CN102203124A

CN102203124A - 淀粉状蛋白β肽类似物，其寡聚物，用于制备的方法以及包括所述类似物或寡聚物的组合物，及其用途

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Publication number: CN102203124A
Application number: CN200980137576XA
Authority: CN
Inventors: S·巴霍恩; H·希伦; R·埃达尔吉; L·巴雷特; P·理查森; 郁立平; E·奥勒尼查克; J·哈兰; T·霍尔斯曼
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG; Abbott Laboratories
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2011-09-28
Also published as: US20110092445A1; EP2303920A4; JP2011529084A; MX2011000975A; CA2730804A1; WO2010011947A2; WO2010011947A3; EP2303920A2

Abstract

本发明涉及包括氨基酸序列或其拟肽的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述序列（i）形成环，（ii）与天然Aβ肽或其部分的氨基酸序列具有至少66％同一性，（iii）包括至少6个邻接氨基酸残基，和（iv）具有彼此共价连接的至少2个非邻接氨基酸残基，包括多个所述淀粉状蛋白β肽类似物的寡聚物，用于制备淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的方法，包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的组合物，和淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的用途，例如其用于治疗或预防淀粉样变性（例如，通过自动免疫接种）、用于诊断淀粉样变性、和用于提供能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的用途。本发明还描述了能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂，例如抗体，包括试剂的组合物，和试剂的用途，例如其用于治疗或预防淀粉样变性（例如，通过被动免疫接种）、和用于诊断淀粉样变性的用途。

Description

淀粉状蛋白β肽类似物,其寡聚物,用于制备的方法以及包括所述类似物或寡聚物的组合物,及其用途

发明领域

本发明涉及淀粉状蛋白β肽类似物，包括多个所述淀粉状蛋白β肽类似物的寡聚物，用于制备淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的方法，包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的组合物，和淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的用途，例如其用于治疗或预防淀粉样变性（例如，通过自动免疫接种）、用于诊断淀粉样变性、和用于提供能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的用途。本发明还描述了能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂，例如抗体，包括试剂的组合物，和试剂的用途，例如其用于治疗或预防淀粉样变性（例如，通过被动免疫接种）、和用于诊断淀粉样变性的用途。

发明背景

在1907年， Alois Alzheimer医生首先描述了后来为了记念他而命名为阿尔茨海默氏病（AD）的痴呆形式的神经病理学特征。特别地，AD是在老年人中的痴呆的最频繁原因，在超过65岁的人中具有约10％人群的发生率。随着年龄增长，疾病的可能性也升高。全球有约15,000,000人患有该疾病，并且生命期望中的进一步增长预期使患有该疾病的人数在下一个十年期间增加至约3倍。

从分子观点来看，阿尔茨海默氏病（AD）的特征在于异常聚集蛋白质的沉积物。在细胞外淀粉状蛋白斑的情况下，这些沉积物主要由淀粉状蛋白β肽纤丝组成，并且在细胞内神经原纤维缠结（NFTs）的情况下，主要由τ蛋白质组成。淀粉状蛋白β（Aβ）肽由β淀粉状蛋白前体蛋白质通过蛋白酶剪切产生。这种切割通过命名为α-、β-和γ-分泌酶的几种蛋白酶的协同活性实现。切割导致不同长度的许多特异性片段。淀粉状蛋白斑主要由长度40或42个氨基酸（Aβ40，Aβ42）的肽组成。占优势的切割产物是Aβ40；然而，Aβ42具有强得多的毒性作用。与在阿尔茨海默氏病中观察到的那些非常类似的大脑淀粉状蛋白沉积物和认知缺损也是唐氏综合征（21三体）的标志，所述唐氏综合征以800次出生约1次的频率发生。

Hardy和Higgins的淀粉状蛋白级联假设假定Aβ（1-42）的生产增加将导致初原纤维和原纤维（即，Aβ斑的主要组分）形成，这些原纤维负责阿尔茨海默氏病的症状。尽管痴呆严重程度和沉积的Aβ斑负荷之间的关联弱，但这个假设直到最近仍是受到支持的。

US 7,342,091描述了在残基Gln15和Val24（APP中的686和695）之间的区域中具有肽内桥的淀粉状蛋白β肽的可溶性环状类似物，其中参与桥形成的2个氨基酸以i+3、i+4、i+5、i+6或i+7的相对间隔排列。具体而言，Aβ肽的Asp17和Lys21（APP编号中的残基688和692）的侧链经由共价桥连接。在US 7,342,091中描述的淀粉状蛋白β肽的可溶性环状类似物设计为抑制通过内源Aβ肽的淀粉状蛋白生成或淀粉状蛋白的形成。即，推测可溶性环状类似物与Aβ肽在物理上相互作用且阻断淀粉状蛋白形成。

然而，比斑负荷与AD症状更佳关联的AD脑中可溶性Aβ形式的发现，已导致修订的淀粉状蛋白级联假设。

在大多数条件下，淀粉状蛋白β肽快速转换为原纤维形式。然而，去污剂或脂肪酸的添加可以导致长寿可溶形式（WO 2004/067561；WO 2006/094724；S. Barghorn等人，J. Neurochem. 95，834（2005）），这是在小鼠和兔中用于引发特异性抗体的有效抗原。它们已显示与海马细胞培养物中的神经元的树状突结合，并且完全阻断大鼠海马切片中的长时程增强。这些数据提示具有与体外制备的可溶形式类似的结构特征的淀粉状蛋白β肽也存在于体内。

更具体而言，WO 2004/067561涉及Aβ（1–42）肽的球形寡聚物（“球聚物（globulomers）”）和用于制备其的方法。数据提示存在Aβ折叠且装配成Aβ球聚物的淀粉状蛋白原纤维非依赖性途径，所述Aβ球聚物展示一种或多种独特表位（下文称为球聚物表位）。因为球聚物表位在AD患者和APP转基因小鼠的脑中检测出，并且球聚物与神经元特异性结合且阻断LTP，所以球聚物代表病理学相关Aβ构象子。WO 2004/067561进一步描述了球聚物的有限蛋白酶解获得所述球聚物的截短形式，例如Aβ（20–42）或Aβ（12–42）球聚物。这些Aβ（20–42）和Aβ（12–42）球聚物已用于产生球聚物特异性抗体。例如，WO 2007/062852描述了特异性识别Aβ（20–42）球聚物的几种单克隆抗体。

WO 2006/094724涉及不可扩散的球形Aβ（X – 38 .. 43）寡聚物，其中X选自数目1 .. 24。这些球聚物被说成可通过与WO 2004/067561中所述的相同方法获得，即SDS或脂肪酸诱导的Aβ（1 – 38 .. 43）肽寡聚化，以产生Aβ（1 – 38 .. 43）球聚物，和Aβ（1 – 38 .. 43）球聚物的有限蛋白酶解以产生其截短形式，即Aβ（X – 38 .. 43）球聚物，其中X选自数目2 .. 24。

WO 2004/067561和WO 2006/094724都还描述了通过使球聚物与交联剂例如戊二醛反应获得的交联球聚物。观察到交联仅在N末端的氨基和Lys-16之间发生，而剩下因此必须隐藏在Aβ（1 – 42）球聚物内部的Lys-28。所得到的交联主要是分子间而不是分子内的。

WO 2007/064917描述了重组形式的淀粉状蛋白β肽的克隆、表达和分离。在大肠杆菌（E. coli）中表达的肽完全保留其N末端甲硫氨酸残基，并且代表从位置0到位置42的淀粉状蛋白β的天然序列（下文被称为N-Met Aβ（1-42））。

类似于Aβ-（1-42）肽，向N-Met Aβ-（1-42）肽制剂中添加脂肪酸或烃去污剂导致形成稳定的可溶性聚集物，观察到其寡聚状态依赖于残留去污剂（SDS）或脂质样添加剂的量。在0.2％SDS的存在下，淀粉状蛋白β肽形成小的可溶性聚集物（下文被称为N-Met Aβ（1-42）前球聚物（pre-globulomer）），当SDS浓度稀释至0.05％时，这随后可以转变为更高MW的可溶性聚集物（下文被称为N-Met Aβ（1-42）球聚物）。基于沉降研究，N-Met Aβ（1-42）前球聚物具有16 kDa的MW（与~4个肽/可溶性聚集物对应），而N-Met Aβ（1-42）球聚物具有~64 kDa的MW（与~14-16个肽/可溶性聚集物对应）。

N-Met Aβ（1-42）前球聚物的生物物理和结构表征揭示它包含混合的分子间平行/分子内反平行β折叠，这不同于在原纤维结构研究中发现的全平行淀粉状蛋白β肽。

所述球聚物形成方法代表在以高得率形成同质Aβ寡聚物制剂的能力中的一大步。然而，即使这种方法也可以导致当去除十二烷基硫酸钠（SDS）且随着时间过去时显示一定程度异质性的制剂。此外，为了最佳展示球聚物表位已进行的截短通常进一步增加异质性且降低Aβ球聚物的稳定性。这些问题仅在SDS从系统中去除时增加。此外，在不存在去污剂的情况下，N末端截短的Aβ球聚物展示非常低的可溶性。

因此，本发明的目的是提供淀粉状蛋白β肽类似物，其展示相关构象或表位，是单体或寡聚物。优选地，此种淀粉状蛋白β肽类似物或其寡聚物显示比已知球聚物更佳的物理/化学性质，例如，更小的尺寸、增强的同质性、增强的稳定性、增加的寿命和/或在体内对蛋白酶更大的抵抗力。更佳的再现性将是进一步的优点。

发明概述

本发明提供了Aβ肽或其部分的稳定化构象，其展示对于下述重要的表位：1）与阿尔茨海默氏病进展有关的毒性应答（在Aβ错折叠肽中体现的“毒性原理”），2）对于这种构象特异且不与内源生理学单体Aβ肽交叉反应的治疗相关抗体的生成，如在CSF和血浆中可检测的，和/或3）通过自动免疫接种造成免疫应答，引起多克隆但对于这种毒性构象单特异性，并且不与内源生理学单体Aβ肽交叉反应的抗体应答，如在CSF和血浆中可检测的。这种稳定化通过分子内共价键达到，所述分子内共价键使肽或其拟肽（peptidomimetic）锁成更稳定且展示需要的表位的构象。这些稳定化肽或拟肽的所需效力可以容易地通过与可获得的球聚物选择性抗体的交叉反应进行测量，如WO 2007/064972和WO 2007/062852中所述在标准免疫测定（例如，免疫沉淀、ELISA、斑点印迹）中，或在用于评估Aβ肽毒性的标准细胞测定中。

根据第一个方面,本发明涉及包括氨基酸序列的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述序列（i）形成环，（ii）与天然Aβ肽或其部分的氨基酸序列具有至少66％同一性，（iii）包括至少6个邻接氨基酸残基，和（iv）具有彼此共价连接的至少2个非邻接氨基酸残基。

根据第二个方面，本发明还涉及淀粉状蛋白β肽类似物，其包括如本文定义的所述氨基酸序列的拟肽。

淀粉状蛋白β肽类似物的具体实施方案包括下述：

淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述环是β发夹环；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中天然Aβ人肽或其部分是Aβ（X .. Y），X选自数目1 .. 23，并且Y选自数目28 .. 43；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X选自数目15 .. 23；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X选自数目18 .. 22；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中Y选自数目28 .. 43；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中天然Aβ肽或其部分具有选自SEQ ID NO:1-368的序列；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述6个邻接氨基酸残基包括序列VGSN或DVGSNK；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述6个邻接氨基酸残基包括序列AED；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃-VGSN-X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂，其中X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂各自独立地代表可以与另一个氨基酸共价连接的氨基酸；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列X₁₉X₂₀X₂₁和X₃₀X₃₁X₃₂处于反向平行方向；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₁₉是选自苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₀是选自苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₁是选自丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₂是选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₃是选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₈是选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₉是选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₃₀是选自丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₃₁是选自异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₃₂是选自异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列F₁₉X₂₀A₂₁-Q-A₃₀I₃₁I₃₂，其中X₂₀代表氨基酸，并且Q是包括序列VGSN的氨基酸序列；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列Q的至少部分形成环；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列Q由5、6、7或8个氨基酸残基组成；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列F₁₉X₂₀A₂₁X₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈X₂₉A₃₀I₃₁I₃₂，并且X₂₀、X₂₂、X₂₉各自独立地代表氨基酸残基；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列F₁₉X₂₀A₂₁和A₃₀I₃₁I₃₂处于反向平行方向；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：F₁₉（NH）-I₃₂（NH）、F₁₉（NH）-I₃₂（HB）、F₁₉（NH）-I₃₂（CG2）、A₂₁（NH）-A₃₀（NH）、A₂₁（NH）-A₃₀（CB）、A₂₁（NH）-I₃₁（CD1）、A₂₁（NH）-I₃₁（CG2）、I₃₂（NH）-F₁₉（CD1）、I₃₂（NH）-F₁₉（CD2）、I₃₂（HN）-F₁₉（CB）和A₃₀（NH）-A₂₁（CB）；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中原子对F₁₉（CO）-I₃₂（N）、I₃₂（CO）-F₁₉（N）、A₂₁（CO）-A₃₀（N）和A₃₀（CO）-A₂₁（N）处于3.3 ± 0.5 ?的距离，其中CO指示主链氧原子，并且残基的phi（φ）角范围为–180至–30，并且残基的psi（ψ）角范围为约60至180或约–180至–150；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:1-368的序列，所述序列的至少2个氨基酸残基这样进行修饰，以便形成序列内共价键；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列是选自SEQ ID NO:369-698的序列，其中

X₁₂是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₃是组氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₄是组氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₅是谷氨酰胺、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸；

X₁₆是赖氨酸、精氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₇是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₈是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₉是苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₀是苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₁是丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₂是谷氨酸、天冬氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₉是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₀是丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₁是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₂是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₃是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₄是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₅是甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₆是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₇是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₈是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；和

X₃₉是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基，

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁和X₂₂的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₂、X₁₃、X₁₄的至少一个氨基酸残基和选自X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₃、X₁₄、X₁₅的至少一个氨基酸残基和选自X₃₆、X₃₇、X₃₈的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₄、X₁₅、X₁₆的至少一个氨基酸残基和选自X₃₅、X₃₆、X₃₇的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₅、X₁₆、X₁₇的至少一个氨基酸残基和选自X₃₄、X₃₅、X₃₆的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₆、X₁₇、X₁₈的至少一个氨基酸残基和选自X₃₃、X₃₄、X₃₅的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₇、X₁₈、X₁₉的至少一个氨基酸残基和选自X₃₂、X₃₃、X₃₄的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₈、X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₃₁、X₃₂、X₃₃的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₉、X₂₀、X₂₁的至少一个氨基酸残基和选自X₃₀、X₃₁、X₃₂的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₂₀、X₂₁和X₂₂的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，或其中氨基酸残基X₁₂和X₃₉、X₁₃和X₃₈、X₁₄和X₃₇、X₁₅和X₃₆、X₁₆和X₃₅、X₁₇和X₃₄、X₁₈和X₃₃、X₁₉和X₃₂、X₂₀和X₃₁、X₂₁和X₃₀或X₂₂和X₂₉彼此共价连接；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃- X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁，其中X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁各自独立地代表可以与另一个氨基酸共价连接的氨基酸；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃和X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁处于反向平行方向；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₀是选自苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₄是选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₅是选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₆是选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中X₂₇是选自天冬酰胺、谷氨酰胺和甲硫氨酸的氨基酸残基；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₂₀-Q-X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁，其中X₂₀、X₂₄ X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉各自独立地代表氨基酸，并且Q是包括序列AED的氨基酸序列；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇的至少部分形成环；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列Q由3、4、5或6个氨基酸残基组成；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁，并且X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉各自独立地代表氨基酸残基；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃和X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁处于反向平行方向；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：A₂₁（NH）-A₃₀（NH）、A₂₁（NH）-A₃₀（CB）、A₂₁（NH）-I₃₁（CD1）、A₂₁（NH）-I₃₁（CG2）和A₃₀（NH）-A₂₁（CB）；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中原子对A₂₁（CO）-A₃₀（N）和A₃₀（CO）-A₂₁（N）处于3.3 ± 0.5 ?的距离，其中CO指示主链氧原子，并且残基的phi（φ）角范围为–180至–30，并且残基的psi（ψ）角范围为约60至180或约–180至–150；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列是选自SEQ ID NO:699-960的序列，其中

X₂₄是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₅是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₆是丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₇是天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₈是赖氨酸、精氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中选自X₁₂、X₁₃、X₁₄的至少一个氨基酸残基和选自X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₃、X₁₄、X₁₅的至少一个氨基酸残基和选自X₃₆、X₃₇、X₃₈的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₄、X₁₅、X₁₆的至少一个氨基酸残基和选自X₃₅、X₃₆、X₃₇的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₅、X₁₆、X₁₇的至少一个氨基酸残基和选自X₃₄、X₃₅、X₃₆的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₆、X₁₇、X₁₈的至少一个氨基酸残基和选自X₃₃、X₃₄、X₃₅的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₇、X₁₈、X₁₉的至少一个氨基酸残基和选自X₃₂、X₃₃、X₃₄的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₈、X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₃₁、X₃₂、X₃₃的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中选自X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₃₀、X₃₁、X₃₂的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，其中氨基酸残基X₂₀和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁的至少一个氨基酸残基彼此共价连接，或其中氨基酸残基X₁₂和X₃₉、X₁₃和X₃₈、X₁₄和X₃₇、X₁₅和X₃₆、X₁₆和X₃₅、X₁₇和X₃₄、X₁₈和X₃₃、X₁₉和X₃₂、或X₂₀和X₃₁彼此共价连接；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸残基经由其侧链共价连接；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸残基的侧链具有独立地选自硫醇、氨基、羧基和羟基的官能团；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中与其他氨基酸残基共价连接的氨基酸残基是选自半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基的那种；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中半胱氨酸和半胱氨酸、半胱氨酸和赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸和赖氨酸、或赖氨酸和赖氨酸的侧链彼此共价连接；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中侧链经由直接共价键共价连接；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中侧链经由接头共价连接；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中接头是同双功能或异双功能接头；

前述实施方案的淀粉状蛋白β肽类似物，其中接头是光反应性接头；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中共价键包括二硫键；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中共价键包括酰胺键；

前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括在2个非邻接氨基酸残基之间的一个共价键。

根据第三个方面，本发明涉及包括多个所述淀粉状蛋白β肽类似物的寡聚物。

寡聚物的具体实施方案包括下述：

寡聚物，其中多个是2 – 28个淀粉状蛋白β肽类似物；

前述实施方案的寡聚物，其中每个淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈，其中一个淀粉状蛋白β肽类似物的序列L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈与另一个淀粉状蛋白β肽类似物的序列L^B ₃₄M^B ₃₅V^B ₃₆G^B ₃₇G^B ₃₈处于平行方向；

前述实施方案的寡聚物，其中关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（NH）、G^A ₃₇（NH）-G^B ₃₈（NH）、L^A ₃₄（NH）-L^B ₃₄（C_δH₃）、M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（CγH₃）；

前述实施方案中任一项的寡聚物，其中每个淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉，其中一个淀粉状蛋白β肽类似物的序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉与另一个淀粉状蛋白β肽类似物的序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉处于平行方向；

前述实施方案的寡聚物，其中关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：G^A ₃₃（NH）-G^B ₃₄（NH）、M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（NH）、G^A ₃₇（NH）-G^B ₃₈（NH）、L^A ₃₄（NH）-L^B ₃₄（C_δH₃）、M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（CγH₃）、G^A ₃₈（NH）-V^B ₃₉（CγH₃）和V^A ₃₉（NH）-V^B ₃₉（CγH₃）；

前述实施方案中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物包括分子间平行的β折叠；

前述实施方案的寡聚物，其中β折叠包括一个淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉和另一个淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉；

前述实施方案的寡聚物，其中原子对G^A33（CO）-L^B34（N）、L^B34（CO）-M^A35（N）、M^A35（CO）-V^B36（N）、V^B36（CO）-G^A37（N）和G^B37（CO）-G^A38（N）处于3.3 ± 0.5 ?的距离，其中CO指示主链氧原子，并且残基的phi（φ）角范围为–180至–30，并且残基的psi（ψ）角范围为约60至180或约–180至–150。

进一步的具体实施方案包括前述实施方案中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物，其包括由选自下述的单克隆抗体识别的表位：可得自由美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7241指定的杂交瘤的单克隆抗体5F7、可得自由美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7240指定的杂交瘤的单克隆抗体7C6、可得自由美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7405指定的杂交瘤的单克隆抗体4D10、或可得自由美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7809指定的杂交瘤的单克隆抗体7E5。

本发明还涉及用于制备如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物的方法，所述方法包括

（i）提供肽或其拟肽；

（ii）对所述肽或拟肽实施足以形成键的条件。

本发明还涉及用于制备如本文定义的寡聚物的方法，所述方法包括

（i）提供肽或其拟肽；

（ii）对所述肽或拟肽实施足以形成寡聚物和键的条件。

该方法的具体实施方案包括这样的方法，其中寡聚物形成在键形成之前。

进一步地，本发明涉及包括如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的组合物。

该方法的具体实施方案包括组合物，其中所述组合物是疫苗并且进一步包括药学上可接受的载体。

本发明还涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备治疗或预防淀粉样变性的药物组合物的用途，且涉及治疗或预防有此需要的受试者中的淀粉样变性的相应方法，其包括给所述受试者施用如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。

用途和方法的具体实施方案包括下述：

用途和方法，其中药物组合物用于自动免疫接种；

前述实施方案的用途和方法，其中所述淀粉样变性是阿尔茨海默氏病或其中所述淀粉样变性是唐氏综合症的淀粉样变性。

本发明还涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备诊断淀粉样变性的组合物的用途，且涉及诊断淀粉样变性的相应方法，其包括提供来自怀疑具有淀粉样变性的受试者的样品，在足以形成包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物和抗体的复合物的时间和条件下，使样品与如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物接触，所述复合物的存在指示受试者具有淀粉样变性。

用途和方法的具体实施方案包括这样的用途和方法，其中所述淀粉样变性是阿尔茨海默氏病或其中所述淀粉样变性是唐氏综合症的淀粉样变性。

进一步地，本发明涉及在包括能够与如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的制剂中富集所述试剂的方法，所述方法包括步骤：a）在足以使试剂与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的时间和条件下，使包括所述试剂的制剂暴露于淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物；和b）获得富集形式的试剂。

用途和方法的具体实施方案包括这样的用途和方法，其中所述试剂是抗体、适体或小分子量化合物。

此外，本发明涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于提供试剂的用途，所述试剂能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，且涉及相应方法，例如提供能够与如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体的方法，其包括

i）提供包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的抗原；

ii）使抗体谱暴露于所述抗原；和

iii）从所述谱中选择与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体。

用途和方法的具体实施方案包括这样的用途和方法，其中所述试剂是抗体、非抗体结合分子、适体或小分子量化合物。

还描述了可通过所述方法可获得的抗体以及能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。

进一步地，本发明描述了包括能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的组合物；能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂用于制备治疗或预防淀粉样变性的药物组合物的用途和治疗或预防有此需要的受试者中的淀粉样变性的相应方法，其包括给所述受试者施用能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂；能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂用于制备诊断淀粉样变性的组合物的用途和诊断淀粉样变性的相应方法，其包括提供来自怀疑具有淀粉样变性的受试者的样品，在足以形成包括试剂和抗原的复合物的时间和条件下，使样品与能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂接触，所述复合物的存在指示受试者具有淀粉样变性。

附图简述

图1显示（A）NMR衍生的Aβ前球聚物结构的图解，描述了用于限定三维折叠的残基间NOE’s；虚线指示观察到的NOEs，并且圆圈指示在NH/ND交换实验中显示慢交换的主链酰胺；（B）描述在SDS中NMR衍生的Aβ前球聚物结构的带状图；具有限定结构的残基以粗体文本突出显示；（C）在NMR Aβ前球聚物结构中观察到的一个单体的图解，显示Leu至Cys突变；（D）在NMR Aβ前球聚物结构中观察到的一个单体的图解，显示Leu至Cys突变和所得到的二硫键交联结构。

图2显示（A）具有由球聚物形成的典型Aβ球聚物条带模式的SDS-PAGE凝胶，所述球聚物用下述制备：S#6046：wt N-Met Aβ（1-42）肽、Mut Pre：在0.2％SDS中的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）突变肽、Mut Post：在0.05％SDS中的（L17C,L34C）N-Met Aβ（1-42）突变肽；（B）下述的SDS-PAGE：1）标记蛋白质，2）（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，3）在嗜热菌蛋白酶消化后的（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，4）（15C，36C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，5）在嗜热菌蛋白酶消化后的（15C，36C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，6）（16C，35C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，7）在嗜热菌蛋白酶消化后的（16C，35C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，8）（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，9）在嗜热菌蛋白酶消化后的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，10）（18C，33C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，11）在嗜热菌蛋白酶消化后的（18C，33C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物；（C）下述的SDS-PAGE：1）标记蛋白质，2）（19C，32C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，3）在嗜热菌蛋白酶消化后的（19C，32C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，4）（20C，31C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，5）在嗜热菌蛋白酶消化后的（20C，31C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，6）（21C，30C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，7）在嗜热菌蛋白酶消化后的（21C，30C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，8）（22C，29C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，9）在嗜热菌蛋白酶消化后的（22C，29C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，10）Aβ（1-42）寡聚物，11）在嗜热菌蛋白酶消化后的Aβ（1-42）寡聚物；（D）下述的SDS-PAGE：1）（17K，34E）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.2％SDS），2）（17K，34E）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.05％SDS），3）（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（0.2％SDS），4）（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（0.05％SDS），5）（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.2％SDS），6）（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.05％SDS），7）（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物（0.2％SDS），8）（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物（0.05％SDS），9）（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物（0.2％SDS），10）（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物（0.05％SDS），11）N-Met Aβ（1-42）寡聚物。标准（（A）的泳道1和5以及（B）和（C）的标记蛋白质）是：肌球蛋白（210kDa）、磷酸化酶（98kDa），BSA（78kDa）、谷氨酸脱氢酶（55kDa）、醇脱氢酶（45kDa）、碳酸酐酶（34kDa）、肌红蛋白红（17kDa）、溶菌酶（16kDa）、抑酶肽（7kDa）和胰岛素（4kDa）。条带模式的属性是：条带~40-50kDa的簇、条带~15kDa的簇、和在~5kDa处的条带（单体）。

图3显示（A）N-Met Aβ（1-42）球聚物和（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物与球聚物特异性单克隆抗体5F7的直接Elisa应答比较；

（B）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（disulfide stabilized）（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同突变球聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（C）比较球聚物特异性mAb 7C6与二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同突变球聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（D）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同突变球聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（E）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（F）比较球聚物特异性mAb 7C6与二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（G）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（H）比较球聚物特异性mAb 5F7与Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（I）比较球聚物特异性mAb 7C6与Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（J）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（K）比较球聚物特异性mAb 5F7与（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（L）比较球聚物特异性mAb 7C6与（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（M）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（N）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（O）比较球聚物特异性mAb 7C6与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（P）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（Q）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）、（17C，34C）Aβ（16-35）和（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（全都在寡聚物形成后进行环化）比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（R）比较球聚物特异性mAb 5F7与嗜热菌蛋白酶截短的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和嗜热菌蛋白酶截短的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）、（17C，34C）Aβ（16-35）和（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（全都在寡聚物形成后进行环化）比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（S）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（T）比较球聚物特异性mAb 7C6与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（U）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（V）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（W）比较球聚物特异性mAb 7C6与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（X）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较；

（Y）比较球聚物特异性mAb 5F7与二硫键稳定的（17C，34C）（K插入）Aβ（13-42）寡聚物的表观结合亲和力的直接ELISA结果；

（Z）比较球聚物特异性mAb 7C6与二硫键稳定的（17C，34C）（K插入）Aβ（13-42）寡聚物的表观结合亲和力的直接ELISA结果；

（AA）比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与二硫键稳定的（17C，34C）（K插入）Aβ（13-42）寡聚物的表观结合亲和力的直接ELISA结果。

图4显示在（A）二硫键形成条件下和（B）用DTT还原后得自用（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变肽形成的Aβ球聚物的质谱：在（C）二硫键形成条件下和（D）用DTT还原后得自（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物的质谱；在（E）二硫键形成条件下和（F）用DTT还原后得自（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物的质谱；在（G）二硫键形成条件下和（H）用DTT还原后得自（17C，42C）Aβ（12-42）寡聚物的质谱；在（I）二硫键形成条件下和（J）用DTT还原后得自（17KC，42C）Aβ（13-42）寡聚物的质谱；显示了完全同位素去褶合（deconvolation）。

图5显示（A）在5mM NaPO₄、35 mM NaCl，pH 7.4中N-Met Aβ（1-42）球聚物（虚线）和二硫键稳定的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物（实线）的异质性的沉降速度分析；（B）在补充有0.05％SDS的5 mM NaPO₄、35 mM NaCl，pH 7.4中N-Met Aβ（1-42）球聚物（虚线）和通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的二硫键稳定的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物（实线）的异质性的沉降速度分析；（C）在5 mM NaPO₄、35 mM NaCl，pH 7.4中通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的二硫键稳定的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变球聚物（虚线）的异质性的沉降速度分析。

图6是指示通过SELDI-MS检测的在嗜热菌蛋白酶消化前和后（xC，yC）N-Met A?（1-42）寡聚物的肽质量的表。

表7是指示通过SELDI-MS检测的碘乙酰胺处理的嗜热菌蛋白酶截短的（xC，yC）N-Met A?（1-42）寡聚物或嗜热菌蛋白酶截短的A?（1-42）球聚物的肽质量峰的表。

表8显示A）单克隆抗体7C6和B）兔多克隆抗体5599与下述的反应性的斑点印迹分析

1.（14C，37C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

2. 嗜热菌蛋白酶截短的（14C，37C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

3.（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

4. 嗜热菌蛋白酶截短的（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

5.（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

6. 嗜热菌蛋白酶截短的（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

7.（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

8. 嗜热菌蛋白酶截短的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

9.（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

10. 嗜热菌蛋白酶截短的（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

11.（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

12. 嗜热菌蛋白酶截短的（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

13.（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

14. 嗜热菌蛋白酶截短的（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

15.（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

16. 嗜热菌蛋白酶截短的（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

17.（22C,29C）N-Met A?（1-42）寡聚物；

18. 嗜热菌蛋白酶截短的（22C,29C）N-Met A?（1-42）；寡聚物

19. A?（1-42）球聚物；和

20. A?（1-42）嗜热菌蛋白酶截短的球聚物。

图9是指示通过SELDI-MS检测的碘乙酰胺处理的嗜热菌蛋白酶截短的（17C，34C）N-Met A?（16-35）寡聚物的肽质量峰的表。

图10是指示（A）不含先前碘乙酰胺烷基化和（B）在DTT的存在下碘乙酰胺烷基化后免疫沉淀的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物的量的表。

图11显示指示在K16或K17用（A）磺基-SMCC、（B）磺基-MBS或（C）磺基-SIAB处理后（17K，34C）N-Met A?（1-42）的交联位置的示意图；和（D）指示在用EDAC/NHS处理后（17K，34E）N-Met A?（1-42）的潜在交联位置的示意图。

图12显示（A）在与异双功能交联试剂磺基-SMCC的交联反应后用（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽制备的寡聚物的质谱（ESI）；（B）在与异双功能交联试剂磺基-MBS的交联反应后用（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽制备的球聚物的质谱（MALDI）；（C）在与异双功能交联试剂磺基-SIAB的交联反应后用（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽制备的球聚物的质谱（ESI）；和（D）在与异双功能交联试剂EDC和NHS的交联反应后用（17K，34E）N-Met A?（1-42）肽制备的球聚物的质谱（MALDI）。箭标指示在所需交联形成后的预期质量。

图13显示（A）不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图14显示（A）不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前和后与SMCC交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图15显示（A）不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前和后与MBS交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图16显示（A）不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前和后与SIAB交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图17显示（A）不含交联的（17C，34E）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图18显示（A）不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前和后与EDC/NHS交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图19显示指示关于下述的策略的示意图：（A）形成亚甲基二硫醚连接；（B）执行在烯丙基甘氨酸之间的环合复分解反应；（C）执行在修饰的氨基酸X =（S）-Fmoc-α（2’戊烯基）丙氨酸之间的环合复分解反应；和（D）执行Lys（N3）和炔丙基甘氨酸氨基酸的点击（click）化学。

发明详述

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物包括氨基酸序列（肽）或氨基酸序列的拟肽。根据具体实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物不包括除所述氨基酸序列或氨基酸序列的所述拟肽外的任何进一步的氨基酸或氨基酸的任何进一步的拟肽（但本发明的淀粉状蛋白β肽类似物可以包括附着所述氨基酸序列或拟肽的进一步化学基团或部分）。根据一个方面，氨基酸序列由最高达45、44、43、42、41、40、39、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、20、16个氨基酸（或相应拟肽）组成。根据另一个方面，氨基酸序列由至少10、11、12、13、14、15、16个氨基酸（或相应拟肽）组成。

除非另有说明，否则如本文采用的，术语“氨基酸”单独或作为另一个基团的部分，包括但不限于，与被称为“α”碳–CRR’-的相同碳连接的氨基和羧基，其中R和/或R’可以是天然或非天然侧链，包括氢。在“α”碳上的绝对“S”构型通常被称为“L”或“天然”构型。在其中“R”和“R’”（’（prime））取代基两者都是氢的情况下，氨基酸是甘氨酸并且不是手性的。

氨基酸包括遗传编码的L-对映体氨基酸（例如丙氨酸（A Ala）、精氨酸（R；Arg）、天冬酰胺（N；Asn）、天冬氨酸（D；Asp）、半胱氨酸（C；Cys）、谷氨酰胺（Q；Gln）、谷氨酸（E；Glu）、甘氨酸（G；Gly）、组氨酸（H；His）、异亮氨酸（I；Ile）、亮氨酸（L；Leu）、赖氨酸（K；Lys）、苯丙氨酸（F；Phe）、脯氨酸（P；Pro）、丝氨酸（S；Ser）、苏氨酸（T；Thr）、色氨酸（W；Trp）、酪氨酸（Y；Tyr）、缬氨酸（V；Val）），相应D-氨基酸，以及许多非遗传编码的氨基酸，这包括但不限于，β-丙氨酸（β-AIa）和其他ω-氨基酸例如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸（Dpr）、4-氨基丁酸等等；α-氨基异丁酸（Aib）；ε-氨基己酸（Aha）；δ-氨基戊酸（Ava）；N-甲基甘氨酸或肌氨酸（MeGIy）；鸟氨酸（Orn）；瓜氨酸（Cit）；叔丁基丙氨酸（t-BuA）；叔丁基甘氨酸（t-BuG）；N-甲基异亮氨酸（MeIle）；苯甘氨酸（Phg）；环己基丙氨酸（Cha）；正亮氨酸（NIe）；萘基丙氨酸（Nal）；4-苯基苯丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸（Phe（4-Cl））；2-氟苯基丙氨酸（Phe（2-F））；3-氟苯基丙氨酸（Phe（3-F））；4-氟苯基丙氨酸（Phe（4-F））；青霉胺（Pen）；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸（Tic）；β- 2-噻吩丙氨酸（Thi）；甲硫氨酸亚砜（MSO）；高精氨酸（hArg）；N-乙酰赖氨酸（AcLys）；2,4-二氨基丁酸（Dbu）；2,3-二氨基丁酸（Dab）；对氨基苯丙氨酸（Phe（pNH₂））；N-甲基缬氨酸（MeVal）；高半胱氨酸（hCys）、高苯丙氨酸（hPhe）和高丝氨酸（hSer）；羟脯氨酸（Hyp）、高脯氨酸（hPro）、N-甲基化氨基酸和拟肽（N-取代甘氨酸）。

为了确定保守氨基酸取代的目的，氨基酸可以方便地分类为2个主要种类 – 亲水的和疏水的 – 这主要取决于氨基酸侧链的物理化学特征。这2个主要种类可以进一步分类为更清楚地限定氨基酸侧链的特征的子种类。例如，亲水性氨基酸的类别可以进一步再分为酸性、碱性和极性氨基酸。疏水性氨基酸的类别可以进一步再分为非极性和芳族氨基酸。

术语“亲水性氨基酸”指根据Eisenberg等人，1984，J. Mol. Biol. 179:125-142的归一化共有区疏水性等级，显示小于零的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr（T）、Ser（S）、His（H）、Glu（E）、Asn（N）、Gln（Q）、Asp（D）、Lys（K）和Arg（R）。

术语“疏水性氨基酸”指根据Eisenberg等人，1984，J. Mol. Biol. 179:125-142的归一化共有区疏水性等级，显示大于零的疏水性的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括Pro（P）、Ile（I）、Phe（F）、Val（V）、Leu（L）、Trp（W）、Met（M）、Ala（A）、Gly（G）和Tyr（Y）。

术语“酸性氨基酸”指具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于氢离子的丧失，酸性氨基酸一般具有在生理学pH带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Glu（E）和Asp（D）。

术语“碱性氨基酸”指具有大于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子结合，碱性氨基酸一般具有在生理学pH带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括His（H）、Arg（R）和Lys（K）。

术语“极性氨基酸”指这样的亲水性氨基酸，其具有在生理学pH不带电的侧链，但具有其中由2个原子共享的电子对由原子之一更紧密地保持的至少一个键。遗传编码的极性氨基酸包括Asn（N）、Gln（Q）Ser（S）和Thr（T）。

术语“非极性氨基酸”指这样的疏水性氨基酸，其具有在生理学pH不带电的侧链，且具有其中由2个原子共享的电子对一般由2个原子各自同等保持的键（即，侧链不是极性的）。遗传编码的非极性氨基酸包括Leu（L）、Val（V）、Ile（I）、Met（M）、Gly（G）和Ala（A）。

术语“芳族氨基酸”指具有这样的侧链的疏水性氨基酸，所述侧链具有至少一个芳环或杂芳环。芳环或杂芳环可以包含一种或多种取代基例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-NO、-NH₂、-NHR、-NRR、-C（O）R、-C（O）OH、-C（O）OR、-C（O）NH₂、-C（O）NHR、-C（O）NRR等，其中每个R独立地是（C₁ - C₆）烷基、取代的（C₁ - C₆）烷基、（C₁ - C₆）链烯基、取代的（C₁ - C₆）链烯基、（C₁ - C₆）炔基、取代的（C₁ - C₆）炔基、（C₅ - C₂₀）芳基、取代的（C₅ - C₂₀）芳基、（C₆ - C₂₆）烷芳基、取代的（C₆ - C₂₆）烷芳基、5-20元的杂芳基、取代的5-20元的杂芳基、6-26元的烷基杂芳基或取代的6-26元的烷基杂芳基。遗传编码的芳族氨基酸包括Phe（F）、Tyr（Y）和Trp（W）。

术语“脂族氨基酸”指具有脂族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸包括Ala（A）、Val（V）、Leu（L）和Ile（I）。

氨基酸残基Cys（C）是与众不同的，因为它可以与其他Cys（C）残基或其他含硫烷基（sulfanyl）的氨基酸形成二硫键。Cys（C）残基（和具有含-SH侧链的其他氨基酸）以还原的游离-SH或氧化的二硫键形式存在于肽中的能力影响Cys（C）残基是否为肽贡献净疏水性或亲水性特征。

如本领域技术人员将认识到的，上文限定的种类不是相互排斥的。因此，具有显示2种或更多种物理化学性质的侧链的氨基酸可以包括在多个种类内。例如，具有由极性取代基进一步取代的芳族部分的氨基酸侧链例如Tyr（Y），可以显示出芳族疏水性和极性或亲水性质，并且因此可以包括在芳族和极性种类中。任何氨基酸的合适分类对于本领域技术人员将是显而易见的，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

代替氨基酸序列（肽），本发明的淀粉状蛋白β肽类似物可以包括具有与模板氨基酸序列（肽）那些类似的性质的所述序列的类似物。这些类型的非肽序列命名为“肽模拟物（peptide mimetics）”或“拟肽”（Fauchere，J.（1986）Adv. Drug Res. 15：29；Veber和Freidinger（1985）TINS第392页；和Evans等人（1987）J. Med. Chem 30：1229），并且通常借助于用计算机分子建模进行开发。

拟肽被称为“可衍生自”特定氨基酸序列。这意指拟肽参照限定的氨基酸序列进行设计，从而使得它保留对于其功能必需的氨基酸序列的结构特征。这可能是氨基酸序列的特定侧链、或结构的氢键合潜力。此种特征可以由非肽组分或一个或多个氨基酸残基提供，或连接氨基酸序列的所述氨基酸残基的键可以如此进行修饰，以便改善氨基酸序列的特定功能例如稳定性或蛋白酶抵抗力，同时保留对于其功能必需的氨基酸序列的结构特征。换言之，包括氨基酸序列的拟肽的淀粉状蛋白β肽类似物和包括由其衍生拟肽的氨基酸序列的淀粉状蛋白β肽类似物具有就其形成环以及若适用则显示如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物的进一步结构和功能性质的能力而言相同的功能特征。

拟肽通常在结构上类似于范例肽（即，由本发明的淀粉状蛋白β肽类似物包括的氨基酸序列），但具有任选由类似于酰胺键的键置换的一个或多个肽键（例如酰胺等排物，例如N-甲基酰胺、硫代酰胺、硫酯、膦酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟乙烯基、（E）-乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫代或烷键）。此种键可以特别选自：-CH₂-NH-、-CH₂-S-、-CH₂-CH₂-、-CH=CH-（顺式和反式）、-COCH₂-、-CH（OH）CH₂-和-CH₂SO-。这些键是本领域众所周知的并且在下述参考文献进一步描述：Spatola，A. F. in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，"B. Weinstein，编辑，Marcel Dekker，New York，第267页（1983）；Szatola，A. F.，Vega Data（March 1983），第1卷，Issue 3，"Peptide Backbone Modifications"（一般综述）；Morley，J. S. ，Trends Pharm Sci（1980）第463-468页（一般综述）；Hudson，D.等人，Int J Pent Prot Res（1979）14：177-185；Spatola，A. F.等人，Life Sci（1986）38：1243-1249；Hann，M. M. ，J Chem Soc Perkin Trans I（1982）307-314；Almquist，R. G.等人，J Med Chem（1980）23：1392-1398；Jennings-White，C.等人，Tetrahedron Lett（1982）23：2533；Szelke，M.等人，EP 45665（1982）CA：97：39405（1982）；Holladay，M. W.等人，Tetrahedron Lett（1983）24：4401-4404；和Hruby，V. J.，Life Sci（1982）31：189-199。特别优选的非肽键是-CH₂NH-。此种肽模拟物可以具有超过肽实施方案的显著优点，包括例如：更经济的生产、更大的化学稳定性、增强的药理性质（半衰期、吸收、效力、功效等）及其他。

拟肽还包括“反向”或“倒”氨基酸序列。反向或倒氨基酸序列包括共价键合的氨基酸残基，其中氨基酸主链中肽键形成的正常羧基至氨基方向是反向的，从而使得以常规左至右方向阅读，肽键的氨基部分在羰基部分之前（而不是之后）。一般参见，Goodman，M.和Chorev，M. Accounts of Chem. Res. 1979，12，423。

反向方向的肽包括（a）其中一个或多个氨基末端残基转变为反向（“rev”）方向的那些（从而获得在分子的最左侧部分上的第二个“羧基末端”），和（b）其中一个或多个羧基末端残基转变为反向（“rev”）方向的那些（获得在分子的最右侧部分上的第二个“氨基末端”）。肽（酰胺）键不能在正常方向残基和反向方向残基之间的界面上形成。

因此，通过利用反向肽（反向酰胺）键，利用合适的氨基酸模拟部分连接序列的2个相邻部分，可以形成本发明的特定反向氨基酸序列。在上文（a）的情况下，二酮化合物的中央残基可以方便地用于连接具有2个酰胺键的结构，以达到拟肽结构。在上文（b）的情况下，二氨基化合物的中央残基将同样用于连接具有2个酰胺键的结构，以形成拟肽结构。

此外，此种化合物中键合的反向方向一般将需要反向氨基酸残基的对映体构型的反转，以维持类似于非反向氨基酸那种的侧链空间方向。在肽的反向部分中氨基酸的构型优选是（D），并且非反向部分的构型优选是（L）。适当时为了最优化结合活性，相反或混合构型是可接受的。

由本发明的淀粉状蛋白β肽类似物包括的氨基酸序列或拟肽的特征在于包括环（同义词：转角）的特定二级结构。如本文使用的，环（或转角）意欲限定至少2个Cα原子的紧密接近（通常< 7 ?）。

合适的环包括α-、β-、γ-和π-环。根据本发明的具体实施方案，环是β-环。如本文使用的，β-环意欲限定特征在于其中供体和受体残基由3个残基分开的一个或多个氢键i → i +/- 3个H键合）的环。

根据本发明的具体实施方案，环是β-发夹环。如本文使用的，β-发夹环意欲限定环，其中肽或拟肽主链的方向反向，并且侧面二级结构元件相互作用。

根据本发明的进一步的具体实施方案，淀粉状蛋白β肽类似物包括形成分子内反平行β-折叠的氨基酸序列。如本文使用的，反平行β-折叠意欲限定通过3个或更多个氢键侧面连接的至少2条β-链的装配，形成一般扭型折叠。β-链是一般包括3-10个氨基酸的氨基酸序列段，其肽主链几乎是完全伸展的，或其拟肽。

根据具体实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物包括氨基酸序列，其中形成反平行β-折叠的β-链经由环连接，优选如本文定义的β-发夹环。

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列与天然人Aβ肽或其部分的氨基酸序列具有至少66％的同一性。

如本文使用的，术语“天然人Aβ肽”指人起源的天然存在的Aβ（X-Y）肽，例如Aβ（1-40）或Aβ（1-42）肽。

术语“天然存在的Aβ（X-Y）肽”在此处指从人淀粉状蛋白β蛋白质的氨基酸位置X到氨基酸位置Y的氨基酸序列，包括X和Y，特别指从氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT（与氨基酸位置1 – 43对应；人查询序列）的氨基酸位置X到氨基酸位置Y的氨基酸序列或任何其天然存在的变体，特别是具有选自下述的至少一个突变的那些：A2T、H6R、D7N、A21G（“Flemish”）、E22G（“Arctic”）、E22Q（“Dutch”）、E22K（“Italian”）、D23N（“Iowa”）、A42T和A42V，其中编号以Aβ肽的开始为基准，包括位置X和位置Y。

例如，术语“天然存在的Aβ（1-42）肽”在此处指从人淀粉状蛋白β蛋白质的氨基酸位置1到氨基酸位置42的氨基酸序列，包括1和42，特别指氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA或任何其天然存在的变体，特别是具有选自下述的至少一个突变的那些：A21G（“Flemish”）、E22G（“Arctic”）、E22Q（“Dutch”）、E22K（“Italian”）、D23N（“Iowa”）、A42T和A42V，其中编号以Aβ肽的开始为基准，包括位置1和位置42。

因此，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物包括这样的氨基酸序列，其对应于天然存在的Aβ肽，其与上文描述的人查询序列或其部分至少约66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多等同的功能片段和变体序列。

术语“对应”在本文中用于指氨基酸序列与参考氨基酸序列的全部或部分同源（即，等同，非严格进化上相关）。

下述术语用于描述2个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗（comparison window）”、“序列同一性”和“序列同一性百分比”。“参考序列”或“查询序列”是用作用于序列比较的基础的限定序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如作为全长cDNA、基因序列或多肽序列的部分，或可以包括完整cDNA、基因序列或多肽序列，例如上文描述的人Aβ肽序列。因为2个序列可以各自（1）包括在2个序列之间相似的序列（即，完整序列的部分），和（2）可以进一步包括在2个序列之间趋异的序列，所以2个（或更多个）多核苷酸之间的序列比较一般通过在“比较窗”上比较2个序列的序列来执行，以鉴定且比较序列相似性的局部区域。如本文使用的，“比较窗”指至少6个邻接氨基酸或24个核苷酸位置的概念区段，其中序列可以与至少6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42个邻接氨基酸或18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120或126个核苷酸的参考序列比较，并且其中与参考序列（其不包括添加或缺失）相比较，比较窗中的序列部分可以包括20％或更少的添加或缺失（即，缺口）用于2个序列的最佳比对。在序列最佳比对的背景下，对于比对，比较窗可以通过下述来进行：Smith和Waterman（1981）Adv. Appl. Math. 2：482的局部同源性算法， Needleman和Wunsch（1970）J. Mol. Biol. 48：443的同源性比对算法， Pearson和Lipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci.（U. S. A.）85：2444的相似性方法搜索，这些算法的计算机实现（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr. ，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA）或检查，并且选择通过各种方法生成的最佳比对（即，导致在比较窗上的最高同源性百分比）。术语“序列同一性”意指2个序列在比较窗上是等同的（即，在逐核苷酸或逐氨基酸的基础上）。术语“序列同一性百分比”通过下述进行计算：在比较窗上比较2个最佳比对的序列，确定在其上等同核酸碱基或氨基酸存在于2个序列中的位置数目，以获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目（即，窗口大小），并且将结果乘以100，以获得序列同一性百分比。

如果待测定淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列与天然人Aβ肽的氨基酸序列的同一性，那么比较窗可以包括由淀粉状蛋白β肽类似物包括的整个氨基酸序列或其部分。如果由淀粉状蛋白β肽类似物包括的氨基酸序列短于天然人Aβ肽的氨基酸序列，那么比较窗将仅包括天然人Aβ肽的部分，从而使得序列同一性百分比仅指那个部分。如果由淀粉状蛋白β肽类似物包括的氨基酸序列长于天然人Aβ肽的氨基酸序列，那么比较窗将仅包括由淀粉状蛋白β肽类似物包括的氨基酸序列的部分，从而使得序列同一性百分比仅指那个部分。

根据具体实施方案，本发明涉及淀粉状蛋白β肽类似物，其中淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列与天然人Aβ（X – Y）序列具有至少66％的同一性，X选自数目1 .. 23，例如15、18、19、20、21、22或23，并且Y选自数目28 .. 43，例如28、29、30、31、34、37、40、42或43。

如本文使用的，省略法A .. B表示包括从A到B的所有自然数的集合，包括A和B，例如“17 .. 20”因此表示数目17、18、19和20的组。连字符表示氨基酸的邻接序列，即，“X – Y”包括从氨基酸X到氨基酸Y的序列，包括X和Y。因此，“A .. B – C .. D”包括在这2个集合的成员之间的所有可能组合，例如“17 .. 20 – 40 .. 42”包括下述全部：17 – 40、17 – 41、17 – 42、18 – 40、18 – 41、18 – 42、19 – 40、19 – 41、19 – 42、20 – 40、20 – 41和20 – 42。除非另有说明，否则所有数目都指成熟肽的开始，1指示N末端氨基酸。

特别地，淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-368的序列具有至少66％的同一性：

根据具体实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-368的序列对应，其中所选序列的至少一个氨基酸由另一个氨基酸取代。

将认识到在本发明的特定实施方案中，氨基酸取代是保守的，即置换氨基酸残基具有与被置换的氨基酸残基相似的物理和化学性质。尤其优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。

此外，用相同类型的D-氨基酸系统取代上述序列的一个或多个氨基酸（例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸）可以用于增强稳定性。

将进一步认识到在本发明的特定实施方案中，氨基酸取代是非保守的，即置换氨基酸残基具有与被置换的氨基酸残基的那些不同的物理和化学性质。这个实施方案特别涉及能够形成键的置换氨基酸残基。即，此种氨基酸取代使得能够在置换氨基酸和另一个氨基酸之间形成共价键，所述另一个氨基酸也可以是或不是置换氨基酸。这允许在氨基酸序列内的限定位置上的氨基酸之间引入共价键。

根据进一步的具体实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:1-368的序列，所述序列的至少2个例如2个氨基酸残基这样进行修饰，以便形成所需序列内共价键。例如，2个氨基酸各自可以由半胱氨酸置换。这将允许形成多种键。用于此种氨基酸置换的具体位置和多种合适键在本文中得到描述。进一步地，一个氨基酸可以由半胱氨酸置换，并且另一个氨基酸可以由赖氨酸置换。这将允许形成多种键。用于此种氨基酸置换的具体位置和多种合适键在本文中得到描述。进一步地，一个氨基酸可以由谷氨酸或天冬氨酸置换，并且另一个氨基酸可以由赖氨酸置换。这将允许形成多种键。用于此种氨基酸置换的具体位置和多种合适键在本文中得到描述。

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括至少6个，优选至少8、10、12、14、16或18个邻接氨基酸残基。进一步地，在一般实施方案中，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列将包括小于45、43、41、39、37或36个邻接氨基酸残基。根据优选实施方案，邻接氨基酸残基包括序列VGSN、DVGSN或VGSNK。根据另一个优选实施方案，邻接氨基酸残基包括序列AED。根据另外一个优选实施方案，邻接氨基酸残基包括序列AED和序列VGSN、DVGSN或VGSNK之一，特别是序列AEDVGSN或AEDVGSNK。

根据本发明的进一步的实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃-VGSN-X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂，其中X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂ X₂₃、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂各自独立地代表氨基酸，特别是如本文定义的。所述氨基酸各自可以与另一个氨基酸共价连接，其中另一个氨基酸选自X₁₉、X₂₀ X₂₁、X₂₂ X₂₃、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂，或代表不同氨基酸。优选地，氨基酸序列X₁₉X₂₀X₂₁和X₃₀X₃₁X₃₂处于反向平行方向。

本发明的具体淀粉状蛋白β肽类似物包括这些，其中

X₁₉是选自苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基，其中苯丙氨酸是优选的；

X₂₀是选自苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基，其中苯丙氨酸是优选的；

X₂₁是选自丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中丙氨酸是优选的；

X₂₂是选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基，其中谷氨酸是优选的；

X₂₃是选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基，其中天冬氨酸是优选的；

X₂₈是选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸残基，其中赖氨酸是优选的；

X₂₉是选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中甘氨酸是优选的；

X₃₀是选自丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中丙氨酸是优选的；

X₃₁是选自异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基，其中异亮氨酸是优选的；

X₃₂是选自异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基，其中异亮氨酸是优选的；

或其任何组合。

本发明的进一步具体淀粉状蛋白β肽类似物包括其中淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列F₁₉X₂₀A₂₁-Q-A₃₀I₃₁I₃₂的那些，其中X₂₀代表氨基酸，特别是如本文定义的，并且Q是包括序列VGSN的氨基酸序列。

氨基酸序列Q通常由5、6、7或8个氨基酸残基组成。根据具体实施方案，它形成环，即Q的一些或全部氨基酸如此排列，以便形成环。

淀粉状蛋白β肽类似物包括序列F₁₉X₂₀A₂₁X₂₂D₂₃V₂₄G₂₅S₂₆N₂₇K₂₈X₂₉A₃₀I₃₁I₃₂，其中X₂₀、X₂₂、X₂₉各自独立地代表氨基酸残基，特别是如本文定义的，代表本发明的优选实施方案。在这些淀粉状蛋白β肽类似物中，氨基酸序列F₁₉X₂₀A₂₁和A₃₀I₃₁I₃₂优选处于反向平行方向。更具体地，如果关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：F₁₉（NH）-I₃₂（NH）、F₁₉（NH）-I₃₂（HB）、F₁₉（NH）-I₃₂（CG2）、A₂₁（NH）-A₃₀（NH）、A₂₁（NH）-A₃₀（CB）、A₂₁（NH）-I₃₁（CD1）、A₂₁（NH）-I₃₁（CG2）、I₃₂（NH）-F₁₉（CD1）、I₃₂（NH）-F₁₉（CD2）、I₃₂（HN）-F₁₉（CB）和A₃₀（NH）-A₂₁（CB），则是优选的。如果原子对F₁₉（CO）-I₃₂（N）、I₃₂（CO）-F₁₉（N）、A₂₁（CO）-A₃₀（N）和A₃₀（CO）-A₂₁（N）处于3.3 ± 0.5 ?的距离，则也是优选的，其中CO指示主链氧原子，并且残基的phi（φ）角范围为–180至–30，并且残基的psi（ψ）角范围为约60至180或约–180至–150。

根据进一步的具体实施方案，淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：369-698的序列，其中

X₁₅是谷氨酰胺、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₉是甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸或与序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁和X₂₂的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈和X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接。

所述一个或多个序列内共价键是用来稳定本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的环和任选进一步的二级结构元件的，如描述的。因此，共价连接的氨基酸残基方便地通过至少成环氨基酸分开，例如如本文描述的序列VGSN、DVGSN、VGSNK或Q。SEQ ID NO：369-698中特别优选的序列内共价键位置可以以下述实施方案的形式描述：

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄的至少一个氨基酸残基和选自X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₃、X₁₄、X₁₅的至少一个氨基酸残基和选自X₃₆、X₃₇、X₃₈的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₄、X₁₅、X₁₆的至少一个氨基酸残基和选自X₃₅、X₃₆、X₃₇的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₅、X₁₆、X₁₇的至少一个氨基酸残基和选自X₃₄、X₃₅、X₃₆的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₆、X₁₇、X₁₈的至少一个氨基酸残基和选自X₃₃、X₃₄、X₃₅的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₇、X₁₈、X₁₉的至少一个氨基酸残基和选自X₃₂、X₃₃、X₃₄的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₈、X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₃₁、X₃₂、X₃₃的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₁₉、X₂₀、X₂₁的至少一个氨基酸残基和选自X₃₀、X₃₁、X₃₂的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

选自X₂₀、X₂₁和X₂₂的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

更具体地，氨基酸残基X₁₂和X₃₉、X₁₃和X₃₈、X₁₄和X₃₇、X₁₅和X₃₆、X₁₆和X₃₅、X₁₇和X₃₄、X₁₈和X₃₃、X₁₉和X₃₂、X₂₀和X₃₁、X₂₁和X₃₀、或X₂₂和X₂₉可以方便地彼此共价连接。

根据本发明的进一步实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃- X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁，其中X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁各自独立地代表氨基酸，特别是如本文定义的。所述氨基酸各自可以与另一个氨基酸共价连接，其中另一个氨基酸选自X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁，或代表不同氨基酸。优选地，氨基酸序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃和X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁处于反向平行方向。

本发明的具体淀粉状蛋白β肽类似物包括这些，其中

X₂₄是选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基，其中缬氨酸是优选的；

X₂₅是选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中甘氨酸是优选的；

X₂₆是选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，其中丝氨酸是优选的；

X₂₇是选自天冬酰胺、谷氨酰胺和甲硫氨酸的氨基酸残基，其中天冬酰胺是优选的；

或其任何组合。

本发明的进一步具体淀粉状蛋白β肽类似物包括其中淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₂₀-Q-X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁的那些，其中X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉各自独立地代表氨基酸，特别是如本文定义的，并且Q是包括序列AED的氨基酸序列。

氨基酸序列Q通常由3、4、5或6个氨基酸残基组成。根据具体实施方案，氨基酸序列X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇的至少部分形成环。

淀粉状蛋白β肽类似物包括序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁，其中X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉各自独立地代表氨基酸残基，特别是如本文定义的，代表本发明的优选实施方案。在这些淀粉状蛋白β肽类似物中，氨基酸序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃和X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁的至少3个邻接氨基酸优选处于反向平行方向。更具体地，如果关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：A₂₁（NH）-A₃₀（NH）、A₂₁（NH）-A₃₀（CB）、A₂₁（NH）-I₃₁（CD1）、A₂₁（NH）-I₃₁（CG2）和A₃₀（NH）-A₂₁（CB），则是优选的。如果原子对A₂₁（CO）-A₃₀（N）和A₃₀（CO）-A₂₁（N）处于3.3 ± 0.5 ?的距离，则也是优选的，其中CO指示主链氧原子，并且残基的phi（φ）角范围为–180至–30，并且残基的psi（ψ）角范围为约60至180或约–180至–150。

根据进一步的具体实施方案，淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列是选自SEQ ID NO：699-960的序列，其中

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈和X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接。

所述一个或多个序列内共价键是用来稳定本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的环和任选进一步的二级结构元件的，如描述的。因此，共价连接的氨基酸残基方便地通过至少成环氨基酸分开，例如如本文描述的序列X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇。SEQ ID NO：699-960中特别优选的序列内共价键位置可以以下述实施方案的形式描述：

选自X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₃₀、X₃₁、X₃₂的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

氨基酸残基X₂₀和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁的至少一个氨基酸残基是彼此共价连接的。

更具体地，氨基酸残基X₁₂和X₃₉、X₁₃和X₃₈、X₁₄和X₃₇、X₁₅和X₃₆、X₁₆和X₃₅、X₁₇和X₃₄、X₁₈和X₃₃、X₁₉和X₃₂、或X₂₀和X₃₁可以方便地彼此共价连接。

注意到本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列可以包括除本文具体描述的那些外的进一步氨基酸残基。特别地，在选自SEQ ID NO:1-960的序列的N末端和/或C末端位置上可以存在一个或超过一个另外氨基酸残基。例如，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列可以包括在SEQ ID NO:1-960中所示序列之一的N末端位置上的甲硫氨酸，尤其是如果与氨基酸序列对应的肽在原核宿主中重组产生的话。进一步地，一个或超过一个氨基酸可以插入本文描述的氨基酸序列内。

进一步注意到在SEQ ID NO:1-960中缺乏来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:369或SEQ ID NO:699的3、11、15或19个N末端氨基酸的那些序列代表本发明的具体实施方案。

同样地，注意到在SEQ ID NO:1-960中缺乏来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:369或SEQ ID NO:699的1、2、3、4、5、6、7或8个C末端氨基酸的那些序列代表本发明的具体实施方案。

本发明的具体实施方案包括如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物，其中氨基酸序列是A?（1-42）、A?（12-42）、A?（16-42）、A?（20-42）或A?（16-35），其中在位置14、15、16、17、18、19、20、21或22上的氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，特别是半胱氨酸或赖氨酸，并且在位置37、36、35、34、33、32、31、30或29上的氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，特别是半胱氨酸、赖氨酸或谷氨酸，并且在位置14上的氨基酸与在位置37上的氨基酸共价连接，在位置15上的氨基酸与在位置36上的氨基酸共价连接，在位置16上的氨基酸与在位置35上的氨基酸共价连接，在位置17上的氨基酸与在位置34上的氨基酸共价连接，在位置18上的氨基酸与在位置33上的氨基酸共价连接，在位置19上的氨基酸与在位置32上的氨基酸共价连接，在位置120上的氨基酸与在位置31上的氨基酸共价连接，在位置21上的氨基酸与在位置30上的氨基酸共价连接，或在位置22上的氨基酸与在位置29上的氨基酸共价连接。

在2个氨基酸残基之间的共价键可以通过本领域众所周知的多种方法来确立，例如通过二硫键形成或交联技术。特别地，氨基酸残基的侧链可以彼此连接。特别地，具有官能团例如硫醇、氨基、羧基或羟基基团的侧链，可以彼此直接连接，例如形成二硫键的2个半胱氨酸残基，或经由接头间接连接。因此，与其他氨基酸残基共价连接的氨基酸残基可以特别是选自半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基的那种。

蛋白质的交联具有长且详尽的历史，先前具有大量文献。允许在天然或非天然氨基酸侧链之间进行特异性共价交联的本领域技术人员已知的任何方法都可以用于形成本发明中设想的位置特异性交联。这种方法的一些例子在下文列出。

存在本领域技术人员已知的大量化学交联剂。对于本发明，优选的交联剂包括同双功能和异双功能交联剂，其中异双功能交联剂是优选的，这是由于其以逐步方式连接氨基酸的适合性。

同样，异双功能交联剂提供了确立更特异性键的能力，从而减少不需要的副反应的发生。

广泛多样的异双功能交联剂是本领域已知的。

这些包括用于形成2个氨基（-NH₂）基团、1个氨基和1个硫醇（或巯基，即-SH）基团或2个硫醇基团之间的键的异双功能交联剂。

作为异双功能交联剂的部分有用的一种反应基团是胺反应基团。常见的胺反应基团包括N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯。NHS酯在微酸性至中性（pH 6.5-7. 5）条件下在数分钟内与游离胺（例如，赖氨酸残基）特异性反应。

注意到具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的交联剂也可以以其N-羟磺基琥珀酰亚胺类似物的形式使用，这一般具有更大的水溶性。

作为异双功能交联剂的部分有用的另一种反应基团是硫醇反应基团。常见的硫醇反应基团包括马来酰亚胺、卤素和吡啶基二硫化物。马来酰亚胺在数分钟内与游离硫醇基团（例如，在半胱氨酸残基中）特异性反应，优选在微酸性至中性（pH 6.5-7. 5）条件下。卤素（碘乙酰基官能团）在生理学pH's下与-SH基团反应。这2种反应基团导致稳定硫醚键的形成。

例如，琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧酸酯（SMCC）或磺基-SMCC可以用于形成在例如Lys侧链的胺和例如Cys侧链的游离-SH之间的交联。胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯将与氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成稳定的酰胺键。所得到的马来酰亚胺活化肽随后将与相同肽的巯基基团（例如，Cys残基的那种）反应，以形成二硫键，从而确立共价键。这种化学过程在文献中得到充分描述；参见例如：Uto，I.，等人（1991）. J. Immunol. Methods 138，87-94；Bieniarz，C.，等人（1996）. Extended Length Heterobifunctional Coupling Agents for Protein Conjugations. Bioconjug. Chem. 7，88-95；Chrisey，L.A.，等人（1996）. Nucleic Acids Res. 24（15），3031-3039；Kuijpers，W.H.，等人（1993）. Bioconjug. Chem. 4（1），94-102；Brinkley，M.A.（1992）. A survey of methods for preparing protein conjugates with dyes，haptens and crosslinking reagents. Bioconjugate Chem. 3，2-13；Hashida，S.，等人（1984）. More useful maleimide compounds for the conjugation of Fab to horseradish peroxidase through thiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem. 6，56-63；Mattson，G.，等人（1993）. A practical approach to crosslinking. Molecular Biology Reports 17，167-183；Partis，M.D.，等人（1983）. Crosslinking of proteins by omega-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimide esters. J. Protein. Chem. 2，263-277；Samoszuk，M.K.，等人（1989）. A peroxide-generating immunoconjugate directed to eosinophil peroxidase is cytotoxic to Hodgkin’s disease cells in vitro. Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 2，37-45；Yoshitake，S.，等人（1982）. Mild and efficient conjugation of rabbit Fab and horseradish peroxidase using a maleimide compound and its use for enzyme immunoassay. J. Biochem. 92，1413-1424。

进一步的异双功能交联剂可以以类似方式使用，例如（[N-ε-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[γ-马来酰亚胺丁酰基氧]琥珀酰亚胺酯、N-[κ-马来酰亚胺十一烷酰氧基]琥珀酰亚胺酯、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、或其磺基琥珀酰亚胺类似物（例如，磺基-MBS）。

可以用于形成在例如Lys侧链的胺和例如Cys侧链的游离-SH之间的交联的异双功能交联剂的进一步例子是琥珀酰亚胺基-6-[（3-（2-吡啶基二硫代）-丙酸酯）-己酸酯（LC-SPDP）或磺基-LC-SPDP。胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯将与氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成稳定的酰胺键。所得到的肽具有吡啶基二硫化物基团，这随后将与相同肽的巯基基团（例如，Cys残基的那种）反应，以形成二硫键，从而确立共价键。这种化学过程在文献中得到充分描述；参见例如：Carlsson，J.，等人（1978）Biochem. J. 173，723-737；Stan，R.V.（2004）Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286，H1347-H1353；Mader，C.，等人（2004）J. Bacteriol. 186，1758-1768。

进一步的异双功能交联剂可以以类似方式使用，例如，4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-（2-吡啶基二硫代）-甲苯（SMPT）或磺基-SMPT、N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP）或磺基-SPDP。

可以用于形成在例如Lys侧链的胺和例如Cys侧链的游离-SH之间的交联的异双功能交联剂的进一步例子是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或磺基-SATA。胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯将与氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成稳定的酰胺键。所得到的肽受保护的-SH基团随后将通过用羟胺处理进行脱保护，并且所得到的游离-SH随后将与相同肽的巯基基团（例如，Cys残基的那种）反应，以形成二硫键，从而确立共价键。

进一步的异双功能交联剂可以以类似方式使用，例如，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯或其磺基琥珀酰亚胺类似物。

进一步合适的异双功能交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-（4-碘乙酰基）-氨基苯甲酸酯（SIAB）或磺基-SIAB。

特异性逐步交联也可以在氨基（-NH₂）和羧基（-COOH）基团之间形成。

例如，1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）可以用于形成在例如Lys侧链的胺和酸性侧链的游离-COOH之间的交联。羧基反应性碳二亚胺将与羧基基团（例如，Asp、Glu、Dab（2,4-二氨基丁酸）、Dap（2,4-二氨基丙酸）或鸟氨酸残基的那种）反应，以形成不稳定的邻酰基异脲酯。反应性邻酰基异脲酯随后将与相同肽的氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成酰胺键，从而确立共价键。可替代地，反应性邻酰基异脲酯可以与N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟磺基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟磺基琥珀酰亚胺反应，以产生半稳定的胺反应性NHS酯，这随后将与相同肽的氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成酰胺键，从而确立共价键。这种化学过程在文献中得到充分描述；参见例如：DeSilva，N.S.（2003）Interactions of Surfactant Protein D with Fatty Acids. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 29，757-770；Grabarek，Z.和Gergely，J.（1990）Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem. 185，131-135；Sinz，A.（2003）. J. Mass Spectrom. 38，1225-1237. Staros，J.V.，Wright，R.W.和Swingle，D.M.（1986）Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal. Biochem. 156，220-222；Taniuchi，M.，等人（1986）. Induction of nerve growth factor receptor in Schwann cells after axotomy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA83，4094-4098。

异双功能交联剂还包括Lys（N3）和炔丙基甘氨酸氨基酸的反应。这种反应可以在溶液中或在树脂上执行（如例如在Jiang，S.,（2008）Curr. Org. Chem. 12，1502-1542和其中的参考文献中所述）。

具体类别的交联剂特别是异双功能交联剂包括光反应性交联剂。

例如，（SDA）可以用于形成在例如Lys侧链的胺和例如另一个Lys侧链的胺之间的交联。胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯将与氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成稳定的酰胺键。所得到的肽具有光不稳定性双吖丙啶（diazirine）部分，这在暴露于UV光后，将与相同肽的氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成酰胺键，从而确立共价键。

进一步合适的光反应性交联剂包括二-[β-（4-叠氮基水杨酰胺）-乙基]-二硫化物（BASED）和N-琥珀酰亚胺基-6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯基-氨基）己酸酯（SANPAH）。

除异双功能交联剂外，还存在许多其他交联剂，包括同双功能交联剂。

这些包括用于形成2个氨基（-NH₂）基团之间的键的同双功能交联剂。

例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯（DSS）可以用于形成在例如Lys侧链的胺和例如另一个Lys侧链的胺之间的交联。胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯将与氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成稳定的酰胺键。所得到的肽随后将与相同肽的另一个氨基基团（例如，Lys残基的那种）反应，以形成进一步稳定的酰胺键，从而确立共价键。

进一步合适的同双功能交联剂包括双马来酰亚胺己烷（BMH）和庚二亚氨酸二甲酯（dimethylpimelimidate）（DMP）。

进一步合适的同双功能交联剂包括在2个半胱氨酸之间的亚甲基二硫醚键。肽与TBAF（氟化四丁铵）的反应可以在包含部分脱保护的肽的树脂上执行，随后为切割（参见例如，Ueki等人，（1999）Bioorg. Med. Chem. Lett.，9，1767-1772，和Ueki等人在Peptide Science，1999，539-541中）。

进一步合适的同双功能交联系统包括在烯丙基甘氨酸（参见例如，Wels，B.等人，（2005）Bioorg. Med. Chem. 13，4221-4227）或修饰的氨基酸例如（S）-Fmoc-α（2’戊烯基）丙氨酸（参见例如，Walensky，L.D.，等人，（2004）Science 305，1466-1470；Schafmeister，C.E.，等人，（2000）J. Am. Chem. Soc. 122，5891-5892；Qiu，W.，等人，（2000）Tetrahedron 56，2577-2582；Belokon，Y.N.，等人，（1998）Tetrahedron：Asymmetry，9，4249-4252）；Qiu W.,（2008）Anaspec poster at 20th American Peptide Society Annual Meeting）之间的环合复分解反应。这些反应可以分别在溶液中在受保护的肽片段上或在树脂上执行。

同和异双功能交联剂可以包括间隔臂或桥。桥是连接2个反应末端的结构。桥最明显的属性是它对位阻的作用。在一些情况下，较长的桥可以更容易地跨越连接2个氨基酸残基所需的距离。

虽然在2个非邻接氨基酸残基之间的1个共价键可以提供足够的稳定作用，但本发明的淀粉状蛋白β肽类似物可以包括超过一个共价键。

本发明还涉及包括如本文定义的多个淀粉状蛋白β肽类似物的寡聚物。

术语“寡聚物”在此处指如本文定义的2个或更多个淀粉状蛋白β肽类似物的非共价结合，具有同质性和独特的物理特征。根据一个方面，寡聚物是淀粉状蛋白β肽类似物的稳定、非原纤维、寡聚装配。根据一个实施方案，所述装配包括2 – 28个淀粉状蛋白β肽类似物。

此种寡聚物的特征可以进一步在于2个或淀粉状蛋白β肽类似物之间的特定相互作用。

例如，如果每个淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈，则是优选的，其中一个淀粉状蛋白β肽类似物（A）的序列L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈与另一个淀粉状蛋白β肽类似物（B）的序列L^B ₃₄M^B ₃₅V^B ₃₆G^B ₃₇G^B ₃₈处于平行方向。更具体地，如果关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（NH）、G^A ₃₇（NH）-G^B ₃₈（NH）、L^A ₃₄（NH）-L^B ₃₄（C_δH₃）、M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（CγH₃），则是优选的。

根据进一步具体实施方案，本发明涉及寡聚物，其中每个淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列G₃₃L₃₄M₃₅V₃₆G₃₇G₃₈V₃₉，其中一个淀粉状蛋白β肽类似物（A）的序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉与另一个淀粉状蛋白β肽类似物（B）的序列G^B ₃₃L^B ₃₄M^B ₃₅V^B ₃₆G^B ₃₇G^B ₃₈V^B ₃₉处于平行方向。更具体地，如果关于选自下述的至少一个原子对的质子间距离是1.8 - 6.5埃：G^A ₃₃（NH）-G^B ₃₄（NH）、M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（NH）、G^A ₃₇（NH）-G^B ₃₈（NH）、L^A ₃₄（NH）-L^B ₃₄（C_δH₃）、M^A ₃₅（NH）-V^B ₃₆（CγH₃）、G^A ₃₈（NH）-V^B ₃₉（CγH₃）和V^A ₃₉（NH）-V^B ₃₉（CγH₃），则是优选的。

进一步地，如果寡聚物包括通过不同淀粉状蛋白β肽类似物的β-链形成的分子间平行β-折叠，则是优选的。根据进一步的具体实施方案，β-折叠包括一个淀粉状蛋白β肽类似物（A）的氨基酸序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉和另一个淀粉状蛋白β肽类似物（B）的氨基酸序列G^A ₃₃L^A ₃₄M^A ₃₅V^A ₃₆G^A ₃₇G^A ₃₈V^A ₃₉。更具体地，如果原子对G^A33（CO）-L^B34（N）、L^B34（CO）-M^A35（N）、M^A35（CO）-V^B36（N）、V^B36（CO）-G^A37（N）和G^B37（CO）-G^A38（N）处于3.3 ± 0.5 ?的距离，则是优选的，其中CO指示主链氧原子，并且残基的phi（φ）角范围为–180至–30，并且残基的psi（ψ）角范围为约60至180或约–180至–150。

限定反平行β-折叠结构的质子间距离可以通过主链酰胺之间以及主链酰胺和侧链之间的分子内核欧沃豪斯（Overhauser）效应（NOEs）进行确定。

限定平行β-折叠结构的质子间距离可以通过主链NH-NH之间以及主链NH和侧链的甲基基团之间的分子间NOEs进行确定。

分子内与分子间NOEs比较可以使用不同的同位素标记的样品进行区分，如例如在引入本文作为参考的WO2007/064917中所述，特别是在实施例V，部分G，NMR特征中。

使用来自NMR数据分析的NOE衍生的距离约束，可以例如使用程序CNX [A.T. Brunger，等人，Acta Crystallogr. D54（Pt 5），905-21,（1998）]，通过使用模拟退火规程[M. Nilges，等人，FEBS Lett. 229，317-324,（1988）]计算结构，从而提供2个原子之间的进一步分子内和/或分子间距离。

根据进一步的具体实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的特征在于其与特定抗体的反应性。此种抗体特别包括与Aβ（20-42）截短的球聚物具有结合亲和力的抗体，所述结合亲和力大于该抗体对于Aβ（1-42）球聚物的结合亲和力。

术语“Aβ（X-Y）球聚物”（Aβ（X-Y）球状寡聚物）在此处指如本文定义的Aβ（X-Y）肽的可溶性、球状、非共价结合，具有同质性和独特的物理特征。根据一个方面，Aβ（X-Y）球聚物是Aβ（X-Y）肽的稳定、非原纤维、寡聚装配。与单体和原纤维形成对比，这些球聚物的特征在于亚单位的限定装配数目（例如，早期装配形式，n=4-6，“寡聚物A”，和晚期装配形式，n=12-14，“寡聚物B”，如WO2004/067561中所述）。球聚物具有三维球状结构（“熔球”，参见Barghorn等人，2005，J Neurochem，95，834-847）。它们的特征可以进一步在于下述特点中的一个或多个：

- N末端氨基酸X-23用混杂蛋白酶的可切割性（例如嗜热菌蛋白酶或内切蛋白酶（endoproteinase）GluC），从而获得截短形式的球聚物；

- C末端氨基酸24-Y对于混杂蛋白酶和抗体的不可接近性；

- 截短形式的这些球聚物维持所述球聚物的三维核心结构，其球聚物构型中核心表位A?（20-Y）具有更佳可接近性。

术语“Aβ（X-Y）球聚物”还包括在WO2007/064917中描述的N-Met Aβ（X-Y）球聚物。

术语“Aβ（X-Y）截短的球聚物”在此处指截短形式的 Aβ（X-Y）球聚物，其可以通过对Aβ（X-Y）球聚物实施限制性蛋白酶解消化来获得。更具体而言，Aβ（X-Y）截短的球聚物包括N末端截短形式，其中X选自数目2 .. 24，其中X优选是20或12，并且Y如本文定义的，其可通过用合适的蛋白酶处理截短Aβ（1-Y）球聚物来获得。例如，Aβ（20-42）球聚物可以通过对Aβ（1-42）球聚物实施嗜热菌蛋白酶蛋白酶解来获得，并且Aβ（12-42）球聚物可以通过对Aβ（1-42）球聚物实施内切蛋白酶GluC蛋白酶解来获得。当达到所需蛋白酶解程度时，蛋白酶以一般已知的方式进行灭活。所得到的球聚物随后可以根据本文已描述的程序进行分离，并且若需要，则通过进一步的整理（work-up）和纯化步骤进行进一步加工。所述过程的详细描述公开于引入本文作为参考的WO 2004/067561中。

为了本发明的目的，Aβ（1-42）球聚物特别是如本文参考实施例1中所述的Aβ（1-42）球聚物；N-Met Aβ（1-42）球聚物特别是如参考实施例2中所述的N-Met Aβ（1-42）球聚物；Aβ（20-42）截短的球聚物特别是如本文参考实施例3中所述的Aβ（20-42）截短的球聚物，并且Aβ（12-42）截短的球聚物特别是如本文参考实施例4中所述的Aβ（12-42）截短的球聚物。

对于Aβ（20-42）截短的球聚物具有的结合亲和力大于抗体对于Aβ（1-42）球聚物的结合亲和力的抗体在WO 2007/062852中描述，并且包括例如选自7C6、7E5、4D10和5F7的单克隆抗体。

根据具体实施方案，所述抗体以范围至少1x10^-6 M的K_D与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合。优选地，抗体以高亲和力与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，例如以1x10^-7的K_D或更大亲和力，例如以3x10^-8 M的K_D或更大亲和力，以1x10^-8 M的K_D或更大亲和力，例如以3x10^-9 M的K_D或更大亲和力，以1x10^-9 M的K_D或更大亲和力，例如以3x10^-10 M 的K_D或更大亲和力，以1x10^-10 M的K_D或更大亲和力，例如以3x10^-11 M的K_D或更大亲和力，或以1x10^-11 M的K_D或更大亲和力。

术语“更大亲和力”在此处指相互作用程度，其中一方面未结合的抗体和未结合的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物和另一方面抗体-淀粉状蛋白β肽类似物/寡聚物复合物之间的平衡进一步有利于抗体-淀粉状蛋白β肽类似物/寡聚物复合物。同样地，术语“更小亲和力”在此处指相互作用程度，其中一方面未结合的抗体和未结合的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物和另一方面抗体-淀粉状蛋白β肽类似物/寡聚物复合物之间的平衡进一步有利于未结合的抗体和未结合的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。术语“更大亲和力”与术语“更高亲和力”同义，并且术语“更小亲和力”与术语“更低亲和力”同义。

抗体（单克隆或多克隆）与给定抗原（例如本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物）的结合亲和力可以通过使用标准化体外免疫测定进行评估，例如ELISA、斑点印迹或BIAcore分析（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典和Piscataway，NJ）。关于进一步描述，参见J?nsson，U.，等人（1993）Ann. Biol. Clin. 51:19-26；J?nsson，U.，等人（1991）Biotechniques 11:620-627；Johnsson，B.，等人（1995）J. Mol. Recognit. 8:125-131；和Johnsson，B.，等人（1991）Anal. Biochem. 198:268-277。

根据具体实施方案，本文定义的亲和力指通过执行如实施例12中所述的斑点印迹且通过光密度测定法评估其而获得的值。根据本发明的具体实施方案，通过斑点印迹测定结合亲和力包括下述：将特定量的抗原，或方便地，其例如在20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl、pH 7.4，0.2 mg/ml BSA中至例如100 pmol/μl、10 pmol/μl、1 pmol/μl、0.1 pmol/μl和0.01 pmol/μl的抗原浓度的合适稀释物，点在硝酸纤维素膜上，随后用乳封闭膜以阻止非特异性结合，并且洗涤，随后与目的抗体接触，随后借助于酶缀合的第二抗体和比色反应检测后者；在限定的抗体浓度下，结合的抗体量允许亲和力测定。因此，2种不同抗体与1种靶或1种抗体与2种不同靶的相对亲和力，在此处定义为在其他方面等同的斑点印迹条件下用2种抗体-靶组合观察到的靶结合的抗体的各自量的关系。与基于蛋白质印迹的相似方法不同，斑点印迹方法将测定在靶的天然构型中抗体对于给定靶的亲和力。

如本文使用的，术语“K_d”意指如本领域已知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数。

与球聚物特异性抗体反应的本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物被认为展示至少一个球聚物表位。因此，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物能够引发这样的免疫应答，其具有与Aβ（20-42）截短的球聚物或其他截短的球聚物用作免疫原时引发的免疫应答相似的概况。

术语“表位”包括能够与免疫球蛋白特异性结合的任何多肽决定簇。在特定实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面定组（grouping），并且在特定实施方案中，可以具有具体三维结构特征，和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。表位还可以由除免疫球蛋白外的其他结合抗原识别。

根据进一步的具体实施方案，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的特征在于其引发此种特定免疫应答的能力，例如如果哺乳动物例如兔或小鼠用本发明的寡聚物或衍生物免疫接种的话。

免疫应答可以被视为起因于用抗原（免疫原）攻击（免疫接种）宿主的抗体混合物。所述抗体混合物可以得自宿主并且在下文中被称为多克隆抗血清。

在一个方面，此种特定免疫应答，即相应的多克隆抗血清的特征在于包括与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物或与Aβ（20-42）截短的球聚物具有的结合亲和力大于抗体与选自下述的至少一种Aβ形式的结合亲和力的抗体：单体Aβ（1-42）、单体Aβ（1-40）、单体Aβ（20-42）、fibrillomeric Aβ（1-42）、fibrillomeric Aβ（1-40）和Aβ（1-42）球聚物。

根据具体实施方案，免疫应答，即相应的多克隆抗血清的特征在于与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物或与Aβ（20-42）截短的球聚物具有的结合亲和力是抗血清与选自下述的至少一种Aβ形式的结合亲和力的至少2倍，例如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，例如至少20倍，至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，例如至少200倍，至少300倍或至少500倍，且甚至更加优选至少1000倍，例如至少2000倍，至少3000倍或至少5000倍，甚至更加优选至少10000倍，例如至少20000倍，至少30000倍或至少50000倍，并且最优选至少100000倍：单体Aβ（1-42）、单体Aβ（1-40）、单体Aβ（20-42）、fibrillomeric Aβ（1-42）、fibrillomeric Aβ（1-40）和Aβ（1-42）球聚物。

术语“Aβ（X-Y）单体”或“单体Aβ（X-Y）”在此处指分离形式的Aβ（X-Y）肽，优选基本上不参加与其他Aβ肽的非共价相互作用的Aβ（X-Y）肽形式。它代表不展示球聚物表位的基本上解折叠的肽。实际上，Aβ（X-Y）单体通常以水溶液的形式提供。在本发明的特别优选的实施方案中，单体水溶液包含0.05％- 0.2％、更优选约0.1％NH₄OH。在本发明的另一个特别优选的实施方案中，单体水溶液包含0.05％- 0.2％、更优选约0.1％NaOH。当使用时（例如用于测定本发明的抗体的结合亲和力时），可以方便地以合适方式稀释所述溶液。进一步地，通常方便地在其制备后2小时内使用所述溶液、特别在1小时内、且尤其在30分钟内。

更具体而言，术语“Aβ（1-40）单体”在此处指如本文参考实施例5中所述的Aβ（1-40）单体制剂，并且术语“Aβ（1-42）单体”在此处指如本文参考实施例6中所述的Aβ（1-42）制剂。

在另一个方面，此种免疫应答的特征在于包括与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物或与Aβ（20-42）截短的球聚物具有的结合亲和力大于抗体与Aβ（1-42）球聚物的结合亲和力的抗体。

术语“原纤维”在此处指包括非共价结合的、个别Aβ（X-Y）肽的装配的分子结构，其在电子显微镜下显示原纤维结构，其结合刚果红且随后在偏振光下显示双折射，并且它的X射线衍射图形是交叉β结构。

在本发明的另一个方面，原纤维是可通过这样的方法获得的分子结构，所述方法包括在不存在去污剂的情况下例如在0.1 M HCl中自诱导的合适Aβ肽的聚合聚集，从而导致形成超过24、优选超过100个单位的聚集物。这个方法是本领域众所周知的。方便地，Aβ（X-Y）原纤维以水溶液的形式使用。在本发明的特别优选的实施方案中，这样制备原纤维水溶液：将Aβ肽溶解于0.1％NH₄OH中，用20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4将它1 ：4稀释，随后将pH再调整至7.4，使溶液在37℃温育20小时，随后在10,000 g离心10分钟，并且重悬浮于20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4中。

术语“Aβ（X-Y）原纤维”在此处指基本上由Aβ（X-Y）亚单位组成的原纤维，其中如果平均起来至少90％的亚单位是Aβ（X-Y）类型的，则是优选的，如果至少98％的亚单位是Aβ（X-Y）类型的，则是更优选的，并且如果非Aβ（X-Y）肽的含量低于检测阈值，则是最优选的。

更具体而言，术语“Aβ（1-42）原纤维”在此处指如本文参考实施例7中所述的Aβ（1-42）原纤维制剂。

本发明还涉及本发明的纯化的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。根据本发明的一个实施方案，纯化的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物是具有超过总Aβ肽的80重量％的纯度的那种，优选超过总Aβ肽的90重量％，优选超过总Aβ肽的95重量％。

除淀粉状蛋白β衍生的氨基酸序列或其拟肽外，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物还包括一个或多个进一步部分，这可以是方便的。例如，诊断应用可能需要标记淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。同样，在自动免疫接种中，附着在自动免疫接种应用中证明是方便的部分可能具有优点。

因此，本发明还涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物，其包括促进检测的共价连接的基团，优选荧光团，例如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、Alexa-488、维多利亚多管水母（Aequorea victoria）荧光蛋白质、Dictyosoma荧光蛋白质或其任何组合或荧光活性衍生物；生色团；化学发光团（chemoluminophore），例如萤光素酶，优选北美萤火虫（Photinus pyralis）萤光素酶、费氏弧菌（Vibrio fischeri）萤光素酶或其任何组合或化学发光活性衍生物；酶促活性基团，例如过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶或其任何酶促活性衍生物；电子致密基团，例如含重金属基团，例如含金基团；半抗原，例如酚衍生的半抗原；强抗原结构，例如预期是抗原性的，例如通过Kolaskar和Tongaonkar的算法预期是抗原性的肽序列；帮助引发针对淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的免疫应答的分子，例如血清清蛋白、卵清蛋白、匙孔

血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、来自细菌的类毒素例如破伤风类毒素和白喉类毒素、天然存在的T细胞表位、天然存在的T辅助细胞表位；人工T细胞表位例如泛DR（pan DR）表位（"PADRE"；WO 95/07707），或另一种免疫刺激试剂，例如甘露聚糖、三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸等；关于另一种分子的适体；螯合基团，例如六组氨酰基；介导进一步特异性蛋白质-蛋白质相互作用的天然或天然衍生的蛋白质结构，例如fos/jun对成员；磁性基团，例如铁磁基团；或放射性基团，例如包括1H、14C、32P、35S或125I的基团或其任何组合。为了避免不利的促炎免疫应答Th1途径，包括能够指导针对抗炎途径（Th2途径）的免疫应答的分子的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物，例如包括B细胞表位例如PADRE的分子，预期在自动免疫接种中提供特别优点（还参见，Petrushina I.，等人，The Journal of Neuroscience 2007，27（46）：12721-12731；Woodhouse A.，等人，Drugs Aging 2007；24（2）：107-119）。

用于使其与肽或拟肽连接的此种基团和方法是本领域已知的。

本文公开的淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物可以以本领域本身已知的方式进行生产。

在第一个步骤中，提供了包括所需淀粉状蛋白β肽类似物或其拟肽的氨基酸序列的肽。

所述肽或拟肽可以使用各种固相技术通过化学合成进行生产，例如下述中公开的那些：G. Barany和R.B. Merrifield，“The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology”；第2卷 - “Special Methods in Peptide Synthesis，Part A”，第3-284页，E. Gross和J. Meienhofer，编辑，Academic Press，New York，1980；以及J. M. Stewart和J. D. Young，“Solid-Phase Peptide Synthesis”，第2版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984。这种策略基于用于α-氨基的临时保护的Fmoc（9-芴基甲基甲氧羰基）基团，与用于氨基酸侧链的临时保护的叔丁基基团组合（参见例如E. Atherton和R. C. Sheppard，“The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group”，in “The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology”；第9卷 -“Special Methods in Peptide Synthesis，Part C”，第1-38页，S. Undenfriend和J. Meienhofer，编辑，Academic Press，San Diego，1987。

肽可以以逐步方式在不溶性聚合物支持体（也称为“树脂”）上从肽的C末端开始合成。合成通过经由形成酰胺或酯键向树脂添加肽的C末端氨基酸开始。这允许所得到的肽分别作为C末端酰胺或羧酸最后释放。可替代地，在其中存在C末端氨基醇的情况下，C末端残基可以如本文描述的与2-甲氧基-4-烷氧基苯甲醇树脂（SASRIN^TM，Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia，PA）附着，并且在肽序列装配完成后，用在THF中的LiBH₄释放所得到的肽醇（参见J. M. Stewart和J. D. Young，同上，第92页）。

在合成中使用的C末端氨基酸和所有其他氨基酸需要具有其差别保护的α-氨基基团和侧链官能团（如果存在的话），从而使得α-氨基保护基团可以在合成过程中选择性去除。氨基酸的偶联通过其羧基基团作为活性酯的活化，及其与向树脂添加的N末端氨基酸的未封闭α-氨基基团的反应来执行。重复α-氨基基团脱保护和偶联的顺序，直至装配整个肽序列。肽随后从树脂释放，伴随侧链官能团的脱保护，通常在合适清除剂的存在下以限制副反应。所得到的肽通过反相HPLC进行最终纯化。

作为最终肽的前体所需的肽基-树脂合成利用商购可得的交联聚苯乙烯聚合物树脂（Novabiochem，San Diego，CA；Applied Biosystems，Foster City，CA）。优选的固体支持体是：4-（2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基）-苯氧基乙酰基-对甲基二苯甲基胺树脂（Rink酰胺MBHA树脂）；9-Fmoc-氨基-吨-3-基氧-Merrifield树脂（Sieber酰胺树脂）；4-（9-Fmoc）氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基）戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂（PAL树脂），用于C末端羧酰胺。第一个和后续氨基酸的偶联可以分别使用由DIC/HOBT、HBTU/HOBT、BOP、PyBOP，或由DIC/HOAT、HATU/HOAT生产的HOBT或HOAT活化酯来完成。优选的固体支持体是：2-氯三苯甲基氯树脂和9-Fmoc-氨基-

吨-3-基氧-Merrifield树脂（Sieber酰胺树脂）用于受保护的肽片段。第一个氨基酸装载到2-氯三苯甲基氯树脂上最好通过使Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应来达到。若需要，则可以加入少量DMF以促进氨基酸的溶解。

合成可以通过使用肽合成仪来执行，例如Advanced Chemtech Multiple Peptide Synthesizer（MPS396）或Applied Biosystems Inc. 肽合成仪（ABI 433a）。

可替代地，可以使用本领域技术人员已知的任何其他合适方法，包括：1）合成通过合适切割位点分开的所需肽或拟肽的多个拷贝，所述切割位点用于肽键的酶促或化学切割，从而导致所需肽拟肽，2）在本领域技术人员已知并且包含氨基酸序列的任何系统中重组表达APP，随后为酶促或化学加工以获得所需肽，3）在本领域技术人员已知的任何系统中重组表达作为融合蛋白的所需肽，4）在本领域技术人员已知的任何系统中直接重组表达所需肽。

淀粉状蛋白β肽的重组表达在WO2007/064917中描述。此外，用于在重组宿主中表达异源蛋白质、化学合成多肽和体外翻译的一般方法是本领域众所周知的，并且在下述中进一步描述：Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（1989），第2版，Cold Spring Harbor，N. Y.；Berger和Kimmel，Methods in Enzymology，第152卷，Guide to Molecular Cloning Techniques（1987），Academic Press，Inc.，San Diego，Calif. ；Merrifield，J.（1969）J. Am. Chem. Soc. 91：501；Chaiken 1. M.（1981）CRC Crit. Rev. Biochem. 11：255；Kaiser等人（1989）Science 243：187 ；Merrifield，B.（1986）Science 232：342；Kent，S. B. H.（1988）Ann. Rev. Biochem. 57：957；和Offord，R. E.（1980）Semisynthetic Proteins，Wiley Publishing）。

在第二个步骤中，对所获得的肽或拟肽实施允许形成键的条件。条件当然将依赖于形成的键类型，并且可以容易地由技术人员确定。参考本文提供的键及其化学过程的描述。

寡聚物合成另外涉及寡聚物形成。因此，第二个步骤将不仅包括连接还包括寡聚物形成。

适合于寡聚物形成的条件在例如WO 2004/067561；WO 2006/094724；S. Barghorn等人，J. Neurochem.95，834（2005）和WO2007/064917中描述，所述参考文献引入本文作为参考。

原则上，寡聚物形成可以在键形成之前。如果预先形成的寡聚物指导或促进键形成，那么这是有利的。可替代地，键形成可以在寡聚物形成之前。如果预先形成的键指导或促进寡聚物形成，那么这是有利的。寡聚物形成和键形成还可以同时发生。

淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物可以使用肽或拟肽进行制备，所述肽或拟肽不同于由最终淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物包括的氨基酸序列或拟肽。例如，起始肽可以在其C和/或N末端上包括另外氨基酸，这将随后在合成过程中例如通过蛋白酶剪切去除。

在本发明的一个实施方案中，寡聚物由肽或其拟肽形成，并且随后通过一个或多个肽内或拟肽内共价键加以稳定。在这个实施方案中，使用肽而不是拟肽可能是方便的。

在本发明的另一个实施方案中，寡聚物由肽或其拟肽形成，通过一个或多个肽内或拟肽内共价键加以稳定，并且随后通过化学或酶促方式加工为更佳地展示相关结构元件的截短形式。可替代地，寡聚物由肽或其拟肽形成，通过化学或酶促方式加工为更佳地展示相关结构元件的截短形式，并且随后通过一个或多个肽内或拟肽内共价键加以稳定。在这些实施方案中，使用肽而不是拟肽可能是方便的。

在本发明的另外一个实施方案中，肽或其拟肽用于形成相关结构元件，其中肽或拟肽将通过一个或多个肽内或拟肽内共价键，而不是通过与寡聚物中的相邻肽或拟肽的相互作用保持正确构象。预见由一个或多个合适的肽内或拟肽内共价键稳定的这些淀粉状蛋白β肽类似物将相关结构元件作为单体呈现。在这个实施方案中，使用拟肽而不是肽可能是方便的。

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物具有许多效用。例如，它们可以用于：1）基于免疫接种的介入治疗（例如，淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物可以用于自动免疫接种以治疗或预防淀粉样变性）；2）诊断测试（例如，淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物可以用于诊断淀粉样变性；3）提供与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂，例如抗体和适体；和4）基于晶体学或NMR的基于结构的设计研究用于开发与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂，例如抗体和适体。

术语“淀粉样变性”在此处指特征在于特定蛋白质（淀粉状蛋白、纤维状蛋白质及其前体）在身体各种组织中的异常折叠、团集、聚集和/或积累的许多病症。在阿尔茨海默氏病和唐氏综合症中，神经组织受累，并且在脑淀粉状蛋白血管病（CAA）中，血管受累。根据本发明的具体实施方案，淀粉样变性选自阿尔茨海默氏病（AD）和唐氏综合症的淀粉样变性。

在自动免疫接种中，Aβ（20-42）截短的球聚物显示在逆转阿尔茨海默氏病转基因小鼠中的认知缺陷中是有效的。本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物能够引发免疫应答，其概况类似于由Aβ（20-42）截短的球聚物引发的免疫应答的概况。

因此，本发明还涉及用于治疗用途的如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。

在一个方面，本发明涉及包括如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的治疗组合物。根据具体实施方案，所述组合物是进一步包括药学上可接受的载体的药物组合物。

在进一步的方面，本发明涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备药物组合物用于治疗或预防淀粉样变性的用途。

在本发明的优选实施方案中，药物组合物是用于自动免疫接种的疫苗。

因此，本发明还涉及治疗或预防有此需要的受试者中的淀粉样变性的方法，其包括给受试者施用如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。

在本发明的优选实施方案中，施用淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于针对淀粉样变性主动免疫接种受试者。

在自动免疫接种的背景下，如果淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物不能以显著量进入患者的CNS，那么这是特别优选的。

如果包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的药物组合物能够诱导针对Aβ寡聚物的强免疫应答，那么这也是特别优选的，优选仅针对Aβ寡聚物的强免疫应答，更优选仅针对Aβ寡聚物的非炎性基于抗体的强免疫应答。因此，在本发明的一个实施方案中，药物组合物包括免疫学佐剂，优选佐剂和发信号分子，例如细胞因子，其指导免疫应答朝向非炎性、基于抗体的类型。此种佐剂和发信号分子是本领域技术人员众所周知的。

如果用于自动免疫接种的药物组合物经由选自静脉内途径、肌内途径、皮下途径、鼻内途径和通过吸入的途径施用，那么这是特别优选的。如果组合物通过选自注射、弹丸输注（bolus infusion）和连续输注的方法施用，那么这也是特别优选的，所述方法各自可以执行1次、反复执行或以规则时间间隔执行。

在本发明的具体实施方案中，通过采用可植入设备达到长期连续输注。在本发明的进一步的具体实施方案中，组合物作为可植入的持续释放或控释贮存制剂应用。合适制剂和设备是本领域技术人员已知的。对于任何给定途径待使用的方法细节将依赖于疾病的病期和严重程度以及受试者的总体医学参数，并且优选随治疗医生或兽医的意思个别决定。

在本发明的尤其优选实施方案中，用于自动免疫接种的药物组合物包括选自下述的一种或多种物质：药学上可接受的防腐剂、药学上可接受的色素、药学上可接受的保护胶体、药学上可接受的pH调节剂和药学上可接受的渗透压调节剂。此种物质在本领域中得到描述。

与球聚物假设一致，认为患有淀粉样变性的受试者发展针对内源球聚物表位的免疫应答。因为本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物与抗体反应，所述抗体与所述表位特异性反应，所以寡聚物被认为展示相同或非常相似的表位。

本发明因此还涉及用于诊断用途的如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。

在一个方面，本发明涉及包括如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的诊断组合物。根据具体实施方案，所述组合物是进一步包括药学上可接受的载体的药物组合物。

在进一步的方面，本发明涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备组合物用于诊断淀粉样变性的用途。

因此，本发明还涉及诊断淀粉样变性的方法，其包括提供来自怀疑具有淀粉样变性的受试者的样品，在足以形成包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物和抗体的复合物的时间和条件下，使样品与如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物接触，所述复合物的存在指示受试者具有淀粉样变性。根据具体实施方案，至少接触样品的步骤先体外后体内且特别是在体外执行。

因此，本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物可以在多种诊断方法和测定中使用。

根据一个实施方案，诊断怀疑具有这种疾病的患者中的淀粉样变性的方法包括步骤：a）从患者中分离生物样品；b）在足以形成抗体/淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物复合物的时间和条件下，使生物样品与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物接触；c）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和d）通过检测由信号生成化合物生成的信号，检测可能存在于生物样品中的抗体的存在，所述信号指示患者中淀粉样变性的诊断。根据具体实施方案，步骤b）、c）和d）中的至少一个先体外后体内且特别是在体外执行。根据进一步的具体实施方案，该方法不包括步骤a）。

根据进一步的实施方案，诊断怀疑具有这种疾病的患者中的淀粉样变性的方法包括步骤：a）从患者中分离生物样品；b）在足以允许形成抗抗体/抗体复合物的时间和条件下，使生物样品与对于样品中的抗体特异的抗抗体接触；b）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物；和c）检测由信号生成化合物生成的信号，所述信号指示患者中淀粉样变性的诊断。根据具体实施方案，所述步骤b）和c）中的至少一个先体外后体内且特别是在体外执行。根据进一步的具体实施方案，该方法不包括步骤a）。

更具体而言，因为本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物展示球聚物表位，并且球聚物表位被认为是引起内源免疫应答的内源抗原，所以淀粉样变性的诊断可以与测定自身抗体的存在有关，所述自身抗体与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物特异性结合。

本发明因此还涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备用于检测受试者中与寡聚物或衍生物结合的自身抗体的组合物的用途。因此，本发明还涉及检测受试者中与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的自身抗体的方法，所述方法包括给受试者施用如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物，并且检测由抗体和淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物形成的复合物，所述复合物的存在指示自身抗体的存在。在本发明的具体实施方案中，受试者怀疑具有任何形式的淀粉样变性，例如阿尔茨海默氏病，并且检测自身抗体是用于诊断受试者中任何形式的淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病的存在或不存在。

本发明还涉及如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于检测样品中与寡聚物或衍生物结合的自身抗体的用途。因此，本发明还涉及检测样品中与Aβ淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的自身抗体的方法，所述方法包括使样品与如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物接触，并且检测由抗体和淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物形成的复合物，所述复合物的存在指示自身抗体的存在。根据具体实施方案，至少接触样品的步骤先体外后体内且特别是在体外执行。在本发明的优选实施方案中，样品衍生自怀疑具有淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病的受试者，并且检测自身抗体是用于诊断受试者中淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病的存在或不存在。合适样品包括可以通过上述方法测试的生物学流体。这些包括血浆、全血、干燥全血、血清、脑脊液或组织和细胞的含水或有机-含水（organo-aqueous）提取物。

如果怀疑具有淀粉样变性的受试者是具有淀粉样变性或具有获得淀粉样变性的增加的危险的受试者，那么这是特别优选的。

根据本发明的具体实施方案，如本文描述的检测自身抗体进一步包括制剂（样品）的预处理，这促使自身抗体/抗原复合物解离。因此可以使用包括此种预处理的方法以测定制剂（样品）中存在的自身抗体总量，而可以使用不包括所述预处理的方法以测定仍可以与抗原结合的自身抗体量。进一步地，2种方法都将允许间接测定复合的自身抗体的量。

适合于诱导自身抗体/抗原复合物解离的条件是技术人员已知的。例如，用酸处理制剂（样品），例如使用缓冲液，从而使得所得到的制剂（样品）的pH在1 – 5的范围中、优选在2 - 4的范围中、且特别在2 - 3的范围中。可以是方便的。合适缓冲液包括生理学浓度的盐，例如NaCl和乙酸。用于分离抗体/抗原复合物的方法已在整体引入本文的WO2005/037209中描述。

简言之，使抗体/抗原复合物中的抗体与抗原解离包括步骤：使包含抗体/抗原复合物的样品与解离缓冲液接触；温育样品；和任选浓缩样品。

解离缓冲液可以是具有在如本文所示范围中的pH的PBS缓冲液。例如，包含约1.5％BSA和0.2 M 甘氨酸-乙酸盐 pH 2.5或140 mM NaCl和0.58％乙酸的PBS缓冲液是合适的。

在20 – 40℃温育几分钟，例如10 – 30例如20分钟已证明是足够的。

浓缩可以以本身已知的方式来达到，例如通过使样品经过Centriprep YM30（Amincon Inc.）。

在本发明的一个实施方案中，使淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物或其部分包被在固相上。随后使样品（例如，全血、脑脊液、血清等）与固相接触。如果抗体例如自身抗体存在于样品中，那么此种抗体与固相上的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，并且随后通过直接或间接方法进行检测。直接方法包括简单地检测复合物自身的存在，并且因此检测抗体的存在。在间接方法中，将缀合物添加到结合的抗体中。缀合物包括第二抗体，其与第一种结合的抗体结合，与信号生成化合物或标记附着。倘若第二抗体与结合的第一抗体结合，那么信号生成化合物生成可测量信号。此种信号随后指示样品中第一抗体的存在。

在诊断免疫测定中使用的固相的例子是多孔和非多孔材料、胶乳颗粒、磁性颗粒、微粒（参见美国专利号5,705,330）、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。若需要，则固相材料的选择和标记缀合物中存在的抗原或抗体的方法基于所需测定形式性能特征来确定。

如本文指出的，缀合物（或指示试剂）将包括与信号生成化合物或“标记”附着的抗体（或可能自身抗体，依赖于测定）。这种信号生成化合物或标记自身是可检测的，或可以与一种或多种另外化合物反应，以生成可检测产物。信号生成化合物的例子在本文中得到描述，且特别包括生色团、放射性同位素（例如，125I、131I、32P、3H、35S和14C）、化学发光化合物（例如，吖啶

（acridinium））、粒子（可见或荧光的）、核酸、络合剂或催化剂例如酶（例如，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶）。在酶使用（例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）的情况下，生色、荧光或发光（lumo-genic）底物的添加导致可检测信号的生成。其他检测系统例如时间分辨荧光、内部反射荧光、扩增（例如，聚合酶链反应）和拉曼光谱也是有用的。

试剂盒也包括在本发明的范围内。更具体而言，本发明包括用于测定受试者中抗体例如自身抗体的存在的试剂盒。特别地，用于测定样品中所述抗体的存在的试剂盒包括a）如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物；和任选地b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。试剂盒还可以包含对照或校准物（calibrator），其包括与抗原结合的试剂。

本发明还包括用于检测样品中抗体例如自身抗体的另一类试剂盒。试剂盒可以包括a）对于目的抗体特异的抗抗体，和b）如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物。还包括了对照或校准物，其包括与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。更具体而言，试剂盒可以包括a）对于自身抗体特异的抗抗体，和b）包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的缀合物，所述缀合物与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着。再次，试剂盒还可以包括对照或校准物，其包括与抗原结合的试剂。

试剂盒还可以包括一个容器例如小瓶、瓶或条，其中每个容器具有预置固相，并且其他容器包含分别的缀合物。这些试剂盒还可以包含用于执行测定所需的其他试剂的小瓶或容器，例如洗涤、加工和指示试剂。

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于提供能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。此种试剂包括例如抗体（下文也称为抗寡聚物抗体）、非抗体结合分子（例如affibodies、affilin分子、AdNectins、Anticalins、DARPins、结构域抗体、evibodies、knotins、Kunitz型结构域、maxibodies、四连凝集素、trans-bodies和V（NAR）s，如例如在由Stefan Dübel编辑的Handbook of Therapeutic Antibodies，第II卷，第7章，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim，2007中所述）、适体或小分子量化合物。

在一个方面，本发明因此涉及淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于筛选能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的用途。因此，本发明还涉及鉴定此种试剂的方法，所述方法包括步骤：a）在足以使一种或多种试剂与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的时间和条件下，使一种或多种目的试剂暴露于本文描述的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物；和b）鉴定与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的那些试剂。

在另一个方面，本发明涉及淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于在包括能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的制剂中富集所述试剂的用途。因此，本发明还涉及在包括所述试剂的制剂中富集此种试剂的方法，所述方法包括步骤：a）在足以使试剂与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的时间和条件下，使包括能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的制剂暴露于淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物；和b）获得富集形式的试剂。更特别地，淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物可以是固定化的（例如在树脂上），这允许试剂被捕获。获得富集形式的试剂随后可以包括使捕获的试剂解吸，优选以这样的方式，从而使得使捕获的试剂解吸包括使捕获的试剂与高盐缓冲液或酸性溶液接触。通过对商业免疫球蛋白制剂如IVIG或Octagam?（Octapharma Inc. Vienna，奥地利）实施这种方法，这种方法可以例如用于富集如本文描述的自身抗体。认为这些免疫球蛋白制剂包含针对Aβ的自身抗体，并且通过处理受试者，人们升高其体内的抗Aβ抗体水平。就所述自身抗体富集的制剂将预期更有效。

在进一步的方面，本发明因此涉及淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于提供与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体的用途。因此，本发明还涉及用于提供结合如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的抗体的方法，所述方法包括：

a）提供包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的抗原；

b）使抗体谱或潜在抗体谱暴露于所述抗原；和

c）从所述谱中选择与所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体。

此处应当理解“潜在抗体谱”指氨基酸或相应核酸序列的任何文库、收集、装配或集合，或可以用于在体内或在体外生产抗体谱的此种氨基酸序列文库、收集、装配或集合的任何发生器。在本发明的优选实施方案中，发生器是动物的适应性免疫系统，特别是哺乳动物的免疫系统的抗原生产部分，所述哺乳动物通过本领域技术人员众所周知的重组过程生成抗体多样性。在本发明的另一个优选实施方案中，发生器是用于大量生产随机核酸序列的系统，随后通过插入合适的抗体构架内，所述核酸序列可以用于在体外生产抗体谱。

在本发明的优选实施方案中，通过用所述抗原免疫接种生物，使抗体谱或潜在抗体谱在体内暴露于抗原。在本发明的另一个优选实施方案中，潜在抗体谱是合适核酸的文库，通过如本领域描述的体外亲和力筛选，例如噬菌体展示和淘选（panning）系统，使其暴露于抗体。

在另一个方面，本发明还提供了与如本文定义的Aβ（X – 38 .. 43）淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体。

在本发明的优选实施方案中，抗体可通过这样的方法获得，所述方法包括如本文描述的从谱或潜在谱选择抗体。

根据特别优选的实施方案，本发明提供了淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物特异性抗体。这些特别包括与对于本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物相比较，对于单体和fibrillomeric形式的Aβ肽具有相当更小的亲和力的抗体。在特定实施方案中，当它在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，抗体被说成特异性结合抗原。

在本发明的优选实施方案中，抗体与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的亲和力为抗体与单体Aβ（1-42）的结合亲和力的至少2倍，例如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，例如至少20倍，至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，例如至少200倍，至少300倍或至少500倍，且甚至更加优选至少1000倍，例如至少2000倍，至少3000倍或至少5000倍，甚至更加优选至少10000倍，例如至少20000倍，至少30000倍或至少50000倍，并且最优选至少100000倍。

在本发明的优选实施方案中，抗体与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的亲和力为抗体与单体Aβ（1-40）的结合亲和力的至少2倍，例如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，例如至少20倍，至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，例如至少200倍，至少300倍或至少500倍，且甚至更加优选至少1000倍，例如至少2000倍，至少3000倍或至少5000倍，甚至更加优选至少10000倍，例如至少20000倍，至少30000倍或至少50000倍，并且最优选至少100000倍。

方便地，本发明的抗体以低亲和力与一种或更优选地两种单体结合，最优选以1x10^-8 M的K_D或更小亲和力，例如以3x10^-8 M的K_D或更小亲和力，以1x10^-7 M的K_D或更小亲和力，例如以3x10^-7 M的K_D或更小亲和力，或以1x10^-6 M的K_D或更小亲和力，例如以3x10^-5 M的K_D或更小亲和力，或以1x10^-5 M的K_D或更小亲和力。

在本发明的优选实施方案中，抗体与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的亲和力为抗体与fibrillomeric Aβ（1-42）的结合亲和力的至少2倍，例如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，例如至少20倍，至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，例如至少200倍，至少300倍或至少500倍，且甚至更加优选至少1000倍，例如至少2000倍，至少3000倍或至少5000倍，甚至更加优选至少10000倍，例如至少20000倍，至少30000倍或至少50000倍，并且最优选至少100000倍。

在本发明的优选实施方案中，抗体与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的亲和力为抗体与fibrillomeric Aβ（1-40）的结合亲和力的至少2倍，例如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，例如至少20倍，至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，例如至少200倍，至少300倍或至少500倍，且甚至更加优选至少1000倍，例如至少2000倍，至少3000倍或至少5000倍，甚至更加优选至少10000倍，例如至少20000倍，至少30000倍或至少50000倍，并且最优选至少100000倍。

方便地，本发明的抗体以低亲和力与一种或更优选地两种原纤维结合，最优选以1x10^-8 M的K_D或更小亲和力，例如以3x10^-8 M的K_D或更小亲和力，以1x10^-7 M的K_D或更小亲和力，例如以3x10^-7 M的K_D或更小亲和力，或以1x10^-6 M的K_D或更小亲和力，例如以3x10^-5 M的K_D或更小亲和力，或以1x10^-5 M的K_D或更小亲和力。

本发明的抗体优选是分离的抗体。“分离的抗体”意指具有如上所述的结合亲和力且基本上不含具有不同结合亲和力的其他抗体的抗体。术语“基本上不含”在此处指抗体制剂，其中至少95％的抗体、优选至少98％的抗体且更优选至少99％的抗体具有所需结合亲和力。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学试剂。

本发明的分离的抗体包括单克隆抗体。如本文使用的，“单克隆抗体”意指抗体分子的制剂，共享共同重链和共同轻链氨基酸序列的抗体，与包含具有不同氨基酸序列的抗体混合物的“多克隆”抗体制剂形成对比。单克隆抗体可以通过几种新技术如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，以及通过由杂交瘤衍生抗体例示的传统方法来生成（例如，通过由杂交瘤技术制备的杂交瘤分泌的抗体，例如标准Kohler和Milstein杂交瘤方法（（1975）Nature 256:495-497）。因此，具有均一序列的非杂交瘤衍生的抗体在本文中仍被称为单克隆抗体，尽管它可能已通过非传统方法获得，并且术语“单克隆”不限于杂交瘤衍生的抗体，还用于指衍生自一个核酸克隆的所有抗体。

因此，本发明的单克隆抗体包括重组抗体。术语“重组”在此处指2个否则分开的序列区段的任何人工组合，例如通过化学合成或通过经由遗传工程技术处理分离的核酸区段。特别地，术语“重组抗体”指通过重组方法生产、表达、生成或分离的抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体文库中分离的抗体；从由于人免疫球蛋白基因而是转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见例如，Taylor，L.D.，等人（1992）Nucl. Acids Res. 20:6287-6295）；或以任何其他方式生产、表达、生成或分离的抗体，其中特定免疫球蛋白基因序列（例如人免疫球蛋白基因序列）与其他DNA序列一起装配。重组抗体包括例如嵌合、CDR嫁接和人源化抗体。本领域技术人员将知道常规杂交瘤衍生的单克隆抗体在异源系统中的表达将需要重组抗体的生成，即使所得到的抗体蛋白质的氨基酸序列不改变或预期改变。

在本发明的具体实施方案中，抗体是人源化抗体。

根据多个实施方案，抗体可以包括整个衍生自单个物种的氨基酸序列，例如人抗体或小鼠抗体。根据其他实施方案，抗体可以是嵌合抗体或CDR嫁接抗体或其他形式的人源化抗体。

术语“抗体”意指由4条多肽链――2条重（H）链和2条轻（L）链组成的免疫球蛋白分子。链通常经由二硫键彼此连接。每条重链由所述重链的可变区（本文缩写为HCVR或VH）和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由3个结构域――CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由所述轻链的可变区（本文缩写为LCVR或VL）和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL结构域组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区（CDRs）的高变区，且由称为构架区（FR）的保守区域点缀。每个VH和VL区因此由3个CDRs和4个FRs组成，其从N末端到C末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。这种结构是本领域技术人员众所周知的。

术语抗体的“抗原结合部分”（或简单地“抗体部分”）指本发明抗体的一个或多个片段，所述一个或多个片段仍具有如上定义的结合亲和力。已显示完整抗体的片段能够执行抗体的抗原结合功能。依照术语抗体的“抗原结合部分”，结合片段的例子包括（i）Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F（ab’）₂片段，即包括在铰链区中经由二硫键彼此连接的2个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的FL和VH结构域组成的Fv片段；（v）由VH结构域或由VH、CH1、CH2、DH3或VH、CH2、CH3组成的dAb片段（Ward等人（1989）Nature 341:544-546）；和（vi）分离的互补性决定区（CDR）。尽管Fv片段的2个结构域，即VL和VH，由分离的基因编码，但它们可以使用合成接头例如聚G₄S氨基酸序列和重组方法进一步彼此连接，从而使得能够将其制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区组合以形成单价分子（称为单链Fv（ScFv）；参见例如，Bird等人（1988）Science 242:423-426；和Huston等人（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883）。术语抗体的“抗原结合部分” 也意欲包括此种单链抗体。此处还同样包括了其他形式的单链抗体例如“双抗体”。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而使得2个结构域不能在相同链上组合的接头，从而迫使所述结构域与不同链的互补结构域配对，且形成2个抗原结合部位（参见例如，Holliger，P.，等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak，R.J.，等人（1994）Structure 2:1121-1123）。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。

此外，本发明的抗体或其抗原结合部分可以是更大免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子由所述抗体或抗体结合部分与一种或多种进一步蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。与此种免疫粘附分子相关的是链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov，S.M.，等人（1995）Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101），以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酰基例如六组氨酰基标签的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子（Kipriyanov，S.M.，等人（1994）Mol. Immunol. 31:1047-1058）。

术语“人抗体”指其可变和恒定区对应于或衍生自人种系的免疫球蛋白序列的抗体，如例如由Kabat等人所述（参见Kabat，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242）。然而，本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变），例如，在CDRs且特别是CDR3中。本发明的重组人抗体具有可变区，并且还可以包含衍生自人种系的免疫球蛋白序列的恒定区（参见Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242）。然而，根据具体实施方案，对此种重组人抗体实施体外诱变（或体细胞体内诱变，如果使用由于人Ig序列而是转基因的动物的话），从而使得重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管涉及或衍生自人种系的VH和VL序列，但在人抗体种系谱内在体内并非天然存在。根据具体实施方案，这类重组抗体是选择性诱变或回复突变或两者的结果。优选地，诱变导致对于靶的亲和力更大，和/或对于非靶结构的亲和力小于亲本抗体的那种。

术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的关于重和轻链可变区的序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。

术语“CDR嫁接的抗体”指包括来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列由另一个物种的CDR序列置换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs（例如，CDR3）已由人CDR序列置换。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其包含来自非人物种（例如，小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼科成员（camelid）、绵羊或山羊）的重和轻链可变区的序列，但其中VH和/或VL序列的至少一个部分已改变，以便更“人样”，即更类似于人种系的可变序列。一类人源化抗体是CDR嫁接抗体，其中人CDR序列已插入非人VH和VL序列内，以置换相应非人CDR序列。

本发明的生产抗体的方法在下文描述。此处在体内方法、体外方法或两者的组合之间存在差异。

本发明的生产抗体的一些方法在下文描述。此处在体内方法、体外方法或两者的组合存在差异。

体内方法

依赖于所需抗体的类型，各种宿主动物可以用于体内免疫接种。可以使用自身表达内源形式的目的抗原的宿主。可替代地，可能使用在内源形式的目的抗原中已造成缺陷的宿主。例如，在相应内源基因上经由同源重组在特定内源蛋白质中已造成缺陷的小鼠（即，敲除小鼠）已显示生成针对它们已用其免疫接种的蛋白质的体液应答，并且因此能够用于生产针对蛋白质的高亲和力单克隆抗体（参见例如，Roes，J.等人（1995）J. Immunol. Methods 183:231-237；Lunn，M.P.等人（2000）J. Neurochem. 75:404-412）。

多种非人哺乳动物是用于抗体生产的合适宿主，以生产本发明的非人抗体。它们包括小鼠、大鼠、鸡、骆驼科成员、兔、绵羊或山羊（及其敲除形式），尽管对于杂交瘤的生产，优先是小鼠。此外，表达人抗体谱的非人宿主动物可以用于生产具有双重特异性的针对人抗原的基本上人抗体。这类非人动物包括具有人免疫球蛋白转基因的转基因动物（例如小鼠）（嵌合hu-PBMC SCID小鼠）和在下文更详细描述的人/小鼠照射嵌合体。

根据一个实施方案，用淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物免疫接种的动物是非人哺乳动物，优选小鼠，其由于人免疫球蛋白基因而是转基因的，从而使得所述非人哺乳动物在抗原刺激后制造人抗体。一般地，将关于具有人种系构型的重和轻链的免疫球蛋白转基因引入此种动物内，所述动物已改变，从而使得其内源重和轻链基因座是无活性的。如果此种动物用抗原（例如，用人抗原）进行刺激，那么产生衍生自人免疫球蛋白序列的抗体（人抗体）。可能借助于标准杂交瘤技术由此种动物的淋巴细胞制备人单克隆抗体。关于具有人免疫球蛋白的转基因小鼠及其在人抗体生产中的用途的进一步描述，参见例如，US 5,939,598、WO 96/33735、WO 96/34096、WO 98/24893和WO 99/53049（Abgenix Inc.），以及US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US 5,770,429、US 5,814,318、US 5,877,397和WO 99/45962（Genpharm Inc.）；还参见MacQuitty，J.J.和Kay，R.M.（1992）Science 257:1188；Taylor，L.D.等人（1992）Nucleic Acids Res. 20:6287-6295；Lonberg，N.等人（1994）Nature 368:856-859；Lonberg，N.和Huszar，D.（1995）Int. Rev. Immunol. 13:65-93；Harding，F.A.和Lonberg，N.（1995）Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546；Fishwild，D. M.等人（1996）Nature Biotechnology 14:845-851；Mendez，M. J.等人（1997）Nature Genetics 15:146-156；Green，L.L.和Jakobovits，A.（1998）J. Exp. Med. 188:483-495；Green，L.L.（1999）J. Immunol. Methods 231:11-23；Yang，X.D.等人（1999）J. Leukoc. Biol. 66:401-410；Gallo，M.L.等人（2000）Eur. J. Immunol. 30:534-540。

根据另一个实施方案，用淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物免疫接种的动物可以是具有重度联合免疫缺陷（SCID）的小鼠，其已用人外周血单核细胞或淋巴样细胞或其前体重建。被称为嵌合hu-PBMC SCID小鼠的此种小鼠在抗原刺激后产生人免疫球蛋白应答，如已证明的。关于这些小鼠及其用于生成抗体的进一步描述，参见例如，Leader，K.A.等人（1992）Immunology 76:229-234；Bombil，F.等人（1996）Immunobiol. 195:360-375；Murphy，W.J.等人（1996）Semin. Immunol. 8:233-241；Herz，U.等人（1997）Int. Arch. Allergy Immunol. 113:150-152；Albert，S.E.等人（1997）J. Immunol. 159:1393-1403；Nguyen，H.等人（1997）Microbiol. Immunol. 41:901-907；Arai，K.等人（1998）J.Immunol.Methods 217:79-85；Yoshinari，K.和Arai，K.（1998）Hybridoma 17:41-45；Hutchins，W.A.等人（1999）Hybridoma 18:121-129；Murphy，W.J.等人（1999）Clin. Immunol. 90:22-27；Smithson，S.L.等人（1999）Mol. Immunol. 36:113-124；Chamat，S.等人（1999）J. Infect. Diseases 180:268-277；和Heard，C.等人（1999）Molec. Med. 5:35-45。

根据另一个实施方案，用淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物免疫接种的动物是这样的小鼠，其已用致死剂量的全身照射处理，随后用来自具有重度联合免疫缺陷（SCID）的小鼠的骨髓细胞保护不受辐射，并且随后用功能人淋巴细胞进行移植。这类嵌合体，被称为Trimera系统，用于生产人单克隆抗体，这通过用目的抗原免疫接种所述小鼠且随后通过使用标准化杂交瘤技术产生单克隆抗体来实现。关于这些小鼠及其用于生成抗体的进一步描述，参见例如，Eren，R.等人（1998）Immunology 93:154-161；Reisner，Y和Dagan，S.（1998）Trends Biotechnol. 16:242-246；Ilan，E.等人（1999）Hepatology 29:553-562；和Bocher，W.O.等人（1999）Immunology 96:634-641。

从体内生成的抗体生产细胞开始，单克隆抗体可以借助于标准技术来生产，例如最初由Kohler和Milstein（1975，Nature 256:495-497）描述的杂交瘤技术（还参见Brown等人（1981）J. Immunol 127:539-46；Brown等人（1980）J Biol Chem 255:4980-83；Yeh等人（1976）PNAS 76:2927-31；和Yeh等人（1982）Int. J. Cancer 29:269-75）。生产单克隆抗体杂交瘤的技术是充分知道的（一般参见R. H. Kenneth，in Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，New York（1980）；E. A. Lerner（1981）Yale J. Biol. Med.，54:387-402；M. L. Gefter等人（1977）Somatic Cell Genet.，3:231-36）。简言之，使无限增殖化细胞系（一般是骨髓瘤）与哺乳动物的淋巴细胞（一般是脾细胞或淋巴结细胞或外周血淋巴细胞）融合，所述哺乳动物用本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物进行免疫接种，并且筛选所得到的杂交瘤细胞的培养上清液，以鉴定生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤。用于使淋巴细胞和无限增殖化细胞系融合的许多众所周知规程中的任何一种都可以应用于这个目的（还参见G. Galfre等人（1977）Nature 266:550-52；上文引用的Gefter等人Somatic Cell Genet.；上文引用的Lerner, Yale J. Biol. Med.; 上文引用的Kenneth，Monoclonal Antibodies）。此外，技术人员将认识到存在同样有用的此种方法的不同变化。一般地，无限增殖化细胞系（例如，骨髓瘤细胞系）衍生自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，通过使来自用本发明的免疫原性制剂免疫接种的小鼠的淋巴细胞与无限增殖化小鼠细胞系融合，可以确立鼠杂交瘤。优选的无限增殖化细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，其对于包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基（HAT培养基）敏感。许多骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以默认用作融合配偶体，例如，P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心（ATCC），Rockville，MD获得。一般地，使用聚乙二醇（PEG）使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。由融合产生的杂交瘤细胞随后使用HAT培养基进行选择，从而杀死未融合和非生产性融合的骨髓瘤细胞（未融合的脾细胞在几天后死亡，因为它们未转化）。通过就此种抗体筛选杂交瘤培养上清液，例如通过使用斑点印迹测定，鉴定生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞，以选择具有如本文定义的结合亲和力的那些抗体。

同样，所述杂交瘤可以用作编码轻和/或重链的核酸来源，以重组生产本发明的抗体，如下文进一步详细描述的。

体外方法

作为通过免疫接种和选择生产本发明的抗体的替代方法，通过用淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物筛选重组组合免疫球蛋白文库，以从而分离具有所需结合亲和力的免疫球蛋白文库成员，可以鉴定且分离本发明的抗体。用于生成且筛选展示文库的试剂盒是商购可得的（例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^? Phage Display Kit，目录号240612）。在许多实施方案中，展示文库是scFv文库或Fab文库。用于筛选重组抗体文库的噬菌体展示技术已得到充分描述。可以特别有利地用于生成且筛选抗体展示文库的方法和化合物的例子可以在例如下述中发现：McCafferty等人WO 92/01047、US 5,969,108和EP 589 877（特别描述scFv展示），Ladner等人US 5,223,409、US 5,403,484、US 5,571,698、US 5,837,500和EP 436 597（例如描述pIII融合物）；Dower等人WO 91/17271、US 5,427,908、US 5,580,717和EP 527 839（特别描述Fab展示）；Winter等人国际公开WO 92/20791和EP 368,684（特别描述用于可变免疫球蛋白结构域的序列克隆）；Griffiths等人US 5,885,793和EP 589 877（特别描述通过使用重组文库分离针对人抗原的人抗体）；Garrard等人WO 92/09690（特别描述噬菌体表达技术）；Knappik等人WO 97/08320（描述人重组抗体文库HuCal）；Salfeld等人WO 97/29131,（描述针对人抗原（人肿瘤坏死因子α）的重组人抗体的生产以及重组抗体的体外亲和力成熟）和Salfeld等人美国临时申请号60/126,603和基于此的专利申请（同样描述针对人抗原（人白细胞介素-12）的重组人抗体的生产以及重组抗体的体外亲和力成熟）

筛选重组抗体文库的进一步描述可以在科学出版物中发现，例如Fuchs等人（1991）Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人（1992）Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等人（1989）Science 246:1275-1281；Griffiths等人（1993）EMBO J 12:725-734；Hawkins等人（1992）J Mol Biol 226:889-896；Clarkson等人（1991）Nature 352:624-628；Gram等人（1992）PNAS 89:3576-3580；Garrard等人（1991）Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人（1991）Nuc Acid Res 19:4133-4137；Barbas等人（1991）PNAS 88:7978-7982；McCafferty等人Nature（1990）348:552-554；和Knappik等人（2000）J. Mol. Biol. 296:57-86。

作为使用噬菌体展示系统的替代方法，重组抗体文库可以在酵母细胞或细菌细胞表面上表达。WO 99/36569描述了制备且筛选在酵母细胞表面上表达的文库的方法。WO 98/49286更详细描述了制备且筛选在细菌细胞表面上表达的文库的方法。

在所有体外方法中，用于富集具有所需性质的重组抗体的选择过程构成过程的整合部分，这一般被称为“淘选”，并且通常采取在柱上亲和层析的形式，靶结构已与所述柱的基质附着。随后对有希望的候选物分子实施其绝对和/或相对亲和力的个别测定，优选借助于标准斑点印迹测定，如上所述。

如技术人员可认识到的，用于选择和富集的此种体外方法也可以应用于获得非免疫球蛋白相关抗原结合部分。

一旦已鉴定且充分表征组合文库的目的抗体，就借助于标准化分子生物学技术分离编码所述抗体的轻和重链的DNA序列，例如借助于来自展示包（例如，噬菌体）的DNA的PCR扩增，所述DNA已在文库筛选过程中分离。可以用于制备PCR引物的关于轻和重抗体链的基因的核苷酸序列是技术人员已知的。多个此种序列例如在Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242和人种系VBASE序列数据库中得到描述。

本发明的抗体或抗体结合部分可以通过在宿主细胞中重组表达关于轻和重免疫球蛋白链的基因进行生产。为了重组表达抗体，用携带编码所述抗体的轻和重免疫球蛋白链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，从而在宿主细胞中表达轻和重链，并且优选将它们分泌到所述宿主细胞在其中培养的培养基内。可以从这种培养基中分离抗体。使用标准重组DNA方法以获得关于重和轻抗体链的基因，将所述基因插入重组表达载体内，并且将所述载体引入宿主细胞内。这类方法例如在Sambrook，Fritsch和Maniatis（编辑），Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.,（1989），Ausubel，F.M.等人（编辑）Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates,（1989）和Boss等人的US 4,816,397中得到描述。

一旦已获得编码目的抗体的VH和VL区段的DNA片段，所述DNA片段就可以使用标准化重组DNA技术进行进一步处理，例如以将关于可变区的基因转变为关于全长抗体链的基因，关于Fab片段的基因或scFv基因。这些处理包括使编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一个DNA片段可操作地连接，所述另一种蛋白质例如恒定抗体区或柔性接头。术语“可操作地连接”在此处应理解为意指2个DNA片段以这样的方式连接，从而使得由所述2个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内。

通过使编码VH区的DNA与编码重链恒定区（CH1、CH2和CH3）的另一个DNA分子可操作地连接，编码VH区的分离的DNA可以转变为关于全长重链的基因。人重链恒定区基因的序列是众所周知的（参见例如，Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242），并且跨越所述区域的DNA片段可以借助于标准化PCR扩增来获得。重链恒定区可以是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgE或IgD的恒定区，其中优选来自IgG的恒定区，特别是IgG1或IgG4。为了获得关于重链Fab片段的基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链恒定区CH1的另一个DNA分子可操作地连接。

通过使编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，编码VL区的分离的DNA可以转变为关于全长轻链的基因（和关于Fab轻链的基因）。人轻链恒定区基因的序列是众所周知的（参见Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242），并且跨越所述区域的DNA片段可以借助于标准化PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是恒定κ或λ区，恒定κ区是优选的。

为了生成scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以与编码柔性接头的另一个片段可操作地连接，所述柔性接头例如氨基酸序列（Gly₄-Ser）₃，从而使得VH和VL序列作为连续单链蛋白质表达，其中VH和VL区经由所述柔性接头彼此连接（参见Bird等人（1988）Science 242:423-426；Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，Nature（1990）348:552-554）。

具有如上所述的结合亲和力的单结构域VH和VL可以通过上述方法从单结构域文库中分离。具有所需结合亲和力的2条VH单结构域链（含或不含CH1）或2条VL链或1条VH链和1条VL链对可以如本文描述的用于本发明的抗体。

为了表达本发明的重组抗体或抗体部分，可以将编码部分或全长轻和重链的DNAs插入表达载体内，以便使基因与合适的转录和翻译控制序列可操作地连接。在这个背景下，术语“可操作地连接”应理解为意指抗体基因在载体中以这样的方式连接，从而使得载体内的转录和翻译控制序列实现其调节所述抗体基因转录和翻译的预期功能。

方便地，这样选择表达载体和表达控制序列，以便与所使用的表达宿主细胞相容。关于抗体轻链的基因和关于抗体重链的基因可以插入分开的载体内，或两种基因插入相同表达载体内，这是通常情况。借助于标准化方法（例如通过在抗体基因片段和载体上的互补限制切割位点的连接，或如果不存在限制切割位点，那么通过平端的连接），将抗体基因插入表达载体内。在插入关于轻和重链的序列前，表达载体可以已携带关于抗体恒定区的序列。例如，一种方法是将VH和VL序列转变为全长抗体基因，这通过将其插入已编码重和分别地轻链恒定区的表达载体内，从而使VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接，以及使VL区段与载体内的CL区段可操作地连接来实现。

另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。关于所述抗体链的基因可以克隆到载体内，从而使信号肽在框内与关于抗体链的基因的N末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽（即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽）。除关于抗体链的基因外，本发明的表达载体可以具有控制关于抗体链的基因在宿主细胞中表达的调节序列。

术语“调节序列”意欲包括控制关于抗体链的基因转录或翻译的启动子、增强子和进一步的表达控制元件（例如多腺苷酸化信号）。这类调节序列例如在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA（1990）中得到描述。技术人员将认识到包括调节序列选择的表达载体设计可以依赖于这样的因素，例如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质的所需表达强度等。用于在哺乳动物宿主细胞中表达的优选调节序列包括导致在哺乳动物细胞中的强和组成型蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒（CMV）的启动子和/或增强子（例如，CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（例如SV40启动子/增强子）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））和多瘤。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，给予Stinski的US 5,168,062，给予Bell等人的US 4,510,245，和给予Schaffner等人的US 4,968,615。

除关于抗体链的基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可以具有另外序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的那些（例如，复制起点）和选择标记基因。选择标记基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择（参见例如，全部给予Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017）。例如，选择标记基因致使载体已插入其内的宿主细胞对于细胞毒性药物有抗性是常见的，所述细胞毒性药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的选择标记基因包括关于二氢叶酸还原酶（DHFR）的基因（与氨甲蝶呤选择/扩增一起用于在dhfr^-宿主细胞中使用）和neo基因（用于G418选择）。

对于轻和重链的表达，借助于标准化技术将编码所述重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优先在真核细胞中且特别在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，这是因为正确折叠且免疫学活性的抗体被装配且分泌的可能性在此种真核细胞且特别是哺乳动物细胞中高于在原核细胞中。抗体基因的原核表达已报告为对于活性抗体的高得率生产无效（Boss，M.A.和Wood，C. R.（1985）Immunology Today 6:12-13）。

用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞（包括在Urlaub和Chasin,（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述的dhfr^- CHO细胞，这连同DHFR选择标记一起使用，如例如在R.J. Kaufman和P.A. Sharp（1982）Mol. Biol. 159:601-621中描述的）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过培养宿主细胞直至抗体在所述宿主细胞中表达时生产抗体，或优选地抗体被分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗体随后可以通过使用标准化蛋白质纯化方法从培养基中分离。

同样可能使用宿主细胞以生产完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。上述程序的变化当然包括在本发明中。例如，可能希望用编码本发明抗体的轻链或重链（但并非两者）的DNA转染宿主细胞。如果存在对于结合目的抗原不需要的轻或重链，那么编码此种轻链或此种重链或两者的DNA可以借助于重组DNA技术部分或全部去除。由此种截短的DNA分子表达的分子同样包括在本发明的抗体内。此外，通过借助于标准化化学方法使本发明的抗体与第二抗体交联，可能生产双功能抗体，其中重链和轻链是本发明的抗体，并且另一条重链和另一条轻链对于不同于目的抗原的抗原具有特异性。

在用于本发明抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，借助于磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr^- CHO细胞内。在重组表达载体内，关于重和轻抗体链的基因在每种情况下与调节CMV增强子/AdMLP-启动子元件可操作地连接，以实现所述基因的强转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其可以用于通过使用氨甲蝶呤选择/扩增选择用载体转染的dhfr^- CHO细胞。这样培养所选择的转化宿主细胞，从而使得重和轻链抗体链被表达，并且从培养基中分离完整抗体。使用标准化分子生物学技术以制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养所述宿主细胞，且从培养基中获得抗体。因此，本发明还提供了合成本发明的重组抗体的方法，这通过在合适培养基中培养本发明的宿主细胞，直至已合成本发明的重组抗体来实现。该方法可以进一步包括从所述培养基中分离所述重组抗体。

作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代方法，技术人员已知的其他方法可以用于筛选大型组合文库，以鉴定本发明的抗体。基本上，可以采用任何表达系统，其中在核酸和由此编码的抗体之间确立封闭物理连接，且可以用于借助于它编码的抗体性质选择合适核酸序列。

在一类可替代的表达系统中，重组抗体文库以RNA-蛋白质融合物的形式表达，如给予Szostak和Roberts的WO 98/31700，和Roberts，R.W.和Szostak，J.W.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中所述。在这种系统中，在其3'末端上携带嘌呤霉素（肽基受体抗生素）的合成mRNAs的体外翻译，生成mRNA和由其编码的肽或蛋白质的共价融合物。因此，mRNAs的复杂混合物（例如组合文库）的特定mRNA可以根据所编码的肽或蛋白质（例如抗体或其部分）的性质进行浓缩，例如所述抗体或其所述部分与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的结合。编码抗体或其部分且通过筛选此种文库获得的核酸序列可以通过重组方法以上述方式（例如在哺乳动物宿主细胞中）表达，并且可以另外实施进一步的亲和力成熟，这通过在进一步轮次中筛选mRNA-肽融合物，将突变引入一个或多个最初选择的序列内，或使用上述方式的重组抗体体外亲和力成熟的其他方法来实现。

体内和体外方法的组合

本发明的抗体同样可以使用体内和体外方法的组合进行生产，例如这样的方法，其中首先允许淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物在体内作用于宿主动物内的抗体谱，以刺激淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合抗体的生产，并且随后借助于一种或多种体外技术实现进一步的抗体选择和/或抗体成熟（即，最佳化）。根据一个实施方案，这类组合方法可以包括首先用所述寡聚物或衍生物免疫接种非人动物（例如，小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼科成员、绵羊或山羊或其转基因形式或嵌合小鼠），以刺激针对抗原的抗体应答，并且随后通过使用淋巴细胞的免疫球蛋白序列制备且筛选噬菌体展示抗体文库，所述淋巴细胞已通过所述寡聚物或衍生物的作用在体内得到刺激。这种组合程序的第一个步骤可以以上文关于体内方法所述的方式执行，而这种程序的第二个步骤可以以上文关于体外方法所述的方式执行。超免疫接种（hyperimmunizing）非人动物随同由所述受刺激的淋巴细胞制备的噬菌体展示文库的后续体外筛选的优选方法包括由BioSite Inc.描述的那些，参见例如，WO 98/47343、WO 91/17271、US 5,427,908和US 5,580,717。

根据另一个实施方案，组合方法包括首先用本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物免疫接种非人动物（例如，小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼科成员、绵羊、山羊或其敲除和/或转基因形式、或嵌合小鼠），以刺激针对所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的抗体应答，并且通过筛选杂交瘤（例如由免疫接种的动物制备的）选择生产具有所需特异性的抗体的淋巴细胞。从所选克隆中分离关于抗体或单结构域抗体的基因（借助于标准化克隆方法，例如逆转录酶聚合酶链反应），并且对其实施体外亲和力成熟，以从而改善一种或多种所选抗体的结合性质。这种程序的第一个步骤可以以上文关于体内方法所述的方式执行，而这种程序的第二个步骤可以以上文关于体外方法所述的方式执行，特别通过使用体外亲和力成熟方法，例如在WO 97/29131和WO 00/56772中描述的那些。

在进一步的组合方法中，重组抗体由个别分离的淋巴细胞生成，这通过使用技术人员称为选择淋巴细胞抗体法（SLAM）以及在US 5,627,052、WO 92/02551和Babcock，J.S.等人（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中描述的程序来实现。在这种方法中，首先在体内用淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物免疫接种非人动物（例如，小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼科成员、绵羊、山羊或其转基因形式、或嵌合小鼠），以刺激针对所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的免疫应答，并且随后通过使用抗原特异性溶血斑（haemolytic plaque）测定来选择分泌目的抗体的个别细胞。为此，使用接头例如生物素，可以使球聚物或其衍生物或结构上相关的目的分子与绵羊红细胞偶联，从而使得可能通过使用溶血斑测定鉴定分泌具有合适特异性的抗体的个别细胞。在鉴定分泌目的抗体的细胞后，通过逆转录酶PCR从细胞获得轻和重链的可变区的cDNAs，并且随后所述可变区可以与合适的免疫球蛋白恒定区（例如，人恒定区）结合在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达。随后通过展开转染的细胞，可以对用衍生自体内选择的淋巴细胞的扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞实施进一步的体外分析和体外选择，例如以分离表达具有结合亲和力的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列可以另外在体外进行处理。

基本上如上所述通过执行斑点印迹可以选择具有本文定义的所需亲和力的抗体。简言之，使抗原与固体基质附着，优选在连续稀释中点在硝酸纤维素膜上。随后使固定的抗原与目的抗体接触，随后借助于酶缀合的第二抗体和比色反应检测后者；在限定的抗体和抗原浓度下，结合的抗体量允许亲和力测定。因此，2种不同抗体与1种靶或1种抗体与2种不同靶的相对亲和力，在此处定义为在其他方面等同的斑点印迹条件下用2种抗体-靶组合观察到的靶结合的抗体的各自量的关系。

通过使用常规技术例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以由完整抗体生产抗体部分例如Fab和F（ab’）₂片段。此外，通过使用标准化重组DNA技术可以获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。

在进一步的方面，本发明还涉及本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于提供适体的用途，所述适体与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合（下文也称为抗淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物适体）。因此，本发明还涉及用于提供对于如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物具有特异性的适体的方法，所述方法包括至少步骤

a）提供包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的结合靶；

b）使适体谱或潜在适体谱暴露于所述结合靶；和

c）从所述谱中选择与所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物特异性结合的适体。

“适体”在此处指能够与其靶特异性、非共价结合的寡核酸（oligonucleic acid）或肽分子。适体优选包括肽、DNA或RNA序列，更优选约3 – 100个单体的肽、DNA或RNA序列，其可以在一个末端或两个末端上与较大分子附着，优选介导生物化学功能的较大分子，更优选诱导灭活和/或降解的较大分子，最优选泛蛋白，或优选促进破坏的较大分子，更优选酶或荧光蛋白质。

此处应当理解“潜在适体谱”指氨基酸序列或核酸序列的任何文库、收集、装配或集合，或可以用于在体内或在体外生产适体谱的氨基酸序列文库、收集、装配或集合的任何发生器。

在另一个方面，本发明还提供了与如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的适体。

在本发明的优选实施方案中，适体可通过这样的方法获得，所述方法包括如本文描述的从谱或潜在谱中选择适体。

根据特别优选的实施方案，本发明提供了淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物特异性适体。这些特别包括与对于本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物相比较，对于单体和fibrillomeric形式的Aβ肽具有相当更小的亲和力的适体。

能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂还具有许多潜在应用，其中一些在下文中描述。它们尤其用于治疗和诊断目的。

与球聚物表位特异性结合的抗体已证明是在治疗和诊断应用中有用的试剂。因为本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物与所述抗体反应，所以淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物被认为展示相同或非常相似的表位。

因此，本发明还提供了用于治疗用途的能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。

在一个方面，本发明还提供了治疗组合物，其包括能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。根据具体实施方案，所述组合物是进一步包括药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的所述药物组合物可以另外包含至少一种另外的治疗剂，例如一种或多种另外的用于治疗本发明的试剂对于其减轻有用的疾病的治疗剂如果例如本发明的试剂与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，那么药物组合物可以另外包含对于治疗其中所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的活性重要的病症有用的一种或多种另外的治疗剂。

药学上合适的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂等，只要它们是生理学相容的。药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，优选使用等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇或山梨糖醇，或加上氯化钠。药学上合适的载体可以另外包含相对小量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的半衰期或功效。

药物组合物可以适合于例如肠胃外施用。此处，试剂优选制备为具有0.1 – 250 mg/ml的试剂例如抗体含量的可注射溶液。可注射溶液可以以液体或冻干形式制备，剂型是燧石玻璃或小瓶、安瓿或填充的注射器。缓冲剂可以包含L-组氨酸（1 – 50 mM，优选5 – 10 mM），并且具有pH 5.0 – 7.0，优选6.0。进一步合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾缓冲液。可以使用氯化钠以使溶液的涨度调节至0 – 300 mM的浓度（对于液体剂型优选150 mM）。对于冻干剂型，还可以包括冷冻保护剂例如蔗糖（例如0 – 10％，优选0.5 – 1.0％）。其他合适的冷冻保护剂是海藻糖和乳糖。对于冻干剂型，还可以包括充填剂例如甘露糖醇（例如1 – 10％，优选2 – 4％）。稳定剂例如L-甲硫氨酸（例如51 – 50 mM，优选5 – 10 mM）可以在液体和冻干剂型中使用。进一步合适的充填剂是甘氨酸和精氨酸。还可以使用表面活性剂例如聚山梨醇酯80（例如0 – 0.05％，例如0.005 – 0.01％）。进一步的表面活性剂是聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。

本发明的组合物可以具有多种形式。这些包括液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液（例如可注射和可输注溶液）、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式依赖于预期施用类型和治疗应用。一般地，优选可注射或可输注溶液形式的组合物，例如类似于用于人的被动免疫接种的抗体的组合物。优选施用途径是肠胃外的（例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内）。根据优选实施方案，试剂通过静脉内输注或注射进行施用。根据另一个优选实施方案，试剂通过肌内或皮下注射进行施用。

治疗组合物一般在制备和贮存条件下必须是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高浓度活性物质的其他有序结构。无菌可注射溶液可以这样制备：通过将所需量的活性化合物（即试剂，例如抗体）引入合适溶剂中，需要时，合适时连同上述成分之一或组合，并且随后使所述溶液过滤灭菌。分散体通常这样制备：通过将活性化合物引入包含基本分散介质以及合适的其他所需成分的无菌载体内。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，真空干燥和喷雾干燥是优选制备方法，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和合适的进一步所需成分的粉末。溶液的正确流动性可以这样得到维持：通过使用例如包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小或使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过另外将延迟吸收的试剂引入组合物内来达到，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。

本发明的试剂可以通过技术人员已知的多种方法进行施用，尽管用于许多治疗应用的优选施用类型是皮下注射、静脉内注射或输注。技术人员将认识到施用途径和/或类型依赖于所需结果。根据具体实施方案，活性化合物可以用保护化合物免于快速释放的载体进行制备，例如具有持续释放或控释的制剂，其包括植入物、经皮贴剂和微囊化释放系统。可以使用生物学可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此种制剂的方法是技术人员众所周知的；参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

根据具体实施方案，本发明的试剂可以经口施用，例如在惰性稀释剂或可代谢的食用载体中。试剂（和若需要进一步的成分）也可以封装在硬或软明胶胶囊中，压缩成片剂或直接加入食物中。对于经口治疗施用，试剂可以与赋形剂混合，并且以经口片剂、口腔含化片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆等的形式使用。如果预期经由除肠胃外途径外的途径施用本发明的试剂，那么可能需要从阻止其灭活的材料中选择包衣。

在进一步的方面，本发明提供了能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂用于制备治疗或预防淀粉样变性的药物组合物的用途。

在本发明的优选实施方案中，药物组合物用于被动免疫接种。

因此，本发明还提供了治疗或预防有此需要的受试者中的淀粉样变性的方法，其包括给受试者施用能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。

在本发明的优选实施方案中，施用能够与Aβ（本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂用于针对淀粉样变性给受试者被动免疫接种。

生物样品的筛选揭示此种样品可能包含与试剂反应的物质，所述试剂能够与淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，例如本发明的抗淀粉状蛋白β肽类似物或抗寡聚物抗体。与所述试剂具有特定结合亲和力但不能被说成与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物对应的此种物质，在下文中被称为包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原。

因此，能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂也能够在体外和体内检测包括它们与之结合的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原。所述试剂因此可以用于检测所述抗原，例如衍生自怀疑具有淀粉样变性的受试者的样品，或在怀疑具有淀粉样变性的受试者中，例如人个体或其他哺乳动物。

本发明因此还提供了用于诊断用途的能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂。

在一个方面，本发明提供了包括试剂的诊断组合物，所述试剂能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合。根据具体实施方案，所述组合物是进一步包括药学上可接受的载体的药物组合物。

在进一步的方面，本发明提供了能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂用于制备诊断淀粉样变性的组合物的用途。

因此，本发明还提供了诊断淀粉样变性的方法，其包括提供来自怀疑具有淀粉样变性的受试者的样品，在足以形成包括试剂（其能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合）和抗原（其包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位）的复合物的时间和条件下，使样品与能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂接触，所述复合物的存在指示受试者具有淀粉样变性。根据具体实施方案，至少接触样品的步骤先体外后体内且特别是在体外执行。

因此，能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂可以在多种诊断方法和测定中使用。

根据一个实施方案，诊断怀疑具有这种疾病的患者中的淀粉样变性的方法包括步骤：1）从患者中分离生物样品；2）在足以形成抗原/试剂复合物的时间和条件下，使生物样品和能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的至少一种试剂接触；和3）检测所述样品中抗原/试剂复合物的存在，所述复合物的存在指示患者中淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病的诊断。抗原是包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原。根据具体实施方案，所述步骤2）和3）中的至少一个先体外后体内且特别是在体外执行。根据进一步的具体实施方案，该方法不包括步骤1）。

根据进一步的实施方案，诊断怀疑具有这种疾病的患者中的淀粉样变性的方法包括步骤：1）从患者中分离生物样品；2）在足以形成抗体/抗原复合物的时间和条件下，使生物样品与抗原接触；3）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂之一；和4）通过检测由信号生成化合物生成的信号，检测可能存在于生物样品中的抗体的存在，所述信号指示患者中淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病的诊断。抗原是包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原。根据具体实施方案，所述步骤2）、3）和4）中的至少一个先体外后体内且特别是在体外执行。根据进一步的具体实施方案，该方法不包括步骤1）。

根据进一步的实施方案，诊断怀疑具有这种疾病的患者中的淀粉样变性的方法包括步骤：1）从患者中分离生物样品；2）在足以允许形成抗抗体/试剂复合物的时间和条件下，使生物样品与抗抗体接触，其中所述抗抗体对于能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂之一特异，所述复合物包含存在于生物样品中的试剂；3）在足以允许缀合物与结合的试剂结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗抗体/试剂复合物中，其中所述缀合物包括包含淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原，其与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；和4）检测由信号生成化合物生成的信号，所述信号指示患者中淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病的诊断。根据具体实施方案，所述步骤2）、3）和4）中的至少一个先体外后体内且特别是在体外执行。根据进一步的具体实施方案，该方法不包括步骤1）。

在本发明的一个诊断实施方案中，使能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物或其部分结合的试剂包被在固相上（或存在于液相中）。随后使测试或生物样品（例如，全血、脑脊液、血清等）与固相接触。如果抗原（例如，球聚物）存在于样品中，那么此种抗原与固相上的试剂结合，所述试剂能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，并且随后通过直接或间接方法进行检测。直接方法包括简单地检测复合物自身的存在，并且因此检测抗原的存在。在间接方法中，将缀合物添加到结合试剂中。缀合物包括第二抗体，其与结合的抗原结合，与信号生成化合物或标记附着。倘若第二抗体与结合的抗原结合，信号生成化合物就生成可测量信号。此种信号随后指示测试样品中抗原的存在。

如上文指出的，缀合物（或指示试剂）将包括与信号生成化合物或标记附着的抗体（或可能抗抗体，依赖于测定）。这种信号生成化合物或“标记”自身是可检测的，或可以与一种或多种另外化合物反应，以生成可检测产物。信号生成化合物的例子包括色原、放射性同位素（例如，125I、131I、32P、3H、35S和14C）、化学发光化合物（例如，吖啶

）、粒子（可见或荧光的）、核酸、络合剂或催化剂例如酶（例如，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶）。在酶使用（例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）的情况下，生色、荧光或发光底物的添加导致可检测信号的生成。其他检测系统例如时间分辨荧光、内部反射荧光、扩增（例如，聚合酶链反应）和拉曼光谱也是有用的。

可以通过上述免疫测定测试的生物学流体的例子包括血浆、全血、干燥全血、血清、脑脊液或组织和细胞的含水或有机-含水提取物。

试剂盒也包括在本发明的范围内。更具体而言，本发明包括用于测定受试者中包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原的存在的试剂盒。特别地，用于测定样品中所述抗原的存在的试剂盒包括a）能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂；和任选地b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的、与试剂结合的抗体的缀合物。试剂盒还可以包含对照或校准物，其包括与抗原结合的试剂。

本发明还包括用于检测样品中抗体例如自身抗体的另一类试剂盒。试剂盒可以包括a）对于能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂特异的抗体（例如抗抗体），和b）包括如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原。还包括了对照或校准物，其包括与抗原结合的试剂。更具体而言，试剂盒可以包括a）对于自身抗体特异的抗抗体，和b）包括包含如本文定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的抗原的缀合物，所述缀合物与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着。再次，试剂盒还可以包括对照或校准物，其包括与抗原结合的试剂。

由于其与试剂的结合亲和力，所述试剂能够与本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合，包括淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位的所述抗原可以在怀疑包含此种表位的制剂中进行检测，其量可以在所述制剂中进行测定，并且它们可以进行富集。因此，本发明还提供了用于在怀疑或已知包括此种表位的制剂中检测淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物表位、用于测定其量和/或用于富集其的方法。一旦检测且富集，所述物质就可以具有与本文就本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物而言描述的那些相似的潜在应用。

此外，本发明包括设计在治疗或预防患者中的淀粉样变性中有用的试剂例如抗体、非抗体生物学试剂或小分子的方法。这种方法包括步骤：a）分析本文描述的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的三维结构；b）鉴定在步骤a）的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的表面上的一种或多种表位；和c）设计将与步骤b）的一种或多种鉴定的表位结合的试剂，例如抗体、非抗体生物学试剂或小分子，所述抗体、非抗体生物学试剂或小分子待用于治疗或预防淀粉样变性。

本发明的优点

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物的氨基酸组成是定义明确且可再现的。

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物展示稳定构象。

本发明的淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物展示更佳的流体动力学性质。

用本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的自动免疫接种预期引发关于Aβ球聚物的高度选择性免疫应答。因为本发明的淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物可以容易地设计为缺乏N末端序列，所以可以消除引发非特异性N末端Aβ肽指导的免疫应答的危险。本发明的淀粉状蛋白β肽类似物和寡聚物因此能够引发区别其他形式的Aβ肽特别是单体和原纤维的免疫应答。

此外，预期用本发明的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的自动免疫接种在逆转AD转基因小鼠模型中的认知缺陷中将是有效的，这是因为引发的抗体应答可与用Aβ（20-42）截短的球聚物的自动免疫接种相比较。后者已证明逆转新物体识别任务中的缺陷。

本文提及的所有专利、专利申请和出版物在此整体引入作为参考。

保藏信息：生产单克隆抗体5F7的杂交瘤根据布达佩斯条约（Budapest Treaty）条款于2005年12月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110，并且接受名称PTA-7241。进一步地，生产单克隆抗体10F11的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2005年12月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7239。另外，生产单克隆抗体4B7的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2005年12月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7242，并且生产单克隆抗体7C6的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2005年12月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7240。另外，生产单克隆抗体6A2的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2006年2月28日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7409，并且生产单克隆抗体2F2的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2006年2月28日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7408。生产单克隆抗体4D10的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2006年2月28日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7405。生产单克隆抗体7E5的杂交瘤根据布达佩斯条条款约于2006年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7809。生产单克隆抗体10C1的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2006年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7810。生产单克隆抗体3B10的杂交瘤根据布达佩斯条约条款于2006年9月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801，并且接受名称PTA-7851。所有保藏已以Abbott Laboratories，100 Abbott Park Road，Abbott Park，Illinois 60064（US）名义进行。

所有这些单克隆抗体都是鼠单克隆抗体。

下述实施例预期举例说明本发明而不限制其范围。

实施例

实施例1：肽合成

除非另有说明，否则所有试剂如得自供应商那样使用。肽合成试剂包括二异丙基乙胺（DIEA）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二氯甲烷（DCM）、（2-（7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲阳离子六氟磷酸酯）（HATU）、2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲阳离子六氟磷酸酯）（HBTU）、1-氢化苯并三唑（HOBt）和哌啶得自Applied Biosystems，Inc.（ABI），Foster City，CA；或American Bioanalytical，Natick，MA。标准9-芴基甲氧羰基（Fmoc）氨基酸衍生物（Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Cys（ACM）-OH、Fmoc-Asp（tBu）-OH、Fmoc-Glu（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH）得自Anaspec，San Jose，CA；或ABI。Fmoc-3-氨基-1-羧甲基-吡啶-2-酮和Fmoc-顺式-3-苯基-吡咯烷-2-羧酸得自NeoSystem，Strasbourg，法国。肽合成树脂（Fmoc-Ala-PEG聚苯乙烯树脂、Fmoc-Ala-Wang树脂、Rink酰胺MBHA树脂）得自ABI，CS-Bio，Menlo Park，CA或Novabiochem，Hohenbrunn，德国。三氟乙酸（TFA）得自Oakwood Products，West Columbia，SC。茴香硫醚、酚、三异丙基硅烷（TIS）、3,6-二氧杂-1,8-辛二硫酚（octanedithiol）（DODT）、铁氰化钾和异丙醇得自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI。基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）在Applied Biosystems Voyager DE-PRO MS）上进行记录。电喷射质谱（ESI-MS）以正和负离子模式在Finnigan SSQ7000（Finnigan Corp.，San Jose，CA）上进行记录。

关于固相肽合成的一般程序：

使用标准0.1 mM偶联循环在ABI Pioneer肽合成仪上用100 μmol预装载树脂/容器，或在ABI 433肽合成仪上用250 μmol树脂/容器来合成肽。在偶联标准Fmoc-氨基酸的ABI Pioneer合成仪上，对于单次偶联使用包含0.4 mmol试剂的预装载管连同4:4:8 Fmoc-氨基酸:HATU:DIEA。在ABI 433合成仪上，对于单次偶联使用作为4:4:4:8 Fmoc-氨基酸:HBTU:HOBt:DIEA预活化的包含1 mM Fmoc-氨基酸的预装载药液筒。在每种合成仪上，在偶联后，通过用哌啶（piperdine）处理去除Fmoc保护基团。当合成完成时，用3 × DCM和3 × 异丙醇洗涤树脂，并且在真空中干燥，以给出受保护的肽树脂。

用于树脂结合的肽的切割和脱保护的一般程序：

通过使树脂在环境温度在切割混合物中振荡3小时，从树脂中切割肽，所述切割混合物由80％TFA、5％水、5％茴香硫醚、5％酚、2.5％TIS和2.5％DODT（1 mL/0.1 g树脂）组成。通过过滤去除树脂，用2 × TFA冲洗，从滤液中蒸发TFA，用醚（10 mL/0.1 g树脂）沉淀残渣，通过离心回收，用2 × 醚（10 mL/0.1 g树脂）洗涤并且干燥，以给出粗制肽。

用于肽纯化的一般程序：

在Gilson制备型HPLC系统运行Unipoint^?分析软件（Gilson，Inc.，Middleton，WI）上在用Zorbax?-C3、7 μm颗粒、300 ?孔径填充的Agilent 21.2×250mm柱上纯化粗制肽。纯化自始至终柱的温度维持在＞60℃。每次注射纯化3毫升粗制肽溶液（在75:25甲酸:水中5 mg/mL）。使包含来自每次运行的一种或多种产物的峰合并且冻干。所有制备型运行以20 mL/分钟运行，其中洗脱剂为缓冲液A：0.1％TFA-水和缓冲液B：乙腈，使用B的1％/分钟梯度直至产物洗脱。

用于分析型HPLC的一般程序：

在具有双波长检测器运行D-7000软件的Hitachi D-7000分析型HPLC系统上在用Zorbax?-C3、5 μm颗粒、300 ?孔径填充的Agilent 0.46 × 250 mm柱上执行分析型HPLC，在起始条件下预平衡7分钟后，用下文列出的梯度方法之一洗脱。所有分析型运行以1 mL/分钟运行，其中洗脱剂为缓冲液A：0.1％TFA-水和缓冲液B：乙腈，使用B的2％/分钟梯度在75℃进行45分钟。

在下文中，Aβ肽和寡聚物被称为（xXaa1，yXaa2）Aβ（X-Y）肽和寡聚物，其中Aβ（X-Y）指从人淀粉状蛋白β蛋白质的氨基酸位置X到氨基酸位置Y的氨基酸序列，包括X和Y，如SEQ ID NO:1中阐述的（与氨基酸位置1 – 43对应），并且Xaa1和Xaa2指定分别置换SEQ ID NO:1中在位置x和y上的氨基酸的氨基酸。术语“（xXaa1，yXaa2）Aβ（X-Y）”与术语“Aβ（X-Y）（xXaa1/yXaa2）”同义。

a）（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）（1a）

如下制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:961）的淀粉状蛋白β肽类似物。

使用一般肽合成程序使预装载树脂（0.59 g，100 μmol）延伸，以给出受保护的树脂结合的肽（0.989 g，57％）。使用一般程序切割树脂并且脱保护，以给出作为白色固体的粗制肽1a（0.319 g，62.6％）。使粗制肽1a溶解于纯甲酸（6.7 mg/mL）中，并且在HPLC纯化伴随基于在260 nm处的吸光度收集前立即用水稀释（至5 mg/mL）。分离且冻干主要峰，从而给出作为白色固体的1a（0.0274 g，8.5％）；去褶合ESI-MS m/z = 4625.4 [（M+H）⁺]。

通过标准Fmoc固相合成从C末端到N末端合成下述肽（1b）至（1j）。在合成后，通过反相HPLC纯化肽。为了维持在半胱氨酸上的游离巯基基团（避免氧化），在生产过程中维持酸性pH（正常程序）。简言之，从在树脂上的氨基酸去除FMOC保护基团。添加在序列中的下一个氨基酸，并且使用HBTU与第一个氨基酸偶联。从第二个氨基酸去除FMOC保护基团。添加在序列中的下一个氨基酸，并且使用HBTU与先前氨基酸偶联。重复步骤4和5直至序列完成。使用TFA从树脂切割肽。使用TFA/乙腈缓冲系统（酸性缓冲系统）经由反相HPLC纯化肽。使满足质量和纯度规格的纯化级分合并且冻干。质谱分析和RP-HPLC证实肽的特性。

b）（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）（1b）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHCQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVCGVVIA（SEQ ID NO:962）的淀粉状蛋白β肽类似物。

c）（15C，36C）N-Met Aβ（1-42）（1c）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHCKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMCGGVVIA（SEQ ID NO:963）的淀粉状蛋白β肽类似物。

d）（16C，35C）N-Met Aβ（1-42）（1d）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQCLVFFAEDVGSNKGAIIGLCVGGVVIA（SEQ ID NO:964）的淀粉状蛋白β肽类似物。

e）（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）（1e）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:965）的淀粉状蛋白β肽类似物。

f）（18C，33C）N-Met Aβ（1-42）（1f）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKLCFFAEDVGSNKGAIICLMVGGVVIA（SEQ ID NO:966）的淀粉状蛋白β肽类似物。

g）（19C，32C）N-Met Aβ（1-42）（1g）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKLVCFAEDVGSNKGAICGLMVGGVVIA（SEQ ID NO:967）的淀粉状蛋白β肽类似物。

h）（20C，31C）N-Met Aβ（1-42）（1h）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFCAEDVGSNKGACIGLMVGGVVIA（SEQ ID NO:968）的淀粉状蛋白β肽类似物。

i）（21C，30C）N-Met Aβ（1-42）（1i）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFCEDVGSNKGCIIGLMVGGVVIA（SEQ ID NO:969）的淀粉状蛋白β肽类似物。

j）（22C，29C）N-Met Aβ（1-42）（1j）

使用标准肽化学制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFACDVGSNKCAIIGLMVGGVVIA（SEQ ID NO:970）的淀粉状蛋白β肽类似物。

k）（17C，34C）Aβ（12-42）（1k）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列VHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:971）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：3186.73；MALDI-MS：obs 3186.7 [（M+H）⁺]。

l）（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）-酰胺（1l）

使用Rink-酰胺-MBHA树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KC（ACM）VFFAEDVGSNKGAIIGC（ACM）M-酰胺（SEQ ID NO:972）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2230,67；MALDI-MS：obs 2231.4，2228.9 [（M+H）⁺]。

m）Aβ（16-35）-酰胺（1m）

使用Rink-酰胺-MBHA树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KLVFFAEDVGSNKGAIIGLM-酰胺（SEQ ID NO:973）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2108,5；MALDI-MS： obs 2108.1 [（M+H）⁺]，2130 [（M+Na）⁺]。

n）（17K，34K）A?（16-35）-酰胺（1n）

使用Rink-酰胺-MBHA树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KKVFFAEDVGSNKGAIIGKM-酰胺（SEQ ID NO:974）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2135,53；MALDI-MS： obs 2137.96 2137.91 [（M+H）⁺]。

o）（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状（1o）

通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KC*VFFAEDVGSNKGAIIGC*M-酰胺（SEQ ID NO:975）的淀粉状蛋白β肽类似物。通过使线性前体肽（17C，34C）A?（16-35）-酰胺（1p）以18 mg/mL溶解于二甲亚砜中完成二硫键环化（disulfide cyclization），并且以1个等分试样添加到真空脱气的3:2 100 mM碳酸氢铵:乙腈（200 mL，v:v）中。添加1份铁氰化钾溶液（在水中0.05％w/v，44.3 mL），并且使反应在环境下搅拌2小时。在使用上文描述的一般程序纯化和分析前，使黄色溶液冻干至干燥，以给出环化（17C，34C）A?（16-35）-酰胺。计算的MW [g/mol]：2086.46；MALDI-MS：obs 2086.6 [（M+H）⁺]，2108.6 [（M+Na）⁺]。

p）（17C，34C）A?（16-35）-酰胺（1p）

使用Rink-酰胺-MBHA树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KCVFFAEDVGSNKGAIIGCM-酰胺（SEQ ID NO:976）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2088.47；MALDI-MS：obs 2087.99 [（M+H）⁺]，2109.98 [（M+Na）⁺]。

q）（17K，34K）N-Met A?（1-42）（1q）

使用H-Ala-HMPB NovaPEG树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKKVFFAEDVGSNKGAIIGKMVGGVVIA（SEQ ID NO:977）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：4675,26；MALDI-MS：obs 4680.16 [(M+H)⁺]。

r）（17KC，34C）A?（13-42）（1r）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列HHQKKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:978）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：3215.77；MALDI-MS： obs 3214.72 [（M+H）⁺]。

s）（17C，34C）A?（16-42）（1s）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:979）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2685.19；MALDI-MS：obs 2683.82 [（M+H）⁺]，2705.84 [（M+Na）⁺]。

t）（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））A?（16-35）-酰胺（1t）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KC（ACM）VFFAEDVGSNKGAIIGC（ACM）M（S-氧化物）-酰胺（SEQ ID NO:980）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2246.67；MALDI-MS：obs 2245.48 [（M+H）⁺]。

u）（17C（ACM），34C（ACM））A?（16-35）-酰胺（1u）

使用Rink酰胺MBHA树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KC（ACM）VFFAEDVGSNKGAIIGC（ACM）M-酰胺（SEQ ID NO:981）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2230.67；MALDI-MS： obs 2229.45 [（M+H）⁺]。

v）（17K，34E）A?（16-35）-酰胺（1v）

使用PEGA-Novabiochem树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列KKVFFAEDVGSNKGAIIGEM-酰胺（SEQ ID NO:982）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：2139.47；MALDI-MS：obs 2161.1 [（M+Na）⁺]。

w）（17K，34C）N-Met A?（1-42）（1w）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKKVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:983）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：4650.23；MALDI-MS：obs 4651.07 [(M+H)⁺]。

x）（17K，34E）N-Met A?（1-42）（1x）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKKVFFAEDVGSNKGAIIGEMVGGVVIA（SEQ ID NO:984）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：4676.21；MALDI-MS：obs 4676.2 [(M+H)⁺]。

y）（17C，34C）N-Met A?（1-42）（1y）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:985）的淀粉状蛋白β肽类似物。计算的MW [g/mol]：4625.21；MALDI-MS：obs 4625.52 [(M+H)⁺]。

z）（22C*，29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的（1z）

通过上文概述的一般程序并且使用对于肽（1o）描述的环化方法，可以制备具有氨基酸序列KKVFFAC*DVGSNKC*AIIGKM-酰胺（SEQ ID NO:986）的淀粉状蛋白β肽类似物。

aa）（22C，29C）A?（16-35）-酰胺（1aa）

通过上文概述的一般程序，可以制备具有氨基酸序列KKVFFACDVGSNKCAIIGKM-酰胺（SEQ ID NO:987）的淀粉状蛋白β肽类似物。

ab）（F20 ->FA19501，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）（1ab）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序，可以制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKCVF-FA19501-AEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:988）的淀粉状蛋白β肽类似物。FA19501是关于可以就肽中的正常氨基酸而论并入的Fmoc-顺式-3-苯基-吡咯烷-2-羧酸的目录号。

ac）（22C，29C）Aβ（20-35）（1ac）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序，可以制备具有氨基酸序列FACDVGSNKCAIIGLM（SEQ ID NO:989）的淀粉状蛋白β肽类似物。

ad）（22C，29C）A?（20-42）（1ad）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序，可以制备具有氨基酸序列FACDVGSNKCAIIGLMVGGVVIA（SEQ ID NO:990）的淀粉状蛋白β肽类似物。

ae）（17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）（1ae）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序，可以制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFACDVGSNKCAIIGCMVGGVVIA（SEQ ID NO:991）的淀粉状蛋白β肽类似物。

af）（K28G29->FA12401，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）（1af）

使用Fmoc-Ala-Wang树脂，通过上文概述的一般程序，可以制备具有氨基酸序列MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSN-FA12401-AIIGCMVGGVVIA （SEQ ID NO:992）的淀粉状蛋白β肽类似物。FA12401是关于可以就肽中的正常氨基酸而论并入的Fmoc-3-氨基-1-羧甲基-吡啶-2-酮的目录号。

实施例2：寡聚物的制备

a）二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（2a）

用HFIP处理实施例1a的83.1 mg合成的（17C,34C）N-Met Aβ（1-42）（1a），TFA盐，（1 ml用于每6 mg肽），并且通过冻干去除溶剂。将这溶解于4.0 ml DMSO内。随后伴随搅拌，将肽的这种DMSO溶液缓慢添加到包含0.2％SDS（十二烷基硫酸钠）的45 mL 20 mM PBS（20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4）中。随后使这种溶液在DTT（二硫苏糖醇）中制成5 mM，并且37℃温育6小时。

随后用3份水稀释样品，并且在室温针对含0.05％SDS的四分之一强度PBS透析过夜，其中使用3500 MWCO透析膜。第二天早晨针对1 L新鲜缓冲液在4℃继续透析2小时。

随后使用YM10膜在Amicon搅拌的池中浓缩样品。0.5 ml等分试样在4℃针对不含SDS的四分之一强度PBS透析过夜，其中使用Pierce 10K slidelyzer。

实施例3：寡聚物的制备

a）（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（3a）

使实施例1b的（14C，37C）N-Met A?（1-42）肽（1b）以4 mg/mL悬浮于100％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）中，并且在振荡下在37℃温育2小时用于完全溶解。HFIP充当氢键破坏物，并且用于消除Aβ肽中预先存在的结构不均一性。通过在SpeedVac中蒸发去除HFIP，并且使Aβ肽以5 mM的浓度溶解或悬浮于二甲亚砜中，并且超声处理20秒。用230 μl磷酸缓冲盐水（PBS）+ 0.2％SDS + 2 mM DTT（在H₂O + 3 mg DTT中溶解的9.8 ml氦充气的20 mM NaH₂PO₄，140 mM NaCl，pH 7.4 + 0.2 ml 10％SDS溶液，Serva，目录号：20710），使在DMSO中的20 μl HFIP预处理的Aβ肽稀释至400 μM肽浓度。在37℃温育6小时导致16/20-kDa（xC，yC）N-Met Aβ（1-42）中间体和Aβ（1-42）中间体。通过用3体积氦充气的H₂O进一步稀释，并且在37℃温育18小时，生成38/48-kDa（xC，yC）N-Met Aβ（1-42）寡聚物。在10,000 g离心10分钟后，取出上清液并且贮存于-30℃直至进一步使用。

b）（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3b）

使用实施例3a所述程序，对实施例1c的（15C，36C）N-Met A?（1-42）肽（1c）实施寡聚化。

c）（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3c）

使用实施例3a所述程序，对实施例1d的（16C，35C）N-Met A?（1-42）肽（1d）实施寡聚化。

d）（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3d）

使用实施例3a所述程序，对实施例1e的（17C，34C）N-Met A?（1-42）肽（1e）实施寡聚化。

e）（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3e）

使用实施例3a所述程序，对实施例1f的（18C，33C）N-Met A?（1-42）肽（1f）实施寡聚化。

f）（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3f）

使用实施例3a所述程序，对实施例1g的（19C，32C）N-Met A?（1-42）肽（1g）实施寡聚化。

g）（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3g）

使用实施例3a所述程序，对实施例1h的（20C，31C）N-Met A?（1-42）肽（1h）实施寡聚化。

h）（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3h）

使用实施例3a所述程序，对实施例1i的（21C，30C）N-Met A?（1-42）肽（1i）实施寡聚化。

i）（22C，29C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3i）

使用实施例3a所述程序，对实施例1j的（22C，29C）N-Met A?（1-42）肽（1j）实施寡聚化。

j）Aβ（1-42）球聚物（3j）

使用实施例3a所述程序，对Aβ（1-42）野生型肽（Bachem H-1368）实施寡聚化。

k）（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物（3k）

使用实施例2a所述程序，对实施例1k的（17C，34C）Aβ（12-42）肽（1k）实施寡聚化，伴随下述修饰。在HFIP处理后，使肽溶解于在35％乙腈/65％水中的1％氨中，并且在RT温育约30分钟用于形成铵盐。随后使这种盐壳型冷冻（shell frozen）且冻干至干燥过夜。寡聚化随后完成至如实施例2a中所述的0.05％SDS步骤。

用HFIP处理实施例1k的（17C，34C）Aβ（12-42）肽（1k）（1 ml用于每6 mg肽），并且通过冻干去除溶剂。在HFIP处理后，使肽溶解于在35％乙腈/65％水中的1％氨中，并且在RT温育约30分钟用于形成铵盐。随后使这种盐壳型冷冻且冻干至干燥过夜。将这溶解于4.0 ml DMSO内。随后伴随搅拌，将肽的这种DMSO溶液缓慢添加到包含0.2％SDS（十二烷基硫酸钠）的45 mL 20 mM PBS（20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4）中。随后使这种溶液在DTT（二硫苏糖醇）中制成5 mM，并且37℃温育6小时。

l）（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（3l）

使用实施例3k所述程序，对（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）肽（1l）实施寡聚化，除不使用DTT外。

m）Aβ（16-35）-酰胺寡聚物（3m）

使用实施例3k所述程序，对Aβ（16-35）-酰胺肽（1m）实施寡聚化，除不使用DTT外。

n）（17K，34K）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3n）

使用实施例3k所述程序（不使用DTT），对（17K，34K）A?（16-35）-酰胺肽（1n）实施寡聚化将获得寡聚物。

o）[（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状]寡聚物（3o）

使用实施例3k所述程序，对[（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状]肽（1o）实施寡聚化，除不使用DTT外。

p）（17C，34C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3p）

使用实施例3k所述程序，对（17C，34C）A?（16-35）-酰胺肽（1p）实施寡聚化。

q）（17K，34K）N-Met A?（1-42）寡聚物（3q）

使用实施例3k所述程序（不使用DTT），对（17K，34K）N-Met A?（1-42）肽（1q）实施寡聚化将获得寡聚物。

r）（17KC，34C）A?（13-42）寡聚物（3r）

使用实施例3k所述程序，对（17KC，34C）A?（13-42）肽（1r）实施寡聚化。

s）（17C，34C）A?（16-42）寡聚物（3s）

使用实施例3k所述程序，对（17C，34C）A?（16-42）肽（1s）实施寡聚化。

t）（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））A?（16-35）-酰胺寡聚物（3t）

使用实施例3k所述程序（不使用DTT），对（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））肽（1t）实施寡聚化将获得寡聚物。

u）（17C（ACM），34C（ACM））A?（16-35）-酰胺寡聚物（3u）

使用实施例3k所述程序，对（17C（ACM），34C（ACM））肽（1u）实施寡聚化，除不使用DTT外。

v）（17K，34E）A?（16-35）寡聚物（3v）

使用实施例3k所述程序，对（17K，34E）A?（16-35）肽（1v）实施寡聚化，除不使用DTT外。

w）（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3w）

使用实施例3k所述程序，对（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽（1w）实施寡聚化，除不使用DTT外。

x）（17K，34E）N-Met A?（1-42）寡聚物（3x）

使用实施例3k所述程序，对（17K，34E）N-Met A?（1-42）肽（1x）实施寡聚化，除不使用DTT外。

y）（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3y）

使用实施例3k所述程序，对（17C，34C）N-Met A?（1-42）肽（1y）实施寡聚化。

z）[（22C*，29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的]寡聚物（3z）

使用实施例3k所述程序，对[（E22C*，G29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的]肽（1z）实施寡聚化将获得寡聚物。

aa）（22C，29C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3aa）

使用实施例3k所述程序，对（22C，29C）A?（16-35）-酰胺肽（1aa）实施寡聚化将获得寡聚物。

ab）（F20 ->FA19501，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3ab）

使用实施例3k所述程序，对（F20 ->FA19501，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）肽（1ab）实施寡聚化将获得寡聚物。

ac）（22C，29C）Aβ（20-35）寡聚物（3ac）

使用实施例3k所述程序，对（22C，29C）Aβ（20-35）肽（1ac）实施寡聚化将获得寡聚物。

ad）（22C，29C）A?（20-42）寡聚物（3ad）

使用实施例3k所述程序，对（22C，29C）A?（20-42）肽（1ad）实施寡聚化将获得寡聚物。

ae）（17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）寡聚物（3ae）

使用实施例3k所述程序，对（17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）肽（1ae）实施寡聚化将获得寡聚物。

af）（K28G29->FA12401，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3af）

使用实施例3k所述程序，对（K28G29->FA12401，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）肽（1af）实施寡聚化将获得寡聚物。

实施例4：键形成

a）二硫键稳定的（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（4a）

使1 ml实施例3a的（14C，37C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3a）解冻，并且在透析管中在室温针对2 L 5 mM NaH₂PO₄、35 mM NaCl，pH 7.4透析2次进行2小时。随后，取出透析液，并且通过Bio-Rad Protein Assay，BioRad，目录号：500-0006测定蛋白质浓度。

b）二硫键稳定的（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4b）

使用实施例4a所述程序，对实施例3b的（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3b）实施氧化。

c）二硫键稳定的（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4c）

使用实施例4a所述程序，对实施例3c的（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3c）实施氧化。

d）二硫键稳定的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4d）

使用实施例4a所述程序，对实施例3d的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3d）实施氧化。

e）二硫键稳定的（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4e）

使用实施例4a所述程序，对实施例3e 的（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3e）实施氧化。

f）二硫键稳定的（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4f）

使用实施例4a所述程序，对实施例3f的（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3f）实施氧化。

g）二硫键稳定的（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4g）

使用实施例4a所述程序，对实施例3g的（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3g）实施氧化。

h）二硫键稳定的（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4h）

使用实施例4a所述程序，对实施例3h的（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3h）实施氧化。

i）二硫键稳定的（22C，29C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4i）

使用实施例4a所述程序，对实施例3i的（22C,29C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3i）实施氧化。

j）Aβ（1-42）球聚物（4j）

使用实施例4a所述程序，对实施例3j的Aβ（1-42）野生型球聚物（Bachem H-1368）（3j）实施氧化。

k）二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物（4k）

用3份水稀释（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物（3k），并且在室温针对含0.05％SDS的四分之一强度PBS透析过夜，其中使用3500 MWCO透析膜。第二天早晨针对1 L新鲜缓冲液在4℃继续透析2小时。

随后使用YM10膜在Amicon搅拌的池中浓缩样品。还可以使用Millipore UltraMax离心浓缩器与10kDa截断膜浓缩样品。

l）（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（4l）

（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（3l）不形成半胱氨酸桥。

m）Aβ（16-35）-酰胺寡聚物（4m）

Aβ（16-35）-酰胺寡聚物（3m）不形成交联。

n）交联的（17K，34K）A?（16-35）-酰胺寡聚物（4n）

对（17K，34K）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3n）实施适合于使2个胺基团交联的条件将获得产物。

o）[（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状]寡聚物（4o）

[（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状]寡聚物（3o）已包括键。

p）二硫键稳定的（17C，34C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（4p）

对（17C，34C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3p）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，如实施例4k中所述。

q）交联的（17K，34K）N-Met A?（1-42）寡聚物（4q）

对（17K，34K）N-Met A?（1-42）寡聚物（3q）实施适合于使2个胺基团交联的条件将获得产物。

r）二硫键稳定的（17KC，34C）A?（13-42）寡聚物（4r）

对（17KC，34C）A?（13-42）寡聚物（3r）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，如实施例4k中所述。

s）二硫键稳定的（17C，34C）A?（16-42）寡聚物（4s）

对（17C，34C）A?（16-42）寡聚物（3s）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，如实施例4k中所述。

t）（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））A?（16-35）-酰胺寡聚物（4t）

（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））A?（16-35）-酰胺寡聚物（3t）不形成半胱氨酸桥。

u）（17C（ACM），34C（ACM））A?（16-35）-酰胺寡聚物（4u）

（17C（ACM），34C（ACM））A?（16-35）-酰胺寡聚物（3u）不形成半胱氨酸桥。

v）EDC/NHS连接的（17K，34E）A?（16-35）寡聚物（4v）

对（17K，34E）A?（16-35）寡聚物（3v）实施实施例4x的程序将获得产物。

w1）SMCC连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4w1）

使在0.05％SDS中的实施例3w的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3w）（2.37 mM肽）与11 mM 磺基-SMCC（Pierce目录#22622，由在无水DMSO中的100 mM原液供应）在室温交联1小时。通过添加来自100 mM，pH 8含水母液的10 mM乙醇胺猝灭反应。通过使用Slide-A-Lyzer与2000 Da mw截断膜针对5 mM NaPO₄、35 mM NaCl、0.05％SDS，pH 7.4透析取出过量试剂和反应产物。使用BCA蛋白质测定（Pierce）来测定终浓度。

w2）MBS连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4w2）

使在0.05％SDS中的实施例3w的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3w）（2.47 mM肽）与12 mM 磺基-MBS（Pierce目录#22312，由在无水DMSO中的100 mM原液供应）在室温交联1小时。通过添加来自100 mM，pH 8含水母液的10 mM乙醇胺猝灭反应。通过使用Slide-A-Lyzer与2000 Da MW截断膜针对5 mM NaPO₄、35 mM NaCl、0.05％SDS，pH 7.4透析取出过量试剂和反应产物。使用BCA蛋白质测定（Pierce）来测定终浓度。

w3）SIAB连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4w3）

使在0.05％SDS中的实施例3w的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3w）（2.47 mM肽）与12 mM 磺基- SIAB（Pierce目录#22327，由在无水DMSO中的100 mM原液供应）在室温交联1小时。通过添加来自100 mM，pH 8含水母液的10 mM乙醇胺猝灭反应。通过使用Slide-A-Lyzer与2000 Da MW截断膜针对5 mM NaPO₄、35 mM NaCl、0.05％SDS，pH 7.4透析取出过量试剂和反应产物。使用BCA蛋白质测定（Pierce）来测定终浓度。

x）EDC/NHS连接的（17K，34E）N-Met A?（1-42）寡聚物（4x）

使用20 mM EDC（Pierce目录#22980，由100 mM含水原液供应）和50 mM 磺基-NHS（Pierce目录#24520，由100 mM含水原液供应），使在0.05％SDS中的实施例3x的（17K，34E）N-Met A?（1-42）寡聚物（3x）（2.14 mM肽）在室温交联1小时。通过使用Slide-A-Lyzer与2000 Da MW截断膜针对5 mM NaPO₄、35 mM NaCl、0.05％SDS，pH 7.4透析取出过量试剂和反应产物。使用BCA蛋白质测定（Pierce）来测定终浓度。

y）二硫键稳定的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4y）

对（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3y）实施透析，以便去除DTT且实现二硫键形成，如实施例4k中所述。

z）[（E22C*，G29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的]寡聚物（4z）

[（22C*，29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的]寡聚物（3z）已包括键。

aa）二硫键稳定的（22C，29C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（4aa）

如实施例4k中所述，对（22C，29C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3aa）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，将获得产物。

ab）二硫键稳定的（F20 ->FA19501，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4ab）

如实施例4k中所述，对（F20 ->FA19501，L17C，L34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3ab）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，将获得产物。

ac）二硫键稳定的（22C，29C）Aβ（20-35）寡聚物（4ac）

如实施例4k中所述，对（22C，29C）Aβ（20-35）寡聚物（3ac）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，将获得产物。

ad）二硫键稳定的（22C，29C）A?（20-42）寡聚物（3ad）

如实施例4k中所述，对（22C，29C）A?（20-42）寡聚物（3ad）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，将获得产物。

ae）二硫键稳定的（17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）寡聚物（4ae）

如实施例4k中所述，对17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）寡聚物（3ae）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，将获得产物。

af）二硫键稳定的（K28G29->FA12401，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4af）

如实施例4k中所述，对（K28G29->FA12401，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（3af）实施透析，以去除DTT且实现二硫键形成，将获得产物。

实施例5：嗜热菌蛋白酶截短

a）二硫键稳定的（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（5a）的嗜热菌蛋白酶截短

将0.5 ml实施例4a的二硫键稳定的（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（4a）与1/91嗜热菌蛋白酶w/w（Roche，目录号：161586）一起添加。使嗜热菌蛋白酶以1 mg/ml的浓度溶解于H₂O（新鲜制备的）中。使样品在振荡下在30℃温育20小时。随后添加在水中的2.5 μl 100 mM EDTA溶液，pH 7.4，并且使样品在室温振荡5分钟。随后用5 μl 10％强度的SDS溶液将样品调整至0.1％的SDS含量。使样品在室温振荡10分钟。随后，经由0.4 ml 30 kDa Ultrafree-MC管（Amicon，目录号：UFC3LTK00）使样品浓缩至约20 μl。使浓缩物与0.2 ml缓冲液（5 mM NaH₂PO₄、35 mM NaCl，pH 7.4）混合，并且使用30 kDa Ultrafree-MC管（Amicon，目录号：UFC3LTK00）再次浓缩至20 μl。随后用0.38 ml缓冲液（5 mM NaH₂PO₄、35 mM NaCl，pH 7.4）将浓缩物调整至0.4 ml的终体积。随后，用2 μl 10％强度的SDS溶液将样品调整至0.05％的SDS含量，并且贮存于-30℃直至进一步使用。

b）二硫键稳定的（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5b）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4b的二硫键稳定的（15C，36C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4b）实施嗜热菌蛋白酶截短。

c）二硫键稳定的（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5c）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4c的二硫键稳定的（16C，35C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4c）实施嗜热菌蛋白酶截短。

d）二硫键稳定的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5d）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4d的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4d）实施嗜热菌蛋白酶截短。

e）二硫键稳定的（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5e）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4e的二硫键稳定的（18C，33C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4e）实施嗜热菌蛋白酶截短。

f）二硫键稳定的（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5f）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4f的二硫键稳定的（19C，32C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4f）实施嗜热菌蛋白酶截短。

g）二硫键稳定的（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5g）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4g的二硫键稳定的（20C，31C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4g）实施嗜热菌蛋白酶截短。

h）二硫键稳定的（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5h）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4h的二硫键稳定的（21C，30C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4h）实施嗜热菌蛋白酶截短。

i）二硫键稳定的（22C，29C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5i）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4i的二硫键稳定的（22C,29C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4i）实施嗜热菌蛋白酶截短。

j）Aβ（1-42）球聚物（5j）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4j的Aβ（1-42）野生型球聚物（Bachem H-1368）（4j）实施嗜热菌蛋白酶截短。

k）二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物（5k）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4k的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物（4k）实施嗜热菌蛋白酶截短。

l）（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（5l）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（3l）实施嗜热菌蛋白酶截短。

m）Aβ（16-35）-酰胺寡聚物（5m）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例3m的Aβ（16-35）-酰胺寡聚物（3m）实施嗜热菌蛋白酶截短。

n）（17K，34K）A?（16-35）-酰胺寡聚物（5n）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对（17K，34K）A?（16-35）-酰胺寡聚物（3n）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

o）[（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状]寡聚物（5o）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例3o的[（17C，34C）A?（16-35）-酰胺，环状]寡聚物（3o）实施嗜热菌蛋白酶截短。

p）二硫键稳定的（17C，34C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（5p）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4p的二硫键稳定的（17C，34C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（4p）实施嗜热菌蛋白酶截短。

q）（17K，34K）N-Met A?（1-42）寡聚物（5q）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对（17K，34K）N-Met A?（1-42）寡聚物（3q）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

r）二硫键稳定的（17KC，34C）A?（13-42）寡聚物（5r）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序对实施例4r的二硫键稳定的（17KC，34C）A?（13-42）寡聚物（4r）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

s）二硫键稳定的（17C，34C）A?（16-42）寡聚物（5s）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4s的二硫键稳定的（17C，34C）A?（16-42）寡聚物（4s）实施嗜热菌蛋白酶截短。

t）（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））A?（16-35）-酰胺寡聚物（53t）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对（17C（ACM），34C（ACM），35M（S-氧化物））A?（16-35）-酰胺寡聚物（3t）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

u）（17C（ACM），34C（ACM））A?（16-35）-酰胺寡聚物（5u）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对（17C（ACM），34C（ACM））A?（16-35）-酰胺寡聚物（3u）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

v）（17K，34E）A?（16-35）寡聚物（5v）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对（17K，34E）A?（16-35）寡聚物（3v）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

w1）SMCC连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5w）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对SMCC连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4w1）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

w2）MBS连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5w）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对MBS连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4w2）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

w3）SIAB连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5w）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对SIAB连接的（17K，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4w3）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

x）EDC/NHS连接的（17K，34E）N-Met A?（1-42）寡聚物（5x）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对EDC/NHS连接的（17K，34E）N-Met A?（1-42）寡聚物（4x）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

y）二硫键稳定的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5y）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对实施例4y的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4y）实施嗜热菌蛋白酶截短。

z）[（22C*，29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的]寡聚物（5z）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对[（22C*，29C*）A?（16-35）-酰胺，环化的]寡聚物（3z）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

aa）二硫键稳定的（22C，29C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（5aa）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对二硫键稳定的（22C，29C）A?（16-35）-酰胺寡聚物 22C，29C）A?（16-35）-酰胺寡聚物（4aa）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

ab）二硫键稳定的（F20 ->FA19501，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5ab）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对二硫键稳定的（F20 ->FA19501，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4ab）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

ac）二硫键稳定的（22C，29C）Aβ（20-35）寡聚物（5ac）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对二硫键稳定的（22C，29C）Aβ（20-35）寡聚物（4ac）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

ad）二硫键稳定的（22C，29C）A?（20-42）寡聚物（5ad）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对二硫键稳定的（22C，29C）A?（20-42）寡聚物（4ad）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

ae）二硫键稳定的（17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）寡聚物（5ae）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对二硫键稳定的（17C，22C，29C，34C）A?（20-42）N-Met A?（1-42）寡聚物（4ae）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

af）二硫键稳定的（K28G29->FA12401，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（5af）的嗜热菌蛋白酶截短

使用实施例5a所述程序，对二硫健稳定的（K28G29->FA12401，17C，34C）N-Met A?（1-42）寡聚物（4af）实施嗜热菌蛋白酶截短，将获得产物。

生物物理学和生物化学表征

实施例7：SDS PAGE分析

a）（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物的SDS-PAGE（10-20％N-[2-羟-1,1-二羟甲基乙基]甘氨酸（tricine）凝胶）

使用10-20％N-[2-羟-1,1-二羟甲基乙基]甘氨酸凝胶、1.0 mm、15孔（Invitrogen，目录# EC66255）运行SDS-PAGE，其中采用2-x N-[2-羟-1,1-二羟甲基乙基]甘氨酸样品缓冲液（Invitrogen，目录# LC1676）和N-[2-羟-1,1-二羟甲基乙基]甘氨酸运行缓冲液（Invitrogen，目录# LC1675）。使样品与等份样品缓冲液混合且加样，无需加热。使用125 V的恒电压，使凝胶在环境温度显影100分钟。在显影后，使用基于甲醇-乙酸的考马斯（Coomassie ）R-250染色剂（0.1％考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue） R250、30％甲醇、10％乙酸，在水中）染色凝胶，并且使用30％甲醇/10％乙酸/水进行脱色。使用的标准：SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standards（Invitorgen，目录# LC5925），由肌球蛋白（210 kDa）、磷酸化酶（98 kDa）、BSA（78 kDa）、谷氨酸脱氢酶（55 kDa）、醇脱氢酶（45 kDa）、碳酸酐酶（34 kDa）、肌红蛋白红（Myoglobin Red）（17 kDa）、溶菌酶（16 kDa）、抑酶肽（7 kDa）和胰岛素（4 kDa）组成。

来自实施例2a的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（2a）显示典型的Aβ球聚物带型（图2A）。

b）（xC，yC）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物的SDS-PAGE（4-20％Tris/甘氨酸凝胶）

使用下述参数运行SDS-PAGE：

SDS样品缓冲液：

- 0.3 g SDS

- 4 mL 1 M Tris/HCl pH 6.8

- 8 mL甘油

- 70 μL在乙醇中的1％溴酚蓝

- 添加H₂O至50 mL

运行缓冲液：

- 7.5 g Tris

- 36 g 甘氨酸

- 2.5 g SDS

- 添加H₂O至2.5 L

SDS-PAGE凝胶系统：

- 4-20％Tris/甘氨酸凝胶:（Invitrogen Inc.，目录号：EC60255BOX）

将在嗜热菌蛋白酶消化前和后的10 μL（xC，yC）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物或A?（1-42）球聚物制剂添加到10 μL SDS样品缓冲液中。将所得到的20 μL样品装载到4-20％Tris/Glycin Gel（Invitrogen Inc.，目录号：EC60255BOX）上。在25 mA的恒电流下进行SDS-PAGE。

考马斯染色：

染色溶液：

- 2500 ml甲醇

- 500 ml乙酸

- 5 g 考马斯亮蓝（Coomassie Brillant Blue） R250 ，Fa.Bio-Rad ，目录号161-0400

- 2000 ml H₂O

脱色溶液：

- 875 ml甲醇

- 250 ml乙酸

- 3925 ml H₂O

在电泳后，使凝胶在染色溶液中在室温在振荡下在摇摆平台上温育30分钟。在染色后，凝胶的背景在室温在脱色溶液中脱色过夜。

来自实施例4a的（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5a的热菌蛋白酶截短的（14C，37C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例4b的（15C，36C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5b的嗜热菌蛋白酶截短的（15C，36C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例4c的（16C，35C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5c的嗜热菌蛋白酶截短的（16C，35C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例4d的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5d的嗜热菌蛋白酶截短的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例4e的（18C，33C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物，和来自实施例5e 的嗜热菌蛋白酶截短的（18C，33C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（图2B）以及来自实施例4f的（19C，32C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5f的嗜热菌蛋白酶截短的（19C，32C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例4g的（20C，31C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5g的嗜热菌蛋白酶截短的（20C，31C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例4h的（21C，30C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例5h的嗜热菌蛋白酶截短的（21C，30C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、来自实施例3i的（22C，29C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物、和来自实施例5h的嗜热菌蛋白酶截短的（22C，29C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（图2C）显示Aβ（1-42）球聚物或Aβ（1-42）嗜热菌蛋白酶截短的球聚物的典型Aβ球聚物带型（尽管存在一些（YC，YC）N-Met Aβ（1-42）寡聚物和嗜热菌蛋白酶截短的（YC，YC）N-Met Aβ（1-42）寡聚物运行的条带高度的明显移动。

进一步地，来自实施例3x的（17K，34E）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.2％SDS）、来自实施例3x的（17K，34E）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.05％SDS）、来自实施例3u的（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（0.2％SDS）、来自实施例3u的（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物（0.05％SDS）、来自实施例3w的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.2％SDS）、来自实施例3w的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（0.05％SDS）、来自实施例3s的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物（0.2％SDS）、来自实施例3s的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物（0.05％SDS）、来自实施例3r的（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物（0.2％SDS）、和来自实施例3r的（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物（0.05％SDS）（图2D）显示N-Met Aβ（1-42）球聚物的典型Aβ球聚物带型。

实施例8：直接ELISA

通过使用对于Aβ（1-42）球聚物形式的选择性超过原纤维和游离肽> 1000倍的抗体（单克隆抗体5F7），进一步表征来自实施例2a的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（2a）的免疫反应性。

材料：微量滴定板是Nunc Immuno Plate，Maxi-Sorb Surface，平底，（目录#439454）。缀合物（第二抗体）是驴抗小鼠HRPO缀合物，Jackson Immuno Research,（目录#715-035-150）。HRPO底物是3,3',5'5'-四甲基联苯胺液体底物（TMB），Sigma,（目录#T4444）。脱脂奶粉（NFDM）来自BioRad,（目录#170-6404）。所有其他化学试剂来自常规来源。

缓冲液和溶液：PBST缓冲液：用0.05％Tween 20制备Sigma PBS。通过使0.5 mg BSA溶解于100mL PBST中制备含0.5％BSA的PBST。封闭溶液是在PBST中的3％NFDM。缀合物稀释剂是在PBST中的1％NFDM。包被缓冲液是100 mM NaHCO₃ pH8.2。HRPO终止液是2 M H₂SO₄。

包被板：将待测试的Aβ球聚物在包被缓冲液中稀释至1.0μg/mL。将100 μL添加到待包被的每个孔中。用密封薄膜使板密封并且置于4℃过夜。

板封闭：从孔中去除包被溶液。每个孔任选用150 μL PBST洗涤2-3 X。添加300 μL封闭溶液（在PBST中的3％NFDM）。用板密封薄膜覆盖板，并且在室温温育~2小时，伴随搅动。

第一抗体：从孔中去除封闭溶液。每个孔任选用150 μL PBST洗涤2-3 X。添加100 μL第一抗体溶液。对于全长N-Met Aβ（1-42）球聚物，使用0.04 - 100 μg/mL的抗体5F7溶液。使用含0.5％BSA的PBST稀释抗体。用板密封薄膜覆盖板，并且在室温温育~2 - 3小时，伴随搅动。

第二抗体（HRPO缀合物）：从孔中去除第一抗体溶液。每个孔用150 μL PBST洗涤2-3 X。添加在含1％NFDM的PBST中1:5000稀释的200 μL第二抗体（HRPO缀合物）溶液。用板密封薄膜覆盖板，并且在室温温育~1小时，伴随搅动。

底物显影：从孔中去除缀合物溶液。每个孔用200 μL PBST洗涤2-3 X。将100 μL HRPO底物溶液添加到每个孔中。允许颜色在观察下显影。它变成蓝色。反应通常在5-10分钟内在室温完成。将50 μL终止液添加到每个孔中。蓝色变成黄色。使用微量滴定板阅读器在终止液添加30分钟内阅读在450 nm的吸光度。

球聚物特异性单克隆抗体5F7与N-Met Aβ（1-42）球聚物和（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变寡聚物与5F7的结合几乎是等同的（图3A），从而指出（L17C,L34C）N-Met Aβ（1-42）突变寡聚物仍展示球聚物特异性表位。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4y的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）球聚物和来自实施例5y的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3B中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4y的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）球聚物和来自实施例5y的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3C中。

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4y的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）球聚物和来自实施例5y的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3D中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4p的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5p的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3E中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4p的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5p的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3F中。

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4p的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5p的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3G中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4m的Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5m的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3H中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4m的Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5m的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3I中。

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4m的Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5m的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3J中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4l的（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5l的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3K中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4l的（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5l的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3L中。

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4l的（17C（ACM），34C（ACM））Aβ（16-35）寡聚物和来自实施例5l的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3M中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4o的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和来自实施例5o的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3N中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4o的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和来自实施例5o的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3O中；

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4o的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和来自实施例5o的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3P中；

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4o的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和来自实施例4s、4p和4y的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）、（17C，34C）Aβ（16-35）和（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（都在寡聚物形成后进行环化）比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3Q中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例5o的嗜热菌蛋白酶截短的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（在寡聚物形成前进行环化）和来自实施例5s、5p和5y的嗜热菌蛋白酶截短的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）、（17C，34C）Aβ（16-35）和（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（都在寡聚物形成后进行环化）比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3R中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4s的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物和来自实施例5s的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3S中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4s的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物和来自实施例5s的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3T中。

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4s的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物和来自实施例5s的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3U中。

比较球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4k的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物和来自实施例5k的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3V中。

比较球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4k的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物和来自实施例5k的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3W中。

比较球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4k的二硫键稳定的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物和来自实施例5k的通过用嗜热菌蛋白酶酶促切割在残基20处截短的相同寡聚物比较的表观结合亲和力的直接ELISA结果比较显示于图3X中。

球聚物特异性mAb 5F7与来自实施例4r的二硫键稳定的（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物的表观结合亲和力的直接ELISA结果显示于图3Y中。

球聚物特异性mAb 7C6与来自实施例4r的二硫键稳定的（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物的表观结合亲和力的直接ELISA结果显示于图3Z中。

球聚物特异性兔多克隆抗血清5599与来自实施例4r的二硫键稳定的（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物的表观结合亲和力的直接ELISA结果显示于图3AA中。

图13显示来自实施例3w的不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同来自实施例4y的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图14显示（A）来自实施例3w的不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前（来自实施例4w1）和后（来自实施例5w1）与SMCC交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图15显示（A）来自实施例3w的不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前（来自实施例4w2）和后（来自实施例5w2）与MBS交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图16显示（A）来自实施例3w的不含交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同在嗜热菌蛋白酶截短前（来自实施例4w3）和后（来自实施例5w3）与SIAB交联的（17K，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

图17显示（A）不含交联的来自实施例3x的（17K，34E）N-Met Aβ（1-42）寡聚物连同来自实施例3y的二硫键稳定的（17C，34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物对（A）球聚物特异性单克隆抗体5F7；（B）球聚物特异性单克隆抗体7C6；和（C）球聚物特异性兔多克隆抗血清5599的直接Elisa应答比较。

获得的一些结果是：

（17C，34C）A?（16-42）肽（实施例3s）显示形成寡聚物（实施例4s），所述寡聚物包含预期二硫键（图4E和F）且展示球聚物表位（图3S-3U）。在用嗜热菌蛋白酶截短后（实施例5s），观察到对于球聚物特异性抗体的亲和力中的预期增加（图3S-3U）。

（17C，34C）A?（12-42）肽（实施例3k）显示形成寡聚物（实施例4k），所述寡聚物包含预期二硫键（图4G和4H）且展示球聚物表位（图3V-3X）。在用嗜热菌蛋白酶截短后（实施例5k），观察到对于球聚物特异性抗体的亲和力中的预期增加（图3V-3X）。

（17C，34C）A?（16-35）肽（实施例3o）显示形成寡聚物（实施例4o），所述寡聚物包含预期二硫键（图4C和D）且展示球聚物表位（图3E-3G）。在用嗜热菌蛋白酶截短后（实施例5o），观察到对于球聚物特异性抗体的亲和力中的预期增加（图3E-G）。然而，因缺乏cys残基（wt A?（16-35），实施例3m），或cys残基-SH的ACM保护（（17C ACM/34C ACM）A?（16-35），实施例3l），而不能形成这种二硫键的A?（16-35）肽，不能形成展示球聚物表位的寡聚物（图3H-3M）。

通过在位置17上引入赖氨酸和在位置34上引入半胱氨酸，可以采用多种异双功能交联试剂用于这2个残基的侧链之间的桥，包括磺基-SMCC、磺基-MBS和磺基-SIAB。例如，（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽（实施例3w）可以形成展示球聚物表位的寡聚物（图13A-13C）。此外，使用磺基-SMCC（实施例4w1）、磺基-MBS（实施例4w2）和磺基-SIAB（实施例4w3），可以对这些寡聚物实施交联，并且形成所需分子内共价交联（图12A-12C）。这些交联的Aβ寡聚物仍展示与球聚物特异性抗体的合适反应性（分别为图14A-14C、15A-15C和16A-16C）。此外，可以对这些A? 寡聚物实施嗜热菌蛋白酶截短（实施例4w1、4w2、& 4w3），从而导致对于球聚物特异性抗体的亲和力中的预期增加（图14A-14C、15A-15C和16A-16C）。

通过在位置17上引入赖氨酸和在位置34上引入谷氨酸，可以采用多种交联策略用于这2个残基的侧链之间的桥，包括通过与EDC反应、随后与磺基-NHS反应活化谷氨酸侧链。这个活化的侧链随后可以与在位置17上引入的赖氨酸残基的伯胺反应。例如，（17K，34E）N-Met A?（1-42）肽（实施例3x）可以形成展示球聚物表位的寡聚物（图17A-17C）。此外，使用EDC和磺基-NHS，可以对这些寡聚物实施交联，从而导致分子内共价交联（图12D）。这些交联的Aβ寡聚物仍展示与球聚物特异性抗体的合适反应性（图18A-18C）。此外，可以对这些A? 寡聚物实施嗜热菌蛋白酶截短（实施例4x），从而导致对于球聚物特异性抗体的亲和力中的预期增加（图18A-18C）。

实施例9：质谱学

来自实施例2a的（17C，34C）N-Met AN-Met Aβ（1-42）寡聚物（2a）的质谱分析法证实由实施例1a的（L17C,L34C）N-Met Aβ（1-42）突变肽（1a）形成寡聚物指示在2个Cys残基之间的肽内二硫键的有效形成（图4A）。质量集中在4622 Da，关于（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变肽的预期质量，其中形成单个二硫键。在质谱中未观察到共价二聚物肽的征兆。在用二硫苏糖醇（DTT）还原后，质量集中在4624 Da，如对于不含单个二硫键的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变肽预期的，并且在同位素去褶合中观察到的每个质量增加2 Da，如由二硫键还原预期的（图4B）。

来自实施例3p的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（3p）的质谱分析法证实由实施例1p的（17C，34C）Aβ（16-35）肽（1p）形成寡聚物指示在2个Cys残基之间的肽内二硫键的有效形成（图4C）。质量集中在2085 Da，关于（17C，34C）Aβ（16-35）肽的预期质量，其中形成单个二硫键。在质谱中未观察到共价二聚物肽的征兆。在用二硫苏糖醇（DTT）还原后，质量集中在2086 Da，如对于不含单个二硫键的（17C，34C）Aβ（16-35）肽预期的，并且在同位素去褶合中观察到的每个质量增加1 - 2 Da，如由二硫键还原预期的（图4D）。

来自实施例3s的（17C，34C）Aβ（16-42）寡聚物（3s）的质谱分析法证实由实施例1s的（17C，34C）Aβ（16-42）肽（1s）形成寡聚物指示在2个Cys残基之间的肽内二硫键的有效形成（图4E）。质量集中在2683 Da，关于（17C，34C）Aβ（16-35）肽的预期质量，其中形成单个二硫键。在质谱中未观察到共价二聚物肽的征兆。在用二硫苏糖醇（DTT）还原后，质量集中在2684 Da，如对于不含单个二硫键的（17C，34C）Aβ（16-42）肽预期的，并且在同位素去褶合中观察到的每个质量增加1 - 2 Da，如由二硫键还原预期的（图4F）。

来自实施例3k的（17C，34C）Aβ（12-42）寡聚物（3k）的质谱分析法证实由实施例1k的（17C，34C）Aβ（12-42）肽（1k）形成寡聚物指示在2个Cys残基之间的肽内二硫键的有效形成（图4G）。在质谱中未观察到共价二聚物肽的征兆。在用二硫苏糖醇（DTT）还原后，质量集中在3186 Da，如对于不含单个二硫键的（17C，34C）Aβ（12-42）肽预期的，并且在同位素去褶合中观察到的每个质量增加1 - 2 Da，如由二硫键还原预期的（图4H）。

来自实施例3r的（17KC，34C）Aβ（13-42）寡聚物（3r）的质谱分析法（ESI）证实由实施例1r的（17KC，34C）Aβ（13-42）肽（1r）形成寡聚物指示在2个Cys残基之间的肽内二硫键的有效形成（图4I）。虽然在质谱中观察到显著量的共价二聚物肽（数据未显示），但所需分子内二硫键是明显的。在用二硫苏糖醇（DTT）还原后，质量集中在3215 Da，如对于不含单个二硫键的（17KC，34C）Aβ（13-42）肽预期的，并且在同位素去褶合中观察到的每个质量增加1 - 2 Da，如由二硫键还原预期的（图4J）。

如通过SELDI-MS检测的，在嗜热菌蛋白酶消化前（来自实施例4a-4j）和后（来自实施例5a-5j）（xC，yC）N-Met A?（1-42）寡聚物的肽质量在图6中指出。

来自实施例4w1的在与异双功能交联试剂磺基-SMCC的交联反应后的用（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽制备的寡聚物的质谱（ESI）显示于图12A中。占优势种类看起来是所需产物。

来自实施例4w2的在与异双功能交联试剂磺基-MBS的交联反应后的用（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽制备的球聚物的质谱（MALDI）显示于图12B中。存在关于已形成所需交联的证据（4852 Da），然而，还观察到与后面有马来酰亚胺水解的MBS添加（4869 Da）、后面有水解的2个MBS加合物添加（5088 Da）、和未反应的肽（4652 Da）对应的质量。

来自实施例4w3的在与异双功能交联试剂磺基-SIAB的交联反应后的用（17K，34C）N-Met A?（1-42）肽制备的球聚物的质谱（ESI）显示于图12C中。箭标指出在所需交联形成后的预期质量（mw = 4810 Da）。

来自实施例4x的在与异双功能交联试剂EDC和NHS的交联反应后的用（17K，34E）N-Met A?（1-42）肽制备的球聚物的质谱（MALDI）显示于图12D中。箭标指出暗示2个交联的质量（mw = 4637 Da），并且已形成3个交联（mw = 4620 Da）。

实施例10：流体动力学分析

使用蓝宝石窗口将样品装载到标准二区池（two-sector cells）内。使用4孔或8孔转子检查所有样品。

条件如下：温度20℃，转子速度：42,000 rpm，收集干涉数据，以连续模式用0.003 cm的径向阶大小（radial step size）收集在280 nm的吸光度数据。每阶收集1个数据点（信号不进行平均）。一般地，在不超过9小时的过程期间收集200次扫描或更少。

如在Sedfit v8.9（P. Schuck（2000），" Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm

沉降速度实验显示N-Met Aβ（1-42）球聚物和来自实施例2a的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变寡聚物（2a）都形成均质寡聚物（图5A）。然而，（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）突变寡聚物展示更佳的流体动力学性质。

沉降速度实验还显示N-Met Aβ（1-42）截短的球聚物和来自实施例5y的嗜热菌蛋白酶截短的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物（5y）都形成均质寡聚物（图5B和C）。然而，嗜热菌蛋白酶截短的（L17C，L34C）N-Met Aβ（1-42）寡聚物展示更佳的流体动力学性质。

在5mM Na-PO₄、35mM NaCl，pH 7.4中，相对于wt N-Met A?（1-42）寡聚物，在N-Met（17C/34C）A?（1-42）寡聚物（实施例4y）中二硫键的引入的确稳定进一步的聚集（图5A）。此外，相对于wt N-Met A?（1-42）寡聚物，通过嗜热菌蛋白酶在残基20处截短后，二硫键稳定的（17C/34C）N-Met A?（1-42）寡聚物保持显著更加流体动力学均质的（实施例5y）。这在0.05％SDS的存在（图5B）和不存在下（图5C）都是明显的。事实上，在wt N-Met A?（1-42）寡聚物的嗜热菌蛋白酶处理后，导致太异质而无法在不存在0.05％SDS的情况下进行检查的制剂（数据未显示）。

实施例11：嗜热菌蛋白酶截短的（xC，yC）N-Met A?（1-42）寡聚物的碘乙酰胺烷基化和SELDI-MS分析

A：用于烷基化的嗜热菌蛋白酶截短的（xC，yC）N-Met A?（1-42）寡聚物和N-Met A?（1-42）球聚物：

对下述嗜热菌蛋白酶截短的寡聚物和球聚物实施碘乙酰胺烷基化

1）实施例5a 的嗜热菌蛋白酶截短的（14C,37C）N-Met A?（1-42）寡聚物

2）实施例5b的嗜热菌蛋白酶截短的（15C,36C）N-Met A?（1-42）寡聚物

3）实施例5c的嗜热菌蛋白酶截短的（16C,35C）N-Met A?（1-42）寡聚物

4）实施例5d的嗜热菌蛋白酶截短的（17C,34C）N-Met A?（1-42）寡聚物

5）实施例5e的嗜热菌蛋白酶截短的（18C,33C）N-Met A?（1-42）寡聚物

6）实施例5f的嗜热菌蛋白酶截短的（19C,32C）N-Met A?（1-42）寡聚物

7）实施例5g的嗜热菌蛋白酶截短的（20C,31C）N-Met A?（1-42）寡聚物

8）实施例5h的嗜热菌蛋白酶截短的（21C,30C）N-Met A?（1-42）寡聚物

9）实施例5i的嗜热菌蛋白酶截短的（22C,29C）N-Met A?（1-42）寡聚物

10）实施例5j的A?（1-42）嗜热菌蛋白酶截短的球聚物

B：碘乙酰胺烷基化

B1：对照样品

- 用5 μl 50 mM Tris/HCl、1 mM EDTA，pH 8.6（5分钟氦充气的）稀释2.5 μl嗜热菌蛋白酶截短的寡聚物或球聚物

- 在37℃温育20分钟

- 添加2 μl H₂O

- 在室温温育1小时

- 添加115 μl 50％CH₃CN、0.5％TFA

B2：碘乙酰胺烷基化样品

- 用5 μl 50 mM Tris/HCl、1 mM EDTA，pH 8.6（氦充气的）稀释2.5 μl嗜热菌蛋白酶截短的寡聚物或球聚物

- 在37℃温育20分钟

- 添加2 μl在H₂O中的100 mM碘乙酰胺（Sigma；目录号 I1149）溶液

- 在室温温育1小时

- 添加115 μl 50％CH₃CN、0.5％TFA

B3：DTT还原随后为碘乙酰胺烷基化样品

- 用5 μl 50 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、2 mM DTT，pH 8.6（氦充气的）稀释2.5 μl嗜热菌蛋白酶截短的寡聚物或球聚物

- 在37℃温育20分钟

- 在室温温育1小时

- 添加115 μl 50％CH₃CN、0.5％TFA

C：免疫沉淀的Aβ（20-42）肽的表面增强激光解吸电离质谱分析法（SELDI-MS）定量

- 将2 μL样品点在H4 Protein Chip Array（BioRad；目录号 C573-0028）上。

- 允许点在热培养箱板上干燥。

- CHCA溶液：

· 使5 mg CHCA溶解于150 μL乙腈 + 150 μL 1％TFA = 母液中；贮存于-20℃

· 用20 μL乙腈和20 μL 1％TFA稀释10 μL母液 = 工作CHCA溶液

· 将2 μL工作CHCA溶液应用于点

- 允许点在热培养箱板上干燥，并且通过SELDI-MS（表面增强激光解吸电离质谱分析法；BioRad，Protein chip SELDI系统企业版本））进行分析。

o 条件：质量范围：800 - 10000 Da；焦点质量（focus mass）：2220 Da；基质衰减（matrix attenuation）：500 Da；采样速率：400 MHz；加热发射（warming shots）：2具有能量：1100 nj；数据发射（shots）：10具有能量1000 nJoule；分区3个中的1个。

o 分析：检测了分别双重烷基化（2xCM）、烷基化（1xCM）或非烷基化（0xCM）肽质量峰的峰强度。

结果显示于图7中。

在不存在作为还原剂的DTT的情况下，碘乙酰胺不能使半胱氨酸的–SH基团烷基化，如果这已形成共价S-S键，半胱氨酸与另一个半胱氨酸。因此，通过SELDI-MS分析在嗜热菌蛋白酶处理后，（xC，yC）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物的碘乙酰胺烷基化反应的不存在（如通过图7中的0xCM指出的）显示S-S形成已在（xC，yC）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物中发生。在还原条件下验证碘乙酰胺烷基化反应原则上可以发生，其中使用DTT以破坏S-S且生成游离–SH基团，随后发现所述游离–SH基团可顺应碘乙酰胺烷基化（图7）。

实施例12：在嗜热菌蛋白酶截短前和后，（xC，yC）N-Met A?（1-42）寡聚物和A?（1-42）球聚物的斑点印迹分析

方法：

用于斑点印迹的Aβ标准：

1. 实施例4a的（14C,37C）N-Met A?（1-42）寡聚物

2. 实施例5a 的嗜热菌蛋白酶截短的（14C,37C）N-Met A?（1-42）寡聚物

3. 实施例4b的（15C,36C）N-Met A?（1-42）寡聚物

4. 实施例5b的嗜热菌蛋白酶截短的（15C,36C）N-Met A?（1-42）寡聚物

5. 实施例4c的（16C,35C）N-Met A?（1-42）寡聚物

6. 实施例5c的嗜热菌蛋白酶截短的（16C,35C）N-Met A?（1-42）寡聚物

7. 实施例4d的（17C,34C）N-Met A?（1-42）寡聚物

8. 实施例5d的嗜热菌蛋白酶截短的（17C,34C）N-Met A?（1-42）寡聚物

9. 实施例4e的（18C,33C）N-Met A?（1-42）寡聚物

10. 实施例5e的嗜热菌蛋白酶截短的（18C,33C）N-Met A?（1-42）寡聚物

11. 实施例4f的（19C,32C）N-Met A?（1-42）寡聚物

12. 实施例5f的嗜热菌蛋白酶截短的（19C,32C）N-Met A?（1-42）寡聚物

13. 实施例4g的（20C,31C）N-Met A?（1-42）寡聚物

14. 实施例5g的嗜热菌蛋白酶截短的（20C,31C）N-Met A?（1-42）寡聚物

15. 实施例4h的（21C,30C）N-Met A?（1-42）寡聚物

16. 实施例5h的嗜热菌蛋白酶截短的（21C,30C）N-Met A?（1-42）寡聚物

17. 实施例4i的（22C,29C）N-Met A?（1-42）寡聚物

18. 实施例5i的嗜热菌蛋白酶截短的（22C,29C）N-Met A?（1-42）寡聚物

19. 实施例4j的A?（1-42）球聚物

20. 实施例5j的A?（1-42）嗜热菌蛋白酶截短的球聚物

用于斑点印迹的材料：

Aβ标准：

在20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4 + 0.2 mg/ml BSA中在柱1–20中的Aβ抗原连续稀释物

1) 10 pmol/μl

2) 1 pmol/μl

3) 0.1 pmol/μl

4) 0.01 pmol/μl

5) 0.001 pmol/μl

硝酸纤维素：

反式斑点（Trans-Blot）转移介质，纯硝酸纤维素膜（0.45 μm）；BioRad

抗小鼠-AP：

AP326A（Chemicon）

抗兔-AP：

AP304A（Chemicon）

检测试剂：

NBT/BCIP片剂（Roche）

牛血清清蛋白,（BSA）：

11926 Serva

封闭试剂：

在TBS中的5％低脂乳

缓冲溶液：

TBS

25 mM Tris / HCl – 缓冲液pH 7.5

+ 150 mM NaCl

TTBS

25 mM Tris / HCl – 缓冲液pH 7.5

+ 150 mM NaCl

+ 0.05％Tween 20

PBS + 0.2 mg/ml BSA

20 mM NaH₂PO₄ 缓冲液pH 7.4

+ 140 mM NaCl

+ 0.2 mg/ml BSA

抗体溶液I:

兔血清样品或小鼠单克隆抗体用作抗体溶液I且如下制备：

- 兔血清样品（在20 ml在TBS中的1％低脂乳中1:200稀释）

- 小鼠单克隆抗体（在20 ml在TBS中的1％低脂乳中稀释至0.2 μg/ml）

抗体溶液II:

在抗体溶液I是兔血清样品的情况下，那么抗体溶液II是抗兔-AP。在抗体溶液I是小鼠单克隆抗体的情况下，那么抗体溶液II是抗小鼠-AP。

抗体溶液II如下制备：

- 抗小鼠-AP：在TBS中的1％低脂乳中1:5000稀释

- 抗兔-AP：在TBS中的1％低脂乳中1:5000稀释

斑点印迹程序：

1) 将各1 μl不同的Aβ标准（以其5个连续稀释）以彼此约1 cm的距离点在硝酸纤维素膜上。

2) 允许Aβ标准点在硝酸纤维素膜上在空气中在室温（RT）干燥至少10分钟（= 斑点印迹）

3) 封闭：

使斑点印迹与30 ml在TBS中的5％低脂乳在RT温育1.5小时。

4) 洗涤：

弃去封闭溶液，并且使斑点印迹与20 ml TTBS一起在振荡下在RT温育10分钟。

5) 抗体溶液I：

弃去洗涤缓冲液，并且使斑点印迹与抗体溶液I一起在RT温育2小时。

6) 洗涤：

弃去抗体溶液I，并且使斑点印迹与20 ml TTBS一起在振荡下在RT温育10分钟。弃去洗涤溶液，并且使斑点印迹与20 ml TTBS一起在振荡下在RT温育10分钟。弃去洗涤溶液，并且使斑点印迹与20 ml TBS一起在振荡下在RT温育10分钟。

7) 抗体溶液II：

弃去洗涤缓冲液，并且使斑点印迹与抗体溶液II一起在RT温育1小时

8) 洗涤：

弃去抗体溶液II，并且使斑点印迹与20 ml TTBS一起在振荡下在RT温育10分钟。弃去洗涤溶液，并且使斑点印迹与20 ml TTBS一起在振荡下在RT温育10分钟。弃去洗涤溶液，并且使斑点印迹与20 ml TBS一起在振荡下在RT温育10分钟。

9) 显影：

弃去洗涤溶液。使1片NBT/BCIP溶解于20 ml H₂O中，并且使斑点印迹与这种溶液一起温育4分钟。通过用H₂O强烈洗涤停止显影。

结果显示于图8中。

嗜热菌蛋白酶截短的（xC，yC）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物显示与Aβ（1-42）嗜热菌蛋白酶截短的球聚物可比较的由Aβ 球聚物特异性抗体7C6和多克隆兔血清5599识别。例外是嗜热菌蛋白酶截短的（15C，36C）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物，其仅由多克隆兔血清5599识别。这可能是由于在嗜热菌蛋白酶截短的（15C，36C）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物中在位置36上的半胱氨酸突变，其可能干扰7C6的Aβ 球聚物表位识别。此外，抗体7C6和多克隆兔血清5599未检测出无嗜热菌蛋白酶处理的（xC，yC）N-Met-Aβ（1-42）寡聚物，这可与Aβ（1-42）球聚物比较。应当指出多克隆兔血清5599对于点的所有肽一般显示高本底反应，其不能归因于Aβ球聚物表位的特异性识别（图8）。

实施例13：用SELDI-MS分析的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物的碘乙酰胺烷基化

A：用于烷基化的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物：

使用实施例4p的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（4p）。

B：碘乙酰胺烷基化

B1：无碘乙酰胺烷基化的对照样品

- 用50 μl 100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA，pH 8.6（5分钟氦充气的）稀释2.5 μl寡聚物

- 在37℃温育20分钟

- 添加20 μl H₂O

- 在室温温育6小时

- 在49 μl 50％CH₃CN、0.5％TFA中稀释1 μl样品

B2：碘乙酰胺烷基化样品

- 在37℃温育20分钟

- 添加20 μl在H₂O中的100 mM碘乙酰胺（Sigma；目录号 I1149）溶液

- 在室温温育6小时

- 在49 μl 50％CH₃CN、0.5％TFA中稀释1 μl样品

B3：DTT还原随后为碘乙酰胺烷基化样品

- 用50 μl 100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、2 mM DTT，pH 8.6（氦充气的）稀释2.5 μl寡聚物

- 在37℃温育20分钟

- 在室温温育6小时

- 在49 μl 50％CH₃CN、0.5％TFA中稀释1 μl样品

C：寡聚物的表面增强激光解吸电离质谱分析法（SELDI-MS）定量

- 将2 μL样品B1和B2和B3的样品个别点在H4 Protein Chip Array（BioRad；目录号 C573-0028）上。

- 允许点在热培养箱板上干燥。

- CHCA溶液：

·使5 mg CHCA溶解于150 μL乙腈 + 150 μL 1％TFA = 母液中；贮存于-20℃

·用20 μL乙腈和20 μL 1％TFA稀释10 μL母液 = 工作CHCA溶液

· 将2 μL工作CHCA溶液应用于点

- 允许点在热培养箱板上干燥，并且通过SELDI-MS（表面增强激光解吸电离质谱分析法；BioRad，Protein chip SELDI系统企业版本）进行分析。

o 条件：质量范围：800 - 10000 Da；焦点质量：2220 Da；基质衰减：500 Da；采样速率：400 MHz；加热发射：2具有能量：1100 nj；数据发射：10具有能量1000 nJoule；分区2个中的1个。

o 分析：检测了分别双重烷基化（2xCM）、烷基化（1xCM）或非烷基化（0xCM）寡聚物质量峰的峰强度。

结果显示于图9中。

在不存在作为还原剂的DTT的情况下，碘乙酰胺不能使半胱氨酸的–SH基团烷基化，如果这已形成共价S-S键，半胱氨酸与另一个半胱氨酸。因此，如通过SELDI分析的，（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物的碘乙酰胺烷基化反应的不存在显示S-S形成已在（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物中发生。在还原条件下验证碘乙酰胺烷基化反应原则上可以发生，其中使用DTT以破坏S-S且生成游离–SH基团，随后发现所述游离–SH基团可顺应碘乙酰胺烷基化（图9）。

实施例14：使用免疫沉淀与SELDI-MS检测，通过Aβ 球聚物特异性抗体识别（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物

A：用单克隆小鼠抗体活化Dynabeads

- 使dynabeads（Dynabeads M-280绵羊抗小鼠IgG，Invitrogen；目录号：112.02）的原液悬浮液小心振荡，以防止发泡。

- 无菌取出1 mL，并且转移至1.5 mL反应小瓶。

- 用1 mL免疫沉淀（IP）-洗涤缓冲液（IP-洗涤缓冲液：PBS（20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4），0.1％BSA）将dynabeads洗涤3次5分钟。在洗涤程序过程中，小心取出上清液，同时经由磁性分离器支架（magnetic separator stand）（MSS）使dynabeads固定在反应小瓶的侧面上。

- 使洗涤的dynabeads与40 μg Aβ抗体一起在1 mL PBS、0.1％BSA中温育

- 通过在振荡下在4℃过夜温育来执行活化。

- 用1 mL IP-洗涤缓冲液（PBS（20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4），0.1％BSA）将活化的dynabeads洗涤4次30分钟（再次使用MSS）。

- 用1 mL PBS、0.1％BSA、0.02％叠氮化钠（Na-Azide）使活化的dynabeads重悬浮；涡旋且短暂离心。

- 使抗体活化的dynabeads贮存于4℃直至进一步使用。

B：用于免疫沉淀的样品的制备：

1：无碘乙酰胺烷基化的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物

- 用50 μl 100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA，pH 8.6（5分钟氦充气的）稀释2.5 μl实施例4p的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（4p）

- 在37℃温育20分钟

- 添加20 μl H₂O

- 在室温温育6小时

- 在Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Units Plus Float，3500 MWCO（Thermo Scientific，#69558）中针对5 mM NaH₂PO₄、35 mM NaCl，pH 7.4透析过夜

2：具有DTT和碘乙酰胺烷基化的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物

- 用50 μl 100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、2 mM DTT，pH 8.6（氦充气的）稀释2.5 μl实施例4p的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物（4p）

- 在37℃温育20分钟

- 在室温温育6小时

C：免疫沉淀（IP）

- 用20 mM NaH₂PO₄，140 mM NaCl；0.05％Tween 20，pH 7.4 + 0.1％BSA将（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物样品B1和B2稀释至1 μg/ml的终浓度。

- 使下文列出的各25 μL抗体活化的dynabeads与0.1 mL稀释的样品一起温育：

·10F11-Dynabead

· 7C6-Dynabeads

·IgG2a-Dynabeads（用作用于IP本底的同种型对照）

· IgG2b-Dynabeads（用作用于IP本底的同种型对照）

- 通过在振荡下在6℃温育18小时来执行免疫沉淀。

- 用MSS固定化dynabeads。

- 小心取出上清液且弃去。

- 如下洗涤dynabeads：

o 用500 μL 20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4 + 0.1％BSA 2次5分钟；

o 用500 μL 2 mM NaH₂PO₄、14 mM NaCl，pH 7.4 1次3分钟；

o 重要：在最后一次取出洗涤缓冲液后，使反应小瓶离心，放回到MSS中并且小心取出剩余滴；

o 将在H₂O中的10 μL 50％CH₃CN、0.5％TFA添加到反应小瓶中且涡旋；

o 使反应小瓶在RT在振荡下温育10分钟；

o 用MSS固定化dynabeads；

o 小心取出包括免疫沉淀的洗脱的Aβ种类的上清液（= IP-洗脱物）。

D：免疫沉淀的（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物的表面增强激光解吸电离质谱分析法（SELDI-MS）定量

- 将2 μL IP-洗脱物点在H4 Protein Chip Array（BioRad；目录号 C573-0028）上。

- 允许点在热培养箱板上干燥。

- CHCA溶液：

·用20 μL乙腈和20 μL 1％TFA稀释10 μL母液 = 工作CHCA溶液

· 将2 μL工作CHCA溶液应用于点

o 条件：质量范围：800 - 10000 Da；焦点质量：2220 Da；基质衰减：500 Da；采样速率：400 MHz；加热发射：2具有能量：1350 nj；数据发射：10具有能量1300 nJoule；分区2个中的1个。

o 分析：定量各Aβ（16-35）肽质量峰的峰强度。

结果显示于图10A和10B中。

（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物由Aβ 球聚物特异性抗体7C6和10F11识别。通过同种型对照抗体IgG2a和IgG2b控制在免疫沉淀过程中的非特异性本底水平，所述同种型对照抗体IgG2a和IgG2b在SELDI-MS分析中显示显著更低的信号强度（图10A）。如果半胱氨酸 S-S共价由DTT还原为游离–SH，并且在游离–SH上执行后续碘乙酰胺反应，那么后续IP揭示（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物构象已被破坏这是因为具有1个或2个烷基化–SH基团（1x或2xCM）的（17C，34C）Aβ（16-35）肽不再由7C6或10F11识别。仅由于不充分的DTT还原和/或碘乙酰胺反应，具有完整半胱氨酸 S-S共价键（0xCM）的剩余非烷基化（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物进行免疫沉淀。总之，（17C，34C）Aβ（16-35）寡聚物包含Aβ 球聚物表位，而线性化（17C，34C）Aβ（16-35）肽则不。

参考实施例

重组N-Met Aβ（1-42）肽

克隆和表达：使用pET29载体在大肠杆菌（E.coli）中克隆且表达编码淀粉状蛋白β肽的序列。所表达的肽完全保留其N末端甲硫氨酸残基，并且代表从位置0到位置42的淀粉状蛋白β的天然序列（来自淀粉状蛋白前体蛋白质APP内）。肽使用大肠杆菌BL21（DE3）细胞进行表达。细胞在30℃生长直至培养物OD₆₀₀nm达到0.45，随后通过添加1 mM IPTG诱导Aβ表达，并且将瓶转移至在41℃的定轨振荡器。诱导后3小时收获细胞。不溶性级分获得预期大小的产物，如在考马斯染色的SDS蛋白质凝胶上显现的。

重组表达的Aβ的纯化. 关于所有分离的样品的原材料都是得自大肠杆菌细胞培养收获的在-80℃冷冻的细胞糊（cell paste）。在4℃将冷冻的细胞糊添加到5-10体积的裂解缓冲液（100 mM Tris最终pH 7.5）中。添加Benzonase,（EMD Biosciences，Madison，WI）至细胞裂解物的0.1 μl/ml浓度，并且搅拌直至沉淀均一地重悬浮（45-60分钟）。使用M-110L微射流机（microfluidizer）（Microfluidics，Newton，PA）执行细胞裂解。使裂解的材料在15℃以23000xG在JLA 16.25转子（Beckman Instruments，Palo Alto，CA）中在4℃旋转30分钟。通过添加pH 7.5 - 7.8的冷50 mM Tris缓冲液将材料洗涤3次，并且随后使重悬浮的沉淀匀浆且以23000xG在JLA 16.25转子中旋转。这随后为水洗涤以去除Tris缓冲液。使沉淀重悬浮于包含0.1％三氟乙酸的水中。使重悬浮的样品壳型冷冻且置于冻干器上。

在37℃将10–20 g冻干的材料添加到DMSO中，并且使用组织匀浆器进行匀浆，并且搅拌1小时，随后允许静置过夜。随后使样品在2个250 mL nalgene瓶中在25℃以23000xG在JLA 16.25转子中旋转30分钟。倾析DMSO上清液，并且将另外50 mL DMSO添加到每个瓶中，匀浆且旋转，并且随后将这个DMSO倾析并且同样保存。弃去沉淀。

将DMSO提取物小心地倒入6000-8000截断透析膜（Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA）内，足以保持约1.5 L。它针对10 mL浓缩氨（0.1％v/v）已加入其中的10 L 15％乙腈进行透析。允许这在工作台上透析4小时。定时地拿出透析膜，以便使稠密DMSO再分配且加速透析过程。在4小时结束时，将膜置于新鲜更换的10 L缓冲液内，并且过程继续另外2小时。在透析结束时，取出样品且在25℃以23000xG离心30分钟。将样品转移至2 L量筒，并且用在水中的0.1％氨稀释2倍至多达2000 ml的总体积。

用来自Polymer Labs（Amherst，MA）的15-20微米、300 A、PLPR-S反相树脂手工填充2.2 X 25 cm（95 mL）不锈钢柱。使其通过自75％乙腈 + 0.1％氨（75％B）的循环，并且平衡至10％B。使柱与Pharmacia P500泵（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）连接，并且在室温在~16.7小时期间将1400 mL肽溶液通过柱过夜用泵抽吸到工作台上。第二天早晨，将柱用P500泵用约250 mL 10％B洗涤，并且随后与Beckman HPLC（Palo Alto，CA）连接。用10％B继续洗涤直至在280 nm处的吸光度达到基线，并且随后起始在200分钟期间从10％B到30％B的梯度（0.1％梯度）。全刻度吸光度保持在1吸光度单位，并且流动在5 mL/分钟。将材料手工收集在约10 mL的约50个级分中。将各100 uL级分置于speed vac上，干燥且将100 uL 1X样品缓冲液添加到管中。材料在3500截断膜上在Amicon（Millipore Inc，Billerica，CA）搅拌池上进行浓缩，并且从~350浓缩到50 mL，随后使其冻干至干燥过夜。

所产生的纯化的Aβ肽显示出4645 - 4648 Da的观察质量。这与N末端甲硫氨酸的存在一致，如由所采用的DNA表达序列预期的。

参考实施例

参考实施例1

Aβ（1-42）球聚物

使Aβ（1-42）合成肽（H-1368，Bachem，Bubendorf，瑞士）以6 mg/mL悬浮于100％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）中，并且在振荡下在37℃温育1.5小时用于完全溶解。HFIP充当氢键破坏物，并且用于消除Aβ肽中预先存在的结构不均一性。通过在SpeedVac中蒸发去除HFIP，并且使Aβ（1-42）以5 mM的浓度重悬浮于二甲亚砜中，并且超声处理20秒。HFIP预处理的Aβ（1-42）在磷酸缓冲盐水（PBS）（20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4）中稀释至400 μM，并且添加1/10体积2％十二烷基硫酸钠（SDS）（在H₂O中）（终浓度0.2％SDS）。在37℃下温育6小时导致16/20-kDa Aβ（1-42）球聚物中间体。通过用3体积H₂O进一步稀释，并且在37℃温育18小时，生成38/48-kDa Aβ（1-42）球聚物。在3000 g离心20分钟后，通过超滤（30-kDa截断）使样品浓缩，针对5 mM NaH₂PO₄、35 mM NaCl，pH 7.4透析，在10000 g离心10分钟，并且取出包括38/48-kDa Aβ（1-42）球聚物的上清液。

参考实施例2

N-Met Aβ（1-42）球聚物

使在2个1.6 mL Eppitubes（2 x 500 μL份）（Eppendorf Northamerica，Westbury，NY）中的6 mg人淀粉状蛋白β（1-42）肽（Bachem Biosciences，King of Prussia，PA）或重组N-Met Aβ（1-42）肽 + 2 X 500 μL HFIP（六氟异丙醇）（6 mg/mL悬浮液）在37℃振荡1.5小时，在speedvac中干燥1.5小时，并且随后重悬浮于各132 μL DMSO的2个等分试样中，在水浴中超声处理20秒，在板式搅拌器上轻轻振荡10分钟；并且贮存于-20℃。将690 μL 20 mM NaPO₄；140 mM NaCl；pH 7.4缓冲液装入15 mL Falcon管中，添加在DMSO中的60 μL 5 mM淀粉状蛋白原液悬浮液（400 μM淀粉状蛋白），并且随后添加在水中的75 μl 2％SDS（0.2％SDS）。使混合物在37℃温育6–8 h，并且添加2475 μL水（用水4倍稀释）达3.3 mL的终体积。使混合物在37℃温育18-20小时，在3000xG离心10分钟，并且最后通过30 kDa Centriprep（Millipore Inc，Billerica，CA）使上清液浓缩至1 mL。样品在PBS/4（PBS = 磷酸缓冲盐水，1 mM KCl、154 mM NaCl、4 mM磷酸盐，pH 7.4；PBS/4 = 用蒸馏水1比4稀释的PBS，最终pH 7.4）中在4℃在12-15 kDa截断透析管中透析过夜。使浓缩物在10,000xG在Eppendorff管中离心10分钟（清楚的沉淀），以250 μL等分试样且冷冻于-20℃。

参考实施例3

Aβ（20–42）球聚物

使参考实施例3的1.59 ml Aβ（1-42）球聚物制剂与38 ml缓冲液（50 mM MES/NaOH，pH 7.4）和200 μl在水中的1 mg/ml嗜热菌蛋白酶溶液（Roche）混合。使反应混合物在RT搅拌20小时。随后添加80 μl在水中的100 mM EDTA溶液，pH 7.4，并且用400 μl 1％强度SDS溶液将混合物进一步调整至0.01％的SDS含量。经由15 ml 30 kDa Centriprep管，使反应混合物浓缩至约1 ml。使浓缩物与9 ml缓冲液（50 mM MES/NaOH、0.02％SDS，pH 7.4）混合，并且再次浓缩至1 ml。使浓缩物在6℃针对1 l缓冲液（5 mM磷酸钠、35 mM NaCl）在透析管中透析16小时。用在水中的2％强度SDS溶液将透析液调整至0.1％的SDS含量。使样品在10000 g离心10分钟，并且取出Aβ（20–42）球聚物上清液。

参考实施例4

Aβ（12-42）球聚物

使2 ml参考实施例3的Aβ（1-42）球聚物制剂与38 ml缓冲液（5 mM磷酸钠、35 mM氯化钠，pH 7.4）和150 μl在水中的1 mg/ml GluC内切蛋白酶（Roche）混合。使反应混合物在RT搅拌6小时，并且随后添加另外150 μl在水中的1 mg/ml GluC内切蛋白酶（Roche）。使反应混合物在RT搅拌另外16小时，随后添加8 μl 5 M DIFP溶液。经由15 ml 30 kDa Centriprep管，使反应混合物浓缩至约1 ml。使浓缩物与9 ml缓冲液（5 mM磷酸钠、35 mM氯化钠，pH 7.4）混合，并且再次浓缩至1 ml。使浓缩物在6℃针对1 l缓冲液（5 mM磷酸钠、35 mM NaCl）在透析管中透析16小时。用在水中的1％强度SDS溶液将透析液调整至0.1％的SDS含量。使样品在10000 g离心10分钟，并且取出Aβ（12–42）球聚物上清液。

参考实施例5

Aβ（1-40）单体（0.1％NaOH）

使1 mg Aβ（1-40）（Bachem Inc.，目录号 H-1194）溶解于在H₂O中的232.6 μl 0.1％NaOH（新鲜制备的）（= 4.3 mg/ml = 1 nmol/1 μl）中，并且立即在室温振荡30秒以获得澄清溶液。将样品贮存于-20℃用于进一步使用。

参考实施例6

Aβ（1-42）单体（0.1％NaOH）

使1 mg Aβ（1-42）（Bachem Inc.，目录号 H-1368）溶解于在H₂O中的222.2 μl 0.1％NaOH（新鲜制备的）（= 4.5 mg/ml = 1 nmol/1 μl）中，并且立即在室温振荡30秒以获得澄清溶液。将样品贮存于-20℃用于进一步使用。

参考实施例7

Aβ原纤维

使1 mg Aβ（1-42）（Bachem Inc. 目录号：H-1368）溶解于500 μl含水0.1％NH₄OH（Eppendorff管）中，并且使样品在室温搅拌1分钟。使样品在10000xg离心5分钟，并且取出上清液。将100 μl这种新鲜制备的Aβ（1-42）溶液用300 μl 20 mM NaH₂PO₄ ；140 mM NaCl，pH 7.4中和。用1％HCl将pH调整至pH 7.4。使样品在37℃温育24小时，并且离心（在10000xg 10分钟）。弃去上清液，并且用400 μl 20mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4将原纤维沉淀洗涤2次，并且随后通过涡旋1分钟用400 μl 20 mM NaH₂PO₄；140 mM NaCl，pH 7.4最终重悬浮。

参考实施例8

sAPPα

由Sigma供应（目录号S9564；在20 mM NaH₂PO₄；140 mM NaCl ；pH 7.4中25 μg）。sAPPα用20 mM NaH₂PO₄、140 mM NaCl，pH 7.4、0.2 mg/ml BSA稀释至0.1 mg/ml（= 1 pmol/μl）。

参考实施例9

多克隆抗血清5599

多克隆抗血清5599以与WO 2004/067561，实施例25a，Serum a1 5600中所述的多克隆抗血清5600的方式获得，除使用Aβ（20-42）球聚物代替5600 LPH缀合的Aβ（20-42）球聚物外。

Claims

1.一种包括氨基酸序列的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述序列（i）形成环，（ii）与天然人Aβ肽或其部分具有至少66％同一性，（iii）包括至少6个邻接氨基酸残基，和（iv）具有彼此共价连接的至少2个非邻接氨基酸残基。

2.一种包括氨基酸序列的拟肽的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述序列（i）形成环，（ii）与天然人Aβ肽或其部分具有至少66％同一性，（iii）包括至少6个邻接氨基酸残基，和（iv）具有彼此共价连接的至少2个非邻接氨基酸残基。

3.权利要求1或2的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述环是β-发夹环。

4.权利要求1-3中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中天然Aβ人肽或其部分是Aβ（X .. Y），X选自数目1 .. 23、15 .. 23或18 .. 22，并且Y选自数目28 .. 43或28 .. 43。

5.权利要求1-4中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述6个邻接氨基酸残基包括序列VGSN或DVGSNK或AED。

6.权利要求1-5中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列F₁₉X₂₀A₂₁-Q-A₃₀I₃₁I₃₂，其中X₂₀代表氨基酸，并且Q是包括序列VGSN的氨基酸序列。

7.权利要求6的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述氨基酸序列Q的至少部分形成环，并且所述氨基酸序列F₁₉X₂₀A₂₁和A₃₀I₃₁I₃₂处于反向平行方向。

8.权利要求1-7中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:1-368的序列，所述序列的至少2个氨基酸残基这样进行修饰，以便形成序列内共价键。

9.权利要求1-8中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列是选自SEQ ID NO:369-698的序列，其中

X₁₂是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₃是组氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₄是组氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₅是谷氨酰胺、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸；

X₁₆是赖氨酸、精氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₇是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₈是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₁₉是苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₀是苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₁是丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₂是谷氨酸、天冬氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₉是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₀是丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₁是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₂是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₃是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₄是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₅是甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₆是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₇是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₃₈是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；和

X₃₉是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基，

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁和X₂₂的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接。

10.权利要求1-5中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列包括序列X₂₀-Q-X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁，其中X₂₀、X₂₄ X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉各自独立地代表氨基酸，并且Q是包括序列AED的氨基酸序列。

11.权利要求10的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述氨基酸序列X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇的至少部分形成环，并且所述氨基酸序列X₂₀A₂₁E₂₂D₂₃和X₂₈X₂₉A₃₀I₃₁处于反向平行方向。

12.权利要求1-5中任一项的淀粉状蛋白β肽类似物，其中所述淀粉状蛋白β肽类似物的氨基酸序列是选自SEQ ID NO:699-960的序列，其中

X₂₄是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₅是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₆是丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₇是天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

X₂₈是赖氨酸、精氨酸或与所述序列的另一个氨基酸残基共价连接的氨基酸残基；

选自X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀的至少一个氨基酸残基和选自X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉的至少一个氨基酸残基彼此共价连接。

13.一种寡聚物，其包括多个如权利要求1-12中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物。

14.一种用于制备如权利要求1-12中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物的方法，所述方法包括

（iii）提供肽或其拟肽；

（iv）对所述肽或拟肽实施足以形成键的条件。

15.用于制备如权利要求13中定义的寡聚物的方法，所述方法包括

（i）提供肽或其拟肽；

（ii）对所述肽或拟肽实施足以形成寡聚物和键的条件。

16.一种组合物例如疫苗，其包括如权利要求1-13中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物和任选地药学上可接受的载体。

17.如权利要求1-13中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备用于在治疗或预防淀粉样变性中的自动免疫接种的药物组合物的用途，所述淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病或唐氏综合症的淀粉样变性。

18.如权利要求1-13中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物用于制备诊断淀粉样变性的组合物的用途，所述淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病或唐氏综合症的淀粉样变性。

19.一种鉴定能够与如权利要求1-13中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的试剂的方法，所述方法包括步骤：a）在足以使一种或多种试剂与所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的时间和条件下，使一种或多种目的试剂暴露于所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物；和b）鉴定与所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的那些试剂。

20.一种提供能够与如权利要求1-13中任一项中定义的淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体的方法，其包括：

i）提供包括所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物的抗原；

ii）使抗体谱暴露于所述抗原；和

iii）从所述谱中选择与所述淀粉状蛋白β肽类似物或寡聚物结合的抗体。