активность которых направлена на подавление процессов развития и метастазирования опухолевых злокачественных образований, является весьма актуальной. Известны вещества, полученные химическим путем или путем биологического синтеза, обладающие противоопухолевой активностью.

Известно применение в качестве вещества, обладающего противоопухолевой активностью, гексапептида формулы OCH-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp (RU, C1, 2064935, МКИ⁶ С 07 К 7/06), активность которого связана со свойствами гексапептида восстанавливать пролиферацию клеток Т-лимфоцитов, угнетаемую продуктами лейкозных клеток. Гексапептид имеет низкий молекулярный вес 927 Да, его получение возможно методом твердофазного синтеза. Эффект воздействия гексапептида направлен на активизацию процессов, противодействующих развитию опухоли.

Известно применение производных пептидов общей формулы X-Glu-Cys(Acm)-LysOH, где Х=Н или Glp, Acm - ацетамидометильная группа, эффективных в отношении ингибирования пролиферации миелопоэтических клеток (RU, C1, 2037499, MKИ⁶ C 07 K 7/06, А 61 К 38/00), и показывающих в группе производных избирательную активность в отношении различных клеток мозга, миелобластов и т.д.

Известен протеин, обладающий активностью ингибирования метастазирования злокачественных образований, состоящий из 408 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 45000±5000 Да (US, A, 5498697, MKИ⁶ C 07 K 1/00, С 07 К 2/00). Протеин синтезирован с помощью клеток человека или животного, например клеток Т-лейкемии, таких, как HPB-MLT и MOLT-4, что является дорогостоящей технологией. Кроме того, протеин обладает токсичностью, доза LD₅₀ составляет 50 мг/кг веса для 7-дневных мышей.

Известна проблема создания веществ, нормализующих процессы жизнедеятельности организма, нарушения которых вызваны адаптивными биохимическими и физиологическими изменениями в ответ на воздействие неблагоприятных факторов внешней среды и могут носить патологический характер и вызывать или обострять развитие многих серьезных заболеваний, а также веществ, оказывающих защитное воздействие на организм в условиях, неблагоприятных для организма.

Например, известно применение пептидов общей формулы Trp-X-Gly-Gly-Asp-R, где Х - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации, a R - Ala-Ser-Gly-Glu или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, или А1а, обладающих антистрессовым, противосудорожным и нейропротекторным действием (RU С1 2115660, МКИ⁶ С 07 К 7/06, А 61 К 38/08) в условиях, например, гипокинетического и эмоционально-болевого стресса.

В связи с вышеизложенным получение нового низкомолекулярного вещества, обладающего биологической активностью подавления развития клеток злокачественных образований, нетоксичного, благоприятно влияющего на процессы жизнедеятельности организма млекопитающего, является весьма актуальным и перспективным.

Сущность изобретения
В настоящем изобретении была поставлена задача создания и получения низкомолекулярного вещества, обладающего свойствами подавления роста злокачественных клеток и нормализации жизнедеятельности здоровых клеток организма млекопитающего за счет наличия у этого вещества активности индуцирования дифференциации и ингибирования пролиферации раковых клеток, а также за счет наличия активности протекторного и нормализующего действия в отношении процессов жизнедеятельности клетки.

Поставленная задача была решена созданием нового пептида формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg, обладающего биологической активностью индуцирования дифференциации и ингибирования пролиферации клеток раковых образований и активностью протекторного и нормализующего действия в отношении процессов жизнедеятельности клетки млекопитающего, полученного методом твердофазного пептидного синтеза путем последовательного наращивания пептидной цепи и имеющего следующие свойства:
молекулярная масса 714+1 Да, определенная с помощью MALDI-спектрометрии;
аминокислотный состав, определенный с помощью аминокислотного анализа со следующим соотношением аминокислотных остатков в одной молекуле пептида:
Треонин (Thr) - 1
Глицин (Gly) - 1
Глутаминовая
кислота (Glu) - 1
Аспарагин (Asn) - 1
Гистидин (His) - 1
Аргинин (Arg) - 1
изоэлектрическая точка 7,18, определенная в растворе рН 7,0;
рН-стабильность в интервале рН от 2,0 до 9,0, определена с помощью N-концевого аминокислотного анализа и MALDI- спектрометрии;
термостабильность в интервале температур от 0 до 50^oС, определена после инкубирования в течение 2 час;
гомогенность 99,8%, определена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии;
растворимость в воде, физиологическом растворе и в буферных растворах pH 2-9;
неиммуногенный.

Поставленная задача была решена также созданием фармацевтической композиции, обладающей противоопухолевым, протекторным и нормализующим действием, содержащей активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающейся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит пептид согласно изобретению в эффективном количестве.

Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется описанием конкретных, не ограничивающих настоящее изобретение примеров осуществления изобретения и прилагаемыми чертежами, на которых
фиг. 1 - график, иллюстрирующий влияние пептида согласно изобретению на дифференциацию клеток линии промиелоцитарного лейкоза HL-60 и эритромиелоцитарного лейкоза К-562;
фиг. 2 - график, иллюстрирующий влияние пептида согласно изобретению на пролиферацию клеток линии HL-60;
фиг. 3 - диаграмма, иллюстрирующая влияние пептида согласно изобретению на анальгетическую эффективность морфина при экспериментальной опийной наркомании у мышей;
фиг. 4 - диаграмма, иллюстрирующая влияние пептида согласно изобретению на толерантность к морфину у мышей при экспериментальной опийной наркомании;
фиг. 5 - диаграмма, иллюстрирующая влияние пептида согласно изобретению на болевую чувствительность мышей при экспериментальной опийной наркомании;
фиг. 6 - диаграмма, иллюстрирующая влияние пептида согласно изобретению на болевую чувствительность неморфинизированных мышей;
фиг. 7 - диаграмма, иллюстрирующая влияние мальтозосвязывающего белка и пептида согласно изобретению на величину "времени замирания" при формировании у мышей условного обстановочного страха;
фиг. 8 - диаграмма, иллюстрирующая влияние мальтозосвязывающего белка и пептида согласно изобретению на амплитуду "стартл-реакции";
фиг. 9 - график, иллюстрирующий влияние пептида согласно изобретению на процессы обучения и формирования памяти у мышей при тестировании в водяном лабиринте.

Лучший вариант осуществления изобретения
Изобретение может быть осуществлено получением пептида согласно изобретению, имеющего формулу Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg, любыми, известными специалистам, работающим в этой области, методами, например методом твердофазного пептидного синтеза с использованием трет-бутилоксикарбонильной схемы по методологии BOC/Bzl (Peptide Synthesis, 2nd edn., Pierce Chem. Co., Rickford IL), (Rodionov I.L., Baru M.B. and Ivanov V.T. A Swellographic approach to monitoring continuous flow solid phase peptide synthesis, Peptide Res., 1992, v.5, No.2, p. 119-125).

Синтез проводят в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе. В качестве носителя используют сополимер полистирола и дивинилбензола с 4-гидроксилметилацетамидометильной (РАМ) якорной группировкой BOC-ARG(Tos)-PAM RESIN (100-200 mesh, 0,47 ммол/г, Advanced Chem. Tech., USA Cat No. SR 5605) в количестве 250 мкмоль.

Для временной защиты α-аминогрупп аминокислот используют блокирующую трет-бутилоксикарбонильную (ВОС) группировку. Для проведения реакции конденсации используют четырехкратные избытки реагентов: пентафторфенилового эфира ВОС-аминокислоты и гидроксибензтриазола.

В качестве исходных продуктов используют аминокислоты Треонин, Глицин, Глутаминовую кислоту, Аспарагин, Гистидин, Аргинин в твердом состоянии, имеющиеся в виде препаратов в свободной продаже, например препаратов фирмы Reanal, в количестве 0,564 г каждой аминокислоты.

Концевую карбоксильную группу С-концевой аминокислоты синтезируемого пептида ковалентно связывают с носителем.

Ступенчатое наращивание пептидной цепи с N-конца проводят, последовательно отщепляя с α-аминогруппы блокирующую группировку и связывая с ней карбоксигруппу последующей аминокислоты. Полноту протекания реакций контролируют с помощью качественного и количественного нингидринового теста с использованием свеллографического мониторинга (Kaiser E., Colescott R.L., Bossinger C.D., Cook P.I., 1970. Anal. Biochem., 34, p.595-598).

Полученный пептидил-полимер отщепляют от носителя с одновременным удалением блокирующих групп действием жидкого фтористого водорода (19 мл на 700-1000 мг пептидилполимера) в присутствии мета-крезола (1 мл) и цистеина (500 мг) при температуре от -10 до 0^oС в течение двух часов.

Пептид очищают хроматографически методом гель-фильтрации на колонке со смолой Sephadex G-10 (26 х 500 мм) в 1 N уксусной кислоте. Структуру пептида затем анализируют по аминокислотному составу известными специалистам, работающим в области пептидов, методами аминокислотного анализа и MALDI-спектрометрии.

Пептид очищают до гомогенности 99,8% методом обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке NUCLEOSIL С 18 на приборе ALTEX, USA, или другими известными специалистам, работающим в этой области, методами хроматографии.

Выход конечного продукта составляет 78% сухого вещества по отношению к суммарному количеству исходных аминокислот.

Затем пептид подвергают анализу на определение физико-химических свойств.

Таким образом получен пептид, имеющий формулу Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg и следующие свойства:
аминокислотный состав со следующим соотношением аминокислотных остатков в одной молекуле пептида:
Thr - 1
Gly - 1
Glu - 1
Asn - 1
His - 1
Arg - 1
молекулярная масса 714+1 Да;
изоэлектрическая точка 7,18;
растворимость в воде, физиологическом растворе и в буферных растворах рН 2-9;
рН стабильность в интервале рН от 2,0 до 9,0;
термостабильность в интервале температур от 0 до 50^oС;
гомогенность 99,8%.

Иммунохимический анализ полученного пептида, проведенный методом иммунизации кроликов конъюгатом пептида с бычьим сывороточным альбумином и гемоцианином улитки (KLH) показал, что антитела к пептиду не вырабатываются, что свидетельствует о неспецифичности пептида и, в силу его малой молекулярной массы, его неиммуногенности.

Из представленных материалов каждому специалисту, сведущему в этой области, ясно, что низкомолекулярный пептид, полученный описанным способом, обладает фармацевтической чистотой, не нуждается в дальнейшей очистке, может быть получен в жидкой форме, полужидкой форме или в виде твердого вещества.

Пептиды согласно изобретению могут быть использованы в виде растворов или в качестве биологически активного ингредиента в составе фармацевтических композиций в фармацевтически удобных формах. Например, твердые фармацевтические композиции могут представлять собой порошок для инъекций, жидкие композиции - растворы для инъекций или терапевтические средства в капсулированной форме и т.д.

Наличие у пептида согласно изобретению биологической активности подтверждается далее описанием примеров применения пептида.

Пример 1. Наличие у пептида активности индуцирования дифференциации раковой клетки.

Влияние пептида на процесс дифференциации раковой клетки проверяли на культурах клеток-мишеней промиелоцитарного лейкоза HL-60 и эритромиелоцитарного лейкоза К-562, выращенных в стандартной среде RPMI-1640, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка, в атмосфере с 5%-ным содержанием углекислого газа при температуре +37^oС. Клетки-мишени помещали в лунки 12-луночного планшета для культивирования клеток (фирмы Costar) дозами по 2,5 мл в концентрации 2,5•10⁵ клеток/мл. Затем в лунки с опытными клетками были внесены стерильные водные растворы пептида согласно изобретению дозами по 25 мкл до создания в лунках конечных концентраций Q_p в интервале от 10^-6 до 10^-11 М. В лунки с контрольными клетками была внесена стерильная вода дозой 25 мкл. Были проведены 3 группы опытов, каждое значение концентрации пептида проверено в двух параллелях, 2 лунки контрольные.

Заполненные вышеописанным образом планшеты были инкубированы 72 часа в стандартных условиях: t^o=+37^oC, атмосфера с 5%-ным содержанием углекислого газа. Затем контрольные и опытные пробы переносили в пробирки и центрифугировали 5 минут при 180g. После этого проводили тест на выявление дифференцированных клеток.

Тест основан на восстановлении нитроголубого тетразолия до нерастворимых гранул формазона, появляющихся в цитоплазме дифференцированных лейкоцитарных клеток под действием мембранных окислительно-восстановительных ферментов (NTB-тест). Для окрашивания клеток нитроголубым тетразолием смеси равных объемов клеточных осадков и 0,2%-ного раствора нитроголубого тетразолия, приготовленного в буферном растворе (рН 7,2), инкубировали 25 минут в стандартных условиях (t^o=+37^oС, атмосфера с 5%-ным содержанием углекислого газа) и затем 15 минут при комнатной температуре. Из смеси, подвергшейся инкубации, готовили мазки на предметных стеклах. После высыхания мазки фиксировали в 10%-ном метиловом спирте и изучали под световым микроскопом при увеличении 40 x 10, подсчитывая при этом в каждых просчитанных в поле зрения 100 клетках количество клеток, содержащих не менее 5 темно-синих гранул формазона, то есть количество дифференцированных клеток.

Результаты тестирования показаны на графике фиг.1, где по оси абсцисс показана концентрация Q_p пептида в опыте, а по оси ординат - процент дифференцированных клеток Q_d. Значения кривой 1 соответствуют опытам с дифференцированием клеток линии промиелоцитарного лейкоза HL-60, значения кривой 2 - опытам с дифференцированием клеток линии эритромиелоцитарного лейкоза К-562, точка C₁ - результат в контрольном опыте с клетками лейкоза HL-60, точка С₂ - результат в контрольном опыте с клетками лейкоза К-562. Из графика видно, что при возрастании концентрации пептида в культуре клетки от 10^-10 до 10^-6 возрастает и количество дифференцированных клеток в культуре с пептидом, причем их количество превышает количество дифференцированных клеток в культуре без пептида в 2-2,5 раза, что свидетельствует об активности пептида индуцировать дифференциацию клетки.

Пример 2. Наличие у пептида активности ингибирования пролиферации раковых клеток.

Влияние пептида на пролиферацию клеток определяли на культуре клеток линии промиелоцитарного лейкоза HL-60, выращенных в стандартной среде RPMI-1640, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка, в атмосфере с 5%-ным содержанием углекислого газа при температуре +37^oС. Клетки-мишени помещали в лунки 12-луночного планшета для культивирования клеток (фирмы Costar) дозами по 3 мл в концентрации 5•10⁵ клеток/мл. Затем в лунки с опытными клетками были внесены стерильные водные растворы пептида согласно изобретению дозами по 25 мкл до создания в лунках конечных концентраций Q_p в интервале от 10^-5 до 10^-10 М. В лунки с контрольными клетками была внесена стерильная вода дозой 25 мкл.

Заполненные вышеописанным образом планшеты были инкубированы 72 часа в стандартных условиях: t^o=+37^oC, атмосфера с 5%-ным содержанием углекислого газа.

Степень ингибирования пролиферации клеток определялась по количеству включения в ДНК клеток радиоактивно меченого тимидина ³Н-тимидина с удельной радиоактивностью 1,0 мкКи/ммоль.

В культуру опытных клеток и культуру контрольных клеток добавили по 10 мкл ³H-тимидина и инкубировали культуры 2 часа при температуре +37^oС, после чего определяли количество изотопа ³H-тимидина, включившегося в ДНК клеток, с помощью сцинтилляционного счетчика (DELTA, USA). Индекс I_p ингибирования пролиферации определяется отношением количества радиоактивного тимидина, включившегося в опытные клетки, к количеству радиоактивного тимидина, включившегося в контрольные клетки.

Результаты опытов показаны на графике фиг.2, где по оси абсцисс показана концентрация Q_p пептида в культуре опыта, а по оси ординат - индекс I_p ингибирования пролиферации.

Из графика видно, что индекс I_p в культуре с внесенным пептидом составляет 0,6-0,8, что означает уменьшение пролиферации раковых клеток на 20-40%, и можно сделать вывод, что испытуемый пептид обладает активностью ингибирования пролиферации раковых клеток.

Пример 3. Наличие у пептида активности нормализующего типа.

1. Была исследована способность пептида вызывать усиление анальгетического воздействия дозы анальгетика на организм млекопитающего.

Исследования были проведены на примере применения в качестве анальгетика наркотического вещества, а именно морфина. Известно, что при длительном применении наркотических средств в качестве анальгетиков в организме наблюдается эффект привыкания, и для достижения одного и того же анальгетического эффекта требуется введение увеличенных доз анальгетика.

Исследованию были подвергнуты мыши-самцы линии C57BL/6 весом по 25 г, которые были предварительно морфинизированы. Наркотизацию проводили согласно методике Башаровой Л.А. (Башарова Л.А., Евсеев В.А., Ветрилэ А.Н. и др. Индукция аутоантител к серотину и катохоламинам у хронически морфинизированных крыс с проявлением абстинентного синдрома. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1993, 5, стр.468-471) возрастающими дозами морфина от 20 до 60 мг/кг веса подкожно в 0,2 мл физиологического раствора дважды в сутки с интервалом между инъекциями 12 часов. По окончании курса морфинизации мышей разделили на 2 группы: контрольную и опытную. Затем мышей опытной группы однократно инъецировали внутрибрюшинно введением пептида согласно изобретению в дозе 4 мг/кг веса в физрастворе объемом 0,2 мл. Мышам контрольной группы ввели физраствор в объеме 0,2 мл.

По истечении суток после этого все мыши были подвергнуты инъецированию тест-дозами морфина 5 мг/кг веса одноразово с последующим тестированием на величину болевой чувствительности мыши к ноноцептивному термическому раздражению после введения анальгетика, в данном случае морфина. Тестирование проводилось тестом горячей пластины при температуре +55^oС. Наступление болевой чувствительности фиксировалось по реакции отдергивания и облизывания мышью задней лапы, соприкасающейся с пластиной, измерялось время, называемое "латентным периодом t_lp".

Анальгетический эффект морфина Е_а определяется по формуле

где t_lp1 - латентный период облизывания задней лапы до введения тест-дозы морфина;
t_lp2 - латентный период облизывания задней лапы по истечении 30 мин после введения тест-дозы морфина.

Результаты исследований показаны на диаграмме фиг.3, где область 1 диаграммы соответствует результатам, полученным при тестировании на мышах до наркотизации, область 2 диаграммы соответствует результатам, полученным при тестировании на тех же мышах после наркотизации вышеописанным способом, а область 3 - соответствует результатам, полученным при тестировании на тех же мышах, подвергавшихся инъецированию раствором пептида или физраствора. Столбцы диаграммы, имеющие штриховку, соответствуют результатам опытов в группах опытных животных.

Как видно из диаграммы, в области 2 по сравнению с областью 1 анальгетический эффект морфина значительно снижен, что говорит о наличии эффекта привыкания к морфину, а в области 3 по сравнению с областями 1 и 2 анальгетический эффект морфина значительно усилен в группе мышей, инъецированных раствором пептида. То есть можно сделать выводы о том, что наилучший анальгетический эффект одной и той же дозы морфина получен в области 3, что связано с введением пептида в организм испытуемого животного.

2. Была исследована способность пептида согласно изобретению вызывать снижение физической зависимости организма млекопитающего от наркотика при экспериментальной опийной наркомании.

Исследованию были подвергнуты мыши-самцы линии C57BL/6 весом по 25 г, хронически наркотизированных морфином способом, аналогичны описанному в примере 3.1.

Тестирование животных проводили до наркотизации, по окончании наркотизации и затем через сутки после введения им внутрибрюшинно одноразово раствора пептида в 0,2 мл физраствора с дозой пептида 4 мг/кг веса (опытная группа) или после введения физраствора 0,2 мл (контрольная группа).

Величину зависимости от наркотика оценивали по величине толерантности Т, определяемой по формуле

где t_lp1m - латентный период облизывания задней лапы с тест-дозой морфина 5 мг/кг веса до наркотизации;
t_lp2m - латентный период облизывания задней лапы с тест-дозой морфина 5 мг/кг веса после наркотизации и после инъецирования пептидом или физраствором.

Результаты исследований показаны на диаграмме фиг.4, на которой по оси ординат показано значение толерантности Т, область 1 соответствует значениям толерантности мышей после наркотизации, а область 2 - значениям толерантности после введения этим животным раствора пептида. Штриховкой показаны столбцы, соответствующие результатам в опытной группе животных.

Как видно из диаграммы, толерантность к морфину в группе животных опытной группы повышена, что говорит о том, что пептид согласно изобретению нормализует процессы жизнедеятельности организма.

3. Была исследована способность пептида согласно изобретению вызывать восстановление болевой чувствительности организма млекопитающего.

Известно, что при длительном введении в организм анальгетического наркотического средства наблюдается снижение болевой чувствительности организма.

Исследования воздействия пептида были проведены на мышах-самцах линии C57BL/6 весом по 25 г, которые были предварительно наркотизированы морфином способом, аналогичным описанному в примере 3.1, до создания у мышей состояния опийной наркомании. Затем через сутки животные опытной группы, которым ввели внутрибрюшинно одноразово раствор пептида в 0,2 мл физраствора с дозой пептида 4 мг/кг веса мыши, и животные контрольной группы, которым ввели одноразово внутрибрюшинно по 0,2 мл физраствора, были подвергнуты тестированию на величину болевой чувствительности мыши к ноноцептивному термическому раздражению тестом "горячей пластины" аналогично описанному в примере 3.1 с фиксированием латентного периода t_lp1 - времени до отдергивания и облизывания задней лапы, соприкасающейся с горячей пластиной.

Результаты исследований показаны на диаграмме фиг.5, на которой область 1 диаграммы соответствует результатам, полученным на группах мышей до наркотизации, область 2 - после наркотизации, область 3 - после введения раствора пептида.

Заштрихованные столбцы соответствуют результатам в опытной группе мышей.

Результаты показывают, что введение пептида в организм животного вызывает восстановление болевой чувствительности.

4. Было проверено влияние введения пептида на болевую чувствительность мышей, не подвергавшихся предварительной морфинизации.

Испытанию были подвергнуты три группы животных, одна из которых была инъецирована 0,2 мл физраствора, вторая инъецирована раствором пептида в 0,2 мл физраствора с концентрацией пептида 0,8 мг/кг веса, а третья инъецирована раствором пептида в 0, 2 мл физраствора с дозой пептида 4 мг/кг веса. Затем все три группы животных были подвергнуты тестированию на определение болевой чувствительности по методу, описанному в п.3.1.

Результаты испытаний представлены на диаграмме фиг.6, где столбцы, помеченные цифрой 1, соответствуют результатам тестирования до инъецирования, цифрой 2 - результатам тестирования по истечении 1 часа после инъецирования, цифрой 3 - по истечении 24 часов. Область 1 диаграммы соответствует результатам тестирования контрольной группы животных, область 2 - инъецированных раствором пептида в дозе 0,8 мг/кг веса, область 3 - то же, в дозе 4 мг/кг веса. Из диаграммы видно, что сам пептид анальгетическим воздействием не обладает.

5. Была исследована способность пептида нормализовывать поведенческие реакции животного в состоянии острого абстинентного сидрома.

Исследования были проведены на примере изменения поведенческих реакций животного в открытом поле, реакций, включающих прыжковую активность, птоз, тремор, вздрагивание, отряхивание, а также специфически выраженных синдромов в стадии абстиненции - судорог, корч, груминга, диареи. Исследования воздействия пептида были проведены на мышах-самцах линии C57BL/6 весом по 25 г, морфинизированных по описанной в примере 3.1 методике до создания у мышей состояния опийной наркомании, а затем инъецированных одноразово внутрибрюшинно раствором налоксона в дозе 20 мг/кг веса для воспроизведения острого абстинентного синдрома.

Затем животных опытной группы инъецировали одноразово внутрибрюшинно раствором пептида в объеме 0,2 мл в физрастворе с дозой пептида 4 мг/кг веса.

Результаты исследований представлены в таблице 1 (см. в конце описания).

6. Была исследована способность пептида согласно изобретению вызвать нормализацию поведенческих реакций животного, нарушения которых были связаны с патологическими нарушениями коры мозжечка.

Исследования были проведены на крысах на примере изменения процессов памяти и обучения, например формирования у крысы условного обстановочного страха, вызванного звуковой стимуляцией, что приводит к отклонениям от нормы амплитуды акустической стартл-реакции.

Акустическая стартл-реакция является важной характеристикой психофизического статуса организма. "Стартл-реакция" позволяет оценить сенсомоторную готовность к адекватным действиям и способность организма к незамедлительному движению. Малая стартл-амплитуда свидетельствует о пониженном уровне побудительной и исследовательской активности или двигательных расстройствах, что может быть следствием ишемии мозга или каких-либо нарушений в системе передачи нервного импульса.

Повышенная амплитуда стартла присуща пациентам с посттравматическим стрессом, иногда шизофреникам, и указывает на высокую степень страха и тревожности. У животных увеличение стартла может наблюдаться также после социальной изоляции. Стартл является необходимым компонентом ранней стадии обучения, особенно при защитном поведении. Будучи неспецифической реакцией, он формируется в процессе обучения и закрепления навыков. Нарушение формирования "стартла" подавляет выработку навыков. Следовательно, отклонения уровня базовой линии и динамика амплитуды стартла отражают различные расстройства в центральной нервной системе, которые приводят к нарушениям адаптивного поведения.

Воздействие ряда стартл-выявляющих акустических стимулов ведет к выработке условного обстановочного страха, оцениваемого по реакции замирания ("фризинг"). Предполагается, что оптимальный уровень условного обстановочного страха необходим для формирования стартла.

Процедура тестирования заключается в 20 стартл-вызывающих акустических стимулах в течение 2 дней (по 10 стимулов в день). Величина "фризинга", как времени полной неподвижности, оценивалась в течение 15 минут перед воздействием набора стимулов. Отношение величины фризинга во 2-ой день к таковой в 1-ый является, как известно, индексом условного обстановочного страха. Формирование краткосрочного страха оценивалось по разнице между амплитудой реакций в ответ на 1-й (S1) и 10-й (S10) стимулы. Формирование долгосрочного страха оценивалось по разнице между реакцией на 1-й в первый день и на 11-й, (S11), т.е. 1-й во второй день, стимулы. Дальнейшее формирование оценивалось как разница между 11-ой, (S11), т.е. 1-ой во второй день, и 20-ой (S20), т. е. 10-ой во второй день, стартл-реакциями. Известно, что червь мозжечка принимает участие в формировании долгосрочных процессов (Leaton, 1989, 1991).

В качестве агента, вызывающего структурные изменения в нервной ткани мозжечка, был использован мальтозосвязывающий белок, который вводили крысам под эфирным наркозом в область червя мозжечка в объеме 3 мкл в физрастворе с дозой мальтозосвязывающего белка 5 мкг.

Затем одна группа крыс была оставлена контрольной, другой группе крыс были проведены аппликации мальтозосвязывающего белка в физрастворе, а третьей группе крыс - аппликации мальтозосвязывающего белка в физрастворе с добавлением пептида согласно изобретению в концентрации 10^-6 М в составе смеси.

По истечении одних суток и двух суток после аппликации измерялось время замирания T_f (фризинг) животного при формировании условного обстановочного страха.

Результаты измерений представлены на диаграмме фиг.7, на которой область 1 соответствует результатам изменения "фризинга" в контрольной группе, область 2 - в группе животных с апплицированным мальтозосвязывающим белком, область 3 - в группе животных с апплицированным мальтозосвязывающим белком и пептидом. Заштрихованные столбцы соответствуют результатам измерения амплитуды "стартла" в ответ на звуковой стимул в течение двух суток.

S1 - амплитуда "стартла" в ответ на 1-й сигнал в первый день;
S10 - то же, в ответ на 10-й сигнал в первый день;
S11 - то же, в ответ на 1-й сигнал во второй день;
S20 - то же, в ответ на 10-й сигнал во второй день.

Из диаграммы видно, что аппликация пептида одновременно с мальтозосвязывающим белком снимает отрицательные воздействия этого белка на процессы формирования памяти.

По истечении 7 суток после аппликации было изучено изменение стартл-реакции животных.

Результаты представлены на диаграмме фиг.8, на которой по оси ординат указана величина амплитуды А стартл-реакции в условных единицах, область 1 соответствует данным опыта в контрольной группе, область 2 - после аппликации мальтозосвязывающего белка, область 3 - после одновременной одноразовой аппликации мальтозосвязывающего белка с пептидом.

Столбцы 1 соответствуют результатам измерения амплитуды в ответ на первый звуковой сигнал в первый день исследования, столбцы 2 - амплитуды в ответ на десятый звуковой сигнал в первый день исследования, столбцы 3 - то же, в ответ на первый звуковой сигнал второго дня исследования, столбцы 4 - то же, в ответ на десятый звуковой сигнал второго дня исследования.

Из диаграммы видно, что воздействие пептида согласно изобретению нормализует процессы формирования памяти.

На шестые или восьмые сутки после инъецирования проводили декапитацию крыс под наркозом. Из мозга извлекали мозжечок, фиксировали в растворе 4%-ного параформальдегида в 0,01 М растворе фосфатного буфера, рН 7,4, после чего производили стандартную гистологическую обработку с заливкой в парафин. Срезы толщиной 5 мкм приготавливали с помощью микротома и окрашивали гемотоксин/эозином. Полученные препараты исследовали в световом микроскопе с увеличением 10 х 40. Исследования показали, что в коре мозжечка крыс, апплицированных раствором мальтозосвязывающего белка, наблюдается увеличение, относительно контрольной группы, количества гранулированных клеток Пуркинье, что является свидетельством повреждения мозговой ткани, а в коре мозжечка крыс, апплицированных одновременным введением раствора мальтозосвязывающего белка и раствора пептида согласно изобретению, количество гранулированных клеток Пуркинье не превышает количества этих клеток в коре мозжечка контрольной группы крыс.

В связи с изложенным можно сделать вывод о том, что пептид обладает протекторной активностью, предохраняя клетки Пуркинье от гипоксии, вызванной воздействием мальтозосвязывающего белка, что на поведенческом уровне выражается в нормализации процессов формирования памяти.

7. Было исследовано влияние пептида на процессы формирования памяти.

Исследования были проведены на трех группах здоровых мышей линии C57BL/6 весом по 25 г. Первая группа в количестве 8 животных служила контролем, вторая группа в количестве 8 животных была инъецирована одноразово внутрибрюшинно раствором пептида в 0,2 мкл физраствора с дозой пептида 4 мг/кг веса, третья группа - раствором пептида в 0,2 мкл физраствора с дозой пептида 0,8 мг/кг веса. Животные были подвергнуты тестированию на способность обучения в модели "водяной лабиринт" по истечении 6 часов и 30 часов после инъецирования. Результаты тестирования по истечении 6 часов представлены на графике в области А, а по истечении 30 часов - на графике в области В (фиг. 9), где по оси абсцисс указан номер N теста - попытки мыши в воде достичь платформы, невидимой на поверхности воды, но обеспечивающей ее безопасность (затопленной платформы), а по оси ординат показано время достижения Т_е затопленной платформы мышью в каждой попытке. Кривые 1 соответствуют данным контрольной группы, кривые 2 - данным второй группы животных, кривые 3 - данным третьей группы животных.

Как видно из области А графика при введении пептида в дозах 4 мг/кг веса и 0,8 мг/кг веса время достижения Т_e затопленной платформы уменьшается, что свидетельствует об улучшении процессов формирования кратковременной памяти.

Как видно из области В графика, эффективность действия пептида в большей дозе (4 мг/кг) была наибольшей в первые сутки тестирования, и дальнейшего уменьшения времени достижения затопленной платформы на вторые сутки практически не происходило. Эффективность действия пептида в дозе 0,8 мг/кг сохранялась как в первые, так и во вторые сутки.

Полученные данные свидетельствуют о том, что пептид в малой дозе благотворно влияет на процессы формирования долговременной памяти.

8. Наличие у пептида согласно изобретению активности протекторного типа.

Было исследовано in vitro влияние пептида на жизнедеятельность двух- и четырехклеточных зародышей мышей C57BL/6-Wx, мутантных по гену C-KIT, как наиболее уязвимых при воздействии неблагоприятных условий среды.

Зародыши получали следующим образом.

Использовали для спаривания 6-8-недельных мышей SHK в соотношении самок к самцам 3:1. Самцов подсаживали вечером и на следующий день утром отбирали животных с копулятивными пробками. День обнаружения копулятивной пробки считали первым днем беременности.

Зародыши мышей на различных стадиях развития выделяли из яйцеводов.

Зародышей на стадии 2 бластомеров выделяли из яйцеводов на второй день беременности в полдень; зародышей на стадии 4 бластомеров выделяли из яйцеводов на второй день беременности вечером; восьмиклеточных зародышей и зародышей на стадии морулы выделяли из яйцеводов и рогов матки на третий день беременности утром и вечером соответственно. Для этого самок забивали путем смещения шейных позвонков, затем извлекали яйцеводы (и/или рога матки) и промывали их на предметном стекле 0,1-0,2 мл модифицированной среды Виттена.

Состав модифицированной среды Виттена:
70,89 mM NaCl
4,78 mM KCl
1,19 mМ КН₂РO₄
1,19 mM MgSO₄•7H₂O
22,61 mМ NаНСО₃
21,00 mM HEPES
0,33 mM Na-пируват
1,71 mM Са-лактат•5H₂O
22,28 mM Na-лактат
5,56 mM глюкоза
100 мкг/мл БСА
0,08 мкг/мл пенициллина
0,05 мкг/мл стрептомицина
Для промывания извлеченных яйцеводов использовали инсулиновый шприц со специально заточенной инъекционной иглой, которую вводили в воронку яйцевода. Промывание проводили под контролем бинокулярной лупы МБС-10 при увеличении 20х. Для манипуляций с эмбрионами использовали стеклянный капилляр, изготовленный из закаленного пирекса.

Затем зародыши мышей культивировали по методу Березовской (Березовская О. П. , Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования доимплантационных зародышей мыши. Онтогенез, 1986, т. 17, 5, с.553-555) в модифицированной среде Виттена.

Одна группа зародышей была культивирована в среде Виттена и использована в качестве контрольной группы, а другая группа зародышей была культивирована в среде Виттена с добавлением в нее пептида согласно изобретению в концентрации 10^-5 М.

Среду культивирования готовили непосредственно перед использованием. Среду стерилизовали путем фильтрования через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Для контроля рН в среду добавляли феноловый красный до 0,001%. Для культивирования использовали среду с рН 7,2, обеспечивающую нормальное развитие зародышей начиная со стадии 2 бластомеров и до стадии бластоцисты. Для культивирования использовали стеклянные чашки Петри (D 60 мм), ко дну которых герметизирующей силиконовой пастой КЛТ-ЗОА приклеивали стеклянные кольца диаметром 8 мм и высотой 5 мм (фиг. 2). В каждое кольцо, содержащее по 200 мкл среды Виттена, помещали от 5 до 10 зародышей. Для поддержания влажности на дно чашки Петри наливали 2 мл этой же среды. Культивирование проводили в СО₂ - инкубаторе при 37^oС, 5% CO₂ в атмосфере в течение 72 часов. За это время нормальные, неповрежденные 2-клеточные зародыши достигали стадий компактной морулы или бластоцисты. Контроль за ходом развития проводили через каждые 24 часа, оценивали все аномалии (снижение темпов делений дробления, остановка развития, фрагментация, состояние бластомеров, количество бластомеров, характер контактов между ними). Полностью развившимися считали только те зародыши, которые за 72 часа культивирования достигали стадии компактной морулы или бластоцисты. Зародыши, которые проходили одно или несколько делений дробления, но не достигали за это время стадий морулы, относили к разряду имеющих нарушения механизма регуляции развития. При более длительном культивировании такие зародыши погибают.

Результаты исследований представлены в таблице 2 (см. в конце описания).

Как видно из таблицы 2, количество зародышей, достигших развития от стадии двух, четырех, восьми бластомеров до стадии бластоцисты, значительно выше при культивировании их в среде с добавлением пептида согласно изобретению.

Пример 4. Проверка пептида согласно изобретению на наличие цитотоксического эффекта.

Исследования провели на клетках линии HL-60 и К-562. В культуру клеток добавляли раствор пептида в концентрации 10^-4 М 10^-5 М, 10^-6 М в воде и определяли количество жизнеспособных клеток на вторые сутки после его добавления, для чего культуру центрифугировали при 1500 об/мин, к осадку клеток добавляли раствор 0,2%-ного метилового синего в PBS, рН 7,2, и смесь затем осторожно пипетировали. Капли окрашенной клеточной суспензии помещали в камеру Горяева и просчитывали число окрашенных, т.е. погибших, клеток. Жизнеспособность клеток составила не менее 95-96%, что позволяет сделать вывод о том, что пептид согласно изобретению не обладает цитотоксическим эффектом.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что пептид согласно изобретению обладает биологической активностью индуцирования дифференциации и ингибирования пролиферации клеток раковых образований и активностью протекторного и нормализующего действия в отношении процессов жизнедеятельности клетки млекопитающего, неиммуногенен и нетоксичен. Наличие этих свойств обуславливает широкие перспективы использования его в составе фармацевтических композиций, в составе сред для культивирования клетки и для других целей, известных специалистам, работающим в этой области.

Промышленная применимость
Пептид согласно изобретению может быть получен любыми известными специалистам, работающим в химии пептидов, способами химического синтеза, например методом твердофазного пептидного синтеза с использованием трет-бутилоксикарбонильной схемы с использованием известных, широко применяемых в химии пептидов, реагентов и оборудования, широко известных методов и приборов контроля.

Пептид согласно изобретению и фармацевтические композиции на его основе могут широко использоваться в различных областях, например в медицине для терапевтического лечения злокачественных образований, снижения наркотической зависимости организма, восстановления нормальных поведенческих реакций в стадии абстинентного синдрома при наркомании, нормализации деятельности мозга, восстановления и стимулирования памяти и процессов жизнедеятельности организма в целом.

Пептид согласно изобретению может использоваться в качестве одного из реагентов сред для культивирования эмбрионов и клеток, чувствительных к неблагоприятным условиям среды обитания, а также в качестве агента или инструмента для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе жизнедеятельности клетки.

Claims

1. Пептид общей формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg, обладающего биологической активностью индуцирования дифференциации и ингибирования пролиферации клеток раковых образований и активностью протекторного и нормализующего действия в отношении процессов жизнедеятельности клетки млекопитающего, полученный методом твердофазного пептидного синтеза путем последовательного наращивания пептидной цепи и имеющий следующие свойства: мол.м. 714+1 Да, определенная с помощью MALDI-спектрометрии; аминокислотный состав, определенный с помощью аминокислотного анализа и с помощью MALDI-спектрометрии, со следующим соотношением аминокислотных остатков в одной молекуле пептида:
Треонин (Thr) - 1
Глицин (Gly) - 1
Глутаминовая кислота (Glu) - 1
Аспарагин (Asn) - 1
Гистидин (His) - 1
Аргинин (Arg) - 1
изоэлектрическая точка 7,18, определенная в растворе рН 7,0; рН стабильность в интервале рН от 2,0 до 9,0; термостабильность в интервале температур от 0 до +50^oС; гомогенность 99,8%, определенная с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; растворимость в воде, физиологическом растворе и в буферных растворах рН 2,0-9,0; неиммуногенный.

2. Фармацевтическая композиция противоопухолевого, протекторного и нормализующего действия, содержащая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит пептид по п.1 в эффективном количестве.