MX2011000975A

MX2011000975A - Analogos de peptido b amiloide, oligomeros de los mismos, procedimientos para preparar y composiciones que comprenden dichos analogos u oligomeros, y sus usos.

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Publication number: MX2011000975A
Application number: MX2011000975A
Authority: MX
Inventors: Heinz Hillen; Stefan Barghorn; Liping Yu; Rohinton Edalji; Leo Barrett; Paul Richardson; Edward OLEJNICZAK; John Harlan; Thomas Holzman
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2011-05-25
Also published as: EP2303920A4; US20110092445A1; EP2303920A2; CN102203124A; WO2010011947A3; WO2010011947A2; CA2730804A1; JP2011529084A

Abstract

La presente invención se refiere a análogos de péptido ß amiloide que comprenden una secuencia de aminoácido o un peptidomimético de la misma, en la cual la secuencia (i) forma un bucle, (ii) tiene por lo menos 66% de identidad con la secuencia de aminoácido del péptido Aß original o una porción del mismo, (iii) comprende por los menos 6 residuos de aminoácido contiguos y (iv) tiene por lo menos 2 residuos de aminoácido no contiguos los cuales están ligados covalentemente uno al otro, a oligómeros que comprenden una pluralidad de dichos análogos de péptido ß amiloide, a procedimientos para preparar los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, a composiciones que comprenden los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, y a usos de los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide tal como su uso para tratar o prevenir una amiloidosis (por ejemplo mediante inmunización activa), para diagnosticar una amiloidosis, y para proveer agentes que se pueden unir a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide. La presente invención también describe agentes que se pueden unir a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, por ejemplo, anticuerpos, composiciones que comprenden los agentes, y usos de los agentes tal como su uso para tratar o prevenir una amiloidosis (por ejemplo mediante inmunización pasiva) y para diagnosticar una amiloidosis.

Description

ANALOGOS DE PEPTIDO B AMILOIDE. OLIGOMEROS DE LOS MISMOS. PROCEDIMIENTOS PARA PREPARAR Y COMPOSICIONES QUE COMPREN DEN DICHOS ANALOGOS U OLIGOM EROS. Y SUS USOS CAM PO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a análogos de péptido ß amiloide, a oligómeros que comprenden una pluralidad de dichos análogos de péptido ß amiloide, a procedimientos para preparar los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, a composiciones que comprenden los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, y a los usos de los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide tal como su uso para tratar o prevenir una amiloidosis (por ejemplo mediante inmunización activa), para diagnosticar una amiloidosis, y para proveer agentes que se puedan unir a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide. La presente invención también describe agentes que se pueden unir a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, por ejemplo anticuerpos, composiciones que comprenden a dichos agentes, y usos de los agentes tal como su uso para tratar o prevenir u na amiloidosis (por ejemplo mediante inmunización pasiva) y para diagnosticar una amiloidosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En 1 907, el médico Alois Alzheimer describió por primera vez las características neuropatologicas de una forma de demencia nombrada posteriormente en su honor como Enfermedad de Alzheimer (EA). En particular, EA es la causa más frecuente de demencia entre la gente de edad avanzada, con una incidencia de aproximadamente 1 0% de la población en aquellos mayores de 65 años de edad. Al incrementarse la edad , también se eleva la probabilidad de enfermedad . Globalmente, hay aproximadamente 1 5 millones de personas afectadas con la enfermedad y se espera que incrementos adicionales en la expectativa de vida incrementen el número de personas afectadas con enfermedad hasta aproximadamente el triple en el transcurso de las siguientes décadas.

Desde un punto de vista molecular, la enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por un depósito de proteínas anormalmente agregadas. En el caso de las placas amiloides extracelulares, estos depósitos consisten principalmente de filamentos de péptido ß amiloide, y en el caso de los ovillos neu rofibrilares intracelulares (N FTs por sus siglas en inglés), principalmente de proteína tau . El péptido ß amiloide (?ß) surge de la proteína precursora ß-amiloide mediante corte proteolítico. Este corte es efectuado por la actividad cooperativa de varias proteasas llamadas a-, ß- y ?-secretasa. El corte lleva a un número de fragmentos específicos de diferente longitud . Las placas amiloides consisten principalmente de péptidos con una longitud de 40 o 42 aminoácidos (?ß40, ?ß42). El producto de corte dominante es ?ß40; sin embargo, ?ß42 tiene un efecto tóxico mucho más fuerte. Depósitos amiloides cerebrales y deterioros cognitivos muy similares a aquellos observados en la enfermedad de Alzheimer también son rasgos característicos del síndrome de Down (trisomia 21), el cual se presenta a una frecuencia de aproximadamente 1 en 800 nacimientos.

La hipótesis de la cascada de amiloide de Hardy e Higgins postula que la producción incrementada de ?ß(1-42) podría conducir a la formación de protofibrillas y fibrillas (es decir, los componentes principales de las placas de ?ß), siendo estas fibrillas las responsables de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer. A pesar de la baja correlación entre la gravedad de la demencia y la carga de placa ?ß depositada, esta hipótesis fue favorecida hasta hace poco.

El documento US 7,342,091 describe análogos cíclicos solubles de péptido ß amiloide que tienen un puente intra-péptido en la región entre los residuos Gln15 y Val24 (686 y 695 en APP), en el que los dos aminoácidos que participan en la formación del puente están acomodados a separaciones relativas de i+3, i+4, i+5, i+6 o i+7. Específicamente, las cadenas laterales de Asp17 y Lys21 del péptido ?ß (residuos 688 y 692 en la numeración de la APP) están conectadas a través de un puente covalente. Los análogos cíclicos solubles del péptido ß amiloide descritos en el documento US 7,342,091 están diseñados para inhibir la amiloidogénesis o formación de amiloide por parte del péptido ?ß endógeno. Es decir, los análogos cíclicos solubles tendrían que interactuar físicamente con el péptido ?ß y bloquear la formación de amiloide.

Sin embargo, el descubrimiento de formas solubles de ?ß en cerebros con EA, lo cual se correlaciona de manera más adecuada con los síntomas de EA que la carga de placa, ha llevado a una hipótesis de cascada de amiloide revisada.

Bajo la mayoría de condiciones, los péptidos ß amiloides rápidamente se convierten en formas fibrilares. Sin embargo, la adición de detergente o ácido graso puede dar como resultado formas solubles de larga vida (WO 2004/067561; WO2006/094724; S. Barghorn et al., J. Neurochem. 95, 834 (2005)) que son antígenos potentes en ratones y conejos para provocar anticuerpos específicos. Estos han demostrado que se unen a las prolongaciones dendríticas de las neuronas en cultivos de células del hipocampo y bloquean completamente la potenciación a largo plazo en secciones de hipocampo de rata. Estos datos sugieren que los péptidos ß amiloides con rasgos estructurales similares a las formas solubles preparadas in vitro también están presentes in vivo.

De manera más específica, el documento WO 2004/067561 se refiere a oligomeros globulares ("globulómeros") del péptido ?ß(1-42) y a un procedimiento para prepararlos. Los datos sugieren la existencia de una ruta independiente de fibrilla amiloide de plegamiento y ensamblado del ?ß como oligomeros de ?ß los cuales presentan uno o más epítopes exclusivos (referidos de aquí en adelante como los epítopes de globulómero). Debido a que los epítopes de globulómero se detectaron en el cerebro de pacientes con EA y en ratones transgénicos APP y a que los globulómeros se unen específicamente a las neuronas y bloquean a LTP, los globulómeros representan un confórmero de ?ß patológicamente relevante. El documento WO 2004/067561 también describe que la proteólisis limitada de los globulómeros produce versiones truncadas de dichos globulómeros tales como los globulómeros ?ß(20-42) o ?ß(12-42). Estos globulómeros ?ß(20-42) y ?ß(12-42) han sido utilizados para generar anticuerpos específicos de globulómero. Por ejemplo, el documento WO 2007/062852 describe varios anticuerpos monoclonales los cuales reconocen específicamente al globulómero ?ß(20-42).

El documento WO 2006/094724 se refiere a oligómeros globulares ?ß(?-38 .. 43) no difusibles en los cuales X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 1 .. 24. Se dice que estos globulómeros se pueden obtener utilizando los mismos procedimientos descritos en el documento WO 2004/067561, es decir oligomerización de los péptidos ?ß(1-38 ..43) inducida por SDS o por ácido graso para generar los globulómeros ?ß(1-38 43), y proteólisis limitada de los globulómeros ?ß(1-38 .. 43) para generar versiones truncadas de los mismos, es decir, los globulómeros ?ß(?-38 .. 43) en los cuales X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 2 .. 24.

Tanto WO 2004/067561 como WO 2006/094724 describen también globulómeros entrelazados que se obtienen haciendo reaccionar un globulómero con agentes de entrelazamiento tal como glutardialdehído. Se observa que el entrelazamiento ocurre solamente entre los grupos amino de los extremos N-terminales y Lys-16, al tiempo que se reserva Lys-28 el cual, por lo tanto, se tiene que esconder en el interior del globulómero ?ß(1-42). El entrelazamiento resultante es principalmente inter-molecular en vez de intra-molecular.

El documento WO 2007/064917 describe la clonación, expresión y aislamiento de formas recombinantes de péptido ß amiloide. El péptido expresado en E. coli retiene completamente su residuo metionina N-terminal y representa la secuencia original de beta amiloide desde la posición 0 hasta la posición 42 (referido de aquí en adelante como N-Met ?ß(1-42)).

Similar al péptido ?ß-(1-42), la adición ya sea de ácido graso o de detergente basado en hidrocarburo a preparaciones de péptidos N-Met ?ß-(1-42) lleva a la formación de agregados solubles estables cuyo estado oligomérico se observa que depende de la cantidad de detergente (SDS) o de aditivo tipo lípido residual. En presencia de 0.2% de SDS, el péptido ß amiloide forma un agregado soluble pequeño (referido de aquí en adelante como pre-globulómero N-Met ?ß(1-42)) el cual después se puede convertir un un agregado soluble de peso molecular más alto (referido de aquí en adelante como globulómero N-Met ?ß(1-42)) cuando la concentración de SDS se diluye hasta 0.05%. Con base a estudios de sedimentación, el pre-globulómero N- et ?ß(1-42) tiene un peso molecular de 16 kDa (correspondiente a ~4 péptidos/agregado soluble) mientras que el globulómero N-Met ?ß(1-42) tiene un peso molecular de -64 kDa (correspondiente a -14-16 péptidos/agregado soluble).

La caracterización biofísica y estructural del pre-globulómero N-Met ?ß(1-42) revela que éste contiene láminas ß paralelas intermoleculares/anti-paralelas intramoleculares mixtas que son distintas de los péptidos ß amiloides todo-paralelo encontrados en estudios estructurales de las fibrillas.

Dichos métodos de formación de globulómero representan un paso inmenso en la capacidad de formar preparaciones de oligómero ?ß homogéneas con altos rendimientos. Sin embargo, incluso esta metodología puede dar como resultado preparaciones que muestren algún grado de heterogeneidad, a medida que se elimina el dodecilsulfato de sodio (SDS), y con el paso del tiempo. Además, los truncamientos que se han hecho con el fin de presentar de manera más adecuada los epítopes del globulómero con frecuencia incrementan adicionalmente la heterogeneidad y disminuyen la estabilidad de los globulómeros ?ß. Estos problemas se incrementan solamente a medida que se elimina el SDS del sistema. Además, los globulómeros ?ß truncados en el extremo N-terminal presentan solubilidad muy baja en ausencia de detergentes.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proveer análogos de péptido ß amiloide que presenten la conformación o epítope relevante, ya sea como un monómero o un oligómero. De preferencia, dicho análogo de péptido ß amiloide u oligómero del mismo muestra mejores propiedades físico/químicas que las de los globulómeros conocidos, por ejemplo un tamaño más pequeño, homogeneidad incrementada, estabilidad incrementada, tiempo de vida incrementado, y/o mayor resistencia a las proteasas ¡n vivo. Una mejor reproducibilidad sería una ventaja adicional.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee una conformación estabilizada del péptido ?ß, o porciones del mismo, que presenta un epítope importante para: 1) la respuesta tóxica implicada en el avance de la enfermedad de Alzheimer (el "principio tóxico" modalizado en el péptido ?ß mal plegado), 2) la generación de anticuerpos terapéuticamente relevantes los cuales son específicos para esta conformación y no presentan reacción cruzada con péptido ?ß monomérico fisiológico endógeno tal como se puede detectar en CSF y plasma, y/o 3) engendrar una respuesta inmune mediante inmunización activa que provoque una respuesta de anticuerpo que es policlonal pero mono-específica para esta conformación tóxica y que no presenta reacción cruzada con péptido ?ß monomérico fisiológico endógeno tal como se puede detectar en CSF y plasma. Esta estabilización se logra mediante un enlace covalente intra- molecular que asegura al péptido o un peptidomimético del mismo en una conformación que es más estable y que presenta el epítope necesario. La potencia deseada de dichos péptidos o peptidomiméticos estabilizados se puede medir fácilmente mediante reacción cruzada con anticuerpos selectivos para globulómero disponibles como se describe en los documentos WO 2007/064972 y WO 2007/062852 en pruebas inmunológicas estándar (por ejemplo, inmunoprecipitación, ELISA, transferencia puntiforme (dof blot)), o en pruebas celulares estándar utilizadas para evaluar la toxicidad de los péptidos ?ß.

De conformidad con un primer aspecto, la presente invención se refiere a análogos de péptido ß amiloide que comprenden una secuencia de aminoácido, en la cual la secuencia (i) forma un bucle, (ii) tiene por lo menos 66% de identidad con la secuencia de aminoácido del péptido ?ß original o una porción de la misma, (iii) comprende por los menos 6 residuos de aminoácido contiguos y (iv) tiene por lo menos 2 residuos de aminoácido no contiguos los cuales están ligados covalentemente uno al otro.

De conformidad con un segundo aspecto, la presente invención también se refiere a análogos de péptido ß amiloide los cuales comprenden un peptidomimético de dicha secuencia de aminoácido como se define en la presente solicitud.

Las modalidades particulares de los análogos de péptido ß amiloide incluyen lo siguiente: los análogos de péptido ß amiloide, en los cuales el bucle es un bucle de horquilla ß; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales el péptido ?ß original de humano o la porción del mismo es ?ß(? .. Y), en el que X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 1 .. 23 y Y se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 28 .. 43; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 15 .. 23; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 18 .. 22; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales Y se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 28 ..43; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales el péptido ?ß original o la porción del mismo tiene una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO:1-368; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales los 6 residuos de aminoácido contiguos comprenden la secuencia VGSN o DVGSNK; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales los 6 residuos de aminoácido contiguos comprenden la secuencia AED; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia X19X20X21X22X23- GSN-X28X29X30X31X32, en la que cada uno de X19, X2o, X21, 22, X23, X28. X29, X30, X3i> X32 representa de manera independiente un aminoácido el cual puede estar ligado covalentemente con otro aminoácido; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales las secuencias de aminoácido X19X20X21 y X30X31X32 están en orientación anti-paralela; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con las modalidades precedentes, en los cuales X19 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2o es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X21 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de alanína, valina, glicina, y serina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X22 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ácido glutámico y ácido aspártico; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X23 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ácido glutámico y ácido aspártico; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2s es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de lisina y arginina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2g es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de glicina, alanina, y serina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X30 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de alanina, valina, glicina, y serina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X31 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X32 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia F19X20A21-Q-A30I31I32, en la cual X2o representa un aminoácido y Q es una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia VGSN; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos parte de la secuencia de aminoácido Q forma el bucle; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido Q consiste de 5, 6, 7, u 8 residuos de aminoácido; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide comprende la secuencia F19X20 21X22D23V24G25S26N27K28X29A30I31I32 y cada uno de X2o> X22. X29. representa de manera independiente un residuo de aminoácido; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales las secuencias de aminoácido F19X20A21 y A30I31I32 están en orientación anti-paralela; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de F19(NH)-I32(NH), F19(NH)-I32(HB), F19(NH)-I32(CG2), A21(NH)-A30(NH), A21(NH)-A3o(CB), A21(NH)-l3i(CD1), A21(NH)-I31(CG2), l32(NH)-F19(CD1 ), l32(NH)-F19(CD2), l32(HN)-F19(CB), y A30(NH)-A2i(CB) es de 1.8 a 6.5 Angstroms; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales los pares de átomos F19(CO)-l32(N), l32(CO)-F19(N), A21(CO)-A30(N), y A30(CO)-A2i(N) están a una distancia de 3.3 ± 0.5 A, en los cuales CO indica el átomo de oxígeno de la estructura base, y los ángulos phi (f) de los residuos varían desde -180 hasta -30 y los ángulos psi (?) de los residuos varían desde aproximadamente 60 hasta 180 o desde aproximadamente -180 hasta -150; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO:1-368, por lo menos dos residuos de aminoácido de dicha secuencia están modificados para formar un enlace covalente dentro de la secuencia (intra-secuencia); los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide es una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO:369-698, en las cuales X12 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xi3 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xi4 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X-15 es glutamina, asparagina, metionina, serina, o un aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X-16 es lisina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X17 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xis es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X 9 es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X2o es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X21 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X22 es ácido glutámico, ácido aspártico, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X29 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X30 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X31 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X32 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X33 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X34 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X35 es metionina, valina, leucina, isoleucina, alanina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X36 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X37 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X38 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; y X39 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia, por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 2, X13, Xi4, X15, Xie, X17, ??ß, X19, X2o, X21 y X22 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X30, X31. X32. X33, X34, X35, X36, X37, X38, X39 están ligados covalentemente entre sí; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X12, i3, Xi4 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X37, X33, X39 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 3, Xi4, X15 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X36, X37. X33 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X14, X15, X16 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X35, X36, X37 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X15, X 6, Xi7 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X34, X35, X36 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X16, X17, X18 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X33, X34, X35 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 7l X18, X19 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X32, X33, X34 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X18, X19, X20 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X31, X32, X33 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X19, X 20. X21 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X30, X31, X32 están ligados covalentemente entre sí, los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X2o> X21 y X22 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X30, X31 están ligados covalentemente entre sí, o en los cuales los residuos de aminoácido X12 y X39, X13 y X38, 14 y X37, X15 y X36, X16 y 35, X17 y X3 1 X18 y X33. X19 y 32, X20 y X31, X21 y X30, o X22 y 29 están ligados covalentemente entre sí; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia X20 21 E22D23-X24X25 26 27 2e 29 3oX3i , en la que cada uno de X20. X24. X25. X26. X27> X28, X29. X30. X31 representa de manera independiente un aminoácido el cual puede estar ligado covalentemente con otro aminoácido; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales las secuencias de aminoácido X20X21X22X23 y X28X29X30 31 están en orientación anti-paralela; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con las modalidades precedentes, en los cuales X2o es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X24 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de valina, leucina, isoleucina, alanina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2s es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de glicina, alanina, y serina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2s es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de serina, glicina, alanina, y treonina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X27 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de asparagina, glutamina, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2s es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de lisina y arginina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X2g es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de glicina, alanina, y serina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X30 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de alanina, valina, glicina, y serina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales X31 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de isoleucina, leucina, valina, fenílalanína, y metionina; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia X20-Q- 2 25 26 27 28 29A30I31 , en la que cada uno de X20, X2 X25, X26, X27, 28, X29 representa de manera independiente un aminoácido y Q es una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia AED; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos parte de la secuencia de aminoácido forma el bucle; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido Q consiste de 3, 4, 5, o 6 residuos de aminoácido; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia X 20A21 E22D23X2 X25X26X27 28X29A30I31 y cada uno de X2o, X24, X25, 26, X27, 28, X29, representa de manera independiente un residuo de aminoácido; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales las secuencias de aminoácido X20A21E22D23 y X28 29A30I31 están en orientación anti-paralela; el análogo de péptido ß amiloide de conformidad con las modalidades precedentes, en el cual la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de A21(NH)-A30(NH), A21(NH)-A30(CB), A21(NH)-I31(CD1 ), A2i(NH)-l31(CG2), y A30(NH)-A21(CB) es de 1.8 a 6.5 Angstroms; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales los pares de átomos A2i(CO)-A30(N) y A30(CO)-A2i(N) están a una distancia de 3.3 ± 0.5 A, en los cuales CO indica el átomo de oxígeno de la estructura base, y los ángulos phi (f) de los residuos varían desde -180 hasta -30 y los ángulos psi (?) de los residuos varían desde aproximadamente 60 hasta 180 o desde aproximadamente -180 hasta -150; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide es una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO:699-960, en las cuales Xi2 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X13 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xi4 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xi5 es glutamina, asparagina, metionina, serina, o un aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X 6 es lisina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X17 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X18 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xig es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X2o es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X24 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X25 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X26 es serina, glicina, alanina, treonina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X27 es asparagina, glutamina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X28 es lisina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X29 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X30 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X3 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X32 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X33 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X34 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X35 es metionina, valina, leucina, isoleucina, alanina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X36 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X37 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X38 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; y X39 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia, por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ??2, X13, 14, X15, ??ß, X17, X18, X19, X20, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X30. X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, 38, X39 están ligados covalentemente entre sí; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X12, Xi3> X14, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X37, X38, X39 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X13, X14, X^, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X36, X37, X38 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X14) X15, X16, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X35, X3e, X37 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X15, 16, i7. y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X34, X35, X36 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de Xi6, X17, X18, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X33, X34, X35 están ligados covalentemente entre sí; en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 7, X18, X19. y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X32, X33, X34 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 8, X-19, X2o, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X31, X32, X33 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X19, X20. y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X30, X3i, X32 están ligados covalentemente entre sí, en los cuales el residuo de aminoácido X2o y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 29, X30. X31 están ligados covalentemente entre sí, o en los cuales los residuos de aminoácido X12 y X3g, Xi3 y X 38> X-I-» y X37, X-I5 y X36. X16 y X35> X17 y 3 1 Xie y X331 X19 y x32> o x2o y X31 , están ligados covalentemente entre sí; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales el residuo de aminoácido está ligado covalentemente a través de su cadena lateral; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales las cadenas laterales de los residuos de aminoácido tienen un grupo funcional el cual se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de grupos tiol , amino, carboxilo e hidroxilo; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales el residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a los otros residuos de aminoácido es el de un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de cisteina , lisina , ácido aspártico y ácido glutámico; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales las cadenas laterales de una cisteina y una cisteina, u na cisteina y una lisina, un ácido aspártico o un ácido glutámico y una lisina , o una lisina y una lisina están ligados covalentemente entre sí; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales las cadenas laterales están ligadas covalentemente a través de un enlace covalente directo; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales las cadenas laterales están ligadas covalentemente a través de u n enlazador; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales el enlazador es u n enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional ; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales el enlazador es u n enlazador foto-reactivo; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales el enlace covalente comprende un enlace tipo disulfuro; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales el enlace covalente comprende u n enlace tipo amida; los análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende un enlace covalente entre 2 residuos de aminoácido no contiguos.

De conformidad con un tercer aspecto, la presente invención se refiere a oligómeros que comprenden u na pluralidad de dichos análogos de péptido ß amiloide .

Modalidades particulares de los oligómeros incluyen lo. siguiente: los oligómeros, en los cuales la pluralidad es de 2 a 28 análogos de péptido ß amiloide; los oligómeros de conformidad con las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido de cada análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia L34M35 36G37G38, en la que la secuencia LA34MA35 A36GA37GA38 de un análogo de péptido ß amiloide está en orientación paralela con la secuencia LB34MB35VB36GB37GB38 de otro análogo de péptido ß amiloide; los oligómeros de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de MA35(NH)-VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)-LB34(C8H3), MA35(NH)-VB36(CyH3) es de 1.8 a 6.5 Angstroms; los oligómeros de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales la secuencia de aminoácido de cada análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia G33L34M35V36G37G38V39, en la que la secuencia GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 de un análogo de péptido ß amiloide está en orientación paralela con la secuencia GB33LB34 B35VB36GB37GB38 B3g de otro análogo de péptido ß amiloide; los oligómeros de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de GA33(NH)-GB34(NH), MA35(NH)-VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)-Le34(C5H3), ??35(??)-??36(???3), GA38(NH)-VB39(CyH3) y VA39(NH)-VB39(CYH3) es de 1.8 a 6.5 Angstroms; los oligómeros de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, en los cuales los oligómeros comprenden una lámina ß paralela inter-molecular; los oligómeros de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales la lámina ß comprende la secuencia de aminoácido Ga33LA34Ma35VA36GA3 GA38Va39 de un análogo de péptido ß amiioide y la secuencia de aminoácido GA33LA34MA35VA36GA37GA3eVA39 de otro análogo de péptido ß amiioide; los oligómeros de conformidad con la modalidad precedente, en los cuales los pares de átomos GA33(CO)-LB34(N), LB34(CO)-MA35(N), MA35(CO)-VB36(N), VB36(CO)-GA37(N), y GB37(CO)-GA38(N) están a una distancia de 3.3 ± 0.5 A, en los cuales CO indica el átomo de oxígeno de la estructura base, y los ángulos phi (f) de los residuos varían desde -180 hasta -30 y los ángulos psi (?) de los residuos varían desde aproximadamente 60 hasta 180 o desde aproximadamente -180 hasta -150.

Una modalidad adicional particular incluye los análogos u oligómeros de péptido ß amiioide de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes, los cuales comprenden un epítope reconocido por un anticuerpo monoclonal que se selecciona a partir del grupo que consiste del anticuerpo monoclonal 5F7 que se puede obtener a partir de un hibridoma designado con el número de depósito PTA-7241 del Depósito Americano de Cultivos Tipo, el anticuerpo monoclonal 7C6 que se puede obtener a partir de un hibridoma designado con el número de depósito PTA-7240 del Depósito Americano de Cultivos Tipo, el anticuerpo monoclonal 4D10 que se puede obtener a partir de un hibridoma designado con el número de depósito PTA-7405 del Depósito Americano de Cultivos Tipo, o el anticuerpo monoclonal 7E5 que se puede obtener a partir de un hibridoma designado con el número de depósito PTA-7809 del Depósito Americano de Cultivos Tipo.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar un análogo de péptido ß amiloide como el definido en la presente solicitud, cuyo procedimiento comprende (i) proveer un péptido o peptidomimético del mismo; (¡i) someter el péptido o peptidomimético a condiciones suficientes para la formación del enlace.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar un oligómero como el definido en la presente solicitud, cuyo procedimiento comprende (i) proveer un péptido o peptidomimético del mismo; (ii) someter el péptido o peptidomimético a condiciones suficientes para la formación del oligómero y el enlace.

Modalidades particulares de los procedimientos incluyen procedimientos, en los cuales la formación del oligómero antecede la formación del enlace.

Además, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud.

Modalidades particulares de los procedimientos incluyen la composición , en las cuales la composición es una vacuna y comprende también un vehículo farmacéutico aceptable.

La presente invención también se refiere al uso de un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir una amiloidosis y a métodos correspondientes para tratar o prevenir una amiloidosis en u n individuo en necesidad de lo mismo, que comprende administrar un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud al individuo.

Modalidades particulares del uso y métodos incluyen lo siguiente: el uso y métodos, en los cuales la composición farmacéutica es para inmunización activa; el uso y métodos de conformidad con las modalidades precedentes, en los cuales la amiloidosis es enfermedad de Alzheimer o en los cuales la amiloidosis es la amiloidosis del síndrome de Down .

La presente invención también se refiere al uso de un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para preparar una composición para diagnosticar una amiloidosis y a métodos correspondientes para diagnosticar una amiloidosis que comprende proveer una muestra proveniente del individuo del que se sospecha q ue tiene la amiloidosis, poner la muestra en contacto con un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud d urante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un complejo que comprende al análogo u oligómero de péptido ß amiloide y un anticuerpo, la presencia del complejo indica q ue el individuo tiene la amiloidosis.

Modalidades particulares del uso y métodos incluyen el uso y métodos, en los cuales la amiloidosis es enfermedad de Alzheimer o en los cuales la amiloidosis es la amiloidosis del síndrome de Down .

Además, la presente invención se refiere a un método de enriquecimiento de un agente que se puede u nir a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud en una preparación que comprende a dicho agente, cuyo método comprende los pasos de: a) exponer al análogo u oligómero de péptido ß amiloide la preparación que comprende al agente durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que el agente se una al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; y b) obtener el agente en forma enriquecida .

Modalidades particulares del uso y métodos incluyen el uso y métodos, en los cuales el agente es un anticuerpo, un aptámero o un compuesto de peso molecular pequeño.

Además, la presente invención se refiere al uso de un análogo u oligomero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para proveer un agente que se pueda unir al análogo u oligomero de péptido ß amiloide y a los métodos correspondientes, por ejemplo un método para proveer un anticuerpo que se pueda unir a un análogo u oligomero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud, que comprende i) proveer un antígeno que comprende al análogo u oligomero de péptido ß amiloide; ¡i) exponer un repertorio de anticuerpos a dicho antígeno; y iii) seleccionar a partir de dicho repertorio un anticuerpo que se une al análogo u oligomero de péptido ß amiloide.

Modalidades particulares del uso y métodos incluyen el uso y métodos, en los cuales el agente es un anticuerpo, una molécula de unión de tipo no anticuerpo, un aptámero o un compuesto de peso molecular pequeño.

También se describen anticuerpos que se pueden obtener mediante dicho procedimiento así como agentes que se pueden unir a un análogo u oligomero de péptido ß amiloide de la invención.

Además, la presente invención describe composiciones que comprenden un agente que se puede unir a un análogo u oligomero de péptido ß amiloide de la invención; el uso de un agente que se puede unir a un análogo u oligomero de péptido ß amiloide de la invención para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir una amiloidosis y métodos correspondientes para tratar o prevenir una amiloidosis en un individuo en necesidad de lo mismo, que comprende administrar al individuo un agente que se puede unir a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención; el uso de un agente que se puede unir a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para preparar una composición para diagnosticar una amiloidosis y métodos correspondientes para diagnosticar una amiloidosis que comprende proveer una muestra proveniente del individuo del que se sospecha que tiene la amiloidosis, poner en contacto la muestra con un agente que se puede unir a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención d urante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un complejo que comprende el agente y un antígeno, la presencia del complejo indica que el individuo tiene la amiloidosis.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGU RAS Las figu ras 1 A-1 D muestran: (figura 1 A) un diagrama de la estructura obtenida con RM N del pre-globulómero ?ß, que muestra los efectos nucleares de Overhauser (NOE por sus siglas en inglés) inter-residuo utilizados para definir el plegamiento tridimensional; las líneas discontinuas indican los NOEs observados y los círculos las amidas de la estructura base que exhiben intercambio lento en los experimentos de intercambio NH/N D; (figura 1 B) un diagrama de listones que muestra la estructura obtenida con RM N del pre- globulómero ?ß en SDS; los residuos con estructura definida están resaltados en negritas; (figura 1C) un diagrama de un monómero observado en la estructura de RMN del pre-globulómero ?ß, que muestra las mutaciones Leu a Cys; (figura 1D) un diagrama de un monómero observado en la estructura de RMN del pre-globulómero ?ß, que muestra las mutaciones Leu a Cys y la estructura de entrelazamiento con puente de disulfuro resultante.

Las figuras 2A-2D muestran: (figura 2A) un gel de SDS-PAGE con patrón típico de formación de bandas del globulómero ?ß formado a partir de globulómeros elaborados con S#6046: wt péptido N-Met ?ß(1-42), Mut Pre: péptido muíante (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) en 0.2% de SDS, Mut Post: péptido mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) en 0.05% de SDS; (figura 2B) un SDS-PAGE de 1) proteínas marcadoras, 2) oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42), 3) oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 4) oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42), 5) oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 6) oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42), 7) oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 8) oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42), 9) oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 10) oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42), 11) oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina; (figura 2C) un SDS-PAGE de 1) proteínas marcadoras, 2) oligómero (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42), 3) oligómero (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 4) oligómero (20C, 31C) N-Met ?ß(1-42), 5) oligómero (20C, 31C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 6) oligómero (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42), 7) oligómero (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 8) oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42), 9) oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) después de digestión con termolisina, 10) globulómero ?ß(1-42), 11) globulómero ?ß(1-42) después de digestión con termolisina; (figura 3D) un SDS-PAGE de 1) oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (0.2% de SDS), 2) oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (0.05% de SDS), 3) oligómero (17C(ACM), 340(???))?ß(16-35) (0.2% de SDS), 4) oligómero (17C(ACM), 340(???))?ß(16-35) (0.05% de SDS), 5) oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (0.2% de SDS), 6) oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (0.05% de SDS), 7) oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (0.2% de SDS), 8) oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (0.05% de SDS), 9) oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) (0.2% de SDS), 10) oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) (0.05% de SDS), 11) oligómero N-Met ?ß(1-42). Los patrones de referencia (carriles 1 y 5 de la figura 1A y proteínas marcadoras de la figura 2B y la figura 2C) son: miosina (210 kDa), fosforilasa (98 kDa), BSA (78 kDa), ácido glutámico deshidrogenasa (55 kDa), alcohol deshidrogenasa (45 kDa), anhidrasa carbónica (34 kDa), mioglobina roja (17 kDa), lisozima (16 kDa), aprotinina (7 kDa) e insulina (4 kDa). Los atributos del patrón de formación de bandas son: un haz de bandas a ~40-50 kDa, un haz de bandas a ~15 kDa, y una banda a ~5k Da (monómero).

Las figuras 3A-3AA muestran: figura 3A: una comparación de la respuesta ELISA directa del globulómero N-Met ?ß(1-42) y del globulómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) hacia el anticuerpo monoclonal 5F7 específico de globulómero; Figura 3B: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero para globulómero mutante (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo globulómero mutante truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3C: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero para el globulómero mutante (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo globulómero mutante truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3D: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero para el globulómero mutante (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo globulómero mutante truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3E: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3F: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3G: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3H: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero para el oligómero ?ß(16-35) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3I: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero para el oligómero ?ß(16-35) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3J: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero para el oligómero ?ß(16-35) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3K: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globuiómero para el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3L: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globuiómero para el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3M: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globuiómero para el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3N: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globuiómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 30: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulomero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3P: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3Q: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulomero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado por disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) contra los oligómeros (17C, 34C) ?ß(16-42), (17C, 34C) ?ß(16-35) y (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizados por disulfuro (todos ciclizados después de la formación del oligómero); Figura 3R: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulomero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) truncado con termolisina, estabilizado por disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) contra los oligómeros (17C, 34C) ?ß(16-42), (17C, 34C) ?ß(16-35) y (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) truncados con termolisina, estabilizados por disulfuro (todos ciclizados después de la formación del oligómero); Figura 3S: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3T: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3U: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3V: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3W: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3X: una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado por disulfuro contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina; Figura 3Y: resultados de ELISA directa que comparan la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) (inserción de K) ?ß(13-42) estabilizado por disulfuro; Figura 3Z: resultados de ELISA directa que comparan la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) (inserción de K) ?ß(13-42) estabilizado por disulfuro; Figura 3AA: resultados de ELISA directa que comparan la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero para el oligómero (17C, 34C) (inserción de K) ?ß(13-42) estabilizado por disulfuro.

Las figuras 4A-4J muestran: espectro de masas obtenido a partir de globulómeros ?ß formados con el péptido muíante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) bajo condiciones para formación de enlace de disulfuro (Figura 4A) y después de reducción con DTT (Figura 4B); espectro de masas obtenido a partir del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) bajo condiciones para formación de enlace de disulfuro (Figura 4C) y después de reducción con DTT (Figura 4D); espectro de masas obtenido a partir del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) bajo condiciones para formación de enlace de disulfuro (Figura 4E) y después de reducción con DTT (Figura 4F); espectro de masas obtenido a partir del oligómero (17C, 42C) ?ß(12-42) bajo condiciones para formación de enlace de disulfuro (Figura 4G) y después de reducción con DTT (Figura 4H); espectro de masas obtenido a partir del oligómero (17KC, 42C) ?ß(13-42) bajo condiciones para formación de enlace de disulfuro (Figura 41) y después de reducción con DTT (Figura 4J); se muestra la desconvolución isotópica completa.

Las figuras 5A-5C muestran: Figura 5A: un análisis de velocidad de sedimentación de heterogeneidad del globulómero N-Met ?ß(1-42) (línea discontinua) y del globulómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro (línea continua) en NaP045mM, NaCI 35 mM, pH 7.4; Figura 5B: un análisis de velocidad de sedimentación de heterogeneidad del globulómero N-Met ?ß(1-42) (línea discontinua) y del globulómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro, truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina (línea continua) en NaP04 5mM, NaCI 35 mM, pH 7.4 complementado con 0.05% de SDS; Figura 5C: un análisis de velocidad de sedimentación de heterogeneidad del globulómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro, truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina (línea continua) en NaP04 5mM, NaCI 35 mM, pH 7.4.

La Figura 6 es un tabla que indica las masas de péptido de los oligómeros (xC, yC) N-Met ?ß(1-42) antes y después de digestión con termolisina detectadas mediante SELDI-MS.

La Figura 7 es un tabla que indica los picos de las masas de péptido de los oligómeros (xC, yC) N-Met ?ß(1-42) tratados con yodoacetamida, truncados con termolisina o del globulomero ?ß(1-42) truncado con termolisina detectados mediante SELDI-MS.

La Figura 8 muestra el análisis dot blot de la reactividad con 1. Oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42); 2. Oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 3. Oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42); 4. Oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 5. Oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42); 6. Oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 7. Oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42); 8. Oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 9. Oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42); 10. Oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 11. Oligómero (19C, 320) N-Met ?ß(1-42); 12. Oligómero (19C, 320) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 13. Oligómero (20C, 310) N-Met ?ß(1-42); 14. Oligómero (200, 310) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 15. Oligómero (210, 30C) N-Met ?ß(1-42); 16. Oligómero (210, 300) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 17. Oligómero (220, 29C) N-Met ?ß(1-42); 18. Oligómero (220, 290) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina; 19. Globulómero ?ß(1-42); y 20. Globulómero ?ß(1-42) truncado con termolisina de A) anticuerpo monoclonal 706 y B) anticuerpo 5599 policlonal de conejo.

La Figura 9 es un tabla que indica los picos de masas de péptido de los oligómeros (170, 34C) N-Met ?ß(16-35) tratados con yodoacetamida, truncados con termolisina detectados mediante SELDI-MS.

Las Figuras 10A-10B son tablas que indican las cantidades de oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) inmunoprecipitado sin alquilación previa con yodoacetamida (Figura 10A) y después de alquilación con yodoacetamida en presencia de DTT (Figura 10B).

Las Figuras 11A-11D muestran diagramas esquemáticos que indican la posición de los entrelazamientos de (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después del tratamiento con sulfo-SMCC (Figura 11A), sulfo-MBS (Figura 11B) o sulfo-SlAB (Figura 11C) en cualquiera de K16 o K17; y la Figura 11D es un diagrama esquemático que indica la posición de entrelazamientos potenciales de (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) después del tratamiento con EDAC/NHS.

Las Figuras 12A-12D muestran Figura 12A: el espectro de masas (ESI) de oligómeros elaborados con el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional sulfo-SMCC; Figura 12B: el espectro de masas (MALDI) de globulómeros elaborados con el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional sulfo-MBS; Figura 12C: el espectro de masas (ESI) de globulómeros elaborados con el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional sulfo-SlAB; y Figura 12D: el espectro de masas (MALDI) de globulómeros elaborados con el péptido (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional EDC y NHS. Las flechas indican la masa esperada después que se forma el entrelazamiento deseado.

Las Figuras 13A-13C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro para el anticuerpo monoclonal específico de globuíómero 5F7 (Figura 13A); el anticuerpo monoclonal específico de globuíómero 7C6 (Figura 13B); y el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globuíómero (Figura 13C).

Las Figuras 14A-14C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con SMCC antes y después del truncamiento con termolisina para el anticuerpo monoclonal específico de globuíómero 5F7 (Figura 14A); el anticuerpo monoclonal específico de globuíómero 7C6 (Figura 14B); y el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globuíómero (Figura 14C).

Las Figuras 15A-15C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con MBS antes y después del truncamiento con termolisina para el anticuerpo monoclonal específico de globuíómero 5F7 (Figura 15A); el anticuerpo monoclonal específico de globuíómero 7C6 (Figura 15B); y el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globuíómero (Figura 15C).

Las Figuras 16A-16C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con SIAB antes y después del truncamiento con termolisina para el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7 (Figura 16A); el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6 (Figura 16B); y el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero (Figura 16C).

Las Figuras 17A-17C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17C, 34E) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro para el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7 (Figura 17A); el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6 (Figura 17B); y el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero (Figura 17C).

Las Figuras 18A-18C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con EDC/NHS antes y después del truncamiento con termolisina para el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7 (Figura 18A); el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6 (Figura 18B); y el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero (Figura 18C).

Las Figuras 19A-19D muestran diagramas esquemáticos que indican las estrategias para formar un enlace de tipo metilendi-tioéter (Figura 19A); efectuar una reacción de metátesis para cierre de anillo entre las alilglicinas (Figura 19B); efectuar una reacción de metátesis para cierre de anillo entre los aminoácidos modificados X = (S)-Fmoc-a(2'pentenil)alanina (Figura 19C); y efectuar química por embonado (click chemistry) de los aminoácidos Lys(N3) y propargilglicina (Figura 19D).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los análogos de péptido ß amiloide de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácido (péptido) o un peptidomimético de una secuencia de aminoácido. De conformidad con una modalidad particular, los análogos de péptido ß amiloide de la presente invención no comprenden ningún otro aminoácido o ningún otro peptidomimético de un aminoácido que dicha secuencia de aminoácido o dicho peptidomimético de la secuencia de aminoácido (pero los análogos de péptido ß amiloide de la presente invención pueden comprender grupos o porciones químicas adicionales que estén unidos a dicha secuencia de aminoácido o peptidomimético). De conformidad con un aspecto, la secuencia de aminoácido consiste de hasta 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 20, 16 aminoácidos (o un peptidomimético correspondiente). De conformidad con otro aspecto, la secuencia de aminoácido consiste de por lo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 aminoácidos (o un peptidomimético correspondiente).

A menos que se indique de otra manera, el término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente solicitud, sólo o como parte de otro grupo, incluye, sin limitación, un grupo amino y un grupo carboxilo unidos al mismo carbono, referido como carbono "a" -CRR'-, en el cual R y/o R' pueden ser una cadena lateral natural o una no natural, incluyendo hidrógeno. La configuración absoluta "S" en el carbono "a" comúnmente es referida como la configuración "L" o "natural". En el caso en el que tanto el sustituyente "R" como el sustituyente "R"' (prima) son iguales a hidrógeno, el aminoácido es glicina y no es quiral.

Aminoácidos incluye los aminoácidos L-enantioméricos genéticamente codificados (tales como alanina (A Ala), arginina (R; Arg), asparagina (N; Asn), ácido aspártico (D; Asp), cisteína (C; Cys), glutamina (Q; Gln), ácido glutámico (E; Glu), glicina (G; Gly), histidina (H; His), isoleucina (I; He), leucina (L; Leu), lisina (K; Lys), fenilalanina (F; Phe), prolina (P; Pro), serina (S; Ser), treonina (T; Thr), triptófano (W; Trp), tirosina (Y; Tyr), valina (V; Val)), los D-aminoácidos correspondientes, así como un número de aminoácidos no codificados genéticamente los cuales incluyen, pero no se limitan a, ß-alanina (ß-Ala) y otros omega-aminoácidos tales como ácido 3-aminopropiónico, ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutírico, etcétera; ácido a-aminoisobutírico (Aib); ácido e-aminohexanoico (Aha); ácido d-aminovalérico (Ava); N-metilglicina o sarcosina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle); naftilalanina (Nal); 4-fenilfenilalanina, 4-clorofenilalanina (Phe(4-CI)); 2-fluorofenilalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic); ß-2-tienilalanina (Thi); sulfóxido de metionina (MSO); homoarginina (hArg); N-acetil-lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu); ácido 2,3-diaminobutírico (Dab); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N-metil-valina (MeVal); homocisteina (hCys), homofenilalanina (hPhe) y homoserina (hSer); hidroxiprolina ; (Hyp), homoprolina (hPro), aminoácidos y peptoides N-metilados (glicinas N-substituidas).

Para los propósitos de determinar las sustituciones conservadoras de aminoácido, los aminoácidos se pueden clasificar de manera conveniente en dos categorías principales -hidrofílicos e hidrofóbicos- en función principalmente de las características fisicoquímicas de la cadena lateral del aminoácido. Estas dos categorías principales se pueden clasificar adicionalmente en subcategorías que definen de manera más distintiva las características de las cadenas laterales de los aminoácidos. Por ejemplo, la clase de aminoácidos hidrofílicos se puede subdividir adicionalmente en aminoácidos ácidos, básicos y polares. La clase de aminoácidos hidrofóbicos se puede subdividir adicionalmente en aminoácidos no polares y aromáticos.

El término "aminoácido hidrofílico" se refiere a un aminoácido que presenta un carácter hidrofóbico menor de cero de conformidad con la escala de carácter hidrofóbico de consenso normalizada de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Los aminoácidos hidrofílicos genéticamente codificados incluyen Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) y Arg (R).

El término "aminoácido hidrofóbico" se refiere a un aminoácido que presenta un carácter hidrofóbico mayor de cero de conformidad con la escala de carácter hidrofóbico de consenso normalizada de Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 1.25-142. Los aminoácidos hidrofóbicos genéticamente codificados incluyen Pro (P), Me (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) y Tyr (Y).

El término "aminoácido ácido" se refiere a un aminoácido hidrofílico que tiene un valor de pK de la cadena lateral menor de 7. Los aminoácidos ácidos típicamente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológico debido a la pérdida de un hidrógeno. Los aminoácidos ácidos genéticamente codificados incluyen Glu (E) y Asp (D).

El término "aminoácido básico" se refiere a un aminoácido hidrofílico que tiene un valor de pK de la cadena lateral mayor de 7. Los aminoácidos básicos típicamente tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológico debido a la asociación con el ión hidronio. Los aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen His (H), Arg (R) y Lys (K).

El término "aminoácido polar" se refiere a un aminoácido hidrofílico que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero que tiene por lo menos un enlace en el cual el par de electrones compartidos en común por dos átomos es retenido más de cerca por uno de los átomos. Los aminoácidos polares genéticamente modificados incluyen Asn (N), Gln (Q) Ser, (S) y Thr (T).

El término "aminoácido no polar" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico y que tiene enlaces en los cuales el par de electrones compartidos en común por dos átomos generalmente es retenido en forma igual por cada uno de los dos átomos (es decir, la cadena lateral es no polar). Los aminoácidos no polares genéticamente codificados incluyen Leu (L), Val (V), Me (I), Met (M), Gly (G) y Ala (A).

El término "aminoácido aromático" se refiere a un aminoácido hidrofóbico con una cadena lateral que tiene por lo menos un anillo aromático o heteroaromático. El anillo aromático o heteroaromático puede contener uno o más sustituyentes tales como -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -N02> -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(0)R, -C(0)OH, -C(0)OR, -C(0)NH2, -C(0)NHR, -C(0)NRR y similares en los cuales cada R es de manera independiente alquilo de C^-Ce, alquilo de C^Ce sustituido, alquenilo de Ci-C6, alquenilo de (- -06 sustituido, alquinilo de C^-Ce, alquinilo de Ci-C6 sustituido, arilo de C5-C2o> arilo de C5-C2o sustituido, alcarilo de C6-C26, alcarilo de C6-C26 sustituido, heteroarilo de 5-20 miembros, heteroarilo de 5-20 miembros sustituido, alc-heteroarilo de 6-26 miembros o alc-heteroarilo de 6-26 miembros sustituido. Los aminoácidos aromáticos genéticamente codificados incluyen Phe (F), Tyr (Y) y Trp (W).

El término "aminoácido alifático" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que tiene una cadena lateral de hidrocarburo alifático. Los aminoácidos alifáticos genéticamente codificados incluyen Ala (A), Val (V), Leu (L) e Me (I).

El residuo de aminoácido Cys (C) es inusual en el sentido que éste puede formar puentes de disulfuro con otros residuos Cys (C) u otros aminoácidos que contengan sulfanilo. La capacidad de los residuos Cys (C) (y de otros aminoácidos con cadenas laterales que contienen -SH) de existir en un péptido ya sea en la forma reducida de -SH libre o con estructura de puente de disulfuro oxidada afecta el que los residuos Cys (C) contribuyan o no al carácter hidrofóbico o hidrofílico para un péptido.

Como será apreciado por los expertos en la técnica, las categorías antes definidas no son mutuamente excluyentes. Por lo tanto, los aminoácidos que tienen cadenas laterales que presentan dos o más propiedades fisicoquímicas se pueden incluir en categorías múltiples. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoácido que tienen porciones aromáticas que están sustituidas adicionalmente con sustituyentes polares, tales como Tyr (Y), pueden presentar tanto propiedades hidrofóbicas aromáticas como propiedades polares o hidrofílicas, y por lo tanto pueden estar incluidos tanto en la categoría aromática como en la categoría polar. La clasificación apropiada de cualquier aminoácido será evidente para los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada provista en la presente solicitud.

En lugar de una secuencia de aminoácido (péptido) los análogos de péptido ß amiloide de la invención pueden comprender un análogo de dicha secuencia que tenga propiedades análogas a las de la secuencia de aminoácido (péptido) de plantilla. Estos tipos de secuencias no peptídicas se denominan "imitadores de péptido" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15: 29; Veber y Freidinger (1985) TINS p. 392; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 1229) y por lo general se desarrollan con ayuda de modelado molecular por computadora.

Los peptidomiméticos son referidos como "obtenibles a partir de" una cierta secuencia de aminoácido. Con esto se quiere decir que el peptidomimético está diseñado con referencia a una secuencia de aminoácido definida, de modo tal que éste conserva los rasgos estructurales de la secuencia de aminoácido que son esenciales para su función. Esto podría ser las cadenas laterales particulares de la secuencia de aminoácido, o el potencial de formación de puentes de hidrógeno de la estructura. Dichos rasgos pueden ser provistos por componentes no peptídicos o por uno o más de los residuos de aminoácido o los enlaces que unen dichos residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácido se pueden modificar para mejorar ciertas funciones de la secuencia de aminoácido tales como estabilidad o resistencia a proteasa, al tiempo que se conservan los rasgos estructurales de la secuencia de aminoácido que son esenciales para su función. En otras palabras, un análogo de péptido ß amiloide que comprende un peptidomimético de una secuencia de aminoácido y el análogo de péptido ß amiloide que comprende la secuencia de aminoácido a partir de la cual se obtiene el peptidomimético tienen las mismas características funcionales con respecto a su capacidad para formar el bucle y, si fuera aplicable, para desplegar las propiedades estructurales y funcionales adicionales de los análogos de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud.

Los peptidomiméticos por lo general son estructuralmente similares al péptido paradigma (es decir, la secuencia de aminoácido comprendida por los análogos de péptido ß amiloide de la invención), pero tienen uno o más enlazadores peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlazador similar a un enlazador tipo amida (por ejemplo un isóstero de amida tal como un enlazador tipo N-metilamida, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenamino, metilentio o alcano). Dichos enlazadores se pueden seleccionar, en particular, a partir del grupo que consiste de: -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH = CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-. Estos enlazadores son bien conocidos en la técnica y se describen también en las siguientes referencias: Spatola, A. F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Szatola, A. F., Vega Data (Marzo 1983), Vol. 1, Fascículo 3, "Peptide Backbone Modifications" (revisión general); Morley, J. S., Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468 (revisión general); Hudson, D. et al., Int J Pent Prot Res (1979) 14: 177-185; Spatola, A. F. et al., Life Sci (1986) 38: 1243-1249; Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314; Almquist, R. G. et al., J Med Chem (1980) 23: 1392-1398; Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533; Szelke, M. et al., EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982); Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett (1983) 24: 4401-4404; y Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31 : 189-199. Un enlazador no peptídico particularmente preferido es -CH2NH-. Dichos imitadores de péptido pueden tener ventajas significativas sobre las modalidades de péptidos, incluyendo, por ejemplo: producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (tiempo de vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), y otras.

Los peptidomiméticos también incluyen secuencias de aminoácido "invertidas" o "retro". Las secuencias de aminoácido invertidas o retro comprenden residuos de aminoácido unidos covalentemente en los cuales la dirección normal carboxilo-a-amino de formación del enlace peptídico en la estructura base de aminoácido está invertida de modo tal que, leyendo en la dirección convencional izquierda-a-derecha, la porción amino del enlace peptídico precede (en vez de seguir) a la porción carbonilo. Véase, en general, Goodman, M. y Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423.

Los péptidos con orientación invertida incluyen (a) aquellos en los cuales uno o más residuos amino-terminales están convertidos a una orientación invertida ("inv") (produciendo por lo tanto un segundo "extremo carboxilo terminal" en la porción más a la izquierda de la molécula), y (b) aquellos en los cuales uno o más residuos carboxilo-terminales están convertidos a una orientación invertida ("inv"") (lo que produce un segundo "extremo amino terminal" en la porción más a la derecha de la molécula). En la interfaz entre un residuo con orientación normal y un residuo con orientación invertida no se puede formar un enlace peptídico (amida).

Por lo tanto, se pueden formar ciertas secuencias de aminoácido invertidas de la invención utilizando una porción imitadora de aminoácido apropiada para unir las dos porciones adyacentes de las secuencias utilizando un enlace peptídico invertido (amida invertida). En el caso (a) anterior, se puede utilizar de manera conveniente un residuo central de un compuesto diceto para unir estructuras con dos enlaces tipo amida para lograr una estructura peptidomimética. De igual manera, en el caso (b) anterior, un residuo central de un compuesto diamino puede ser útil para unir estructuras con dos enlaces tipo amida para formar una estructura peptidomimética.

La dirección invertida de unión en dichos compuestos por lo general puede requerir, además, que se invierta la configuración enantiomérica de los residuos de aminoácido invertidos con el fin de mantener una orientación espacial de las cadenas laterales que sea similar a la del aminoácido no invertido. La configuración de los aminoácidos en la porción invertida de los péptidos de preferencia es (D), y la configuración de la porción no invertida de preferencia es (L). Las configuraciones opuestas o mixtas son aceptables cuando sean apropiadas para optimizar una actividad de unión.

La secuencia de aminoácido o peptidomimético comprendida por los análogos de péptido ß amiloide de la invención se caracteriza por una estructura secundaria particular que comprende un bucle (sinónimo: vuelta). Un bucle (o. vuelta) tal como se utiliza en la presente solicitud pretende definir la aproximación cercaría (usualmente < 7 A) de por lo menos dos átomos Ca.

Los bucles apropiados incluyen bucles a-, ß-, ?-, y p. De conformidad con una modalidad particular de la invención, el bucle es un bucle ß. Un bucle ß tal como se utiliza en la presente solicitud pretende definir un bucle que se caracteriza por puente(s) de hidrógeno en los cuales los residuos donador y aceptor están separados por tres residuos i ? i +1-3 puentes de H).

De conformidad con una modalidad particular de la invención, el bucle es un bucle de horquilla ß. Un bucle de horquilla ß tal como se utiliza en la presente solicitud pretende definir un bucle, en el cual la dirección de la estructura base de péptido o peptidomimético se invierte y los elementos de la estructura secundaria de flanqueo interactúan.

De conformidad con una modalidad particular adicional de la invención, los análogos de péptido ß amiloide comprenden una secuencia de aminoácido que forma una lámina ß antiparalela intramolecular. Una lámina ß antiparalela tal como se utiliza en la presente solicitud pretende definir un ensamble de por lo menos dos cadenas ß conectadas lateralmente por tres o más puentes de hidrógeno, formando una lámina plegada, generalmente retorcida. Una cadena ß es un tramo de aminoácidos que comprende típicamente 3-10 aminoácidos cuyas estructuras bases peptídicas están casi completamente extendidas, o un peptidomimético de los mismos.

De conformidad con una modalidad particular, los análogos de péptido ß amiloide de la invención comprenden una secuencia de aminoácido en la cual las cadenas ß que forman la lámina ß antiparalela están conectadas a través del bucle, de preferencia el bucle de horquilla ß como se define en la presente solicitud.

La secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención tiene por lo menos 66% de identidad con la secuencia de aminoácido del péptido ?ß original de humano o una porción de la misma.

El término "péptido ?ß original de humano" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un péptido ?ß(?-?) presente en la Naturaleza, de origen humano, tal como el péptido ?ß(1-40) o el péptido ?ß(1-42).

El término "péptido ?ß(?-?) presente en la Naturaleza" en este caso se refiere a la secuencia de aminoácido desde la posición de aminoácido X hasta la posición de aminoácido Y de la proteína ß amiloide de humano incluyendo tanto a X como a Y, en particular a la secuencia de aminoácido desde la posición de aminoácido X hasta la posición de aminoácido Y de la secuencia de aminoácido DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT (correspondiente a las posiciones de aminoácido 1 a 43; la secuencia humana en cuestión) o cualquiera de sus variantes presentes en la Naturaleza, en particular aquellas con por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flamenca"), E22G ("Artica"), E22Q ("Holandesa"), E22K ("Italiana"), D23N ("lowa"), A42T y A42V en las cuales los números son relativos al inicio del péptido ?ß, incluyendo tanto la posición X como la posición Y.

Por ejemplo, el término "péptido ?ß(1-42) presente en la Naturaleza" en este caso se refiere a la secuencia de aminoácido desde la posición de aminoácido 1 hasta la posición de aminoácido 42 de la proteína ß amiloide de humano incluyendo tanto 1 como 42, en particular a la secuencia de aminoácido DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA o cualquiera de sus variantes presentes en la Naturaleza, en particular aquellas con por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de A21G ("Flamenca"), E22G ("Artica"), E22Q ("Holandesa"), E22K ("Italiana"), D23N ("lowa"), A42T y A42V en las cuales los números son relativos al inicio del péptido ?ß, incluyendo tanto 1 como 42.

Por lo tanto los análogos de péptido ß amiloide de la invención comprenden una secuencia de aminoácido que corresponde a los péptidos ?ß presentes en la Naturaleza, fragmentos funcionales y secuencias variantes de los mismos que tienen por lo menos aproximadamente 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más de identidad con la secuencia human en cuestión descrita anteriormente o una porción de la misma.

El término "corresponde a" se utiliza en la presente solicitud para decir que una secuencia de aminoácido es homologa (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada evolutivamente) a todo o una porción de una secuencia de aminoácido de referencia.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótido o aminoácido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", y "porcentaje de identidad de secuencia". Una "secuencia de referencia" o "secuencia en cuestión" es una secuencia definida utilizada como una base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como una porción de un ADNc de longitud completa, secuencia de gen o secuencia de polipéptido, o puede comprender un ADNc completo, secuencia de gen o secuencia de polipéptido, tal como una secuencia de péptido ?ß de humano descrita anteriormente. Debido a que dos secuencias pueden cada una (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa) que sea similar entra las dos secuencias, y (2) también puede comprender una secuencia que sea divergente entra las dos secuencias, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos típicamente se efectúan comparando secuencias de las dos secuencias a través de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 6 posiciones de aminoácido contiguas o 24 nucleótidos en la cual una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia de por lo menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, o 42 aminoácidos contiguos o 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, o 126 nucleótidos y en la cual la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) de 20 por ciento o menor en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para alineación óptima de las dos secuencias. En el contexto de alineación óptima de secuencias para alinear se puede efectuar una ventana de comparación utilizando el algoritmo de homología local de Smi'th y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, utilizando el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, utilizando el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. (U. S. A.) 85: 2444, utilizando implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, la que da como resultado el porcentaje más alto de homología a través de la ventana de comparación) generada mediante los diversos métodos. El término "identidad del secuencia" significa que las dos secuencias son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido o en una base aminoácido por aminoácido) a través de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula mediante comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima a través de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se presenta la base de ácido nucleico o aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Si se va a determinar la identidad de la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide con la secuencia de aminoácido del péptido ?ß original de humano, la ventana de comparación puede incluir la secuencia de aminoácido completa comprendida por el análogo de péptido ß amiloide o una porción de la misma. Si la secuencia de aminoácido comprendida por el análogo de péptido ß amiloide es más corta que la secuencia de aminoácido del péptido ?ß original de humano, la ventana de comparación incluirá solamente una porción del péptido ?ß original de humano de modo que el porcentaje de identidad de secuencia se refiere a dicha porción solamente. Si la secuencia de aminoácido comprendida por el análogo de péptido ß amiloide es más larga que la secuencia de aminoácido del péptido ?ß original de humano, la ventana de comparación incluirá solamente una porción de la secuencia de aminoácido comprendida por el análogo de péptido ß amiloide de modo que el porcentaje de identidad de secuencia se refiere a dicha porción solamente.

De conformidad con una modalidad particular, la invención se refiere a-análogos de péptido ß amiloide en los cuales la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide tiene por lo menos 66% de identidad con una secuencia de ?ß(?-?) original de humano, X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 1 .. 23, por ejemplo 15, 18, 19, 20, 21, 22, o 23, y Y se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 28 .. 43, por ejemplo 28, 29, 30, 31, 34, 37, 40, 42, o 43.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, los puntos suspensivos A .. B representan al conjunto que comprende todos los números naturales desde A hasta B, incluyendo a ambos, por ejemplo "17 .. 20" indica por lo tanto al grupo de los números 17, 18, 19 y 20. El guión indica una secuencia de aminoácidos contiguos, es decir, "X-Y" comprende la secuencia desde el aminoácido X hacia el aminoácido Y, incluyendo a ambos. Por lo tanto, "A .. B - C .. D" comprende todas las combinaciones posibles entre los miembros de estos dos conjuntos, por ejemplo "17 .. 20 - 40 .. 42" comprende todos los siguientes: 17 - 40, 17 - 41, 17 - 42, 18 - 40, 18 - 41, 18 -42, 19 - 40, 19 - 41, 19 - 42, 20 - 40, 20 - 41 y 20 - 42. A menos que se indique lo contrario , todos los números se refieren al comienzo de péptido mad uro , i nd icando 1 el aminoácido N-terminal .

En pa rticular, la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß ami loide tiene por lo menos 66% de identidad con u na secuencia que se selecciona a parti r del g rupo q ue consiste de SEQ I D NO : 1 -368 : Secuencia SEQ ID NO DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 1 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 2 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 3 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 4 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 5 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 6 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 7 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 8 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 9 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 10 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 11 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 12 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 13 — HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 14 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 15 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 16 LVFFAE DVGS N KG Al 1 G LMVG G WIAT- 17 -VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 18 FFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 19 FAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 20 AEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 21 EDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 22 DVGSNKGAIIGLMVGGWIAT- 23 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 24 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 25 --EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 26 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 27 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 28 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 29 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA-- 30 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 31 G YEVH HQKLVFFAED VGSN GAI IG LM VGGWI A~ 32 YEVHHQ LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 33 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 34 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA-- 35 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA-- 36 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA-- 37 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 38 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 39 LVFFAEDVGSNKGAIIGL VGGWIA— 40 -VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 41 FFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 42 FAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 43 -AEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA-- 44 EDVGSNKGAIIGLMVGGWIA- 45 DVGSNKGAIIGLMVGGWIA-- 46 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 47 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 48 — EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 49 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 50 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 51 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 52 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 53 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 54 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 55 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 56 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 57 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 58 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 59 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI- 60 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI-- 61 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 62 LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 63 -VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 64 FFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 65 FAEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 66 -AEDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 67 EDVGSNKGAIIGLMVGGWI— 68 DVGSNKGAIIGLMVGGWI— 69 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 70 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 71 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 72 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 73 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 74 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 75 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— - 76 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— - 77 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— - 78 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 79 E VH HQ KLVFFAE DVG S N KG Al 1 G LM VGGW— 80 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— - 81 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 82 HQ LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 83 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 84 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 85 LVFFAEDVGSNKGAIIGL VGGW— 86 VFFAEDVGSNKGAI IGLMVGGW— 87 FFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 88 FAEDVGSNKGAIIGLMVGGW— - 89 -AEDVGSNKGAIIGLMVGGW— 90 EDVGSNKGAIIGLMVGGW— 91 DVGSNKGAIIGLMVGGW— 92 DAEFRHDSGYEVHHQ LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV-— 93 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV-— 94 — EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 95 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 96 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL VGGV-— 97 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV-— 98 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 99 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV— - 100 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV— - 101 YEVH H Q KLVF FAE DVG S N KG Al IG LM VGGV 102 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV— - 103 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 104 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 105 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV-— 106 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV-— 107 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV— - 108 LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV— - 109 -VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV— - 110 FFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 111 FAEDVGSNKGAIIGLMVGGV 112 AEDVGSNKGAIIGLMVGGV 113 EDVGSNKGAIIGLMVGGV-— 114 DVGSNKGAIIGLMVGGV 1 15 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 116 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 117 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 1 18 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 119 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 120 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 121 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 122 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 123 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 124 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 125 E VH H Q KLVFFAE D VG S N KG Al 1 G LMVGG 126 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 127 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 128 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 129 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 130 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 131 LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 132 VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 133 FFAEDVGSNKGAIIGLMVGG 134 FAEDVGSNKGAIIGLMVGG 135 -AEDVGSNKGAIIGLMVGG 136 EDVGSNKGAIIGLMVGG 137 DVGS N KGA 11 G LMVGG 138 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 139 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 140 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 141 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 142 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 143 H DSG YE VH HQKL VFFAE DVGS N KG Al IG LM VG 144 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 145 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 146 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 147 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 148 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 149 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 150 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 151 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL VG 152 QKLVFFAEDVGSN KGAI 1 G LMVG 153 KLVFFAEDVGSN KGAI 1 GLMVG 54 LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 155 -VFFAEDVGSNKGAIIGLMVG 156 FFAEDVGSNKGAIIGLMVG 157 FAEDVGSNKGAIIGLMVG 158 AEDVGSNKGAIIGLMVG 159 EDVGSNKGAIIGLMVG 160 — - DVGSNKGAIIGLMVG 161 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL V- 162 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 163 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV 164 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV 165 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 166 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 167 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV 168 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 169 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 170 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV 171 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 172 -VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV 173 H H QKLVF FAE DVG S N KG Al 1 G LM V 174 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 175 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 176 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMV 177 LVFFAEDVGSNKGAIIGLMV- 178 -VFFAEDVGSNKGAIIGLMV 179 FFAEDVGSNKGAIIGLMV- 180 FAEDVGSNKGAIIGLMV 181 AEDVGSNKGAIIGLMV- 182 EDVGSNKGAIIGLMV 183 DVGSNKGAIIGLMV 184 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 185 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 186 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 187 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 188 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 189 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 190 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 191 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 192 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 193 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 194 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 195 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 196 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 197 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 198 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 199 KLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 200 LVFFAEDVGSNKGAIIGLM 201 -VFFAEDVGSN GAIIGLM 202 — FFAEDVGSNKGAIIGLM 203 FAEDVGSNKGAIIGLM 204 -AEDVGSNKGAIIGLM 205 EDVGSNKGAIIGLM 206 DVGSNKGAIIGLM 207 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 208 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 209 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 210 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 211 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 212 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 213 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 214 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 215 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 216 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 217 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 218 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 219 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL- 220 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 221 QKLVFFAEDVGSNKGAIIGL 222 KLVFFAEDVGSNKGAIIGL 223 LVFFAEDVGSNKGAIIGL 224 VFFAEDVGSNKGAIIGL 225 FFAEDVGSNKGAIIGL 226 FAEDVGSNKGAIIGL 227 -AEDVGSNKGAIIGL 228 EDVGSNKGAIIGL 229 DVGSNKGAIIGL 230 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 231 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 232 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 233 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 234 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 235 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 236 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 237 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 238 GYEVHHQKLVF FAE DVG S N KG Al 1 G 239 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 240 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 241 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 242 HHQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 243 HQKLVFFAEDVGSNKGAIIG 244 QKLVFFAEDVGSNKGAIIG 245 KLVFFAEDVGSNKGAIIG 246 LVFFAEDVGSNKGAIIG 247 VFFAEDVGSNKGAIIG 248 FFAEDVGSNKGAIIG 249 FAEDVGSNKGAIIG 250 AEDVGSNKGAIIG 251 EDVGSNKGAIIG 252 DVGSNKGAIIG 253 DAEFRHDSGYEVHHQKLVF FAEDVG S N KG Al 1 254 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 255 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 256 — FRHDSGYEVHHQKLVFFÁEDVGSNKGAII 257 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 258 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 259 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 260 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 261 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 262 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 263 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 264 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAII 265 HHQKLVFFAEDVGSNKGAII 266 HQKLVFFAEDVGSNKGAII 267 Q KLVFFAE DVG S N KG Al 1 268 KLVFFAEDVGSNKGAII 269 LVFFAEDVGSNKGAII 270 -VFFAEDVGSNKGAII 271 FFAEDVGSNKGAII 272 FAEDVGSNKGAII 273 AEDVGSNKGAII 274 EDVGSNKGAII 275 DVGSNKGAII 276 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 277 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 278 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 279 — FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 280 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 281 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 282 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 283 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 284 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 285 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 286 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 287 VHHQKLVFFAEDVGSNKGAI 288 HHQKLVFFAEDVGSNKGAI 289 HQKLVFFAEDVGSNKGAI 290 QKLVFFAEDVGSNKGAI 291 KLVFFAEDVGSNKGAI 292 LVFFAEDVGSNKGAI 293 VFFAEDVGSNKGAI 294 FFAEDVGSNKGAI 295 FAEDVGSNKGAI 296 AEDVGSNKGAI 297 EDVGSNKGAI 298 DVGSNKGAI 299 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 300 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 301 --EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 302 —FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 303 — -RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 304 HDSGYEVHHQ LVFFAEDVGSNKGA 305 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 306 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 307 G YEVH H QKLVF FAE DVG S N KG A 308 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 309 EVHHQKLVFFAEDVGSNKGA 310 VHHQKLVFFAEDVGSNKGA 311 HHQKLVFFAEDVGSN GA 312 HQ KLVFFAE DVG S N KG A 313 QKLVFFAEDVGSNKGA 314 KLVFFAEDVGSNKGA 315 LVFFAEDVGSNKGA 316 -VFFAEDVGSNKGA 317 FFAEDVGSNKGA 318 FAEDVGSNKGA 319 AEDVGSNKGA 320 EDVGSNKGA 321 DVGSNKGA 322 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 323 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 324 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 325 —FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 326 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 327 — HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 328 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 329 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 330 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 331 YEVHHQKLVFFAEDVGSNKG 332 EVHHQKLVFFAEDVGSNKG 333 -VH H QKLVFFAE DVGS N KG 334 HHQKLVFFAEDVGSNKG 335 HQKLVFFAEDVGSNKG 336 QKLVFFAEDVGSNKG 337 KLVFFAEDVGSNKG 338 LVFFAEDVGSNKG 339 -VFFAEDVGSNKG 340 FFAEDVGSNKG 341 FAEDVGSNKG 342 -AEDVGSNKG 343 EDVGSNKG 344 DVGSNKG 345 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 346 -AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 347 -EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 348 --FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 349 — RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 350 HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 351 DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 352 SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 353 GYEVHHQKLVFFAEDVGSNK 354 YEVHHQKLVFFAEDVGSNK 355 EVHHQKLVFFAEDVGSNK- 356 VHHQKLVFFAEDVGSNK 357 HHQKLVFFAEDVGSNK 358 HQKLVFFAEDVGSNK 359 QKLVFFAEDVGSNK 360 KLVFFAEDVGSN 361 LVFFAEDVGSN 362 -VFFAEDVGSNK 363 FFAEDVGSNK 364 FAEDVGSNK 365 -AEDVGSNK 366 EDVGSNK 367 DVGSNK 368 De conformidad con una modalidad particular, la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide de la invención corresponde a una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-368 en las cuales por lo menos un aminoácido de la secuencia seleccionada está sustituido por otro aminoácido.

Se reconocerá que en algunas modalidades de la invención , las sustituciones de aminoácido son conservadoras, es decir, el residuo de aminoácido reemplazante tiene propiedades físicas y qu ímicas que son similares a las del residuo de aminoácido que está siendo reemplazado. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadora especialmente preferidos son : valina-leucina-isoleucina , fenilalanina-tirosina , lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina .

Asimismo, se puede utilizar la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de las secuencias anteriores con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para incrementar la estabilidad .

También se reconocerá que en algu nas modalidades de la invención , las sustituciones de aminoácido son no conservadoras, es decir, el residuo de aminoácido reemplazante tiene propiedades físicas y qu ímicas que difieren de las del residuo de aminoácido que está siendo reemplazado. Esta modalidad en particular se refiere a reemplazar residuos de aminoácido que sean capaces de formar enlaces. Es decir, dicha sustitución de aminoácido permite la formación de un enlace covalente entre el aminoácido reemplazante y otro aminoácido el cual , a su vez, puede o no ser un aminoácido reemplazante, también . Esto permite la introducción de enlaces covalentes entre aminoácidos en posiciones definidas dentro de la secuencia de aminoácido.

De conformidad con una modalidad particular adicional, la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención comprende una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-368, por lo menos dos, por ejemplo dos, residuos de aminoácido de dicha secuencia están modificados para formar el enlace covalente intra-secuencia requerido. Por ejemplo, cada uno de los dos aminoácidos puede ser reemplazado por una cisteína. Esto puede permitir la formación de una variedad de enlaces. En la presente solicitud se describen las posiciones particulares para dichos reemplazos de aminoácido y una variedad de enlaces apropiados. Además, un aminoácido puede ser reemplazado por una cisteína y el otro aminoácido puede ser reemplazado por una lisina. Esto puede permitir la formación de una variedad de enlaces. En la presente solicitud se describen las posiciones particulares para dichos reemplazos de aminoácido y una variedad de enlaces apropiados. Además, un aminoácido puede ser reemplazado por un ácido glutámico o ácido aspártico y el otro aminoácido puede ser reemplazado por una lisina. Esto puede permitir la formación de una variedad de enlaces. En la presente solicitud se describen las posiciones particulares para dichos reemplazos de aminoácido y una variedad de enlaces apropiados.

La secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención comprende por los menos 6, de preferencia por lo menos 8, 10, 12, 14, 16 o 18, residuos de aminoácido contiguos. Además, en una modalidad típica, la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención puede comprender menos de 45, 43, 41, 39, 37, o 36 residuos de aminoácido contiguos. De conformidad con una modalidad preferida, los residuos de aminoácido contiguos comprenden la secuencia VGSN, DVGSN, o VGSNK. De conformidad con otra modalidad preferida, los residuos de aminoácido contiguos comprenden la secuencia AED. De conformidad incluso con otra modalidad preferida, los residuos de aminoácido contiguos comprenden tanto la secuencia AED así como una de las secuencias VGSN, DVGSN, o VGSNK, en particular la secuencia AEDVGSN o AEDVGSNK.

De conformidad con una modalidad adicional de la invención, la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención comprende la secuencia X19X2oX2iX22X23- VGSN-X28 29 30 31 32, en la cual cada uno de X19, X20, ?2?, X22 ?3> X28- X29, X30, X31, X32 representa de manera independiente un aminoácido, en particular como se define en la presente solicitud. - Cada uno de dichos aminoácidos puede estar ligado covalentemente por otro aminoácido, en el que el otro aminoácido se selecciona de entre X19, X2o, X21, X22, X23, 28- X29, X30, X31, X32, o representa un aminoácido diferente. De preferencia, las secuencias de aminoácido X19X20X21 y X30X31X32 están en orientación anti-paralela.

Los análogos particulares de péptido ß amiloide de la invención incluyen aquellos en los cuales X19 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, y metionina, prefiriéndose fenilalanina; X20 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de fenilalanina , tirosina , valina, leucina, isoleucina, y metion ina, prefiriéndose fenilalanina ; X21 es u n residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de alanina, valina, glicina , y serina, prefiriéndose alanina; X22 es u n residuo de aminoácido q ue se selecciona a partir del grupo que consiste de ácido giutámico y ácido aspártico, prefiriéndose ácido giutámico; X23 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del g rupo que consiste de ácido giutámico y ácido aspártico, prefiriéndose ácido aspártico; X28 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del g rupo q ue consiste de lisina y arginina, prefiriéndose lisina ; X29 es un residuo de aminoácido q ue se selecciona a partir del grupo que consiste de glicina , alanina, y serina , prefiriéndose glicina; X30 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de alanina, valina , glicina, y serina , prefiriéndose alanina; X31 es u n residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de isoleucina, leucina , valina , fenilalanina, y metionina , prefiriéndose isoleucina ; X32 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del g rupo que consiste de isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, y metionina , prefiriéndose isoleucina; o cualquier combinación de los mismos.

Los análogos particulares adicionales de péptido ß amiloide de la invención incluyen aquellos en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia F-19X20 21-Q-A30I31132, en la que X20 representa un aminoácido, en particular como el definido en la presente solicitud, y Q es una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia VGSN.

La secuencia de aminoácido Q por lo general consiste de 5, 6, 7, u 8 residuos de aminoácido. De conformidad con una modalidad particular, ésta forma el bucle, es decir, algunos o todos los aminoácidos de Q están acomodados de modo tal que forman el bucle.

Los análogos de péptido ß amiloide que comprenden la secuencia F19X20A21X22D23 24G25S26N27 28 29A30I31132, en la cual cada uno de X20, X22. X29 representa de manera independiente un residuo de aminoácido, en particular como el definido en la presente solicitud, representan una modalidad preferida de la invención. En estos análogos de péptido ß amiloide, las secuencias de aminoácido F19X2oA2i y A30I31I32 de preferencia están en orientación anti-paralela. De manera más particular, se prefiere que la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de F19(NH)-I32(NH), F19(NH)-I32(HB), F19(NH)-l32(CG2), A21(NH)-A30(NH), A21(NH)-A30(CB), A21(NH)-I31(CD1), A21(NH)-l3i(CG2), l32(NH)-F19(CD1 ), l32(NH)-F19(CD2), l32(HN)- F19(CB), y A30(NH)-A2 i (CB) sea de 1 .8 a 6.5 Angstroms. También se prefiere que los pares de átomos Fi 9(CO)-l32(N) , l 32(CO)-F19(N), A2i (CO)-A30(N) , y A3o(CO)-A2i (N) estén a una distancia de 3.3 ± 0.5 A, en los cuales CO indica el átomo de oxígeno de la estructura base, y los ángulos phi (<p) de los residuos varían desde -180 hasta -30 y los ángulos psi (?) de los residuos varían desde aproximadamente 60 hasta 180 o desde aproximadamente - 1 80 hasta -1 50.

De conformidad con una modalidad particular adicional , la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide es una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ I D NO: 369-698, en las cuales X12 es valina , leucina, isoleucina , alanina, metionina , o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X 3 es histidina, tirosina, serina, metionina , o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X-I 4 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia ; X15 es glutamina , asparagina , metionina , serina, o un resid uo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X16 es lisina, arginina , o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X17 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X18 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X19 es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X2o es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X2i es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X22 es ácido glutámico, ácido aspártico, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X29 es glicina, alanina, y serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X30 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X31 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X32 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X33 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X34 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X35 es metionina, valina, leucina, isoleucina, alanina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X36 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X37 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X38 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covaíentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; y X39 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia, por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X12, X13, 14, is, X16, X17, ??ß. X19, X2o, X21 y X22 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X3o, X31, X32, X33, X341 X35, X36, X37, X38 y X39 están ligados covalentemente entre sí.

Secuencia DAEFRHDSGYEX12X13X14X15X16X17X18X19 20X21 22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36X37 38X39 IAT 369 AEFRHDSGYEX12X13X1 15X16X17X18 19X20X21X22DVGSNKX29X30 31X32X33X34X35X36X37X38 39 IAT 370 EF HDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5XieXl7XieXl9X2oX2lX22D GS KX29X3oX3lX32X33X3X35X3eX37X3s 39 IAT 371 FRHDSGYEXl2Xl3Xl XlsXl6Xl7Xl8 l9 2oX2lX22D GSNKX29X30X3lX32X33 3 X35 3eX37X3e 39 IAT 372 RHDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5 ie l7XieXl9 2o 2l 22D GSNKX29X3oX3l 32X33 3 3- 36 37X38X39 IAT 373 HDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5 ieXl7Xie l9X2o 2lX22DVGSNKX29X3ClX3lX32 33 3 35X3e 37X38 39VIAT 374 DSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7Xl-Xl9X2oX2lX22DVGSNKX29X3o 3l 32X33X34 35X3eX37 38 39 IAT 375 SGYEXl2Xl3Xl Xl5Xie l7Xl8Xl9X2oX2lX22D GSN X29X3oX3lX32X33 34X3-X3eX37X3BX39VIAT 376 GYEXl2 l3 l4Xl6 le l7XieXie 2oX2lX22DVGSNKX29X3oX3lX32X33XíX36X3eX37X3eX39VIAT 377 YEXl2Xl3Xl Xl5Xl_Xl7XieXl9X2oX2lX22DVGS KX29X3oX3lX32X33X3X35X3e 37X38X39 IAT 378 EX12X13X14X15X16X17X18 19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33 3 35X36 37 38 39 IAT 379 X12X13 14 15X16 17X18X19X20X21 22DVGSNKX29X30X31X32X33 34X35X36X37X38 39 IAT 380 Xl3Xl Xl5XieXl7XieXl9 2oX2lX22DVGSNKX29X3o 3lX32 33X3X35X3eX37 3a VIAT 381 Xl4Xl5XieXl XieXl9X2oX2lX22D GS KX29X3oX3l 32 33 34 35X3e 37GWIAT 382 Xl5Xie l7XiaXl9 2oX2l 22D GSNKX29X3o 3lX32 33 3 35X e GWIAT 383 XieXl7Xie l9X2oX2l 22D GS KX29X3oX3lX32X33X34 35VGGWIAT 384 Xl7Xie l9X20X2lX22DVGS KX29X3oX3lX32X33X34MVGGWIAT 385 XieXl9X20X2lX22DVGSNKX29X30X3lX32X33LMVGGWIAT 386 Xi9X2o 2iX22DVGS X29X3oX3iX32GLMVGGWIAT 387 X20X21X22DVGSNKX29X30X31IGL VGGWIAT 388 X21X22DVGSNKX29X3ollGLMVGGWIAT 389 X22DVGSNKX29AIIGLMVGGWIAT 390 DAEFRHDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5 ieXl7 l8 l9 2o 2lX22DVGSN X29X3oX3l 32X33 3 35X3eX37 3e 39 IA 391 AEFRHDSGYEXl2Xl3Xl XlsXi Xl7 ie l9 2o 2l 22DVGSNKX29X3oX3l 32 33 3 35 3e 37 38 39 IA 392 EFRHDSGYEXl2Xl3X l5 ieXl7 ieXl9 2o 2l 22D\GSNKX29X3o 3lX32 33 3X35 3eX37X38 39VIA 393 FRHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5Xie l7 l8 l9 2o 2l 22DVGSNKX29X3o 3l 32 33 3 35 3eX37 3e 39VIA 394 RHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7Xl8 l9 2oX2l 22D GSN X29X3o 3l 32 33X3X35X3e 37 3_ 39 IA 395 HDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5XieXl7Xl8Xie oX2lX22DVGS KX29X3oX3lX32 33 34 35 3e 37X38 39VIA 396 DSGYEXl2Xl3Xl Xl5Xie l7Xl8Xl9 2o 2lX22DVGSNKX29X3oX3l 32X3 X34X35X36X37X3_X39VIA 397 SGYEXl2Xl3Xl Xl5Xie l7 l8Xl9 2oX2l 22D GSNKX2gX3oX3lX32X33 34X35X3eX37X38X39 IA 398 GYEXl2Xl3Xl4Xl5Xie l7Xia l9X2oX2lX22D GS X29X3oX3lX32 33X34X35 3eX37X38 39 IA 399 YEXl2Xl3Xl4 l5XieXl l8Xl9 2o 2l 22D GSNKX29 3oX3lX32X33X3X35X3eX37 38X39 IA 400 EXi2Xl3 l Xl5 ie l7XieXl- 2oX2l 22D\GSNKX29X3oX3lX32 33 34X35X3eX37X38 39 IA 401 Xl2 l3Xl4 l5 ieXl7 lB l9X2o 2l 22D GSNKX29 3o 3l 32 33 3X35 3eX37X3e 39VIA 402 Xl3Xl4Xl5XieXl7 ie l9 2oX2l 22DVGSNKX29X3o 3lX32 33 34 35 3- 37 39WIA 403 Xl4Xl5XieXl7 ieXl9X2o 2lX22D GS KX29X3oX3l 32X33X34X3sX3eX37 WIA 404 Xl5 ie l7 ie l9X2oX2l 22DVGS KX2X3o 3l 32X33X34 35X36GGWIA 405 X16X17X18 19 20 21X22DVGSNKX2 X30X31 32X33X34X3S GGWIA 406 Xl7Xl8Xl9X20X2lX22DVGS KX29X30X3lX32X33X3- GGWIA 407 XieXl9X20X2lX-2DVGS KX29X30X3l 32X33LM GGWIA 408 X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32GLMVGGWIA 409 X20X21X22DVGSNKX29X30X31IGLMVGGWIA 410 X21X22DVGSNKX29X3DIIGL VGGWIA 411 X22DVGSNKX29AIIGL VGGWIA 412 DAEFRHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7 ie l9 2o 2l 22DVGSNKX29X3oX3l 32 33 34 35 3e 37 38 39 I 413 AEFRHDSGYEX12X13X14X15X16 17X1BX19 20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33 34X35X36X37X38X39 I 414 EFRHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7Xl- l9X2oX2l 22DVGSNKX29X3oX3lX32X33X3X35X3- 37X3- 39 I 415 FRHDSGYEXl2Xl3Xl l_XieXl7Xl8Xl9X2o 2lX22DVGS KX29 3oX3lX32 33X34X35X3eX37X38X39VI 416 RHDSGYEX12X1 1 X15 16X17X18X19 20X21X22D GSNKX29X30X31X32X33X3 35X36X37X38X39VI 417 HDSGYEXi2Xi3Xi X)5XieXl7XlR l9X2oX2lX22DVGSNKX29X3oX3lX32X33 34X35 3eX37X38X39 I 418 DSGYEXl2Xl3Xl l. ieXl7Xie l9X2oX2lX22DVGSNKX29X3oX3lX32X33 34 35 36 37X38 39 I 419 SGYEX12X13X14X15 16 17X1-X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32 33X34X35 36X37X38X39 I 420 GYEXl2Xl3Xl4Xl- ieXl7XleXl9 2o 2l 22D GS KX29X3oX3lX32X3X34X35X3eX37X38X39VI 421 YEXl2Xl3Xl4XlsXieXl7XieXl9X2o 2lX22DVGS KX29X3oX3lX32X33 34X35X3e 37X3e 39 I 422 EXl2 l3Xl Xl5XieXl7XieXl9X2oX2lX22DVGSNKX29X3oX3lX32X33X34X35 36X37X38X39VI 423 Xl2Xl3Xl4Xl5Xl6 l7 ia l9 2oX2l 22DVGSNKX29X3oX3l 32X33X34X35X3eX37X38X39 I 424 Xl3Xl4Xl5Xie l Xl- l9X2o 2lX22DVGSNKX29 3oX3lX32 33X3X35 3eX37 3eWI 425 Xl4XlsXieXl7Xie l9X2oX2lX22DVGSN X29X3o 3lX32 33 34X35 3e 37GWI 426 X15X16X17X18 19X 0X21 22D GSNKX29X30X31X32 33X34X35X36GGWI 427 X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31 32X33X3X35VGGWI 428 X1 18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X3 VGGWI 429 X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33LMVGGWI 430 X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32GL VGGWI 431 X20X21X22DVGSNKX29X30X31IGLMVGGWI 432 X21X22DVGSNKX29X30IIGLMVGGWI 433 X22DVGSNKX29AIIGLMVGGWI 434 DAEFRHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7Xl8 l9 2oX2lX22D GSN X29X3oX3lX32X3X3X3_X3eX37 38 39 435 AEFRHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5Xl6Xl7 ieXl9X2oX2lX22DVGS KX29X3o 3lX32X33 3 35X3e 37 38X39V 436 EFRHDSGYEXl2 l3Xl Xl5XieXl7Xl8Xl- 2oX2lX22D GS X29X3oX3lX32X33X34X3sX3eX3X38X39 437 FRHDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5XieXl7Xl-Xl9X2o 2lX22DVGSNKX29X3oX3lX32X33X34 35X3eX37X3e 39 438 RHDSGYEXl2X 3Xl Xl_XieXl7Xl8Xl9 oX2tX22D\GS X29X3oX3lX32X33X 4X35X3eX37X38X39V 439 HDSGYEXi2Xi3Xi4XisXieXl7Xie l- 2oX2lX22DVGS KX2eX3oX3lX32 33X3 35X3e 37X38X39V 440 DSGYEX12 13X14X15X1-X17 18X19X 0X21X22D GSNKX29X30X31 32X33X3X35X36X37X38X39V 441 SGYEXl Xl3Xl Xl5Xie l7 ieXl9 2oX2lX22D GS KX29X3oX3lX32X33X34X35X3eX37X38X39 442 GYEXl2Xl3 l Xl5XieXl7XieXl9X2oX2lX22D GS KX29X3oX3lX32X33X34 35X3eX37X3eX39 443 YEXl2Xl3Xl4Xl5XieXl7Xl- l9X2o 2lX22DVGS X29X3oX3lX32X33X34X3s 3eX37 38X39V 444 EXl2Xl3Xl4XlsXieXl7XieXl9 2oX2lX22DVGS KX29X3oX3lX32X33X34X35X36X37 3eX39V 445 Xl2Xl3Xl4Xl_ ieXl Xie l9X2o 2l 22DVGSNKX29X3oX3lX32X33 34X35X35X37X3a 39V 446 Xl3Xl Xl5Xl6Xl7XieXl9X2oX2lX22DVGSNKX29X3o 3l 32X3iX34X3s 36X37 38 447 X1 X15X16X17X18X19X20X21X22D GSNKX29 30X31X32X33X34X35X36X3 GW 448 X15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32 33X34X35X36GGW 449 X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35VGGVV 450 X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34MVGGW 451 X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33LMVGGW 452 X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32GLMVGGW 453 X20X21X22DVGSNKX29X30X31IGLMVGGW 454 X21X22DVGSNKX29X30IIGLMVGGW 455 X22DVGSNKX29AIIGL VGGW 456 DAEFRHDSGYEX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 457 AEFRHDSGYEX12X13X14X15X1-X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 458 EFRHDSGYEX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X3SX36X37X38X39 459 FRHDSGYEX12X13X14X15X16X1 X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 460 RHDSGYEX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 461 HDSGYEX12X13X1 X15X16X17X1BX19X20X21X22D GSNKX29X30X31X32X33X34X35X36X37X3BX39 462 DSGYEX12X13X14X15X16 17X18 19X20X21 22DVGSNKX29X30X31X32X33X3 X35X36X37X38X39 463 SGYEX12X13X14X16X16X17X18X19X20X21X22DVGS X29X30X31X32X33 34X35 36 37X38X39 464 GYEX12X13 14 15X16X17 18X19X20 21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X3 X35X36X37X38X39 465 YEX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22D GSNKX29X30X31X32X33 34X35X36X37X38X39 466 EX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33 34X35X36X37X38X39 467 ?? 2X13X14X15X16X17X1 BXI 9X20X21X22DVGSN KX29X30X31 X32X33X34X35X36X37X38X39 468 X13X14X15X16X17X18 19 20 21 22DVGSNKX29X30X31 32 33X34X35 36 37 38 469 Xl Xl5 l6Xl ieXl9X2o 2lX22DVGSN X29X3oX3lX32X33X3 X35X3eX37GV 470 X15X16X17X18 19X20X21 22DVGSNKX29X30X31X32X33 3 X35X36GG 471 X ?e? 17X 1 eX 19X20X21 X22DVG S N KX29X30X31 X32X33X34X3SVGGV 472 X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34MVGGV 473 X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33L VGGV 474 X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32GLMVGGV 475 X20X21X22DVGSNKX29X30X31IGLMVGGV 476 X21X22DVGSNKX29X30IIGL VGGV 477 X22DVGSNKX29AIIGLMVGGV 478 EVHHX15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36 533 VHHX15X16X17X1BX19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36 534 VHX15X1BX17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36 535 HX15X16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35X36 536 X15X16X17X1 ß?? 9X20X21 X22D VGSN KX29X30X31 X32X33X34X35X36 537 16 17X18X19 20 21X22D GS X29 30 31X32 33X3X3SV 538 Xi 7X18X19X20X21X22DVGS N KX29X30X31 32X33X34M V 539 X18X.I9X20X21X22D GSNKX29X30 31X32 33I-MV 540 X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32GLMV 541 X20X21X22DVGSNKX29X30X31IGLMV 542 X2iX22DVGSNKX29X3ollGLMV 543 X22DVGSNKX29AIIGLMV 544 DAEFRHDSGYEVHHQX16 17X18 19 20 21X22D GSNKX29X30 31X32 33X34X35 545 AEFRHDSGYEVHHQX16X17X18X19 20X21X22D GS X29X30X31X32X33X34X35 546 EFRHDSGYEVHHQX16X17X18X19 20X21X22DVGS KX29X30X31X32X33X34X35 547 FRHDSGYEVHHQX16 17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32 33X34X35 548 RHDSGYEVHHQX16X17X18X19X20X21X22DVGS KX29X30X31X32X33X34 35 549 HDSGYEVHHQXisXi7XieXigX2oX2lX22^VGS KX29X3oX3iX32X33 34X35 550 DSGYEVHHQX16X17X18X19X20X21X22DVGSN X29X30X31X32X33X34X35 551 SGYEVHHQX16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35 552 G YE VH H QX-ieX 17X ?ß? 19X20X21 X22D VG S N X29X30X31 X32X33X34X35 553 YEVHHQX16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35 554 EVHHQX16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35 555 VHHQX16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35 556 HHQX16X17X18X19X20X21X22DVGSNKX29X30X31X32X33X34X35 557 ????ß?? 7X1 eXi 9X20X21 X22DVGS KX29X30X31 X32X33X34X35 558 QXl6Xl7XieXl9X2oX2lX22D GS KX29X3oX3lX32X33X3 X35 559 FRHDSGYEVHHQKLVX19X20X21X22DVGSNKX29X3oX3iX32 614 RHDSGYEVHHQ LVX19X2oX2iX22D GSNKX29X3oX3iX32 615 HDSGYEVHHQKLVX19X20X21X22DVGSN X29X3oX3iX32 616 DSGYEVHHQKLVX19X20X2iX22DVGS KX29X3oX3iX32 617 SGYEVHHQKLVX19X2oX2iX22DVGSNKX29X30X3iX32 618 GYEVHHQKLVX19X2oX21X22DVGSNKX29X3oX3iX32 619 YEVHHQKLVX19X20X2iX22DVGSNKX29X3oX3iX32 620 EVHHQKLVX19X2oX2iX22DVGSNKX29X3oX3iX32 621 VH HQKLVXi 9X2oX2iX22D VG SN KX2gX3oX3i X32 622 H HQKLVXi gX2oX2i X22^ VG S N KX29X3oX3i X32 623 H Q KLVXt 9X20X21 X22DVG S N KX29X3oX3i X32 624 Q K LVX 19X20X21 X2 D V G S N KX29X30X31 X32 625 KLVXigX2o 2l 22^^Q2 KX2gX3oX3lX32 626 LVX-)9X2oX2-iX2 ^^^SNKX29X3oX3iX32 627 VXi 9X20X21 X22DVGSN KX29X30X31 X32 628 Xi 9X20X21 X22D VG S N 1 (29X30X31 X32 629 X20X21X22DVGSNKX29X30X311 630 X21X22DVGSNKX29X3oll 631 X22DVGSNKX29AII 632 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X3oX3i 633 AEFRHDSGYEVHHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X3oX3i 634 EFRHDSGYEVHHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X30X31 635 FRHDSGYEVHHQKLVFX20X2iX22DVGSNKX29X3oX3i 636 RHDSGYEVHHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X3oX3i 637 HDSGYEVHHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X3oX3i 638 DSGYEVHHQKLVFX2oX2iX22DVGSNKX29X3oX3i 639 SGYEVHHQKLVFX20X2,X22DVGSN X29X30X31 640 GYEVHHQKLVFX2oX2iX22DVGSNKX29X3oX3i 641 YEVHHQKLVFX2oX2iX22DVGSNKX29X3oX3i 642 EVHHQKLVFX2oX21X22DVGSNKX29X30X31 643 VHHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X3oX3i 644 HHQKLVFX20X21X22DVGSNKX29X3oX31 645 HQKLVFX20X2iX22DVGSNKX39X3QX3i 646 QKLVFX2oX2iX22DVGSNKX29X30X3i 647 KLVFX20X21X22DVGSNKX29X30X31 648 LVFX2oX2iX22DVGSN X29X3oX3i 649 FX20 21 X22 DVG S N KX29X30X31 650 FX20X21X22D GSNKX29 30 31 651 X2OX21X22D GSNKX29X30X31 652 X21X22DVGSNKX29X3ol 653 X22DVGSNKX29AI 654 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 655 AEFRHDSGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 656 EFRHDSGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 657 FRHDSGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X3o 658 RHDSGYEVHHQKLVFFX2iX22DVGSNKX29X3o 659 HDSGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 660 DSGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSN X29X30 661 SGYEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 662 GYEVHHQ LVFFX21X22DVGSNKX29X30 663 YEVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 664 EVHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X3o 665 VHHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 666 HHQKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 667 HQKLVFFX21X22DVGSNKX29X3o 668 QKLVFFX21X22DVGSNKX29X30 669 KLVFFX21X22DVGSNKX29X30 670 LVFFX21X22DVGSNKX29X30 671 VFFX21X22DVGSNKX29X3o 672 FFX21X22DVGSNKX29X30 673 FX21X22DVGSNKX29X3o 674 X21X22DVGSNKX29X30 675 X22DVGSNKX29A 676 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 677 AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSN X29 678 EFRHDSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 679 FRHDSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 680 RHDSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 681 HDSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 682 DSGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 683 SGYEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 684 GYEVHHQKLVFFAX22DVGSN X29 685 YEVHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 686 EVH HQKL VFFAX22D VGS N KX29 687 VHHQKLVFFAX22DVGSNKX29 688 HHQ LVFFAX22DVGSNKX29 689 HQKLVFFAX22DVGSNKX29 690 QKLVFFAX22DVGSNKX29 691 KLVFFAX22DVGSN X29 692 LVFFAX22DVGSNKX29 693 VFFAX22DVGSNKX29 694 FFAX22DVGSNKX29 695 FAX22DVGSNKX29 696 AX22DVGSNKX29 697 X22DVGSN X29 698 Dicho(s) enlace(s) covalente(s) intra-secuencia es(están) pensados para estabilizar el bucle y opcionalmente también los elementos de la estructura secundaria de los análogos de péptido ß amiloide de la invención, como se describe. Por consiguiente, los residuos de aminoácido ligados covalentemente se separan de manera conveniente en por lo menos los aminoácidos formadores de bucle, por ejemplo la secuencia VGSN, DVGSN, VGSNK, o Q como se describe en la presente solicitud. Las posiciones particularmente preferidas de los enlaces covalentes intra-secuencia en SEQ ID NO: 369-698 se pueden describir en forma de las siguientes modalidades: .

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ??2, X13, X14 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X37, X38, X39 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X13, X14, X15 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X36, X37, X38 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 4, Xi5> Xi6 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X35, X36, X37 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 5, X16, Xi7 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X34, X35, X36 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X16l X17, X 8 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X33, X34, X35 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 7, X18, X19 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X32, X33, X34 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X18, X19, X20 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ?3?, X32, X33 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X19, X20, X21 V por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X30, X31, X32 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X20, X2i y X22 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X30, X31 están ligados covalentemente entre sí.

De manera más particular, los residuos de aminoácido X12 y X39> X13 y X381 X-I4 y X37. X15 y X36. 16 y 35, X17 y X34, x-?ß y X331 X19 y X321 20 y X31, X21 y X30. o X22 y X29 de manera conveniente pueden estar ligados covalentemente entre sí.

De conformidad con una modalidad adicional de la invención, la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención comprende la secuencia X20A21E22D23-X24X25X26 27 28X29X30X31 , en la cual cada uno de X2o, X24, X25, X261 X27, X28, X29, X30, X31 representa de manera independiente un aminoácido, en particular como el definido en la presente solicitud. Cada uno de dichos aminoácidos puede estar ligado covalentemente con otro aminoácido, en el que el otro aminoácido se selecciona de entre X2o, X24. X25, X26, X27, X28, X291 X30, X31, o representa un aminoácido diferente. De preferencia, las secuencias de aminoácido X2oA21E22D23 y X28X29X30X31 están en orientación anti-paralela.

Los análogos particulares de péptido ß amiloide de la invención incluyen aquellos en los cuales X20 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, y metionina, prefiriéndose fenilalanina; X24 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de valina, leucina, isoleucina, alanina, y metionina, prefiriéndose valina; X25 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de glicina, alanina, y serina, prefiriéndose glicina; X26 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de serina, glicina, alanina, y treonina, prefiriéndose serina; X27 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de asparagina, glutamina, y metionina, prefiriéndose asparagina; X28 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de lisina y arginina, prefiriéndose lisina; X2g es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de glicina, alanina, y serina, prefiriéndose glicina; X30 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de alanina, valina, glicina, y serina, prefiriéndose alanina; X3 es un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, y metionina, prefiriéndose isoleucina; o cualquier combinación de los mismos.

Los análogos particulares adicionales de péptido ß amiloide de la invención incluyen aquellos en los cuales la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia X20-Q- 24X2S 26 27 28 29A30I31 - en la que cada uno de X2o, X24, X25, 26. X27, 28> X29, representa de manera independiente un aminoácido, en particular como el definido en la presente solicitud, y Q es una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia AED.

La secuencia de aminoácido Q por lo general consiste de 3, 4, 5, o 6 residuos de aminoácido. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos parte de la secuencia de aminoácido X24 25 26 27 forma el bucle.

Los análogos de péptido ß amiloide que comprenden la secuencia X2oA2iE22D23X24X25X26X27 28X29A3ol3i> en la cual cada uno de X2o> X24, X25, X26. X27, X28. X29, representa de manera independiente un residuo de aminoácido, en particular como el definido en la presente solicitud, representan una modalidad preferida de la invención. En estos análogos de péptido ß amiloide, por lo menos tres aminoácidos contiguos de las secuencias de aminoácido X20 21E22D23 y X28 29A30I31 de preferencia están en orientación anti-paralela. De manera más particular, se prefiere que la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de A2i(NH)-A30(NH), A21(NH)-A30(CB), A21(NH)-I31(CD1), A21(NH)-l3i(CG2), y A30(NH)-A2i(CB) sea de 1.8 a 6.5 Angstroms. También se prefiere que los pares de átomos A21(CO)-A30(N) y A30(CO)-A2i(N) estén a una distancia de 3.3 ± 0.5 A, en los cuales CO indica el átomo de oxígeno de la estructura base, y los ángulos phi (f) de los residuos varían desde -180 hasta -30 y los ángulos psi (?) de los residuos varían desde aproximadamente 60 hasta 180 o desde aproximadamente -180 hasta -150.

De conformidad con una modalidad particular adicional, la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiioide es una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 699-960, en las cuales Xi2 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X13 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X 4 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X15 es glutamina, asparagina, metionina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X16 es lisina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X17 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X18 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X19 es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X20 es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X2 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X25 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X26 es serina, glicina, alanina, treonina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X27 es asparagina, glutamina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X28 es Usina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X29 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X30 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X31 es isoleucina , leucina , valina , fenilalanina , metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia ; X32 es isoleucina , leucina , valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido q ue está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia ; X33 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X34 es leucina, isoleucina , valina , fenilalanina, metionina , o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia ; X35 es metionina, valina , leucina , isoleucina , alanina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X36 es valina , leucina, isoleucina , alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X37 es glicina , alanina , serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia ; X38 es glicina , alanina, serina , o u n residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; y X39 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia, por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de Xi2, X13, 14, X15, Xie, X17, ??ß, X19, X20. y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X2g, X30, X31, X32, X33, X34, X35, 36, X37> 38 y X39 están ligados covalentemente entre sí.

Secuencia DAEFRHDSGYEXl2 l3Xl4 l5 l6 l7 l8 l9 20AEDX24X2s 2e 27 28X2eX3o 3lX32X33X3 35X3eX37X38 39 IAT 699 AEFRHDSGYEXl2Xl Xl XlsXie l7Xl8 l9 2oAEDX24X25X2e 27 2e 29 3oX3l 32 33 3X35 36 37X3s 39 IAT 701 EFRHDSGYEXl2Xl Xl4Xl5XieXl7Xie l9 2o EDX2X25 2e 27X28X29X3o 3l 32X33X3X35X3eX37 3eX39 IAT 702 FRHDSGYEXl2 liXl Xl- l6Xl7 l8 l9 2oAEDX2 X25X26 27X28X29X3o 3l 32 3 3X35X3eX37X3-X39 IAT 703 RHDSGYEXl2 l Xl4 l5 ieXl XieXl9 2oAEDX2 25X2eX2 2e 2eX3o 3lX32X33 34X35X3eX37X38X39VIAT 704 HDSGYEXl2Xl3Xl Xl5 l6Xl7 l8Xl9 2o ED 24 25 26 27 2eX29 3oX3l 32 33X3 35X3eX37 3e 39VIAT 705 036????2??3?? ??6??ß??7 ?8 ?9 2?????24?25 2ß 27?2- 29?3? 3??32?3 34?35?3ß 37 38 39???? 706 SGYEXl2Xl3Xl4 l5Xie l7Xie l9 2oAEDX24X25 2-X27 2eX2 3o 3lX32 3 3 35 3e 37X38X39 IAT 707 GYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7Xl8Xl9X20AEDX2 X25X26 27X2eX2- 30X3l 32X33X3X35X3eX37X38X39VIAT 708 YEXi2Xl3Xl4Xl-XieXl7Xl- l9X2oAEDX2 X25 2eX27X2- 29X3oX3lX32X33X3 35X36X37X3-X39 IAT 709 EXi2Xl3Xl4Xl5XieXl7Xl8 l9 20AEDX2X25X26X27X2e 29X30X3lX32X3 X3X35X3e 37X38X39 IAT 710 Xl2 l3Xl Xl5XieXl7Xl8 l9X2oAEDX24X25X26 27 2-X2 3oX3lX32 33X3 X35 36 37X3_X39 IAT 711 Xl3Xl Xl5XieXl XleXl9 2oAEDX2 25X2eX27X28X29X3oX3lX32X33 34X35X3e 37 X38VVIAT 712 X1 X15X16X17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30 31X32 33X3 36X36X37 WIAT 713 XlsXieXl7XieXl9X2oAEDX2 X25 2e 27 28X2X3oX3lX32 33X3 35X eGGWIAT 714 XieXl XieXl9X2oAEDX24X25 26X27X28 29 3oX3l 32 33 3 35VGGVVIAT 715 Xl7Xl8Xl9X2oAEDX2X25X2eX27X2eX29 3oX3lX32 33X3 MVGGWIAT 716 X18X10X2O EDX24X25X26X27X28X29X3OX31X32X33L VGGWIAT 717 X19X20AEDX24X25X26X27X2BX29X30X31X32GLMVGGWIAT 718 X2oAEDX24X25X2eX27X28X29X30X3llGL GGWIAT 719 DAEFRHDSGYEXl2Xl3 l4Xl5 ie l7 l8 l9 20AEDX2 X25 2e 27 28 29 3o 3l 32 33 34 35 3e 37X3_X39 IA 720 AEFRHDSGYEXl2Xl3Xl l5XieXl7 l8Xl9X20AEDX2 X25X2eX27 28X29X30X3lX32X33X3X35X3eX37X38X39 IA 721 EFRHDSGYEXi2Xl3Xl4 lsXl6Xl7Xia l9X2oAEDX24 25X2eX27X2eX29X3oX3lX32X3X3X35X36X37X38X39VIA 722 FRHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5Xl6Xl7 iaXl9X2oAEDX2 25X26X27X28X29X3oX3l 32X33X34 35X3eX37X38X39VIA 723 RHDSGYEXl2 l3 l4 l-Xie l7Xl8 l9X2oAEDX2 X25X2e 27X28 29 3o 3l 32X33 34 35 3- 37 3- 39 IA 724 HDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5XieXl7 l-Xl9X2oAEDX24X25X2e 27X28 29X3o 3l 32X33 34 35X3a 3 3eX3e IA 725 DSGYEXi2Xl3Xl Xl5XieXl Xl8Xl9X2oAEDX24 25X2eX2X28X29X3o 3lX32 33X3X35X3eX37X3eX39 IA 726 SGYEXl2Xl3Xl Xl_Xie l7Xl8Xl9 20AEDX24X25X2eX27X2aX29 3oX3lX32X33X34X35X3e 37X38X39VIA 727 GYEXl2Xl3Xl Xl5Xl_Xl7XieXl9X2oAEDX2 X25X26X27 2eX29X3oX3lX32X33X34X35 3eX37X38X39 IA 728 YEX12X13 14X15X16X17X18X19X20AEDX2 X25X26X27X28X29X30 31X32X33X34X35 36X37X38X39VIA 729 EXl2Xl3Xl Xl5XieXl7XieXl9X2oAEDX24X2- 26X27X28X29X3oX3lX32X33X34X35X3eX37X38X39 IA 730 X12X13X14X15X16X17X18 19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X3X35X36X37X38X39VIA 731 Xl3Xl4Xl5XieXl7Xie l9X2oAEDX2 25X2eX27X28X29X3oX3lX32X33X3 X35X36X37 X38 IA 732 Xl4Xl5XleXl7 l8Xl9 2()AEDX24 25X2eX27X28X29X30 3lX32X33X34X35X3e 37G VIA 733 X15X16X17X18X19X20AEDX24X25 26 27X28X29X30X31X32X33X3X35X36GGWIA 734 XleXl7XieXl9X2o EDX2X25X2e 27X2sX29X3oX3lX32X3_ 34X35VGGWIA 735 X17X18 19X20AEDX24X25 26X27X28X29 30 31X32X33X3 M GGWIA 736 XieXl9X2oAEDX2X25 2eX27 2eX29 3oX3lX32X33L VGGWIA 737 X1BX20AEDX24X25X2eX27X28X29X30X3lX32GLMVGGWIA 738 X20AEDX24X25X2e 27X28X29X30X3llGLMVGGWIA 739 DAEFRHDSGYEXl2Xl3Xl4Xl5Xl6Xl7Xl8Xl9X2oAEDX2X25 26 2X28 29X3oX3lX32X33X3X35X3e 37X38X39VI 740 AEFRHDSGYEXi2Xl3Xl4Xl5XieXl7XieXl9X20AEDX24X25X26X27X2-X29 3oX3lX32X33X3X35X3eX37X38X39VI 741 EFRHDSGYEX12X13X14X15X16X17X18X19X20AE DX24X25X26 27X28X29X30X31X32X33 3X35X36X37 38X39VI 742 FRHDSGYEX12X13X14X15X16X17X18X19X20AEDX24X25X2-X27 28 29 30X31X32X33X34X35X36X37X38 39 I 743 RHDSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl XieXl9X2oAEDX24X2- 2eX27 2eX29X3oX3lX32X33 34X35X3e 37 3a 39 I 744 HDSGYEXl2Xl3Xl Xl5XieXl7Xl8Xl9 20AEDX24X25X2e 27X2eX29X30X3lX32X33X3X35 3eX37X38X39 I 745 DSGYEXl2Xl3Xl4Xl5Xl5Xl7XieXl9X2oAEDX24X2-X2eX27X28X29X30X3lX32X33X34X3sX3eX37X38X3 I 746 SGYEXl2Xl3 l l5 l6 l7XieXl9 20AEDX24 25 2eX27 2e 29 3o 3lX32X33X34 35X3eX37 38X39 I 747 GYEXl2Xl3Xl4Xl5Xie l7Xl8 l9X20AEDX2 X25X2eX27X2eX29X30X3l 32X 3X34X35X3eX37X38X39VI 748 YEXl2Xl3Xl4Xl-Xie l7XieXl9X2oAEDX2 X26X2eX27X28X29X3oX3lX32X33 34X36X3eX37X3eX39 I 749 EX12X13X14X15X16 17X18 19X20AEDX24 25X26X27X28X29X30X31X32 3 X X35 36X37X38X39VI 750 Xl2Xl3 l XlsXieXl7XiaXl9X2oAEDX2 X25X2e 27X28X29X30X3lX32X33X34X3sX3eX37X3eX39 I 751 ??3??4??5??ß?? 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9X20AE DX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35 876 X17X18 19X20A DX24X25 26X27X28X29X30X31 32X33X3 M 877 i e i 9X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31 X32 33L 878 Xl9X2oAEDX24X25X26X27X28X29X3oX3lX32GLI\/l 879 X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31 IGLM 880 DAEFRHDSGYEVHHQ X17X18X19X20A DX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34 881 AEFRHDSGYEVHHQKX17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34 882 EFRHDSGYEVHHQKX17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34 883 FRHDSGYEVHHQKX17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31 32X33X3 884 RHDSGYEVHHQKX17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34 885 HDSGYEVHHQ X17X18X19X2C -DX24X25 26X27X28X29X30X31X32X33X34 886 DSGYEVHHQKX17X18X19X20AEDX24 25X26X27X28X29X30 31X32X33X3 887 SGYEVHHQKX17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29 30X31X32X33X3 888 GYEVHHQ X17X18X19X20AEDX24X25X26X27 28X29X30X31X32X33X3 889 YEVHHQKX17X18X19X2C EDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34 890 E VH H Q ??? 7X 1 ß?? 9X20AE DX24X25 26X27X28 29X30X31 32X33X34 891 VHHQKX17X18 19X2 DX2 X25X26X27X28X29X3C 31X32X33X3 892 HHQKX17X18 19X20AEDX2 X25X26X27X28X29 30X31X32X33X3 893 HQKX17X18 19X20AEDX24 25X26X27X28 29X30 31X32X33X3 894 QKX17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29 30X31X32X33X3 895 KXi 7X1 eXi 9X2 DX24X2S 26X27X28X29 30X31 X32X33X34 896 X17X18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32 33X34 897 X18 19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33L 898 i 9 20AEDX24X25X26 27X28X29X30X31 X32G L 899 X2 D 24 2S 26X27 28X29 30 31 IGL 900 DAEFRHDSGYE HHQKLX18X19X2CAEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32 33 901 AEFRHDSGYEVHHQKLX18 19 20AEDX24 25X26X27X28X29X30X31 32X33 902 EFRH DSG YEVH H QKLX¾ 3X19X2CAEDX24X25X26X27X28X29X30X31 X32X33 903 FRHDSGYEVHHQKLX18 19 20 EDX24X25 26X27X28X29X30X31X32X33 904 RHDSGYEVHHQKLXi8Xig 2o EDX2 X25X26X2 X2eX29X3oX3lX32X33 905 HDSGYEVHHQKLX18X19X20 EDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 906 DSGYEVHHQKLX18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 907 SGYEVHHQ LX18X19X20AEDX24X25 26X27X28X29X30X31X32X33 908 GYEVHHQKLX18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 909 YEVHHQKLX18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 910 EVHHQKLX18 19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 911 VHHQKLXieXi9X2o EDX2 X25X26X27X28X29X3oX3lX32X33 912 HHQKLX18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 913 H Q LX1 ß ? 9X20AE DX24X25X26X27X28X29X30X31 32X33 914 QKLX18X19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 915 KLX18 19 20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31X32X33 916 LXt ß?? 9X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31 X32 33 917 X18X19X20AEDX2 X25X26X27 28X29X30X31 32X33 918 X19X20AEDX24X25 26X27X28X29X30X31X32G 919 X20AEDX2 X25X26X27X28 29 3- 31 IG 920 DAEFRHDSGYEVHHQKLVX19X20AEDX24X25X26X27 28 29X3cX3i 32 921 AEFRHDSGYEVHHQ LVX19X2oAEDX24X25X26X27X28X29X3oX3iX32 922 EFRHDSGYE HHQKLVX19X2C EDX2 X25X26X27X28X29X30X31X32 923 FRHDSGYEVHHQKLVX19X20AEDX24X25X26 27 28 29 30 3l 32 924 RHDSGYEVHHQKLVXi9X2oAEDX24X25X26 2 X28X29X3oX3lX32 925 HDSGYE HHQKLVXigX2oA DX2 X25X26X27X2eX29X3oX3lX32 926 DS G YEVH H Q KL VX 1 gX2oAE DX 24 25X26 2 X28X29X 30X31 X32 927 SGYE VH HQ KLVX19X20AEDX24X25X26X27X28X29X 30X31 32 928 GYEVHHQKLVX19X20AEDX 4X25 26 27X28 29 30 31 32 929 YE HHQKLVX19X20A DX2 X25X2SX27X28X29X30X31X32 930 EVHHQ LVX19X20AEDX24X25X26 27X28X29 30X31X32 931 VH HQ KLVX19?2?????2 ?25?26?27?2ß?29?3? 31 X32 932 HHQKLVX19X20AEDX24X25X26X27X28X29X30X31 32 933 HQ LVXigX2oAEDX24X25X26X27X28X29X3oX3lX32 934 QKLVXi9X2oAEDX24X25X2_ 27X28X29X3oX3lX32 935 KLVX19X20 EDX2 X25X26X27 28 29 30 31X32 936 LVX-i gX2oAEDX24X25X26 27 28 29 3o 31 32 937 VXi 9X20AE DX2 X25X26X27X28X29X30X31X32 938 Xl9X2oAEDX24X25X26X27X28X29X3oX3lX32 939 X20AEDX2 X25X26X27X28 29X30X311 940 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFX20AEDX24X2sX2sX27X28X29X3oX3i 941 AEFRHDSGYEVHHQKLVFX20AEDX24X25X26X27X28X29X3oX3i 942 EFRHDSGYEVHHQ L FX20AEDX24X25X26X27X28X29X3oX3i 943 FRHDSGYEVHHQKLVFX2oAEDX24X25X26X27X28X29X3oX3i 944 HDSGYEVHHQKLVFX20AEDX24X25X26X27 28X29 3o 3i 945 HDSGYEVHHQKLVFX20AEDX24X25 26 27 28 29 30X31 946 DSGYEVHHQ LVFX20AEDX24X25X26X27 28X29 3oX3i 947 SGYEVHHQKLVFX20AEDX24X25X26X27 28 29 3o 3i 948 GYEVHHQ LVFX20 EDX24X25X26X27X28X29X30X31 949 YEVHHQKLVFX2oAEDX24X25X2eX27X2B 29X3c 3i 950 EVHHQKLVFX2OAEDX24X25X26X27 28X29X3DX31 951 VH HQ KLVFX20AEDX24X25 26 27X28X29X30X31 952 HHQ LVFX2oAEDX24X25X26X27X28X29X3oX31 953 HQKLVFX2oAEDX24X25X2sX27X28X29X3oX31 954 QKLVFX2oAEDX24X25X26X2 28 29 3oX31 955 KLVFX2oAEDX24X2sX26 27X2e 29X 30X31 956 L FX2oAEDX24X25X26X27X2aX29X3oX3i 957 VFX2oAEDX24X25 26X27 28 29 3oX31 958 FX2oAEDX24X25 26X27X28X29X3oX31 959 X2oAEDX2 X2sX26X27X2eX29X3oX31 960 Dicho(s) enlace(s) covalente(s) intra-secuencia es(están) pensados para estabilizar el bucle y opcionalmente también los elementos de la estructura secundaria de los análogos de péptido ß amiloide de la invención, como se describe. Por consiguiente, los residuos de aminoácido ligados covalentemente se separan de manera conveniente en por lo menos los aminoácidos formadores de bucle, por ejemplo la secuencia X24 25 26 27, como se describe en la presente solicitud. Las posiciones particularmente preferidas de los enlaces covalentes intra-secuencia en SEQ ID NO: 699-960 se pueden describir en forma de las siguientes modalidades: Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ??2, X13, i , y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X37, X38, X39 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X13, 14, X15, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 361 X371 X38 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X14, X15, i6> y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X35, X36, X37 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 5, X 6l X17, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X34, X35l X36 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 6, X 7, X18, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X33, X34, X35 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de ??7, X18, X19, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X32, X33, X34 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X18, X19, X2o, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X31, X32, X33 están ligados covalentemente entre sí.

Por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 9, X20, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X X32 están ligados covalentemente entre sí.

El residuo de aminoácido X2o y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X30, X31 están ligados covalentemente entre sí.

De manera más particular, los residuos de aminoácido X 2 y X39, Xi3 y X38, Xi4 y X37, X15 y X 36. X16 y X35, X17 y X34. X18 y X33» X19 y X32, o X20 y X31 de manera conveniente pueden estar ligados covalentemente entre sí.

Se menciona que la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención puede comprender residuos de aminoácido adicionales que aquéllos específicamente descritos en la presente solicitud. En particular, podría haber uno o más de un residuo de aminoácido adicionales en la posición N-terminal y/o C-terminal de las secuencias seleccionadas a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-960. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido de los análogos de péptido ß amiloide de la invención puede comprender una metionina en la posición N-terminal de una de las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1-960, especialmente si el péptido correspondiente a la secuencia de aminoácido se produce en forma recombinante en un hospedero procariota. Además, se puede insertar uno o más de un aminoácido en las secuencias de aminoácido descritas en la presente solicitud.

También se menciona que aquellas secuencias entre SEQ ID NO: 1-960 que carecen de 3, 11, 15 o 19 aminoácidos N-terminales de cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 369 o SEQ ID NO: 699 representan modalidades particulares de la presente invención.

De igual manera, se menciona que aquellas secuencias de entre SEQ ID NO: 1-960 que carecen de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos C-terminales de cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 369 o SEQ ID NO: 699 representan modalidades particulares de la presente invención.

Las modalidades particulares de la presente invención incluyen análogos de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud, en los cuales la secuencia de aminoácido es ?ß(1-42), ?ß(12-42), ?ß(16-42), ?ß(20-42), o ?ß(16-35), en las que el aminoácido en la posición 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 se selecciona a partir del grupo que consiste de cisteína, lisina, ácido glutámico o ácido aspártico, en particular cisteína o lisina, y el aminoácido en la posición 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, o 29 se selecciona a partir del grupo que consiste de cisteína, lisina, ácido glutámico o ácido aspártico, en particular cisteina, Usina, o ácido glutámico, y el aminoácido en la posición 14 está ligado en forma covalente con el aminoácido en la posición 37, el aminoácido en la posición 15 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 36, el aminoácido en la posición 16 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 35, el aminoácido en la posición 17 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 34, el aminoácido en la posición 18 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 33, el aminoácido en la posición 19 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 32, el aminoácido en la posición 120 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 31, el aminoácido en la posición 21 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 30, o el aminoácido en la posición 22 está ligado covalentemente con el aminoácido en la posición 29.

Se puede establecer un enlazamiento covalente entre dos residuos de aminoácido mediante una variedad de medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante formación de puente de disulfuro o técnicas de entrelazamiento. En particular, se pueden ligar entre sí las cadenas laterales de los residuos de aminoácido. Especialmente cadenas laterales con un grupo funcional, por ejemplo, un grupo tiol, amino, carboxilo o hidroxilo, se pueden ligar entre sí directamente, tal como dos residuos de cisteina los cuales forman un puente de disulfuro, o indirectamente a través de un enlazador. Por consiguiente, el residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a los otros residuos de aminoácido puede ser, en particular, el de un resid uo de aminoácido que se selecciona a partir del g rupo que consiste de cisteína , lisina , ácido aspártico y ácido glutámico.

El entrelazamiento de prote ínas tiene una historia larga y exhaustiva, con g randes cantidades de literatu ra precedente. Se puede utilizar cualquier metodolog ía conocida por aquéllos familiarizados con la técnica que permita que se puedan hacer entrelazamientos covalentes específicos entre cadenas laterales de aminoácido natu ral o no natural para formar los entrelazamientos específicos de posición contemplados en esta invención . Algunos ejemplos de esta metodolog ía se listan más adelante.

Existe un gran número de agentes qu ímicos para entrelazamiento q ue son conocidos por los expertos en la técnica. Para la presente invención , los agentes de entrelazamiento preferidos incluyen entrelazadores homobifuncionales y heterobifuncionales, siendo preferidos los entrelazadores heterobifuncionales debido a su idoneidad para u nir aminoácidos en una manera paso a paso.

Además, los entrelazadores heterobifuncionales proveen la capacidad de establecer enlazamientos más específicos, con lo cual se reducen las incidencias de reacciones secundarias indeseadas.

En la técnica se conoce una amplia variedad de entrelazadores heterobifuncionales.

Estos incluyen entrelazadores heterobifuncionales para formar enlazamientos entre dos grupos amino (-NH2), un grupo amino y un grupo tiol (o sufhidrilo, es decir, -SH), o dos grupos tiol.

Un grupo reactivo útil como parte de un entrelazador heterobifuncional es un grupo reactivo a amina. Los grupos reactivos a amina comunes incluyen ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). Los ésteres de NHS reaccionan específicamente con las aminas libres (por ejemplo, residuos lisina) en minutos, bajo condiciones ligeramente ácidas a neutras (pH 6.5-7. 5).

Se menciona que los agentes de entrelazamiento que tienen porciones de N-hidroxisuccinimida también se pueden utilizar en forma de sus análogos de N-hidroxisulfosuccinimida, los cuales generalmente tienen mayor solubilidad en agua. , Otro grupo reactivo útil cómo parte de un entrelazador heterobifuncional es un grupo reactivo a tiol. Los grupos reactivos a tiol comunes incluyen maleimidas, halógenos, y disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan específicamente con grupos tiol libres (por ejemplo, en los residuos cisteína) en minutos, de preferencia bajo condiciones ligeramente ácidas a neutras (pH 6.5-7.5). Los halógenos (grupo funcional yodoacetilo) reaccionan con los grupos -SH a pHs fisiológicos. Ambos grupos reactivos dan como resultado la formación de enlaces tioéter estables.

Por ejemplo, se puede utilizar succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1 -carboxilato (SMCC) o sulfo-SMCC para formar un entrelazamiento entre la amina de, por ejemplo, una cadena lateral de Lys y el -SH libre de, por ejemplo, una cadena lateral de Cys. El éster de N-hidroxisuccin¡mida (NHS) reactivo a amina reacciona con un grupo amino (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida estable. El péptido activado con maleimida resultante reacciona después con un grupo sulfhidrilo del mismo péptido (por ejemplo, el de un residuo Cys) para formar un puente de disulfuro, con lo cual se establece el enlazamiento covalente. Esta química está bien descrita en la literatura; véase, por ejemplo: Uto, I., et al. (1991). J. Immunol. Methods 138, 87-94; Bieniarz, C, et al. (1996). Extended Length Heterobifunctional Coupling Agents for Protein Conjugations. Bioconjug. Chem. 7, 88-95; Chrisey, L.A., et al. (1996). Nucleic Acids Res. 24(15), 3031-3039; Kuijpers, W.H., et al. (1993). Bioconjug. Chem. 4(1), 94-102; Brinkley, M.A. (1992). A survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens and crosslinking reagents. Bioconjugate Chem. 3, 2-13; Hashida, S., et al. (1984). More useful maleimide compounds for the conjugation of Fab to horseradish peroxidase through tiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem. 6, 56-63; Mattson, G., et al. (1993). A practical approach to crosslinking. Molecular Biology Reports 17, 167-183; Partís, M. D., et al. (1983). Crosslinking of proteins by omega-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimide esters. J. Protein. Chem. 2, 263-277; Samoszuk, M. K., et al. (1989). A peroxide-generating immunoconjugate directed to eosinophil peroxidase is cytotoxic to Hodgkin's disease cells ¡n vitro. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 2, 37-45; Yoshitake, S., et al. (1982). Mild and efficient conjugation of rabbit Fab and horseradish peroxidase using a maleimide compound and its use for enzyme immunoassay. J. Biochem. 92, 1413-1424.

Se pueden utilizar entrelazadores heterobifuncionales adicionales en un modo similar, por ejemplo, éster de ([?-e-maleimidocaproiloxi]succinimida, éster de ?-[?-maleimidobutiriloxi]succinimida, éster de ?-[?-maleimidoundecanoiloxi]sulfosuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), o sus análogos de sulfosuccinimida (por ejemplo sulfo-MBS).

Un ejemplo adicional de un entrelazador heterobifuncional que se puede utilizar para formar un entrelazamiento entre la amina de, por ejemplo, una cadena lateral de Lys y el -SH libre de, por ejemplo, una cadena lateral de Cys, es succinimidil-6-[(3-(2-piridilditio)-propionato]-hexanoato (LC-SPDP) o sulfo-LC-SPDP. El éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) reactivo a amina reacciona con un grupo amino (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida estable. El péptido resultante tiene un grupo piridildisulfuro que reacciona después con un grupo sülfhidrilo del mismo péptido (por ejemplo, el de un residuo Cys) para formar un puente de disulfuro, con lo cual se establece el enlazamiento covalente. Esta química está bien descrita en la literatura; véase por ejemplo: Carlsson, J., et al. (1978) Biochem. J. 173, 723-737; Stan, R.V. (2004) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H1347-H1353; Mader, C, et al. (2004) J. Bacteriol. 186, 1758-1768.

Se pueden utilizar entrelazadores heterobifuncionales adicionales en un modo similar, por ejemplo, 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT) o sulfo-SMPT, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) o sulfo-SPDP.

Un ejemplo adicional de un entrelazador heterobifuncional que se puede utilizar para formar un entrelazamiento entre la amina de, por ejemplo, una cadena lateral de Lys y el -SH libre de, por ejemplo, una cadena lateral de Cys es N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) o sulfo-SATA. El éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) reactivo a amina reacciona con un grupo amino (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida estable. El grupo -SH protegido del péptido resultante después se desprotege mediante tratamiento con hidroxilamina, y el grupo -SH libre resultante después reacciona con un grupo sulfhidrilo del mismo péptido (por ejemplo, el de un residuo Cys) para formar un puente de disulfuro, con lo cual se establece el enlazamiento covalente.

Se pueden utilizar entrelazadores heterobifuncionales adicionales en un modo similar, por ejemplo, N-succinimidil-S-acetiltiopropionato o su análogo de sulfosuccinimida.

Los entrelazadores heterobifuncionales adicionales apropiados incluyen N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB) o sulfo-SIAB.

También se pueden formar entrelazamientos paso a paso, específicos entre grupos amino (-NH2) y carboxi (-COOH).

Por ejemplo, se puede utilizar clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) para formar un entrelazamiento entre la amina de, por ejemplo, una cadena lateral de Lys y el -COOH libre de una cadena lateral ácida. La carbodi-imida reactiva a carboxi reacciona con un grupo carboxi (por ejemplo, el de un residuo de Asp, Glu, Dab (ácido 2,4-diaminobutírico), Dap (ácido 2,4-diaminopropiónico), u ornitina) para formar un éster o-acilisourea inestable. El éster o-acilisourea reactivo después reacciona con un grupo amino del mismo péptido (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida, con lo cual se establece el enlazamiento covalente. De manera alternativa, el éster o-acilisourea reactivo se puede hacer reaccionar con N-hidroxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimida o sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida para producir el éster de NHS reactivo a amina semi-estable el cual después reacciona con un grupo amino del mismo péptido (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida, con lo cual se establece el enlazamiento covalente. Esta química está bien descrita en la literatura; véase por ejemplo: DeSilva, N. S. (2003) Interactions of Surfactant Protein D with Fatty Acids. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 29, 757-770; Grabarek, Z. y Gergely, J. (1990) Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem. 185, 131-135; Sinz, A. (2003). J. Mass Spectrom. 38, 1225-1237. Staros, J.V., Wright, R.W. y Swingle, D. M. (1986) Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal. Biochem. 156, 220-222; Taniuchi, M., et al. (1986). Induction of nerve growth factor receptor ¡n Schwann cells after axotomy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4094-4098.

Los entrelazadores heterobifuncionales también incluyen la reacción de los aminoácidos Lys(N3) y propargil-glicina. Esta reacción se puede efectuar en solución o sobre resina (como se describe, por ejemplo, en Jiang, S., (2008) Curr. Org. Chem. 12, 1502-1542 y las referencias citadas en el mismo).

Una clase particular de entrelazadores, en particular entrelazadores heterobifuncionales, incluye los entrelazadores foto-reactivos.

Por ejemplo, se puede utilizar (SDA) para formar un entrelazamiento entre la amina de, por ejemplo, una cadena lateral de Lys y la amina de, por ejemplo, otra cadena lateral de Lys. El éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) reactivo a amina reacciona con un grupo amino (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida estable. El péptido resultante tiene una porción diazirina fotolábil que, después de exposición a luz UV, reacciona con un grupo amino (por ejemplo, el de un residuo Lys) del mismo péptido para formar un enlace estable, con lo cual se establece el enlazamiento covalente.

Los entrelazadores foto-reactivos apropiados adicionales incluyen bis-[ -(4-azidosalicilamido)-etil]-disulfuro (BASED) y N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)-hexanoato (SAN-PAH).

Además de los entrelazadores heterobifuncionales, existe un número de otros agentes de entrelazamiento incluyendo los entrelazad o res homob ¡función ales.

Estos incluyen entrelazadores homobifuncionales para formar enlaces entre dos grupos amino (-NH2).

Por ejemplo, se puede utilizar suberato de disuccinimidilo (DSS) para formar un entrelazamiento entre la amina de, por ejemplo, una cadena lateral de Lys y la amina de, por ejemplo, otra cadena lateral de Lys. El éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) reactivo a amina reacciona con un grupo amino (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida estable. El péptido resultante después reacciona con otro grupo amina del mismo péptido (por ejemplo, el de un residuo Lys) para formar un enlace tipo amida estable adicional, con lo cual se establece el enlazamiento covalente.

Los entrelazadores homobifuncionales apropiados adicionales incluyen bismaleimidohexano (BMH) y di-metilpimelimidato (DMP).

Los entrelazadores homobifuncionales apropiados adicionales incluyen un enlazamiento tipo metilenditioéter entre dos cisteínas. La reacción del péptido con TBAF (fluoruro de tetrabutilamonio) se puede efectuar sobre resina que contenga al péptido parcialmente desprotegido seguido por corte (véase, por ejemplo, Ueki et al., (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett., 9, 1767-1772, y Ueki et al. en Peptide Science, 1999, 539-541).

Los sistemas de entrelazamiento homobifuncional apropiados adicionales incluyen reacciones de metátesis de cierre de anillo entre alilglicinas (véase, por ejemplo, Wels, B. et al., (2005) Bioorg. Med. Chem. 13, 4221-4227) o aminoácidos modificados, por ejemplo (S)-Fmoc-a(2'pentenil)alanina (véase, por ejemplo, Walensky, L.D., et al., (2004) Science 305, 1466-1470; Schafmeister, CE., et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892; Qiu, W., et al., (2000) Tetrahedron 56, 2577-2582; Belokon, Y.N., et al., (1998) Tetrahedron: Asymmetry, 9, 4249-4252); Qiu W., (2008) Anaspec poster at 20th American Peptide Society Annual Meeting). Esta reacción se puede efectuar en solución sobre el fragmento de péptido protegido o sobre la resina, respectivamente.

El entrelazador homobifuncional y heterobifuncional puede comprender un brazo espaciador o puente. El puente es la estructura que conecta los dos extremos reactivos. El atributo más evidente del puente es su efecto sobre el impedimento estérico. En algunos casos, un puente más largo puede abarcar más fácilmente la distancia necesaria para enlazar dos residuos de aminoácido.

Aunque un enlazamiento covalente entre 2 residuos de aminoácido no contiguos puede proveer suficiente estabilización, los análogos de péptido ß amiloide de la invención pueden comprender más de un enlazamiento covalente.

La presente invención también se refiere a oligómeros que comprenden una pluralidad de análogos de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud.

El término "oligómeros" en la presente solicitud se refiere a una asociación no covalente de dos o más análogos de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud, que posee homogeneidad y características físicas distintas. De conformidad con un aspecto, los oligómeros son ensambles oligoméricos no fibrilares, estables, de análogos de péptido ß amiloide. De conformidad con una modalidad, dichas ensambles comprenden 2 a 28 análogos de péptido ß amiloide.

Dichos oligómeros se pueden caracterizar adicionalmente por interacciones particulares entre dos o r análogos de péptido ß amiloide.

Por ejemplo, se prefiere que la secuencia de aminoácido de cada análogo de péptido ß amiloide comprenda la secuencia L34M35 36G37G38, en la cual la secuencia LA34MA35VA36GA37GA38 de un análogo de péptido ß amiloide (A) está en orientación paralela con la secuencia LB34MB35VB36GB37GB38 de otro análogo de péptido ß amiloide (B). De manera más particular, se prefiere que la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de MA35(NH)-VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)-LB34(C6H3), MA35(N ?)-??36(???3) sea de 1.8 a 6.5 Angstroms.

De conformidad con una modalidad particular adicional, la invención se refiere a oligómeros en los cuales la secuencia de aminoácido de cada análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia G33L34M35V36G37G38V39, en la que la secuencia GA33LA34MA35VA36GA3 GA38VA39 de un análogo de péptido ß amiloide (A) está en orientación paralela con la secuencia G B33L 3 M B35 B36G 37G 38VB39 de otro análogo de péptido ß amiloide (B). De manera más particular, se prefiere que la distancia entre protones para por lo menos un par de átomos que se selecciona a partir del grupo que consiste de GA33(NH)-GB34(NH), MA35(NH)-VB3e(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(N H)-LB34(C5H3), MA35(NH)-VB36(CyH3), GA38(NH)-VB39(CYH3) y VA39(NH)-VB39(CyH3) sea de 1.8 a 6.5 Angstroms.

Además, se prefiere que el oligómero comprenda una lámina ß paralela ¡nter-molecular formada por cadenas ß de análogos de péptido ß amiloide diferentes. De conformidad con una modalidad particular adicional, la lámina ß comprende la secuencia de aminoácido GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 de un análogo de péptido ß amiloide (A) y la secuencia de aminoácido GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 de otro análogo de péptido ß amiloide (B). De manera más particular, se prefiere que los pares de átomos GA33(CO)-LB34(N), LB34(CO)-MA35(N), MA35(CO)-VB36(N), VB36(CO)-GA37(N), y GB37(CO)-GA38(N) estén a una distancia de 3.3 ± 0.5 A, en los cuales CO indica el átomo de oxígeno de la estructura base, y los ángulos phi (f) de los residuos varían desde -180 hasta -30 y los ángulos psi (?) de los residuos varían desde aproximadamente 60 hasta 180 o desde aproximadamente -180 hasta -150.

Las distancias inter-protón que definen la estructura de la lámina ß anti-paralela se pueden determinar mediante los efectos de Overhauser nucleares (NOEs) intra-moleculares entre las amidas de la estructura base y entre las amidas de la estructura base y las cadenas laterales.

Las distancias inter-protón que definen la estructura de la lámina ß paralela se pueden determinar mediante los NOEs intermoleculares entre el grupo NH-NH de la estructura base y entre el NH de la estructura base y los grupos metilo de las cadenas laterales.

Los NOEs intra-moleculares contra inter-moleculares se pueden distinguir utilizando diferentes muestras marcadas con isótopo, como se describe, por ejemplo en el documento WO2007/064917, en particular en el Ejemplo V, parte G, Características de RMN, el cual se incorpora en la presente solicitud para referencia.

Utilizando las restricciones de distancia derivadas del NOE provenientes del análisis de los datos de RMN, se pueden calcular las estructuras, utilizando por ejemplo el programa CNX [AT. Brunger, et al., Acta Crystallogr. D54 (Parte 5), 905-21, (1998)] empleando un protocolo de fijación simulada [M. Nilges, et al., FEBS Lett. 229, 317-324, (1988)], con lo cual se proveen distancias intramoleculares y/o inter-moleculares adicionales entre dos átomos.

De conformidad con una modalidad particular adicional, los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la invención se caracterizan por su reactividad con anticuerpos particulares. Dichos anticuerpos incluyen en particular anticuerpos que tienen una afinidad de unión hacia un globulomero ?ß(20-42) truncado que es mayor que la afinidad de unión de anticuerpo hacia un globulomero ?ß(1-42).

El término "g lobulómero ?ß(?-?)" (oligómero globular ?ß(?-?)) en la presente solicitud se refiere a una asociación soluble, globular, no covalente de péptidos ?ß(?-?) como se define en la presente solicitud , q ue posee homogeneidad y características físicas distintas. De conformidad con u n aspecto, los globulomeros ?ß(?-?) son ensambles estables, no fibrilares, oligoméricos de péptidos ?ß(?-Y). En contraste al monómero y las fibrillas, estos globu lomeros se caracterizan por numeroso de subun idades de ensamble definidos (por ejemplo formas de ensamble i niciales, n=4-6, "oligómeros A", y formas de ensamble tard ías, n = 1 2- 14, "oligómeros B", como se describe en el documento WO2004/067561 ) . Los globulomeros tienen una estructura tipo g lobular tridimensional ("glóbulo fu nd ido" , véase Barghorn et al . , 2005, J Neurochem , 95, 834-847). Estos también pueden ser ca racterizados por una o más de las siguientes características: - susceptibilidad de corte de los aminoácidos N-terminales X-23 con proteasas promiscuas (tales como termolisina o endoproteinasa G luC) lo q ue produce formas tru ncadas de los globulomeros; - incapacidad de acceso a los aminoácidos 24-Y extermínales proteasas promiscuas y anticuerpos; - las formas tru ncadas de estos globulomeros mantienen la estructura central tridimensional de d ichos globulomeros con una mejor capacidad de acceso del epítope central ?ß(20-?) en su conformación de globulómero.

El término "globulómero ?ß(?-?)" también incluye los globulómeros N- et ?ß(?-?) descritos en el documento WO2007/064917.

El término "globulómero ?ß(?-?) truncado" en la presente solicitud se refiere a una forma truncada del globulómero ?ß(?-?) la cual se puede obtener sometiendo el globulómero ?ß(?-?) a digestión proteolítica limitada. De manera más específica, los globulómeros ?ß(?-?) truncados incluyen formas truncadas en el extremo N-terminal en las cuales X se selecciona a partir del grupo que consiste de los números 2 .. 24, en los que X de preferencia es 20 o 12, y Y es como se define en la presente solicitud, los cuales se pueden obtener truncando los globulómeros ?ß(1-?) mediante tratamiento con proteasas apropiadas. Por ejemplo, se puede obtener un globulómero ?ß(20-42) sometiendo un globulómero ?ß(1-42) a proteólisis con termolisina, y se puede obtener un globulómero ?ß(12-42) sometiendo un globulómero ?ß(1-42) a proteólisis con endoproteinasa GluC. Cuando se alcanza el grado deseado de proteólisis, la proteasa se inactiva en una manera generalmente conocida. Los globulómeros resultante es después se pueden aislar siguiendo los procedimientos de antemano descritos en la presente solicitud, y si fuera necesario, se procesa adicionalmente mediante pasos de tratamiento y purificación adicionales. Una descripción detallada de dichos procedimientos se describe en el documento WO 2004/067561, el cual se incorpora en la presente solicitud para referencia.

Para los propósitos de la presente invención, un globulómero ?ß(1-42) es en particular el globulómero ?ß(1-42) como se describe en el ejemplo de referencia 1 en la presente solicitud; un globulómero N-Met ?ß(1-42) es en particular el globulómero N-Met ?ß(1-42) como se describe en el ejemplo de referencia 2; un globulómero ?ß(20-42) truncado es en particular el globulómero ?ß(20-42) truncado como se describe en el ejemplo de referencia 3 en la presente solicitud, y un globulómero ?ß(12-42) truncado es en particular el globulómero ?ß(12-42) truncado como se describe en el ejemplo de referencia 4 en la presente solicitud.

Los anticuerpos que tienen una afinidad de unión hacia un globulómero ?ß(20-42) truncado que es mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia un globulómero ?ß(1-42) se describen en el documento WO 2007/062852 e incluyen, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se selecciona a partir del grupo que consiste de 7C6, 7E5, 4D10 y 5F7.

De conformidad con una modalidad particular, dicho anticuerpo se une a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la invención con una D en el intervalo de por lo menos 1 x 10"6 M. De preferencia, los anticuerpos se unen a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención con alta afinidad, por ejemplo con una KD de 1 x 10'7 M o mayor afinidad, por ejemplo con una KD de 3 x 10"8 M o mayor afinidad, con una KD de 1 x 10"8 M o mayor afinidad, por ejemplo con una KD de 3 x 10"9 M o mayor afinidad, con una KD de 1 x10"9 M o mayor afinidad, por ejemplo con una KD de 3 x 10"10 M o mayor afinidad, con una KD de 1 x 10"10 M o mayor afinidad, por ejemplo con una KD de 3 x 10~11 M o mayor afinidad, o con una KD de 1 x 10 M o mayor afinidad.

El término "mayor afinidad" en la presente solicitud se refiere a un grado de interacción en el cual el equilibrio entre el anticuerpo no unido y el análogo u oligómero de péptido ß amiloide no unido por un lado y el complejo anticuerpo-análogo/oligómero de péptido ß amiloide por el otro está más a favor del complejo anticuerpo-análogo/oligómero de péptido ß amiloide. Del mismo modo, el término "menor afinidad" en la presente solicitud se refiere a un grado de interacción en el cual el equilibrio entre el anticuerpo no unido y el análogo u oligómero de péptido ß amiloide no unido por un lado el complejo anticuerpo-análogo/oligómero de péptido ß amiloide por el otro está más a favor del anticuerpo no unido y el análogo u oligómero de péptido ß amiloide no unido. El término "mayor afinidad" es sinónimo con el término "afinidad más alta" y el término "menor afinidad" es sinónimo con el término "afinidad más baja".

Las afinidades de unión de los anticuerpos (monoclonales o policlonales) hacia un antígeno dado (tal como los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención) se pueden evaluar utilizando pruebas inmunológicas in vitro normalizadas tales como los análisis ELISA, dot blot o BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véase Jónsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jónsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

De conformidad con una modalidad particular, las afinidades definidas en la presente solicitud se refieren a los valores que se obtienen efectuando un análisis dot blot como se describe en el ejemplo 12 y evaluándolo mediante densitometría. De conformidad con una modalidad particular de la invención, determinar la afinidad de unión mediante dot blot comprende lo siguiente: una cierta cantidad del antígeno o, de manera conveniente, una dilución apropiada del mismo, por ejemplo en NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4, 0.2 mg/ml de BSA para una concentración de antígeno de, por ejemplo, 100 pmol/µ?, 10 pmol/µ?, 1 pmol/µ?, 0.1 pmol/µ? y 0.01 pmol/µ?, se transfiere de manera puntiforme sobre una membrana de nitrocelulosa, la membrana se bloquea después con leche para evitar unión no específica y se lava, después se pone en contacto con el anticuerpo de interés seguido por detección de éste último por medio de un anticuerpo secundario conjugado con enzima y una reacción colorimétrica; a concentraciones definidas de anticuerpo, la cantidad de anticuerpo unido permite la determinación de la afinidad. Por lo tanto, la afinidad relativa de dos anticuerpos diferentes hacia un objetivo, o de un anticuerpo hacia dos objetivos diferentes, se define en la presente solicitud como la relación de las cantidades respectivas de anticuerpo unido a objetivo observada con las dos combinaciones de anticuerpo-objetivo bajo condiciones de dot blot por lo demás idénticas. A diferencia de una estrategia similar basada en análisis Western blot, la estrategia dot blot puede determinar la afinidad de un anticuerpo hacia un objetivo dado en la conformación natural de este último.

El término "Kd", tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular como se sabe en la técnica.

Se cree que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención que reaccionan con anticuerpos específicos de globulómero despliegan por lo menos un epítope de globulómero. Por lo tanto, los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención son capaces de provocar una respuesta inmune que tenga un perfil similar al de la respuesta inmune provocada cuando se utilizan globulómeros ?ß(20-42) truncados u otros globulómeros truncados como inmunógeno.

El término "epítope" incluye cualquier determinante polipeptídico que tenga capacidad de unión específica a una inmunoglobulina. En algunas modalidades, los determinantes epitópícos incluyen agrupamientos de moléculas químicamente activos en superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en algunas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales, y/o características de carga específicas. Un epítope es una región de un antígeno que es ligado por un anticuerpo. Un epítope también puede ser reconocido por otros agentes de unión además de las inmunoglobulinas.

De conformidad con una modalidad particular adicional, los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la invención se caracterizan por su capacidad para provocar dicha respuesta inmune particular, por ejemplo si un mamífero, por ejemplo, un conejo o un ratón, es inmunizado con un oligómero o derivado de la invención.

Una respuesta inmune puede ser considerada como una mezcla de anticuerpos que resulta de exponer (inmunizar) un hospedero con un antígeno (el inmunógeno). Dicha mezcla de anticuerpos se puede obtener a partir del hospedero y es referida de aquí en adelante en la presente solicitud como el antisuero policlonal.

En un aspecto, dicha respuesta inmune particular, es decir, el antisuero policlonal correspondiente, se caracteriza por comprender un anticuerpo que tiene una afinidad de unión hacía un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención o hacia un globulómero ?ß(20-42) truncado que es mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia por lo menos una forma de ?ß que se selecciona a partir del grupo que consiste de ?ß(1-42) monomérico, ?ß(1-40) monomérico, ?ß(20-42) monomérico, ?ß(1-42) fibrilomérico, ?ß(1-40) fibrilomérico y globulómero ?ß(1-42).

De conformidad con una modalidad particular, la respuesta inmune, es decir, el antisuero policlonal correspondiente, se caracteriza por tener una afinidad hacia un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención o hacia un globulómero ?ß(20-42) truncado la cual es por lo menos 2 veces, por ejemplo por lo menos 3 veces o por lo menos 5 veces, de preferencia por lo menos 10 veces, por ejemplo por lo menos 20 veces, por lo menos 30 veces o por lo menos 50 veces, más preferido por lo menos 100 veces, por ejemplo por lo menos 200 veces, por lo menos 300 veces o por lo menos 500 veces, y de manera incluso más preferida por lo menos 1000 veces, por ejemplo por lo menos 2000 veces, por lo menos 3000 veces o por lo menos 5000 veces, de manera incluso más preferida por lo menos 10000 veces, por ejemplo por lo menos 20000 veces, por lo menos 30000 o por lo menos 50000 veces, y de manera más preferida aún por lo menos 100000 veces mayor que la afinidad de unión del antisuero hacia por lo menos una forma de ?ß que se selecciona a partir del grupo que consiste de ?ß(1-42) monomérico, ?ß(1-40) monomérico, ?ß(20-42) monomérico, ?ß(1-42) fibrilomérico, ?ß(1-40) fibrilomérico y globulómero ?ß(1-42).

El término "monómero de ?ß(?-?)" o "?ß(?-?) monomérico" en la presente solicitud se refiere a la forma aislada del péptido ?ß(?-?), de preferencia una forma del péptido ?ß(?-?) la cual no está comprometida en interacciones esencialmente no covalentes con otros péptidos ?ß. Esta representa al péptido esencialmente no plegado el cual no despliega un epítope de globulómero. Prácticamente, el monómero ?ß(?-?) normalmente se provee en forma de una solución acuosa. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución de monómero acuosa contiene 0.05% a 0.2%, de manera más preferida aproximadamente 0.1% de NH4OH. En otra modalidad particularmente preferida de la invención, la solución de monómero acuosa contiene 0.05% a 0.2%, de manera más preferida aproximadamente 0.1% de NaOH. Cuando se utiliza (por ejemplo para determinar las afinidades de unión de los anticuerpos de la presente invención), podría ser conveniente diluir dicha solución en una manera apropiada. Además, normalmente es conveniente utilizar dicha solución dentro de 2 horas, en particular dentro de 1 hora, y especialmente dentro de 30 minutos después de su preparación.

De manera más específica, el término "monómero de ?ß(1-40)" en la presente solicitud se refiere a una preparación de monómero de ?ß(1-40) como se describe en el ejemplo de referencia 5 en la presente solicitud, y el término "monómero de ?ß(1-42)" en la presente solicitud se refiere a una preparación de ?ß(1-42) como se describe en el ejemplo de referencia 6 en la presente solicitud.

En otro aspecto, dicha respuesta inmune se caracteriza por comprender un anticuerpo que tiene una afinidad de unión hacia un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención o hacia un globulómero ?ß(20-42) truncado que es mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia un globulómero ?ß(1-42).

El término "fibrilla" en la presente solicitud se refiere a una estructura molecular que comprende ensambles de péptidos ?ß(?-?) individuales, asociados de forma no covalente, los cuales muestran estructura fibrilar en el microscopio electrónico, el cual liga al colorante rojo Congo y después presenta birrefringencia bajo luz polarizada y cuyo patrón de difracción de rayos X es una estructura ß cruzada.

En otro aspecto de la invención, una fibrilla es una estructura molecular que se puede obtener mediante un procedimiento que comprende la agregación polimérica auto-inducida de un péptido ?ß apropiado en ausencia de detergentes, por ejemplo en HCI 0.1 M, lo que conduce a la formación de agregados de más de 24, de preferencia más de 100 unidades. Este procedimiento es bien conocido en la técnica. De manera conveniente, se utilizan fibrillas de ?ß(?-?) en forma de una solución acuosa. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución de fibrilla acuosa se prepara disolviendo el péptido ?ß en NH4OH al 0.1%, diluyéndola 1:4 con NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4, seguido por reajuste del pH a 7.4, incubando la solución a 37°C durante 20 horas, seguido por centrifugación a 10,000 g durante 10 minutos y volviendo a suspender en NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4.

El término "fibrilla de ?ß(?-?)" en la presente solicitud se refiere a una fibrilla que consiste esencialmente de subunidades ?ß(?-?), en donde se prefiere que en promedio por lo menos 90% de las subunidades sean del tipo ?ß(?-?), más preferido que por lo menos 98% de las subunidades sean del tipo ?ß(?-?), y más preferido que el contenidos de péptidos de tipo no ?ß(?-?) esté por debajo del valor umbral de detección.

De manera más específica, el término "fibrilla de ?ß(1-42)" en la presente solicitud se refiere a una preparación de fibrilla de ?ß(1-42) como se describe en el ejemplo de referencia 7 en la presente solicitud.

La presente invención también se refiere a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención purificado. De conformidad con una modalidad de la presente invención, un análogo u oligómero de péptido ß amiloide purificado es uno que tiene una pureza de más de 80% en peso del péptido ?ß total, de preferencia de más de 90% en peso del péptido ?ß total, de preferencia de más de 95% en peso del péptido ?ß total.

Sería conveniente que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la invención comprendan, además de la secuencia de aminoácido derivada de ß amiloide o peptidomimético de la misma, una o más porciones adicionales. Por ejemplo, las aplicaciones para diagnóstico pueden requerir marcar los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide. Además, en la inmunización activa sería conveniente unir porciones que demuestren su conveniencia en aplicaciones de inmunización activa.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a análogos u oligómeros de péptido ß amiloide, como se define en la presente solicitud, los cuales comprenden a un grupo ligado covalentemente que facilita la detección, de preferencia un fluoróforo, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, Alexa-488, proteína fluorescente de Aequorea victoria, proteína fluorescente de Dictyosoma o cualquier combinación o derivado activo por fluorescencia de los mismos; un cromóforo; un quimioluminóforo, por ejemplo luciferasa, de preferencia luciferasa de Photinus pyralis, luciferasa de Vibrio fischeri, o cualquier combinación o derivado activo por quimioluminiscencia de los mismos; un grupo enzimáticamente activo, por ejemplo peroxidasa, por ejemplo peroxidasa de rábano, o cualquier derivado enzimáticamente activo de los mismos; un grupo denso en cuanto a electrones, por ejemplo un grupo que contenga metal pesado, por ejemplo un grupo que contiene oro; un hapteno, por ejemplo un hapteno derivado de fenol; una estructura fuertemente antigénica, por ejemplo secuencia peptídica pronosticada como antigénica, por ejemplo pronosticada como antigénica mediante el algoritmo de Kolaskar y Tongaonkar; una molécula que ayude a provocar una respuesta inmune hacia el análogo u oligómero de péptido ß amiloide, por ejemplo, seroalbúmina, ovoalbúmina, hemocianina de lapa, tiroglobulina, un toxoide proveniente de bacterias tales como toxoide tetánico y toxoide diftérico, un epítope de célula T normalmente presente en la Naturaleza, un epítope de célula T auxiliar normalmente presente en la Naturaleza; un epítope de célula T artificial tal como el epítope pan DR ("PADRE"; WO 95/07707), u otro agente inmunoestimulador, por ejemplo, mañano, tripalmitoil-S-glicerina cisteína, y similares; un aptámero para otra molécula; un grupo quelante, por ejemplo hexahistidinilo; una estructura proteínica natural u obtenida de la Naturaleza que medie interacciones proteína-proteína específicas adicionales, por ejemplo un miembro del par fos/jun; un grupo magnético, por ejemplo un grupo ferromagnético; o un grupo radioactivo, por ejemplo un grupo que comprenda 1H, 1 C, 32P, 35S o I o cualquier combinación de los mismos. Con el objetivo de evitar la ruta Th 1 de respuesta inmune pro-inflamatoria no favorecida, se espera que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide que comprenden una molécula que sea capaz de dirigir la respuesta inmune hacia la ruta anti-inflamatoria (ruta Th2), por ejemplo moléculas que comprenden un epítope de célula B tal como PADRE provean ventajas particulares en la inmunización activa (véase también, Petrushina I., et al., The Journal of Neuroscience 2007, 27(46): 12721-12731; Woodhouse A., et al., Drugs Aging 2007; 24(2): 107-119).

Dichos grupos y métodos para enlazarlos a péptidos o peptidomiméticos son conocidos en la técnica.

Los análogos y oligómeros de péptido ß amiloide descritos en la presente solicitud se pueden producir en una manera que es conocida per se en la técnica.

En un primer paso, se provee un péptido que comprende la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide deseado o un peptidomimético del mismo.

Dicho péptido o peptidomimético se puede producir mediante síntesis química utilizando diversas técnicas en fase sólida tales como aquellas descritas en G. Barany y R. B. Merrifield, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Volumen 2- "Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", pp. 3-284, E. Gross y J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980; y en J. M. Stewart y J. D. Young, "Solid-Phase Peptide Synthesis", 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984. Esta estrategia se basa en el grupo Fmoc (9-fluorenilmetil-metil-oxicarbonilo) para protección temporal del grupo a-amino, en combinación con el grupo t-butilo para protección temporal de las cadenas laterales del aminoácido (véase por ejemplo E. Atherton y R. C. Sheppard, "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", en "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Volumen 9- "Special Methods in Peptide Synthesis, Part C", pp. 1-38, S. Undenfriend y J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987.

Los péptidos se pueden sintetizar en una manera paso a paso sobre un soporte polimérico insoluble (también referido como "resina") comenzando desde el extremo C-terminal del péptido. Se comienza una síntesis anexando el aminoácido C-terminal del péptido a la resina a través de la formación de un enlace tipo amida o éster. Esto permite la liberación eventual del péptido resultante como una amida o ácido carboxílico C-terminal, respectivamente. De manera alternativa, en casos en los que está presente un amino-alcohol C-terminal, el residuo C-terminal se puede unir a la resina de alcohol 2-metoxi-4-alcoxibencílico (SASRIN™, Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA) como se describe en la presente solicitud y, después de completar el ensamblado de la secuencia de péptido, el alcohol peptídico resultante se libera con LiBH4 en THF (véase J. M. Stewart y J. D. Young, supra, p. 92).

Se requiere que el aminoácido C-terminal y todos los otros aminoácidos utilizados en la síntesis tengan sus grupos a- amino y los grupos funcionales de la cadena lateral (si están presentes) proteg idos en forma d iferencial de modo tal que el grupo protector del a-amino se pueda eliminar selectivamente durante la síntesis. La copulación de u n aminoácido se efectúa mediante activación de su grupo carboxilo como u n éster activo y reacción del mismo con el grupo a-amino no bloq ueado del aminoácido N-terminal anexado a la resina. La secuencia de desprotección del g rupo a-amino y copulación se repite hasta que se ensambla la secuencia peptídica completa. El péptido se libera después de la resina con desprotección concomitante de los g rupos funcionales de la cadena lateral , generalmente en presencia de depu radores apropiados para limitar a las reacciones secu ndarias . El péptido resultante finalmente se purifica med iante H P LC de fase inversa .

La síntesis de las peptidil-resinas req ueridas como precursores para los péptidos finales utiliza resinas de polímero de poliestireno entrelazado comercialmente disponibles (Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA) . Los soportes sólidos preferidos son : resina de 4-(2' ,4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetil-p-metil benzh idrilamina (resina M BHA de amida Rink) ; resina 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi-Merrifield (resina de amida Sieber) ; resina 4-(9-Fmoc)aminometil-3, 5-dimetoxifenoxi)valeril-aminometil-Merrifield (resina PAL) , para carboxamidas C-terminales . La copulación del primer aminoácido y de los aminoácidos subsiguientes se puede lograr utilizando los ésteres activos HOBT o HOAT que se producen a partir de DIC/HOBT, HBTU/HOBT, BOP, PyBOP, o a partir de DIC/HOAT, HATU/HOAT, respectivamente. Los soportes sólidos preferidos son: resina de cloruro de 2-clorotritilo y resina de 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi-Merrifield (resina de amida Sieber) para fragmentos de péptido protegidos. La carga del primer aminoácido sobre la resina de cloruro de 2-clorotritilo se logra de mejor manera haciendo reaccionar el aminoácido protegido con Fmoc con la resina en diclorometano y DIEA. Si fuera necesario, se puede agregar una cantidad pequeña de DMF para facilitar la disolución del aminoácido.

Las síntesis se pueden efectuar utilizando un sintetizador de péptidos, tal como un Sintetizador de péptidos Múltiples de Advanced Chemtech (MPS396) o un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems Inc. (ABI 433a).

De manera alternativa, se puede utilizar cualquier otra metodología apropiada conocida por aquellos familiarizados con la técnica, incluyendo: 1) síntesis de copias múltiples del péptido o peptidomimético deseado separadas mediante los sitios de corte apropiados para corte enzimático o químico de los enlaces peptídicos, lo que da como resultado el péptido peptidomimético deseado, 2) expresión recombinante de APP en cualquier sistema conocido por aquellos familiarizados con la técnica, y que contiene la secuencia de aminoácido, seguido ya sea por procesamiento enzimático o químico para obtener el péptido deseado, 3) expresión recombinante del péptido deseado como una proteína de fusión en cualquier sistema conocido por aquellos familiarizados con la técnica, 4) expresión recombinante del péptido deseado directamente en cualquier sistema conocido por aquellos familiarizados con la técnica.

La expresión recombinante de los péptidos ß amiloides se describe en el documento WO2007/064917. Asimismo, los métodos generales para la expresión de proteínas heterologas en hospederos recombinantes, síntesis química de polipéptidos, y traducción in vitro son bien conocidos en la técnica y se describen también en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif. ; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken 1. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243: 187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957; y Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing).

En un segundo paso, el péptido o peptidomimético obtenido se somete a condiciones que permiten que se forme el enlazamiento. Desde luego, las condiciones dependen del tipo de enlazamiento que se va a formar y pueden ser determinadas fácilmente por el experto en la técnica. Se hace referencia a la descripción de enlazamientos y su química se provee en la presente solicitud.

La síntesis de oligómero adicionalmente implica la formación del oligómero. Por lo tanto, el segundo paso no sólo comprende la formación del enlazamiento sino también la formación del oligómero.

Las condiciones apropiadas para formación de oligómero se describen en, por ejemplo, WO 2004/067561; WO 2006/094724; S. Barghorn et al., J. Neurochem. 95, 834 (2005) y WO2007/064917, las cuales se incorporan en la presente solicitud para referencia.

En principio, la formación del oligómero puede anteceder a la formación del enlazamiento. Esto es conveniente si el oligómero preformado dirige o promueve los enlazamientos que se van a formar. De manera alternativa, la formación del enlazamiento puede anteceder a la formación del oligómero. Esto es conveniente si los enlazamientos preformados dirigen o promueven la formación del oligómero. La formación del oligómero y la formación del enlazamiento también se pueden presentar en forma concomitante.

Tanto el análogo de péptido ß amiloide como el oligómero se pueden preparar utilizando un péptido o peptidomimético que difiera de la secuencia de aminoácido o del peptidomimético comprendidos por el análogo u oligómero de péptido ß amiloide final. Por ejemplo, el péptido de partida puede comprender aminoácidos adicionales en su extremo C-terminal y/o N-terminal los cuales se retiran después durante la síntesis, por ejemplo, mediante corte proteolítico.

En una modalidad de la invención, los oligómeros se forman con un péptido o peptidomimético de los mismos y posteriormente se estabilizan mediante uno o más enlace(s) covalente(s) intra-péptido o intra-peptidomimético. En esta modalidad, podría ser conveniente utilizar un péptido en lugar de un peptidomimético.

En otra modalidad de la invención, los oligómeros se forman con un péptido o peptidomimético de los mismos, se estabilizan mediante uno o más enlace(s) covalente(s) intra-péptido o intra-peptidomimético, y posteriormente se procesan utilizando medios químicos o enzimáticos hasta una forma truncada que despliega de manera más adecuada los elementos estructurales relevantes. De manera alternativa, los oligómeros se forman con un péptido o peptidomimético de los mismos, se procesan utilizando medios químicos o enzimáticos hasta una forma truncada que despliega de manera más adecuada los elementos estructurales relevantes, y posteriormente se estabilizan mediante uno o más enlace(s) covalente(s) intra-péptido o intra-peptidomimético. En estas modalidades, podría ser conveniente utilizar un péptido en lugar de un peptidomimético.

Incluso en otra modalidad de la invención, se utiliza un péptido o peptidomimético de los mismos para formar los elementos estructurales relevantes, en la cual el péptido o peptidomimético se mantiene en la conformación apropiada mediante uno o más enlace(s) covalente(s) intra-péptido o intra-peptidomimético, en vez de mediante interacción con los péptidos o peptidomimético adyacentes en un oligómero. Se contempla que estos análogos de péptido ß amiloide, estabilizados con los enlace(s) covalente(s) intra-péptido o intra-peptidomimético apropiados, presentarán los elementos estructurales relevantes como un monómero. En esta modalidad, podría ser conveniente utilizar un peptidomimético en vez de un péptido.

Los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la invención tienen muchas utilidades. Por ejemplo, éstos se pueden utilizar en: 1) terapias de intervención basadas en inmunización (por ejemplo, se pueden utilizar análogos u oligómeros de péptido ß amiloide en inmunización activa para tratar o prevenir una amiloidosis); 2) análisis de diagnóstico (por ejemplo, se pueden utilizar los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide para diagnosticar una amiloidosis; 3) proveer agentes tales como anticuerpos y aptámeros que se unan a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide; y 4) investigación de diseño basado en estructura basada en datos cristalográficos o de RMN para desarrollar agentes tales como anticuerpos y aptámeros que se unan a los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide.

El término "amiloidosis" en la presente solicitud indica un número de trastornos caracterizados por plegamiento, aglomeración, agregación y/o acumulación anormal de proteínas particulares (proteínas fibrosas, amiloides y sus precursores) en varios tejidos del cuerpo. En la enfermedad de Alzheimer y en el síndrome de Down, se afecta el tejido nervioso, y en angiopatía amiloide cerebral (CAA por sus siglas en inglés) se ven afectados los vasos sanguíneos. De conformidad con una modalidad particular de la presente invención, una amiloidosis se selecciona a partir del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer (EA) y la amiloidosis del S índrome de Down .

En la inmunización activa, el globu lomero ?ß(20-42) truncado ha demostrado ser efectivo para revertir los efectos cognitivos en ratones transgén icos con Enfermedad de Alzheimer. Los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención pueden provocar una respuesta i nmu ne cuyo perfil es similar al perfil de la respuesta inmu ne provocada por el g lobulomero ?ß(20-42) truncado.

Por lo tanto , la invención también se refiere al análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se defi ne en la presente solicitud para usos terapéuticos.

En un aspecto, la invención se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden u n análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud . De conformidad con una modalidad particular, dichas composiciones son composiciones terapéuticas que comprenden también un veh ículo farmacéutico aceptable .

En un aspecto ad icional , la invención se refiere al uso del análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para preparar u na composición farmacéutica para tratar o prevenir u na amiloidosis.

En u na modalidad preferida de la invención , la composición farmacéutica es u na vacuna para inm unización activa.

Por consig u iente, la invención también se refiere a un método para tratar o preveni r una amiloidosis en un ind ividuo en necesidad de lo mismo, q ue comprende administrar el análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud al individ uo.

En u na modalidad preferida de la invención , admi nistrar el análogo u oligómero de péptido ß amiloide es para inmunizar activamente al individuo contra una amiloidosis.

En el contexto de inmunización activa , se prefiere en particular que el a nálogo u oligómero de péptido ß amiloide no pueda entrar al SNC del paciente en cantidades significativas.

También es particularmente preferido que la composición farmacéutica que comprende el análogo u oligómero de péptido ß amiloide sea capaz de inducir una respuesta inmu ne fuerte contra oligómeros ?ß, de preferencia u na respuesta inmune fuerte dirigida contra oligómeros ?ß solamente, de manera más preferida una respuesta inmu ne fuerte basada en anticuerpo no inflamatoria contra oligómeros ?ß solamente. Por lo tanto, en una modalidad de la invención la composición farmacéutica comprende u n coadyuvante inmunológico, de preferencia u n coadyuvante y u na molécula para señalización , por ejemplo una citocina , que dirija la respuesta inmune hacia el tipo basado en anticuerpo, no i nflamatoria . Dichos coadyuvantes y moléculas de señalización son bien conocidos por los expertos en la técnica .

Se prefiere en particular q ue la composición farmacéutica para inmunización activa se admin istre a través de una vía que se selecciona a partir del grupo q ue consiste de la vía intravenosa, la vía intramuscular, la vía subcutánea , la vía intranasal, y mediante inhalación . También es particularmente preferido que la composición se administre mediante un método q ue se selecciona a partir de inyección , infusión de bolo e infusión contin ua , cada uno de los cuales se puede efectuar una vez, en forma repetida o a intervalos reg ulares.

En una modalidad particular de la invención, la infusión continua a largo plazo se logra utilizando un dispositivo que se pueda implantar. En u na modalidad particular ad icional de la invención, la composición se aplica como una form u lación de depósito para liberación sostenida o liberación controlada implantable. Las formulaciones y d ispositivos apropiados son conocidos por los expertos en la técn ica . Los detalles de los métodos a ser utilizados para cualquier vía dada dependen de la etapa y gravedad de la enfermedad y de los parámetros médicos generales del individuo y de preferencia se deciden individualmente a discreción del médico o veterinario encargado.

En una modalidad especialmente preferida de la invención , la composición farmacéutica para inmu nización activa comprende u na o más sustancias q ue se seleccionan a partir del grupo que consiste de conservadores farmacéuticamente aceptables, colorantes farmacéuticamente aceptables, coloides protectores farmacéuticamente aceptables , reguladores de pH farmacéuticamente aceptables y regu ladores de presión osmótica farmacéuticamente aceptables. Dichas sustancias están descritas en la técnica.

En línea con la hipótesis del globulómero, se cree que los individuos que padecen de una amiloidosis desarrollan una respuesta inmune contra epítopes endógenos del globulómero. Debido a que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención reaccionan con anticuerpos que son específicamente reactivos con dichos epítopes, se cree que los oligómeros despliegan el mismo epítope o un epítope muy similar.

La invención por lo tanto también se refiere al análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para usos en diagnóstico.

En un aspecto, la invención se refiere a composiciones para diagnóstico que comprenden un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud. De conformidad con una modalidad particular, dichas composiciones son composiciones terapéuticas que comprenden también un vehículo farmacéutico aceptable.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para preparar una composición para diagnosticar una amiloidosis.

Por consiguiente, la invención también se refiere un método para diagnosticar una amiloidosis que comprende proveer una muestra proveniente del individuo del que se sospecha que tiene la amiloidosis, poner la muestra en contacto con un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud du rante un tiempo y bajo cond iciones suficientes para la formación de un complejo que comprende al análogo u oligómero de péptido ß amiloide y un anticuerpo, la presencia del complejo indica que el individuo tiene la amiloidosis. De conformidad con una modalidad particu lar, por lo menos el paso de poner en contacto la muestra se efectúa ex vivo y en particu lar in vitro.

Por lo tanto , el análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la presente invención se puede utilizar en una variedad de métodos y pruebas de d iagnóstico.

De conformidad con una modalidad , el método para diagnosticar una amiloidosis en u n paciente del q ue se sospecha que tiene esta enfermedad comprende los pasos de: a) aislar u na muestra biológica a partir del paciente; b) poner la muestra biológica en contacto con un análogo u oligómero de péptido ß amiloide du rante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de los complejos de anticuerpo/análogo u oligómero de péptido ß amiloide; c) agregar un conj ugado a los complejos de anticuerpo/análogo u oligómero de péptido ß amiloide resultantes du rante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido , en el cual el conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal q ue sea capaz de generar una señal detectable; y d) detectar la presencia de anticuerpos que puedan estar presentes en la muestra biológica mediante detección de una señal generada por el compuesto generador de señal , la señal indica una diagnosis de una amiloidosis en el paciente. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos uno de los pasos b), c) y d) se efectúa ex vivo y en particular in vitro. De conformidad con una modalidad particular adicional, el método no comprende el paso a).

De conformidad con una modalidad adicional, el método para diagnosticar una amiloidosis en un paciente del que se sospecha que tiene esta enfermedad comprende los pasos de: a) aislar una muestra biológica a partir del paciente; b) poner la muestra biológica en contacto con anticuerpo específico para anticuerpos en la muestra durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anti-anticuerpo/anticuerpo; b) agregar un conjugado a los complejos anti-anticuerpo/anticuerpo resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido, en el cual el conjugado comprende un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la presente invención unido a un compuesto generador de señal que sea capaz de generar una señal detectable; y c) detectar una señal generada por el compuesto generador de señal, la señal indica una diagnosis de una amiloidosis en el paciente. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos uno de dichos pasos b) y c) se efectúa ex vivo y en particular in vitro. De conformidad con una modalidad particular adicional, el método no comprende el paso a).

De manera más específica, debido a que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención despliegan el epítope de g lobu lomero y a q ue se cree q ue el epítope de globulomero es u n antígeno endógeno que da origen a una respuesta inmune endógena , la diagnosis de las amiloidosis se puede relacionar con la determinación de la presencia de auto-anticuerpos los cuales se unen específicamente a los a nálogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la i nvención .

La invención por lo tanto también se refiere al uso del análogo u oligomero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud para preparar una composición para detectar en un individuo auto-anticuerpos q ue se u nen al oligomero o derivado. Por consiguiente, la i nvención también se refiere a u n método para detectar auto-anticuerpos que se unen al análogo u oligomero de péptido ß amiloide en u n individ uo, cuyo método comprende administrar al individuo el análogo u ol igomero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud y detectar un complejo formado por el anticuerpo y el análogo u oligomero de péptido ß amiloide, la presencia del complejo indica la presencia de los auto-anticuerpos. En u na modalidad particular de la invención , se sospecha que el individuo tiene cualquier forma de amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, y la detección de auto-anticuerpos es para diag nosticar la presencia o ausencia de cualq u ier forma de amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, en el individuo.

La invención también se refiere al uso del análogo u oligomero de péptido ß amiloide como se defi ne en la presente solicitud para detectar auto-anticuerpos que se u nen al oligomero o derivado en u na m uestra. Por consig u iente , la invención también se refiere a un método para detectar auto-anticuerpos que se unen al análogo u oligómero de péptido ß amiloide ?ß en u na m uestra, cuyo método comprende poner en contacto la muestra con el análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud y detectar un complejo formado por el anticuerpo y el análogo u oligómero de péptido ß amiloide, la presencia del complejo indica la presencia de los auto-anticuerpos. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos el paso de poner en contacto la muestra se efectúa ex vivo y en pa rticular in vitro. En una modalidad preferida de la invención , la muestra se obtiene a partir de un individ uo del q ue se sospecha que tiene u na amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, y la detección de los auto-anticuerpos es para diagnosticar la presencia o ausencia de la amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer en el individ uo . Las muestras biológicas incluyen fl uidos biológicos que se pueden analizar utilizando el método antes mencionado. Estas incluyen plasma, sang re entera , sa ng re entera seca , suero, fluido cerebroespinal o extractos acuosos u organoacuosos de tejidos y células .

Se prefiere en particula r q ue el ind ividuo del que se sospecha que tiene una amiloidosis sea un individuo que tenga la amiloidosis o que tenga un riesgo incrementado de tener la amiloidosis.

De conformidad con una modalidad particular de la invención , detectar auto-anticuerpos tal como se describe en la presente solicitud también comprende un pretratamiento de la preparación (muestra) el cual ocasiona la disociación de los complejos auto-anticuerpo/antígeno. Por lo tanto, se puede utilizar un método que comprenda dicho pretratamiento con el fin de determinar la cantidad total de auto-anticuerpos presentes en la preparación (muestra) en tanto que se puede utilizar un método que no comprenda dicho pretratamiento para determinar la cantidad de auto-anticuerpos que aún se pueden unir al antígeno. Además, ambos métodos pueden permitir determinar de manera indirecta la cantidad de auto-anticuerpos complejados.

Las condiciones apropiadas para inducir la disociación de los complejos auto-anticuerpo/antígeno son conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, podría ser conveniente tratar la preparación (muestra) con ácido, por ejemplo, utilizando una solución amortiguadora de modo tal que el pH de la preparación (muestra) resultante esté en el intervalo de 1 a 5, de preferencia en el intervalo de 2 a 4 y en particular en el intervalo de 2 a 3. Las soluciones amortiguadoras apropiadas incluyen sales en una concentración fisiológica, por ejemplo NaCI y ácido acético. En el documento WO 2005/037209 se describe un método para la separación de complejos anticuerpo/antígeno, dicho documento se incorpora en la presente solicitud en su totalidad.

Brevemente, la disociación del anticuerpo a partir del antígeno en el complejo anticuerpo/antígeno comprende los pasos de: poner la muestra que contiene un complejo anticuerpo/antígeno en contacto con una solución amortiguadora para disociación; incubar la muestra; y opcionalmente concentrar la muestra.

La solución amortiguadora para disociación puede ser una solución amortiguadora de PBS la cual tiene un pH en el intervalo como el indicado en la presente solicitud. Por ejemplo, es apropiada una solución amortiguadora de PBS que contenga aproximadamente 1.5% de BSA y glicina-acetato 0.2 M, pH 2.5, o NaCI 140 mM y 0.58% de ácido acético.

La incubación durante varios minutos, por ejemplo tal como 10 a 30, por ejemplo, 20 minutos a una temperatura en el intervalo de 20 a 40°C ha demostrado ser suficiente.

La concentración se puede lograr en una manera conocida per se, por ejemplo haciendo pasar la muestra a través de una Centriprep YM30 (Amincon Inc.).

En una modalidad de la presente invención, el análogo u oligomero de péptido ß amiioide, una porción del mismo se aplica como revestimiento sobre una fase sólida. La muestra (por ejemplo, sangre entera, fluido cerebroespinal, suero, etc.) se pone después en contacto con la fase sólida. Si los anticuerpos, por ejemplo los auto-anticuerpos, están presentes en la muestra, dichos anticuerpos se unen al análogo u oligomero de péptido ß amiioide en la fase sólida y después se detectan mediante un método ya sea directo o indirecto. El método directo comprende simplemente detectar la presencia del complejo como tal y por lo tanto la presencia de los anticuerpos. En el método indirecto, se agrega un conjugado al anticuerpo unido. El conjugado comprende un segundo anticuerpo, el cual se une a los primeros anticuerpos unidos, unido a un compuesto generador de señal o marca. En caso que el segundo anticuerpo se una a un primer anticuerpo unido, el compuesto generador de señal genera una señal mensurable. Por lo tanto dicha señal indica la presencia de los primeros anticuerpos en la muestra.

Los ejemplos de fases sólidas utilizadas en las pruebas inmunológicas de diagnóstico son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (véase patente E.U.A. No. 5,705,330), glóbulos, membranas, cavidades de micro-titulación y tubos de plástico. La elección del material de la fase sólida y el método para marcar al antígeno o anticuerpos presentes en el conjugado, si se desea, se determinan tomando como base las características de desempeño del formato de prueba deseado.

Como se indica en la presente solicitud, el conjugado (o reactivo indicador) comprende un anticuerpo (o quizá antianticuerpos, dependiendo de la prueba), unidos a un compuesto generador de señal o "marca". Este compuesto generador de señal o marca es por sí mismo detectable o se puede hacer reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Los ejemplos de compuestos generadores de señal se describen en la presente solicitud e incluyen en particular cromóforos, radioisótopos (por ejemplo, 25l, 131l, 32P, 3H, 35S y 14C), compuestos quimioluminescentes (por ejemplo, acridinio), partículas (visibles o fluorescentes) , ácidos n ucleicos, agentes formadores de complejos, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina , fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa) . En el caso de uso de enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano) , la adición de un substrato cromo-, fluoro-, o lumogénico da como resultado la generación de una señal detectable. También son útiles otros sistemas de detección tal como fl uorescencia resuelta en tiempo, fluorescencia de reflexión interna , amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa) y espectroscopia Raman .

Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen estuches . De manera más específica , la presente invención incluye estuches para determina r la presencia de anticuerpos tales como auto-anticuerpos en u n individ uo. En particu lar, un estuche para determinar la presencia de d ichos anticuerpos en una muestra comprende a) un análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud ; y opcionalmente b) u n conj ugado que comprende un anticuerpo u n ido a u n compuesto generador de señal que sea capaz de generar u na señal detectable. El estuche también puede contener u n control o calibrador que comprende un reactivo que se u ne al a ntígeno.

La presente invención también incluye otro tipo de estuche para detectar anticuerpos ta les como auto-anticuerpos en una muestra . El estuche puede comprender a) u n anti-anticuerpo específico para el anticuerpo de interés, y b) análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud . También puede estar incluido u n control o calibrador q ue comprende un reactivo q ue se u ne al análogo u oligómero de péptido ß amiloide. De manera más específica, el estuche puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para el auto-anticuerpo y b) un conjugado que comprende el análogo u oligómero de péptido ß amiloide, el conjugado está un ido a u n compuesto generador de señal que sea capaz de generar una señal detectable . De nuevo, el estuche también puede comprender u n control o calibrador q ue comprende un reactivo que se une al antígeno.

El estuche también puede comprender u n contenedor tal como un frasco, botella o tira , con cada contenedor con u na fase sólida pre-establecida , y otros contenedores q ue contienen los conjugados respectivos. Estos estuches también pueden contener frascos o contenedores de otros reactivos necesa rios pa ra efectuar la prueba, tal como reactivos de lavado , procesamiento, e indicadores.

Los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la invención son útiles para proveer agentes que se puedan unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide. Dichos agentes incluyen, por ejemplo , anticuerpos (también referidos de aq u í en adelante como anticuerpo anti-oligómero) , moléculas de u nión de tipo no anticuerpo (tales como afficuerpos (affibodies) , moléculas de afilina, AdNectinas, Anticalinas, DARPinas , anticuerpos de dominio, evcuerpos (evibodies) , knotinas , domi nios tipo Ku nitz, maxicuerpos (maxibodies) , tetra nectinas, trans-cuerpos (trans-bod ies) , y V(NAR)S, como se describen , por ejemplo , en Handbook of Therapeutic Antibodies, editado por Stefa n Dübel, Volumen II , Capítulo 7, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Wein heim , 2007) , aptámeros o compuestos de peso molecular peq ueño.

En un aspecto, la i nvención se refiere por lo tanto al uso del análogo u oligómero de péptido ß amiloide para seleccionar un agente q ue se pueda u nir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide. Por consigu iente , la invención también se refiere a un método para identificar dichos agentes , cuyo método comprende los pasos de: a) exponer uno o más agentes de interés al análogo u oligómero de péptido ß amiloide descrito en la presente solicitud durante u n tiempo y bajo cond iciones suficientes para q ue dichos u no o más agentes se una(n) al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; y b) identificar a aquellos agentes que se unan al análogo u oligómero de péptido ß amiloide.

En otro aspecto , la invención se refiere al uso del análogo u oligómero de péptido ß amiloide pa ra en riquecer u n agente que se pueda unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide en una preparación que comprende a dicho agente. Por consiguiente, la invención también se refiere a u n método de en riq uecimiento dicho agente en una preparación que comprende a dicho agente, cuyo método comprende los pasos de: a) exponer al análogo u oligómero de péptido ß amiloide la preparación que comprende al agente que se pueda unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide durante un tiempo y bajo cond iciones suficientes para que el agente se una al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; y b) obtener el agente en forma en riquecida . De manera más pa rticular, el análogo u oligómero de péptido ß amiloide se puede inmovilizar (por ejemplo en una resina) , lo que permite que el agente se pueda capturar. Obtener el agente en forma en riq uecida puede comprender entonces desorción del agente capturado, de preferencia de modo tal q ue la desorción del agente captu rado comprenda poner en contacto el agente captu rado con u na solución amortiguadora con alto contenido salino o una solución ácida . Este método se puede utilizar, por ejemplo, para enriquecer auto-anticuerpos como los descritos en la presente solicitud sometiendo preparaciones comerciales de inmu noglobulina tales como IVIG u Octagam® (Octapharma I nc. Viena , Austria) a este método. Se cree que estas preparaciones de inm unoglobulina contienen auto-anticuerpos para ?ß, y med iante tratamiento de los individuos se eleva el nivel de anticuerpos anti-?ß en el cuerpo de los individ uos . Se esperaría q ue u na preparación que esté enriquecida respecto a dichos auto-anticuerpos sea más eficaz.

En un aspecto adicional, la invención se refiere por lo tanto al uso del análogo u oligómero de péptido ß amiloide para proveer un anticuerpo q ue se u na al análogo u oligómero de péptido ß amiloide. Por consiguiente , la invención también se refiere a un método para proveer u n anticuerpo q ue se una al análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud , cuyo método comprende: a) proveer u n antígeno que comprende al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; b) exponer un repertorio de anticuerpos o repertorio potencial de anticuerpo a dicho antígeno; y c) seleccionar a partir de dicho repertorio un anticuerpo que se una a dicho análogo u oligómero de péptido ß amiloide.

En la presente solicitud se debe entender que un "repertorio potencial de anticuerpo" se refiere a cualquier genoteca, depósito, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido o las secuencias de ácido nucleico correspondientes o a cualquier generador de . dicha genoteca, depósito, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido que se puedan utilizar para producir un repertorio de anticuerpo in vivo o in vitro. En una modalidad preferida de la invención, el generador es el sistema inmune adaptativo de un animal, en particular la parte productora de antígeno del sistema inmune de un mamífero que genera diversidad de anticuerpos mediante un proceso de recombinación bien conocido por los expertos en la técnica. En otra modalidad preferida de la invención, el generador es un sistema para la producción de secuencias de ácido nucleico aleatorias las cuales después se pueden utilizar, mediante inserción en una estructura de anticuerpo apropiada, para producir un repertorio de anticuerpo in vitro.

En una modalidad preferida de la invención, el repertorio de anticuerpo o repertorio potencial de anticuerpo se expone al antígeno in vivo mediante inmunización de un organismo con dicho antígeno. En otra modalidad preferida de la invención, el repertorio potencial de anticuerpo es una genoteca de ácidos nucleicos apropiados la cual se expone al anticuerpo mediante tamizaje por afinidad in vitro como se describe en la técnica, por ejemplo un sistema de despliegue de fago y de visualización (panning).

En otro aspecto, la invención también provee anticuerpos que se unen al análogo u oligómero de péptido ß amiloide ?ß(?-38.. 43) como se define en la presente solicitud.

En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo se puede obtener mediante un método que comprende seleccionar el anticuerpo partir de un repertorio o repertorio potencial como se describe en la presente solicitud.

De conformidad con una modalidad particularmente preferida, la presente invención provee anticuerpos específicos de análogo o de oligómero de péptido ß amiloide. Estos incluyen en particular anticuerpos que tienen una afinidad comparativamente más pequeña para las formas tanto monomérica como fibrilomérica del péptido ?ß que para el análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención. En algunas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando éste reconoce en forma preferencial su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo hacia el análogo u oligómero de péptido ß amiloide es de por lo menos 2 veces, por ejemplo por lo menos 3 veces o por lo menos 5 veces, de preferencia por lo menos 10 veces, por ejemplo por lo menos 20 veces, por lo menos 30 veces o por lo menos 50 veces, de manera más preferida por lo menos 100 veces, por ejemplo por lo menos 200 veces, por lo menos 300 veces o por lo menos 500 veces, y de manera incluso más preferida por lo menos 1,000 veces, por ejemplo por lo menos 2,000 veces, por lo menos 3,000 veces o por lo menos 5,000 veces, más preferido aún por lo menos 10000 veces, por ejemplo por lo menos 20,000 veces, por lo menos 30,000 o por lo menos 50,000 veces, y de manera más preferida por lo menos 100,000 veces mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia un ?ß(1-42) monomérico.

En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo hacia el análogo u oligómero de péptido ß amiloide es de por lo menos 2 veces, por ejemplo por lo menos 3 veces o por lo menos 5 veces, de preferencia por lo menos 10 veces, por ejemplo por lo menos 20 veces, por lo menos 30 veces o por lo menos 50 veces, de manera más preferida por lo menos 100 veces, por ejemplo por lo menos 200 veces, por lo menos 300 veces o por lo menos 500 veces, y de manera incluso más preferida por lo menos 1,000 veces, por ejemplo por lo menos 2,000 veces, por lo menos 3,000 veces o por lo menos 5,000 veces, más preferido aún por lo menos 10,000 veces, por ejemplo por lo menos 20,000 veces, por lo menos 30,000 o por lo menos 50,000 veces, y de manera más preferida por lo menos 100,000 veces mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia un ?ß(1-40) monomérico.

De manera conveniente, el anticuerpo de la presente invención se une a uno o, de manera más preferida, a ambos monómeros con baja afinidad, de manera más preferida con una KD de 1 x 10"8 M o afinidad más pequeña, por ejemplo con una KD de 3 x 10"8 M o afinidad más pequeña, con una KD de 1 x 10"7 M o afinidad más pequeña, por ejemplo con una KD de 3x10"7 M o afinidad más pequeña, o con una KD de 1 x 10"6 M o afinidad más pequeña, por ejemplo con una KD de 3 x 10"5 M o afinidad más pequeña, o con una KD de 1 x 10"5 M o afinidad más pequeña.

En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo hacia el análogo u oligómero de péptido ß amiloide es de por lo menos 2 veces, por ejemplo por lo menos 3 veces o por lo menos 5 veces, de preferencia por lo menos 10 veces, por ejemplo por lo menos 20 veces, por lo menos 30 veces o por lo menos 50 veces, de manera más preferida por lo menos 100 veces, por ejemplo por lo menos 200 veces, por lo menos 300 veces o por lo menos 500 veces, y de manera incluso más preferida por lo menos 1,000 veces, por ejemplo por lo menos 2,000 veces, por lo menos 3,000 veces o por lo menos 5,000 veces, más preferido aún por lo menos 10,000 veces, por ejemplo por lo menos 20,000 veces, por lo menos 30,000 o por lo menos 50,000 veces, y de manera más preferida por lo menos 100,000 veces mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia un ?ß(1-42) fibrilomérico.

En una modalidad preferida de la invención, la afinidad del anticuerpo hacia el análogo u oligómero de péptido ß amiloide es de por lo menos 2 veces, por ejemplo por lo menos 3 veces o por lo menos 5 veces, de preferencia por lo menos 10 veces, por ejemplo por lo menos 20 veces, por lo menos 30 veces o por lo menos 50 veces, de manera más preferida por lo menos 100 veces, por ejemplo por lo menos 200 veces, por lo menos 300 veces o por lo menos 500 veces, y de manera incluso más preferida por lo menos 1,000 veces, por ejemplo por lo menos 2,000 veces, por lo menos 3,000 veces o por lo menos 5,000 veces, más preferido aún por lo menos 10,000 veces, por ejemplo por lo menos 20,000 veces, por lo menos 30,000 o por lo menos 50,000 veces, y de manera más preferida por lo menos 100,000 veces mayor que la afinidad de unión del anticuerpo hacia un ?ß(1-40) fibrilomérico.

De manera conveniente, el anticuerpo de la presente invención se une a una o, de manera más preferida, a ambas fibrillas con afinidad baja, de manera más preferida con una KD de 1 x 10"8 o afinidad más pequeña, por ejemplo con una KD de 3 x 10"8 M o afinidad más pequeña, con una KD de 1 x 10"7 M o afinidad más pequeña, por ejemplo con una KD de 3 x 10'7 M o afinidad más pequeña, o con una KD de 1 x 10~6 M o afinidad más pequeña, por ejemplo con una KD de 3 x 10"5 o afinidad más pequeña, o con una KD de 1 x 10"5 M o afinidad más pequeña.

Los anticuerpos de la presente invención de preferencia son anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que tiene las afinidades de unión como se describieron anteriormente y el cual está esencialmente libre de otros anticuerpos que tengan afinidades de unión diferentes. El término "esencialmente libre" en la presente solicitud se refiere a una preparación de anticuerpo en la cual por lo menos 95% de los anticuerpos, de preferencia por lo menos 98% de los anticuerpos y de manera más preferida por lo menos 99% de los anticuerpos tienen la afinidad de unión deseada. Asimismo, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o compuestos químicos.

Los anticuerpos aislados de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales. Un "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente solicitud pretende hacer referencia a una preparación de moléculas de anticuerpo, anticuerpos que comparten una secuencia de aminoácido de cadena pesada común y cadena ligera común, en contraste con las preparaciones de anticuerpo "policlonal" la cual contiene una mezcla de anticuerpos de diferente secuencia de aminoácido. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar mediante varias tecnologías novedosas tales como despliegue en fago, bacterias, levadura o en ribosoma, así como mediante métodos clásicos ejemplificados por anticuerpos obtenidos de hibridoma (por ejemplo, un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado mediante tecnología de hibridoma, tal como la metodología estándar de hibridoma de Kohler y Milstein ((1975) Nature 256:495-497). Por lo tanto, un anticuerpo no obtenido de hibridoma con secuencia uniforme sigue siendo mencionado como un anticuerpo monoclonal en la presente solicitud aunque éste pudiera haberse obtenido mediante metodologías no clásicas, y el término "monoclonal" no está restringido a anticuerpos obtenidos de hibridoma sino que se utiliza para hacer referencia a todos los anticuerpos obtenidos a partir de un clon de ácido nucleico.

Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos recombinantes. El término "recombinante" en la presente solicitud se refiere a cualquier combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de alguna manera, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos utilizando técnicas de ingeniería genética. En particular, el término "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que se producen, expresan, generan o aislan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos que expresan utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera; anticuerpos aislados a partir de una genoteca de anticuerpo combinatoria recombinante; anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo un ratón) el cual es transgénico debido a genes de inmunoglobulina de humano (véase, por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295); o anticuerpos que se producen, expresan, generan o aislan en cualquier otra manera en la cual secuencias particulares de gen de inmunoglobulina (tales como las secuencias de gen de inmunoglobulina de humano) están ensambladas con otras secuencias de ADN. Los anticuerpos recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, de injerto de CDR y humanizados. El experto en la técnica estará consciente de que la expresión de un anticuerpo monoclonal obtenido de hibridoma convencional en un sistema heterólogo requiere de la generación de un anticuerpo recombinante incluso si la secuencia de aminoácido de la proteína del anticuerpo resultante no se cambia o no se pretende cambiar.

En una modalidad particular de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

De conformidad con una multiplicidad de modalidades, el anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácido obtenida completamente a partir de una sola especie, tal como un anticuerpo de humano o un anticuerpo de ratón. De conformidad con otras modalidades, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de injerto de CDR u otra forma de un anticuerpo humanizado.

El término "anticuerpo" pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina que consisten de 4 cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L). Las cadenas normalmente están unidas entre sí mediante puentes de disulfuro. Cada cadena pesada está constituida por una región variable de dicha cadena pesada (abreviada en la presente solicitud como HCVR o VH) y una región constante de dicha cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste de tres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está constituida por una región variable de dicha cadena ligera (abreviada en la presente solicitud como LCVR o VL) y una región constante de dicha cadena ligera. La región constante de la cadena ligera consiste de un dominio CL. Las regiones VH y VL también se pueden subdividir en regiones hipervariables referidas como regiones determinantes de complementariedad (CDRs) e intercaladas como regiones conservadas referidas como regiones de estructura base (framework regions) (FR). Por lo tanto cada región VH y VL consiste de tres CDRs y cuatro FRs las cuales están acomodadas desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Esta estructura es bien conocida por los expertos en la técnica.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de la invención, dicho fragmento o fragmentos siguen teniendo las afinidades de unión como se definieron anteriormente. Los fragmentos de un anticuerpo completo han demostrado tener la capacidad de efectuar la función de unión a antígeno de un anticuerpo. De conformidad con el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, los ejemplos de fragmentos de unión incluyen (i) un fragmento Fab, es decir un fragmento monovalente constituido por VL, VH, CL y los dominios CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, es decir un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados entre sí en la región de gozne a través de un puente de disulfuro; (iii) un fragmento Fd constituido por la VH y los dominios CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios FL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546) que consiste de un dominio de VH o de VH, CH1 , CH2, DH3, o VH, CH2, CH3; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, en específico VL y VH, son codificados por genes separados, éstos también se pueden ligar uno al otro utilizando un enlazador sintético, por ejemplo una secuencia de aminoácido Poli-G S, y métodos recombinantes, lo que hace posible que se pueden preparar como una cadena de proteína individual en la cual las regiones VL y VH se combinan con el fin de formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (ScFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo también pretende abarcar dichos anticuerpos de cadena individual. Aquí se incluyen de igual manera otras formas de anticuerpos de cadena individual tales como los "diacuerpos". Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL están expresados en una cadena polipeptídica individual, pero utilizando un enlazador en cual es muy corto como para que los dos dominios puedan combinarse en la misma cadena, con lo cual se obliga a dichos dominios a parearse con los dominios complementarios de una cadena diferente y formar dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, RJ., et al. (1994) Structure 2:1121-1 123). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o cadena ligera. Las secuencias de aminoácido del dominio constante de cadena pesada y cadena ligera de IgG de humano son conocidas en la técnica.

Asimismo, un anticuerpo de la presente invención o porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmuno-adhesión más grande formada mediante asociación covalente o no covalente de dicho anticuerpo o porción de unión a anticuerpo con una o más proteínas o péptidos adicionales. Son importantes para dichas moléculas de inmuno-adhesión el uso de la región central de estreptavidina con el fin de preparar una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo cisteína, un péptido marcador y una marca de polihistidinilo C-terminal, por ejemplo hexahistidinilo, para producir moléculas de scFv bivalentes modificadas con biotina (Kipriyanov, S. ., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058).

El término "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos cuyas regiones variables y constantes corresponden a que se obtienen a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano, como se describe, por ejemplo, por Kabat et al. (véase Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242). Sin embargo, los anticuerpos humanos de la invención pueden contener residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano (por ejemplo mutaciones que han sido introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs, y en particular en CDR3. Los anticuerpos recombinantes de humano de la invención tienen regiones variables y también pueden contener regiones constantes derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano (véase Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242). Sin embargo, de conformidad con modalidades particulares, dichos anticuerpos recombinantes de humano se someten a mutagénesis in vitro (o a mutagénesis somática in vivo, si se utiliza un animal que sea transgénico debido a secuencias de Ig de humano) de modo tal que las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes sean secuencias que aunque relacionadas con o derivadas a partir de secuencias de VH y VL de la línea germinal de humano, no existen de manera natural in vivo dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo de humano. De conformidad con modalidades particulares, los anticuerpos recombinantes de este tipo son el resultado de mutagénesis selectiva o mutación de retroceso o de ambas. De preferencia, la mutagénesis lleva a una afinidad hacia el objetivo que es mayor, y/o una afinidad hacia estructuras de tipo no objetivo la cual es más pequeña que la del anticuerpo progenitor.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que contienen secuencias para la región variable de las cadenas pesada y ligera provenientes de una especie y secuencias de región constante provenientes de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de múrido ligadas a las regiones constantes de humano.

El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos los cuales comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera provenientes de una especie pero en los cuales las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL están remplazadas con secuencias CDR de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de múrido en los cuales una o más de las CDR de múrido (por ejemplo, CDR3) ha sido remplazada con secuencias de CDR de humano.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que contienen secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera proveniente de una especie no humana (por ejemplo ratón, rata, conejo, pollo, camélido, oveja o cabra) pero en los cuales por lo menos una parte de la secuencia de VH y/o VL ha sido alterada con el fin de que sea de tipo "más humana", es decir que sea más similar a las secuencias variables de la línea germinal de humano. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo de injerto de CDR en el cual las secuencias de CDR de humano han sido insertadas en las secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias de CDR no humanas correspondientes.

Más adelante se describen los métodos para producir los anticuerpos. En la presente solicitud se hace una distinción entre estrategias in vivo, estrategias in vitro o una combinación de ambas.

Más adelante se describen algunos métodos para producir los anticuerpos de la invención. En la presente solicitud se hace una distinción entre estrategias in vivo, estrategias in vitro o una combinación de ambas.

Estrategias in vivo Dependiendo del tipo del anticuerpo deseado, se pueden utilizar varios animales hospederos para la inmunización in vivo. Se puede utilizar un hospedero que exprese por sí mismo una versión endógena del antígeno de interés. De manera alternativa, es posible utilizar un hospedero que se haya hecho deficiente en una versión endógena del antígeno de interés. Por ejemplo, ratones que se han hecho deficientes en una proteína endógena particular a través de recombinación homologa en el gen endógeno correspondiente (es decir ratones con expresión suprimida) han demostrado generar una respuesta humoral hacia la proteína con la cual éstos han sido inmunizados y por lo tanto de poder ser utilizados para la producción de anticuerpos monoclonales de alta afinidad hacia la proteína (véase, por ejemplo, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, M. P. et al. (2000) J. Neurochem. 75:404-412).

Una multiplicidad de mamíferos no humanos son hospederos apropiados para la producción de anticuerpo con el fin de producir los anticuerpos no humanos de la invención. Estos incluyen ratones, ratas, pollos, camélidos, conejos, ovejas y cabras (y las versiones de expresión suprimida de los mismos), aunque se da preferencia a los ratones para la producción de hibridomas. Asimismo, se puede utilizar un animal hospedero no humano que exprese un repertorio de anticuerpos humanos para producir anticuerpos esencialmente humanos para un antígeno humano con especificidad dual. Los animales no humanos de este tipo incluyen animales transgénicos (por ejemplo ratones) que tienen transgenes de inmunoglobulina de humano (ratones SCID hu-PBMC quiméricos) y quimeras de irradiación de humano/ratón las cuales se describen con mayor detalle más adelante.

De conformidad con una modalidad, el animal inmunizado con análogo u oligómero de péptido ß amiloide es un mamífero no humano, de preferencia un ratón, el cual es transgénico debido a genes de inmunoglobulina de humano de modo tal que dicho mamífero no humano elabora anticuerpos humanos después de la estimulación antigénica. Típicamente, los transgenes de inmunoglobulina para las cadenas pesada y ligera con configuración de línea germinal de humano se introducen en dichos animales los cuales han sido alterados de modo tal que sus loci de las cadenas pesada y ligera endógena estén inactivos. Si dichos animales se estimulan con antígeno (por ejemplo con un antígeno humano), se producen anticuerpos derivados de las secuencias de inmunoglobulina de humano (anticuerpos humanos). Es posible elaborar anticuerpos monoclonales humanos a partir de los linfocitos de dichos animales por medio de tecnología de hibridoma estandarizada. Para una descripción adicional de ratones transgénicos con inmunoglobulina de humano y su uso en la producción de anticuerpos humanos, véase, por ejemplo, los documentos US 5,939,598, WO 96/33735, WO 96/34096, WO 98/24893 y WO 99/53049 (Abgenix Inc.), y los documentos US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, US 5,814,318, US 5,877,397 y WO 99/45962 (Genpharm Inc.); véase también MacQuitty, JJ. y Kay, R.M. (1992) Science 257:1188; Taylor, L.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding, F.A. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. M. er al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; Méndez, M. J. er al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, L.L. y Jakobovits, A. (1998; J. Exp. Med. 188:483-495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410; Gallo, M. L. er al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540.

De conformidad con otra modalidad, el animal que se inmuniza con el análogo u oligómero de péptido ß amiloide puede ser un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID por sus siglas en inglés), el cual ha sido reconstituido con células sanguíneas mononucleadas periféricas o células linfoides de humano o precursores de las mismas. Dichos ratones los cuales son referidos como ratones SCID hu-PBMC quiméricos producen respuestas de inmunoglobulina de humano después de estimulación antigénica, como ha sido demostrado. Para una descripción adicional de estos ratones y de su uso para generar anticuerpos, véase, por ejemplo, Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76:229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195:360-375; Murphy, WJ. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:150-152; Albert, S. E. et al. (1997) J. Immunol. 159:1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbio!. Immunol. 41:901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yoshinari, K. y Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hutchins, W.A. et al. (1999) Hybridoma 18:121-129; Murphy, W.J. er al. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smithson, S. L. er a/. (1999) Mol. Immunol. 36:113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; y Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45.

De conformidad con otra modalidad, el animal que se inmuniza con el análogo u oligómero de péptido ß amiloide es un ratón que se trata con una dosis letal de irradiación corporal total, después se protege contra la radiación con células de médula ósea proveniente de ratones con inmunodeficiencia severa combinada (SCID) y posteriormente se transplanta con linfocitos funcionales de humano. Este tipo de quimera, referido como el sistema Trímera, se utiliza para producir anticuerpos monoclonales de humano mediante inmunización de dichos ratones con el antígeno de interés y después producción de anticuerpos monoclonales utilizando tecnología de hibridoma estandarizada. Para una descripción adicional de estos ratones y de su uso para generar anticuerpos, véase, por ejemplo, Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161 ; Reisner, Y y Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242-246; Nan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553-562; y Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96:634-641.

Partiendo de las células productoras de anticuerpo generado in vivo, se pueden producir anticuerpos monoclonales por medio de técnicas estandarizadas tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) (véase también Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cáncer 29:269-75). La tecnología para producir hibridomas para anticuerpo monoclonal es lo suficientemente conocida (véase en general R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biológica! Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Vale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). Brevemente, una línea celular inmortalizada (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos o células de nodo linfático o linfocitos de sangre periférica) de un mamífero inmunizado con el análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes se someten a tamizaje con el fin de identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Para este propósito se puede aplicar cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos para fusionar linfocitos y líneas de células inmortalizadas (véase también G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet, citado supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado supra). Asimismo, el experto en la técnica apreciará que existen diversas variaciones de dichos métodos, los cuales son igualmente útiles. Típicamente, la línea de célula inmortalizada (por ejemplo una línea de célula de mieloma) se obtiene a partir de la misma especie mamífera que la de los linfocitos. Por ejemplo, se pueden establecer hibridomas de múrido fusionando linfocitos provenientes de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la invención con una línea de célula de ratón inmortalizada. Las líneas de célula inmortalizada preferidas son líneas de célula de mieloma de ratón las cuales son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT). Se puede utilizar cualquiera de un número de líneas de célula de mieloma por omisión como compañero de fusión, por ejemplo las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1 , P3-x63-Ag8.653 o Sp2/0-Ag14. Estas líneas de célula de mieloma se pueden conseguir a partir del Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol (PEG). Las células de hibridoma que resultan de la fusión después se seleccionan utilizando medio HAT, con lo cual se aniqu ilan las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera improductiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios d ías debido a q ue éstos no están transformados) . Las células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales de la invención se identifican seleccionando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma respecto a dichos anticuerpos , por ejemplo utilizando u na prueba dot blot para seleccionar aq uellos anticuerpos que tienen las afin idades de unión como se define en la presente solicitud .

De ig ual manera, dicho hibridoma se puede utilizar como una fuente de ácido nucleico que codifica para las cadenas ligera y/o pesada con el fi n de producir de manera recombinante los anticuerpos de la presente invención, como se describe más adelante con mayor detalle .

Estrategias in vitro Como una alternativa para prod ucir los anticuerpos de la invención mediante inmunización y selección , los anticuerpos de la invención se pueden identificar y aislar sometiendo a tamizaje genotecas de inmu noglobulina combinatorias recombinantes con el análogo u oligómero de péptido ß amiloide para de esta manera aislar miembros de la genoteca de inmu noglobulina que tienen la afinidad de u nión requerida . Se pueden conseguir comercialmente estuches para genera r y someter a tamizaje genotecas de desplieg ue (por ejemplo el Sistema de Anticuerpo de Fago Recombinante de Pharmacia, No. de catálogo 27-9400-01; y el Estuche de Despliegue de Fago Sur-fZAP® de Stratagene, No. de catálogo 240612). En muchas modalidades, la genoteca de despliegue es una genoteca de scFv o una genoteca de Fab. La técnica despliegue de fago para tamizaje de genotecas de anticuerpo recombinante ha sido descrita adecuadamente. Los ejemplos de métodos y compuestos que se pueden utilizar de manera particularmente conveniente para generar y seleccionar genotecas de despliegue de anticuerpo se pueden encontrar, por ejemplo, en McCafferty et al. WO 92/01047, US 5,969,108 y EP 589 877 (describen en particular despliegue de scFv), Ladner et al. US 5,223,409, US 5,403,484, US 5,571,698, US 5,837,500 y EP 436 597 (describen la fusión de plll, por ejemplo); Dower et al. WO 91/17271, US 5,427,908, US 5,580,717 y EP 527 839 (describen en particular despliegue de Fab); Winter et al. Publicación Internacional WO 92/20791 and EP 368,684 (describen en particular la clonación de secuencias para dominios de inmunoglobulina variables); Griffiths et al. US 5,885,793 y EP 589 877 (describen en particular el aislamiento de anticuerpos humanos para antígenos humanos utilizando genotecas recombinantes); Garrard et al. WO 92/09690 (describen en particular técnicas de expresión de fago); Knappik et al. WO 97/08320 (describen la genoteca de anticuerpo recombinante de humano HuCal); Salfeld et al. WO 97/29131, (describen la producción de un anticuerpo recombinante de humano para un antígeno humano (factor de necrosis tumoral alfa de humano) y también la maduración por afinidad in vitro del anticuerpo recombinante) y Salfeld et al. Solicitud provisional E.U.A. No. 60/126,603 y las solicitudes de patente basadas en la presente solicitud (que de igual manera describen la producción de anticuerpos recombinantes de humano para antígeno humano (interleucina-12 de humano), y también la maduración por afinidad in vitro del anticuerpo recombinante).

Descripciones adicionales de tamizajes de genotecas de anticuerpo recombinantes se pueden encontrar en publicaciones científicas tales como Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths ef al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; McCafferty ef al. Nature (1990) 348:552-554; y Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86.

Como una alternativa al uso de sistemas de despliegue de bacteriófago, las genotecas de anticuerpo recombinante se pueden expresar en la superficie de células de levadura o de células bacterianas. El documento WO 99/36569 describe métodos para la preparación y tamizaje de genotecas expresadas en la superficie de células de levadura. El documento WO 98/49286 describe con mayor detalle métodos para la preparación y tamizaje de genotecas expresadas en la superficie de células bacterianas.

En todas las estrategias in vitro, un procedimiento de selección para enriquecer los anticuerpos recombinantes con las propiedades deseadas forma una parte integral del procedimiento, el cual generalmente es referido como "visualización (panning)" y con frecuencia toma la forma de cromatografía por afinidad a través de columnas a cuya matriz se ha unido la estructura objetivo. Las moléculas candidato prometedoras después se someten a determinación individual de sus afinidades absolutas y/o relativas, de preferencia por medio de una prueba dot blot estandarizada, como se describió anteriormente.

Como podrá ser apreciado por los trabajadores calificados, dichos métodos in vitro para selección y enriquecimiento también se pueden aplicar hacia la obtención de porciones de unión a antígeno no relacionadas con inmunoglobulina.

Una vez que un anticuerpo de interés de una genoteca combinatoria ha sido identificado y caracterizado en forma suficiente, se aislan las secuencias de ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada de dicho anticuerpo por medio de técnicas moleculares-biológicas estandarizadas, por ejemplo por medio de amplificación con PCR del ADN a partir del empaque de despliegue (por ejemplo el fago) que se aisló durante el tamizaje de la genoteca. Las secuencias de nucleótido de genes para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, que se pueden utilizar para preparar los iniciadores de PCR, son conocidas por el trabajador calificado. Una multiplicidad de dichas secuencias se describen, por ejemplo, en Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242 y en la base de datos de secuencias de la línea germinal de humano VBASE.

Se puede producir un anticuerpo o porción de unión a anticuerpo de la invención expresando en forma recombinante los genes para las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada en una célula hospedera. Con el fin de expresar en forma recombinante un anticuerpo, una célula hospedera se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que porten fragmentos de ADN que codifican para las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada de dicho anticuerpo, con lo cual se expresan las cadenas ligera y pesada en la célula hospedera y son secretadas de preferencia en el medio de cultivo en el cual se cultivan dichas células hospederas. Los anticuerpos se pueden aislar a partir de este medio. Los métodos de ADN recombinantes estandarizados se utilizan para obtener genes para las cadenas de anticuerpo ligera y pesada, para insertar dichos genes en vectores de expresión recombinantes y para introducir dichos vectores en las células hospederas. Los métodos de este tipo se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en el documento US 4,816,397 de Boss et al.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican para los segmentos VH y VL del anticuerpo de interés, dichos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente utilizando técnicas de ADN recombinante estandarizadas, por ejemplo con el fin de convertir los genes para las regiones variables en genes para las cadenas de anticuerpo de longitud completa, en genes para fragmentos Fab o en un gen para scFv. Estas manipulaciones comprenden enlazar un fragmento de ADN que codifica para VL o VH en forma operativa a otro fragmento de ADN que codifica para otra proteína, por ejemplo una región de anticuerpo constante o un enlazador flexible. Se debe entender que el término "ligado en forma operativa" en la presente solicitud significa que los dos fragmentos de ADN están ligados de modo tal que las secuencias de aminoácido codificadas por dichos dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.

El ADN aislado que codifica para la región de VH se puede convertir en un gen para una cadena pesada de longitud completa ligando en forma operativa el ADN que codifica para la región de VH con otra molécula de ADN que codifica para las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada de humano son bien conocidas (véase, por ejemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242), Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242) y se pueden obtener fragmentos de ADN que abarcan dichas regiones por medio de amplificación con PCR estandarizada. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante proveniente de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgE o IgD, dándose preferencia a una región constante proveniente de IgG, en particular lgG1 o lgG4. Para obtener un gen para un fragmento Fab de cadena pesada, el ADN que codifica para VH se puede ligar en forma operativa a otra molécula de ADN que codifica solamente para la región constante de cadena pesada CH1.

El ADN aislado que codifica para la región VL se puede convertir en un gen para una cadena ligera de longitud completa (y un gen para una cadena ligera de Fab) ligando en forma operativa el ADN que codifica para VL a otra molécula de ADN que codifica para la región constante de la cadena ligera CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera de humano son bien conocidas (véase Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242), y se pueden obtener fragmentos de ADN que abarcan dichas regiones por medio de amplificación con PCR estandarizada. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, siendo preferida una región constante kappa.

Para generar un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL se pueden ligar en forma operativa a otro fragmento que codifica para un enlazador flexible, por ejemplo la secuencia de aminoácido (Gly4-Ser)3 de modo que las secuencias de VH y VL se expresan como una proteína de cadena individual continua, en la que las regiones de VL y VH están ligadas entre sí a través de dicho enlazador flexible (véase Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).

La VH y VL de dominio individual que tienen las afinidades de unión como se describió anteriormente se pueden aislar a partir de genotecas de dominio individual utilizando los métodos antes descritos. Dos cadenas de dominio individual de (con o sin CH1) o dos cadenas de VL o un par de cadena de VH y una cadena de VL con la afinidad de unión deseada pueden ser útiles como se describe en la presente solicitud para los anticuerpos de la invención.

Con el fin de expresar los anticuerpos recombinantes o porciones de anticuerpo de la invención, se pueden insertar las moléculas de ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa en vectores de expresión para ligar en forma operativa los genes a secuencias de control de transcripción y de traducción apropiadas. En este contexto, se debe entender que el término "ligado en forma operativa" significa que un gen de anticuerpo está ligado en un vector de modo tal que las secuencias de control de transcripción y de traducción dentro del vector cumplen con su función pretendida de regular la transcripción y traducción de dicho gen de anticuerpo.

De manera conveniente, el vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen de modo tal que sean compatibles con la célula hospedera para expresión utilizada. El gen para la cadena ligera del anticuerpo y el gen para la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión, siendo esto el caso normal. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por medio de métodos estandarizados (por ejemplo mediante ligación de sitios de corte de restricción complementarios en el fragmento de gen del anticuerpo y en el vector, o mediante ligación de los extremos despuntados, si no están presentes sitios de corte de restricción). El vector de expresión puede portar de antemano secuencias para las regiones constantes del anticuerpo antes de la inserción de las secuencias para las cadenas ligera y pesada. Por ejemplo, una estrategia es convertir las secuencias de VH y VL en genes de anticuerpo de longitud completa insertándolas en vectores de expresión que de antemano codifican para las regiones constantes de cadena pesada y, respectivamente, ligera, por lo cual se ligan en forma operativa el segmento de VH al segmento o segmentos de CH dentro del vector y también se ligan en forma operativa el segmentos de VL al segmento de CL dentro del vector.

Adicionalmente o de manera alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar para un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de la célula hospedera. El gen para dicha cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector, con lo cual se liga al péptido de señal en marco con el extremo N-terminal del gen para la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterologo (es decir un péptido de señal proveniente de una proteína de tipo no inmunoglobulina). Además de los genes para la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión de la invención pueden tener secuencias reguladoras que controlen la expresión de los genes para la cadena de anticuerpo en una célula hospedera.

El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, incrementadores y elementos de control de expresión adicionales (por ejemplo señales de poliadenilación) que controlen la transcripción o traducción de los genes para la cadena de anticuerpo. Las secuencias reguladoras de este tipo se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). El trabajador calificado apreciará que el diseño del vector de expresión que incluye la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que se va a transformar, la intensidad deseada de expresión de la proteína, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión en células hospederas de mamífero incluyen elementos virales que dan como resultado la expresión fuerte y constitutiva de la proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o incrementadores obtenidos a partir de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/incrementador de CMV), virus 40 de simio (SV40) (tal como el promotor/incrementador de SV40), adenovirus (por ejemplo el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, los documentos US 5,168,062 para Stinski, US 4,510,245 para Bell et al. y US 4,968,615 para Schaffner et al.

Además de los genes para la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden tener secuencias adicionales tales como aquellas que regulan la replicación del vector en las células hospederas (por ejemplo orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. Los genes marcadores seleccionables facilitan la selección de células hospederas en las cuales se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas para Axel er al.). Por ejemplo, es común que el gen marcador seleccionable haga que la célula hospedera en la cual se ha insertado el vector sea resistente a fármacos citotóxicos tales como G418, higromicina o metotrexato. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen para dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospederas dhfr" con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o vectores que codifican para dichas cadenas pesada y ligera es(son) transfectados en una célula hospedera por medio de técnicas estandarizadas. Las diversas formas del término "transfección" pretenden comprender una multiplicidad de técnicas utilizadas en forma acostumbrada para introducir ADN exógeno en una célula hospedera procariota o eucariotas, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención ya sea en células hospederas procariotas o eucariotas, se da preferencia a la expresión de los anticuerpos en células eucariotas y, en particular, en células hospederas mamíferas, debido a que la probabilidad de que se ensamble y secrete un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo es más alta en dichas células eucariotas y en particular células de mamífero que en células procariota. Se ha reportado que la expresión procariota de genes de anticuerpo es inefectiva para producción de rendimientos altos de anticuerpo activo (Boss, M.A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Las células hospederas de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células CHO (incluyendo las células CHO dhfr" descritas en Uriaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, las cuales se utilizan junto con un marcador seleccionable de DHFR, como se describe, por ejemplo, en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican para los genes de anticuerpo en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas hasta que el anticuerpo es expresado en dichas células hospederas o, de preferencia, el anticuerpo es secretado en el medio de cultivo en el que crecieron las células hospederas. Los anticuerpos después se pueden aislar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estandarizados.

De igual manera es posible utilizar células hospederas con el fin de producir porciones de anticuerpos intactos, tales como los fragmentos Fab o moléculas scFv. Desde luego, las variaciones del procedimiento antes descrito están incluidas en la invención. Por ejemplo, podría ser deseable transfectar una célula hospedera con DNA que codifique para cualquiera de la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de la invención. Si cualquiera de las cadenas ligera o pesada está presente las cuales no son requeridas para unión del antígeno de interés, entonces el ADN que codifica para cualquiera de dicha cadena ligera o dicha cadena pesada o ambas se puede eliminar parcialmente o completamente por medio de tecnología de ADN recombinante. DE igual manera las moléculas expresadas por dichas moléculas de ADN truncado están incluidas en los anticuerpos de la invención. Además, es posible producir anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y la otra cadena ligera tienen especificidad para un antígeno diferente del antígeno de interés, entrelazando un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo por medio de métodos químicos estandarizados.

En un sistema preferido para expresión recombinante de un anticuerpo de la invención o una porción de unión a antígeno del mismo, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto para la cadena pesada del anticuerpo como para la cadena ligera del anticuerpo en células CHO dhfr" por medio de transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes para las cadenas de anticuerpo pesada y ligera están en cada caso ligados en forma operativa a elementos incrementador de CMV/promotor de AdMLP reguladores con el fin de efectuar la transcripción fuerte de dichos genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR el cual se puede utilizar para seleccionar células CHO dhfr' transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospederas transformadas seleccionadas se cultivan de modo tal que se expresen las cadenas de anticuerpo pesada y ligera, y el anticuerpo intacto se aisla del medio de cultivo. Se utilizan técnicas moleculares-biológicas estandarizadas para preparar el vector de expresión recombinante, para transfectar las células hospederas, para seleccionar los transformantes, para cultivar dichas células hospederas, y para obtener el anticuerpo a partir del medio de cultivo. Por lo tanto la invención también provee un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedera de la invención en un medio de cultivo apropiado hasta que se haya sintetizado un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además aislar dicho anticuerpo recombinante a partir de dicho medio de cultivo.

Como una alternativa para el tamizaje de genotecas de anticuerpo recombinante mediante despliegue de fago, se pueden utilizar otros métodos conocidos por el trabajador capacitado para tamizar genotecas combinatorias grandes para identificar los anticuerpos de la invención. Básicamente, se puede utilizar cualquier sistema de expresión en el cual se establezca un enlazamiento físico cercano entre un ácido nucleico y el anticuerpo codificado con el mismo y se pueda utilizar para seleccionar una secuencia de ácido nucleico apropiada en virtud de las propiedades del anticuerpo que ésta codifica.

En un tipo de un sistema de expresión alternativo, la genoteca de anticuerpo recombinante se expresa en forma de fusiones de ARN-proteína, como se describe en el documento WO 98/31700 para Szostak y Roberts, y en Roberts, R.W. y Szostak, J.W. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. En este sistema, la traducción in vitro de moléculas de ARNm sintéticas que llevan en sus extremos 3' puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, genera una fusión covalente de un ARNm y el péptido o proteína codificada por éste. Por lo tanto un ARNm específico de una mezcla compleja de moléculas de ARNm (por ejemplo una genoteca combinatoria) se puede concentrar con base en las propiedades del péptido o proteína codificada (por ejemplo del anticuerpo o una porción del mismo), tal como la unión de dicho anticuerpo o dicha porción del mismo al análogo u oligómero de péptido ß amiloide. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos o porciones de los mismos y que se obtienen mediante tamizaje de dichas genotecas pueden ser expresadas utilizando medios recombinantes en la manera antes descrita (por ejemplo en células hospederas de mamífero) y además se pueden someter a maduración por afinidad adicional ya sea mediante tamizaje en rondas adicionales de fusiones de ARNm-péptido, mediante introducción de mutaciones en la secuencia o secuencias originalmente seleccionadas, o utilizando otros métodos de maduración por afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes en la manera antes descrita.

Combinaciones de estrategias in vivo e in vitro De igual manera los anticuerpos de la invención se pueden producir utilizando una combinación de estrategias in vivo e in vitro tales como los métodos en los cuales el análogo u oligómero de péptido ß amiloide se deja primero actuar sobre un repertorio de anticuerpo en un animal hospedero in vivo para estimular la producción de anticuerpos de unión a análogo o de unión a oligómero del péptido ß amiloide y después la selección y/o maduración de anticuerpo (es decir optimización) adicionales se logran con la ayuda de una o más técnicas in vitro. De conformidad con una modalidad, un método combinado de este tipo puede comprender en primer lugar inmunizar un animal no humano (por ejemplo un ratón, rata, conejo, pollo, camélido, oveja o cabra o una versión transgénica de los mismos o un ratón quimérico) con dicho oligómero o derivado para estimular una respuesta de anticuerpo hacia el antígeno y después preparar y tamizar una genoteca de anticuerpo de despliegue de fago utilizando secuencias de inmunoglobulina de linfocitos que han sido estimulados in vivo por la acción de dicho oligómero o derivado. El primer paso de este procedimiento combinado se puede efectuar en la manera descrita anteriormente en conexión con las estrategias in vivo, mientras que el segundo paso de este procedimiento se puede efectuar en la manera descrita anteriormente en conexión con las estrategias in vitro. Los métodos preferidos de hiperinmunización de animales no humanos con tamizaje subsiguiente in vitro de genotecas de despliegue de fago preparadas a partir de dichos linfocitos estimulados incluyen aquellos descritos por BioSite Inc., véase, por ejemplo, los documentos WO 98/47343, WO 91/17271, US 5,427,908 y US 5,580,717.

De conformidad con otra modalidad, un método combinado comprende en primer lugar inmunizar un animal no humano (por ejemplo un ratón, rata, conejo, pollo, camélido, oveja, cabra o una versión de expresión suprimida y/o transgénica de los mismos, o un ratón quimérico) con un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para estimular una respuesta de anticuerpo hacia dicho análogo u oligómero de péptido ß amiloide y seleccionar los linfocitos que producen los anticuerpos que tienen la especificidad deseada mediante tamizaje de los hibridomas (preparados, por ejemplo, a partir de los animales inmunizados). Los genes para los anticuerpos o anticuerpos de dominio individual se aislan a partir de los clones seleccionados (por medio de métodos de clonación estandarizados tales como reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa) y se someten a maduración por afinidad in vitro con el fin de mejorar de esta manera las propiedades de unión del anticuerpo seleccionado o los anticuerpos seleccionados. El primer paso de este procedimiento se puede efectuar en la manera descrita anteriormente en conexión con las estrategias in vivo, mientras que el segundo paso de este procedimiento se puede efectuar en la manera descrita anteriormente en conexión con las estrategias in vitro, en particular utilizando métodos de maduración por afinidad in vitro, tales como aquellos descritos en los documentos WO 97/29131 y WO 00/56772.

En un método combinado adicional, los anticuerpos recombinantes se generan a partir de linfocitos aislados individuales utilizando un procedimiento que es conocido por el trabajador calificado como métodos de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM por sus siglas en inglés) y el cual se describe en los documentos US 5,627,052, WO 92/02551 y Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. En este método, primero se inmuniza in vivo un animal no humano (por ejemplo un ratón, rata, conejo, pollo, camélido, oveja, cabra, o una versión transgénica de los mismos, o un ratón quimérico) con el análogo u oligómero de péptido ß amiloide para estimular una respuesta inmune hacia dicho análogo u oligómero de péptido ß amiloide, y después se seleccionan las células individuales que secretan los anticuerpos de interés utilizando una prueba de placa hemolítica específica de antígeno. Para este fin, el globulómero o derivado del mismo o moléculas de interés estructuralmente relacionadas se pueden acoplar a eritrocitos de oveja, utilizando un enlazador tal como biotina, con lo cual se hace posible identificar células individuales que secretan anticuerpos con especificidad apropiada utilizando la prueba de placa hemolítica. Después de la identificación de células que secretan los anticuerpos de interés, se obtienen las moléculas de ADNc para las regiones variables de las cadena ligera y pesada a partir de las células mediante PCR de transcriptasa inversa, y dichas regiones variables después se pueden expresar en asociación con regiones constantes de inmunoglobulina apropiada (por ejemplo regiones constantes de humano) en células hospederas de mamífero tales como las células COS o CHO. Después, las células hospederas transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas obtenidas a partir de linfocitos seleccionados in vivo se pueden someter a análisis in vitro y selección in vitro adicionales mediante diseminación de las células transfectadas, por ejemplo, con el fin de aislar las células que expresan los anticuerpos con la afinidad de unión. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas también se pueden manipular in vitro.

Los anticuerpos que tienen las actividades requeridas definidas en la presente solicitud se pueden seleccionar efectuando un análisis dot blot esencialmente como se describió anteriormente. En breve , el a ntígeno se une a una matriz sólida , de preferencia se aplica de manera puntiforme sobre u na membrana de nitrocelulosa , en diluciones en serie. El antígeno inmovilizado después se pone en contacto con el anticuerpo de i nterés seguido por detección de este último por medio de un anticuerpo secundario conjugado a enzima y una reacción colorimétrica; a concentraciones defi nidas de anticuerpo y antígeno , la cantidad de anticuerpo unido permite la determinación de afinidad . Por lo tanto la afinidad relativa de dos anticuerpos diferentes hacia u n objetivo, o de un anticuerpo hacia dos objetivos diferentes, se define en la presente solicitud como la relación de las cantidades respectivas de anticuerpo u nido a objetivo observadas con las dos combinaciones de anticuerpo-objetivo bajo condiciones de dot blot por lo demás idénticas.

Se pueden producir porciones de anticuerpo tales como los fragmentos Fab y F(ab')2 a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales tales como digestión con papaína o pepsina . Además, los anticuerpos , porciones de anticuerpo y moléculas de inmuno-ad hesión se pueden obtener utilizando técnicas de ADN recombinante estandarizadas.

En u n aspecto adicional, la invención también se refiere al uso del análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para proveer un aptámero que se u ne al análogo u oligómero de péptido ß amiloide (de aqu í en adelante también referido como el aptámero anti-análogo o anti-oligómero de péptido ß amiloide). Por consiguiente, la invención también se refiere a un método para proveer un aptámero que tenga especificidad para el análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud, cuyo método comprende por los menos los pasos de a) proveer un objetivo de unión que comprenda al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; b) exponer un repertorio de aptámero repertorio potencial de aptámero a dicho objetivo de unión; y c) seleccionar a partir de dicho repertorio un aptámero que se una específicamente a dicho análogo u oligómero de péptido ß amiloide.

Un "aptámero" en la presente solicitud se refiere a moléculas de ácido nucleico o de péptido que son capaces de unión específica, no covalente a su objetivo. Aptámeros de preferencia comprende secuencia de péptido, ADN o ARN, de manera más preferida secuencia de péptido, ADN o ARN de aproximadamente 3 a 100 monómeros, la cual puede estar unida por un extremo o por ambos extremos a una molécula más grande, de preferencia una molécula más grande que medie funciones bioquímicas, de manera más preferida una molécula más grande que induzca la inactivación y/o degradación, de manera más preferida ubiquitina, o de preferencia una molécula más grande que facilite la destrucción, de manera más preferida una enzima o una proteína fluorescente.

En la presente solicitud se debe entender que un "repertorio potencial de aptámero" se refiere a cualquier genoteca, depósito, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido o secuencias de ácido nucleico o a cualquier generador de dicha genoteca, depósito, ensamble o conjunto de secuencias de aminoácido que se pueda utilizar para producir un repertorio de aptámero in vivo o in vitro.

En otro aspecto, la invención también provee aptámeros que se unen al análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud.

En una modalidad preferida de la invención, el aptámero se puede obtener mediante un método que comprende seleccionar el aptámero a partir de un repertorio o repertorio potencial como se describe en la presente solicitud.

De conformidad con una modalidad particularmente preferida, la presente invención provee aptámeros específicos de análogo o específicos de oligómero de péptido ß amiloide. Estos incluyen en particular aptámeros que tienen una afinidad comparativamente más pequeña tanto para la forma monomérica como para la forma fibrilomérica del péptido ?ß que para el análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención.

Los agentes que se puedan unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención también tienen muchas aplicaciones potenciales, algunas de las cuales se describen en lo que sigue. Estos son especialmente útiles para propósitos terapéuticos y de diagnóstico.

Los anticuerpos que se unen específicamente al epítope de globulomero han demostrado ser agentes útiles en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Debido a que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención reaccionan con dichos anticuerpos se cree que los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide despliegan el mismo epítope o un epítope muy similar.

Por lo tanto, la invención también provee agentes que se puedan unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para usos terapéuticos.

En un aspecto, la invención también provee composiciones terapéuticas que comprenden un agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención. De conformidad con una modalidad particular, dichas composiciones son composiciones terapéuticas que comprenden también un vehículo farmacéutico aceptable.

Dichas composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener además por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de una enfermedad para cuyo alivio son útiles los agentes de la invención. Si, por ejemplo, el agente de la invención se une a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención, la composición farmacéutica también puede contener uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles para el tratamiento de trastornos en los cuales es importante la actividad de dicho análogo u oligómero de péptido ß amiloide.

Los vehículos farmacéuticamente apropiados incluyen cualesquiera solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retraso de absorción, y similares, en tanto que éstos sean fisiológicamente compatibles. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina regulada con fosfatos, dextrosa, glicerol, etanol y similares, y combinaciones de los mismos. En muchos casos, se prefiere utilizar agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o además cloruro de sodio. Los vehículos farmacéuticamente aceptables también pueden contener cantidades relativamente pequeñas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o amortiguadores, los cuales incrementan el tiempo de vida media o la eficacia de los anticuerpos.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para administración por vía parenteral, por ejemplo. En este caso, los agentes de preferencia se preparan como soluciones inyectables con un contenido de agente, por ejemplo anticuerpo, de 0.1-250 mg/ml. Las soluciones inyectables se pueden preparar en forma líquida o liofilizada, siendo la forma de dosificación un vidrio o frasco transparente, una ampolleta o una jeringa llena. El amortiguador puede contener L-histidina (1-50 mM, de preferencia 5-10 m ) y tener un pH de 5.0-7.0, de preferencia de 6.0. Los amortiguadores apropiados adicionales incluyen, sin estar limitado a los mismos, amortiguadores de succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio se puede utilizar para ajustaría tonicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (de preferencia 150 mM para una forma de dosificación líquida). También se pueden incluir crioprotectores, por ejemplo sacarosa (por ejemplo 0-10%, de preferencia 0.5-1.0%) para una forma de dosificación liofilizada. Otros crioprotectores apropiados son trehalosa y lactosa. También se pueden incluir materiales de relleno, por ejemplo manitol (por ejemplo 1-10%, de preferencia 2-4%) para una forma de dosificación liofilizada. Se pueden utilizar estabilizadores, por ejemplo L-metionina (por ejemplo 51-50 mM, de preferencia 5-10 mM) en forma de dosificación tanto líquidas como liofilizadas. Los materiales de relleno apropiados adicionales son glicina y arginina. También se pueden utilizar agentes tensoactivos, por ejemplo polisorbato 80 (por ejemplo 0-0.05%, de preferencia 0.005-0.01%). Los agentes tensoactivos adicionales son polisorbato 20 y los agentes tensoactivos BRIJ.

Las composiciones de la invención pueden tener una multiplicidad de formas. Estas incluyen formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo soluciones inyectables y soluciones que se pueden aplicar por infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del tipo de administración pretendida y de la aplicación terapéutica.

Típicamente, se prefieren composiciones en forma de soluciones inyectables o soluciones que se puedan aplicar por infusión, por ejemplo composiciones que sean similares a los anticuerpos para inmunización pasiva de humanos. La vía de administración preferida es la vía parenteral (por ejemplo intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular). De conformidad con una modalidad preferida, el agente se administra mediante infusión o inyección intravenosa. De conformidad con otra modalidad preferida, el agente se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de preparación y almacenamiento. Las composiciones se pueden formular como soluciones, microemulsiones, dispersiones, liposomas u otras estructuras ordenadas apropiadas para concentraciones altas de la sustancia activa. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar introduciendo el compuesto activo (es decir el agente tal como un anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado, en donde sea apropiado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes antes mencionados, según se requiera, y dicha solución después se esteriliza por filtración. Las dispersiones normalmente se preparan introduciendo el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y, en donde sea apropiado, otros ingredientes requeridos. En el caso de un polvo liofilizado estéril para preparar soluciones inyectables estériles, el secado al vacío y el secado por aspersión son los métodos preferidos de preparación , los cuales prod ucen un polvo del ingred iente activo y, en donde sea apropiado, de los ingredientes ad icionales deseados a partir de u na solución previamente esterilizada por filtración . La flu idez correcta de una solución se puede mantener utilizando, por ejemplo, u n recubrimiento tal como lecitina, manteniendo, en el caso de dispersiones el tamaño de partícula requerido o utilizando agentes tensoactivos . Se puede lograr una absorción prolongada de las composiciones inyectables introduciendo adicionalmente en la composición un agente que retrase la absorción , por ejemplo sales de monoestearato y gelatina.

Los agentes de la invención se pueden administrar mediante u na multiplicidad de métodos conocidos por el trabajador capacitado , aunque el tipo preferido de admin istración para muchas aplicaciones terapéuticas es inyección subcutánea , inyección o infusión intravenosa. El trabajador capacitado apreciará que la vía y/o tipo de admi n istración depende del resultado deseado. De conformidad con modalidades particulares, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo q ue proteja al compuesto contra la liberación rápida , tal como , por ejemplo, una formulación con liberación sostenida o controlada , la cual incluye implantes, emplastes transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar pol ímeros biocompatibles biológicamente degradables tales como vi nilacetato de etileno, polian h íd ridos, ácido polig licólico, colágena, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para preparar dichas formulaciones son bien conocidos por el trabajador capacitado; véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

De conformidad con modalidades particulares, un agente de la invención se puede administrar por vía oral, por ejemplo en un diluyente inerte o un vehículo comestible que pueda ser metabolizado. El agente (y los ingredientes adicionales, si se desea) también puede estar encerrado en una cápsula de gelatina dura o blanda, compactada como tabletas o agregar directamente al alimento. Para administración terapéutica por vía oral, los agentes se pueden mezclar con excipientes y utilizar en forma de tabletas orales, tabletas bucales, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes y similares. Si se pretende administrar un agente de la invención a través de una vía diferente a la vía parenteral, podría ser necesario elegir un recubrimiento a partir de un material que evite su inactivación.

En un aspecto adicional, la invención provee el uso de un agente que se pueda unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir una amiloidosis.

En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica es para inmunización pasiva.

Por consiguiente, la invención también provee un método para tratar o prevenir una amiloidosis en un individuo en necesidad de lo mismo, que comprende administrar al individuo el agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiioide de la invención.

En una modalidad preferida de la invención, la administración del agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ?ß(ß amiioide) de la invención es para inmunizar pasivamente al individuo contra una amiloidosis.

El tamizaje de muestras biológicas revela que dichas muestras pueden contener sustancias que reaccionan con agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiioide tal como los anticuerpos anti-análogo o anti-oligómero de péptido ß amiioide de la invención. Dichas sustancias que tienen una cierta afinidad de unión a dichos agentes pero que no se puede decir que correspondan a los análogos u oligómeros de péptido ß amiioide de la invención, son referidos de aquí en adelante como antígenos que comprende al epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiioide.

Por lo tanto, los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiioide de la invención también son capaces de detectar, tanto in vitro como in vivo, los antígenos que comprenden epítopes del análogo u oligómero de péptido ß amiioide a los cuales éstos se unen. Por lo tanto, dichos agentes se pueden utilizar para detectar dichos antígenos, por ejemplo una muestra que se obtiene a partir de un individuo del que se sospecha tiene una amiloidosis, o en un individuo del que se sospecha tiene una amiloidosis, por ejemplo un individuo humano u otro animal.

La invención por lo tanto también provee agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para usos de diagnóstico.

En un aspecto, la invención provee composiciones para diagnóstico que comprenden un agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención. De conformidad con una modalidad particular, dichas composiciones son composiciones terapéuticas que comprenden también un vehículo farmacéutico aceptable.

En un aspecto adicional, la invención provee el uso de un agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención para preparar una composición para diagnosticar una amiloidosis.

Por consiguiente, la invención también provee un método para diagnosticar una amiloidosis que comprende proveer una muestra proveniente del individuo del que se sospecha que tiene la amiloidosis, poner la muestra en contacto con un agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de. la invención durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un complejo que comprende al agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención y un antígeno que comprende el epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide, la presencia del complejo indica que el individuo tiene la amiloidosis. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos el paso de poner en contacto la muestra se efectúa ex vivo y en particular in vitro.

Por lo tanto, los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención se pueden utilizar en una variedad de métodos y pruebas de diagnóstico.

De conformidad con una modalidad, el método para diagnosticar una amiloidosis en un paciente del que se sospecha que tiene esta enfermedad comprende los pasos de: 1) aislar una muestra biológica a partir del paciente; 2) poner la muestra biológica en contacto con por lo menos uno de los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos antígeno/agente; y 3) detectar la presencia de los complejos de antígeno/agente en dicha muestra, la presencia de los complejos indica una diagnosis de una amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, en el paciente. El antígeno es aquél que comprende al epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos uno de dichos pasos 2) y 3) se efectúa ex vivo y en particular in vitro. De conformidad con una modalidad particular adicional, el método no comprende el paso 1).

De conformidad con una modalidad adicional, el método para diagnosticar una amiloidosis en un paciente del que se sospecha que tiene esta enfermedad comprende los pasos de: 1) aislar una muestra biológica a partir del paciente; 2) poner la muestra biológica en contacto con un antígeno durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; 3) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido, en el cual el conjugado comprende uno de los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención, unido a un compuesto generador de señal que sea capaz de generar una señal detectable; y 4) detectar la presencia de un anticuerpo que pudiera estar presente en la muestra biológica, mediante detección de una señal generada por el compuesto generador de señal, la señal indica una diagnosis de una amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer en el paciente. El antígeno es aquel que comprende el epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos uno de dichos pasos 2), 3) y 4) se efectúa ex vivo y en particular in vitro. De conformidad con una modalidad particular adicional, el método no comprende el paso 1).

De conformidad con una modalidad adicional, el método para diagnosticar una amiloidosis en un paciente del que se sospecha que tiene esta enfermedad comprende los pasos de: 1) aislar una muestra biológica a partir de dicho paciente; 2) poner la muestra biológica en contacto con anti-anticuerpo, en cual el antianticuerpo es específico para uno de los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/agente, los complejos contienen agente presente en la muestra biológica; 3) agregar un conjugado a los complejos anti-anticuerpo/agente resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al agente unido, en el cual el conjugado comprende un antígeno que comprende el epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide, el cual se une a un compuesto generador de señal que sea capaz de generar una señal detectable; y 4) detectar una señal generada por el compuesto generador de señal, la señal indica una diagnosis de una amiloidosis, por ejemplo enfermedad de Alzheimer en el paciente. De conformidad con una modalidad particular, por lo menos uno de dichos pasos 2), 3) y 4) se efectúa ex vivo y en particular in vitro. De conformidad con una modalidad particular adicional, el método no comprende el paso 1).

En una modalidad de diagnóstico de la presente invención, el agente que se puede unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención, o una porción del mismo, se aplica como recubrimiento sobre una fase sólida (o está presente en una fase líquida). La prueba o muestra biológica (por ejemplo, sangre entera, fluido cerebroespinal, suero, etc.) se pone después en contacto con la fase sólida. Si el antígeno (por ejemplo, globulómero) está presente en la muestra, dichos antígenos se unen a los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención en la fase sólida y después se detectan mediante cualquiera de un método directo o indirecto. El método directo comprende simplemente detectar la presencia del complejo como tal y por lo tanto la presencia de los antígenos. En el método indirecto, se agrega un conjugado al agente unido. El conjugado comprende un segundo anticuerpo, el cual se une al antígeno unido, unido a un compuesto generador de señal o marca. En caso que el segundo anticuerpo se una al antígeno unido, el compuesto generador de señal genera una señal mensurable. Por lo tanto dicha señal indica la presencia del antígeno en la muestra.

Los ejemplos de fases sólidas utilizadas en las pruebas inmunologicas de diagnóstico son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (véase patente E.U.A. No. 5,705,330), glóbulos, membranas, cavidades de micro-titulación y tubos de plástico. La elección del material de la fase sólida y el método para marcar al antígeno o anticuerpo presentes en el conjugado, si se desea, se determinan tomando como base las características de desempeño del formato de prueba deseado.

Como se indicó anteriormente, el conjugado (o reactivo indicador) comprende un anticuerpo (o quizá anti-anticuerpo, dependiendo de la prueba), unido a un compuesto generador de señal o "marca". Este compuesto generador de señal o "marca" es por sí mismo detectable o se puede hacer reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Los ejemplos de compuestos generadores de señal incluyen cromoforos, radioisótopos (por ejemplo, 25l, 31l, 32P, 3H, 35S y 1 C), compuestos quimioluminescentes (por ejemplo, acridinio), partículas (visibles o fluorescentes) , ácidos n ucleicos, agentes formadores de complejos, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa acida , peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso de uso de enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano) , la adición de u n substrato cromo-, fluoro-, o lumogén ico da como resultado la generación de una señal detectable. También son útiles otros sistemas de detección tal como fluorescencia resuelta en tiempo, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (por ejemplo , reacción en cadena de polimerasa) y espectroscopia Raman .

Los ejemplos de fluidos biológicos que se pueden analizar mediante las pruebas in m u nológ icas anteriores incluyen plasma, sangre entera , sa ng re entera seca, suero, fluido cerebroespinal o extractos acuosos u órgano-acuosos de tejidos y cél ulas.

Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen estuches. De manera más específica , la presente invención incluye estuches para determinar la presencia de antígenos que comprenden el epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide en un individ uo. En particu lar, un estuche para determinar la presencia de dichos antígenos en u na muestra comprende a) un agente q ue se pueda u n ir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención ; y opcionalmente b) u n conjugado que comprende u n anticuerpo que se u na al agente, unido a un compuesto generador de señal que sea capaz de generar una señal detectable. El estuche también puede contener un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno.

La presente invención también incluye otro tipo de estuche para detectar anticuerpos tales como auto-anticuerpos en una muestra. El estuche puede comprender a) un anticuerpo específico para el agente que se puede uni r al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la i nvención (por ejemplo u n antianticuerpo) , y b) u n antígeno que comprende al ep ítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud . También se puede incluir un control o calibrador que comprende u n reactivo que se u ne al antígeno. De manera más específica, el estuche puede comprender a) u n anti-anticuerpo específico para el auto-anticuerpo y b) u n conjugado que comprende el antígeno que comprende el epítope del análogo u oligómero de péptido ß amiloide como se define en la presente solicitud , el conjugado está unido a u n compuesto generador de señal que sea capaz de genera r u na señal detectable. De n uevo, el estuche también puede comprender un control o calibrador que comprende un reactivo que se u ne al a ntígeno.

El estuche también puede comprender u n contenedor tal como un frasco, botellas o ti ra, con cada contenedor con una fase sólida pre-establecida , y otros contenedores que contienen los conjugados respectivos . Estos estuches también pueden contener frascos o contenedores de otros reactivos necesarios pa ra efectuar la prueba, tal como reactivos de lavado , procesamiento, e indicadores.

Debido a su afinidad de u n ión a los agentes que se pueden unir al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención, dichos antígenos que comprenden epítopes del análogo u oligómero de péptido ß amiloide se pueden detectar en preparaciones de las que se sospecha contienen dichos epítopes, sus cantidades pueden ser determinadas en dichas preparaciones y estos se pueden enriquecer. Por consiguiente, la presente invención también provee un método para detectar, para determinar la cantidad de y/o para enriquecer los epítopes de análogo u oligómero de péptido ß amiloide en preparaciones de las que se sospecha o se sabe que comprenden dichos epítopes. Una vez detectadas y enriquecidas, dichas sustancias pueden tener aplicaciones potenciales similares a las descritas en la presente solicitud con respecto al análogo u oligómero de péptido ß amiloide de la invención.

Asimismo, la presente invención incluye un método para diseñar agentes tales como anticuerpos, agentes biológicos de tipo no anticuerpo o moléculas pequeñas útiles en el tratamiento o prevención de una amiloidosis en un paciente. Este método comprende los pasos de: a) analizar la estructura tridimensional del análogo u oligómero de péptido ß amiloide descrito en la presente solicitud; b) identificar uno o más epítopes en la superficie del análogo u oligómero de péptido ß amiloide del paso a); y c) diseñar un agente tal como un anticuerpo, agentes biológicos de tipo no anticuerpo o una molécula pequeña que se una al epítope o epítopes identificados del paso b), el anticuerpo, agentes biológicos de tipo no anticuerpo o una molécula pequeña se van a utilizar en el tratamiento o prevención de ami loidosis.

Ventajas de la invención La composición de aminoácido de los análogos y oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención está bien definida y es reprod ucible.

Los análogos y oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención despl iegan una conformación estable .

Los análogos y oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención despliegan mejores propiedades hidrod inámicas.

Se espera que la inmunización activa con los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente i nvención provoque una respuesta inm u ne altamente selectiva para los globu lómeros de ?ß. Debido a q ue los análogos y oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención se pueden diseñar fácilmente para que carezcan de las secuencias N-terminales, se puede elim inar el riesgo de provocar u na respuesta inmu ne d irigida contra el péptido ?ß N-terminal no específica . Por lo tanto , los análogos y oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención son capaces de provocar una respuesta in mune que discrimine otras formas de péptidos ?ß, particularmente monómeros y fibrillas .

Además , se espera que la inmunización activa con los análogos u oligómeros de péptido ß amiloide de la presente invención pueda ser efectiva para revertir las deficiencias cog nitivas en modelos de ratón transgénico con EA debido a que la respuesta de anticuerpo provocada es comparable a la inmunización activa con el globulómero ?ß(20-42) truncado. Este último ha demostrado revertir las deficiencias en la tarea de reconocimiento de objeto nuevo.

Todas las patentes, solicitudes y publicaciones de patente a las que se hace referencia en la presente solicitud quedan incorporadas para referencia en sus totalidades.

Información del Depósito: El hibridoma que produce al anticuerpo monoclonal 5F7 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110 el 01 de diciembre de 2005 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7241. Además, el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 10F11 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 01 de diciembre de 2005 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7239. De manera adicional, el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 4B7 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 01 de diciembre de 2005 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7242, y el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 7C6 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 01 de diciembre de 2005 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7240. De manera adicional, el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 6A2 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 28 de febrero de 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7409, y el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 2F2 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 28 de febrero de 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7408. El hibridoma que produce al anticuerpo monoclonal 4D10 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 28 de febrero de 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7405. El hibridoma que produce al anticuerpo monoclonal 7E5 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 16 de agosto de 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7809. El hibridoma que produce al anticuerpo monoclonal 10C1 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 16 de agosto de 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7810. El hibridoma que produce al anticuerpo monoclonal 3B10 se depositó en el Depósito Americano de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10801 el 01 de septiembre de 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest y recibió la designación PTA-7851. Todos los depósitos se han hecho a favor de Abbott Laboratories, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, Illinois 60064 (EE. UU.). Todos estos anticuerpos monoclonales. son anticuerpos monoclonales de múrido.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención, sin limitar su alcance.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de péptido Todos los reactivos se utilizan tal como se obtienen a partir del proveedor a menos que se especifique otra manera. Los reactivos para síntesis de péptido incluyendo di-isopropiletilamina (DIEA), N-metilpirrolidona (NMP), di-clorometano (DCM), (hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1 H-benzotriazol-1 -il)-1 , 1 ,3,3-tetrametiluronio) (HATU), hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio (HBTU), 1 -hidrobenzotriazol (HOBt), y piperidina se obtienen a partir de Applied Biosystems, Inc. (ABI), Foster City, CA; o American Bioanalytical, Natick, MA. Los derivados de aminoácido del patrón de referencia 9-Fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) (Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(ACM)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val- OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH) se obtuvieron a partir de Anaspec, San José, CA; o ABI. Fmoc-3-amino-1 -carboximetil-piridin-2-ona y el ácido Fmoc-cis-3-fenil-pirrolidin-2-carboxílico se obtuvieron a partir de NeoSystem, Strasbourg, Francia. Las resinas para la síntesis de péptido (resina de poliestireno Fmoc-Ala-PEG , resina Fmoc-Ala-Wang, reina MBHA de amida de Rink) se obtuvieron a partir de ABI, CS-Bio, Menlo Park, CA o Novabiochem, Hohenbrunn, Alemania. El ácido trifluoroacético (TFA) se obtuvo de Oakwood Products, West Columbia, SC. Tioanisol, fenol, tri-isopropilsilano (TIS), 3,6-dioxa-1 ,8-octanoditiol (DODT), ferricianuro de potasio, e isopropanol, se obtuvieron a partir de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl. Los espectros de masas de ionización por desorción de láser asistida con matriz (MALDI-MS) se registraron en un aparato Voyager DE-PRO MS de Applied Biosystems). Los espectros de masas por electroaspersión (ESI-MS) se registraron en un aparato SSQ7000 de Finnigan (Finnigan Corp., San José, CA) en modo iónico tanto positivo como negativo.

Procedimiento general para síntesis de péptido en fase sólida Los péptidos se sintetizan ya sea con 100 pmol de resina precargada/recipiente en un sintetizador de péptido Pioneer de ABI utilizando ciclos estándar de copulación 0.1 mM, o 250 pmol de resina/recipiente en un sintetizador de péptido 433 de ABI. En la copulación de los Fmoc-aminoácidos de referencia en el sintetizador Pioneer de ABI se utilizan tubos precargados que contienen reactivo 0.4 mmol con copulación sencilla con Fmoc-aminoácido:HATU:DIEA 4:4:8. En el sintetizador 433 de ABI, se utilizan cartuchos precargados que contienen Fmoc-aminoácido 1 mM con copulación sencilla preactivada como un Fmoc-aminoácido:HBTU:HOBt:DIEA 4:4:4:8. En cada sintetizador después de la copulación se elimina el grupo protector Fmoc mediante tratamiento con piperdina. Cuando se completa la síntesis, la resina se lava con 3 x DCM y 3 x isopropanol, y se seca al vacío para obtener la resina con péptido protegido.

Procedimiento general para corte y desprotección del péptido unido a resina Los péptidos se cortan de la resina agitando la resina durante 3 horas a temperatura ambiente en una mezcla para corte que consiste de 80% de TFA, 5% de agua, 5% de tioanisol, 5% de fenol, 2.5% de TIS, y 2.5% de DODT (1 mL/0.1 g de resina). La resina se retira mediante filtración, se enjuaga con 2 x TFA, el TFA se evapora de los filtrados, el residuo se precipita con éter (10 mL/0.1 g de resina), se recupera mediante centrifugación, se lava con 2 x éter (10 mL/0.1 g de resina) y se seca para obtener el péptido crudo.

Procedimiento general para la purificación de los péptidos Los péptidos crudo se purifican en un sistema de HPLC preparativa de Gilson que ejecuta el software de análisis Unipoint® (Gilson, Inc., Middleton, Wl) en una columna Agilent de 21.2 x 250 mm empacada con Zorbax®-C3, partículas de 7 µ?t?, tamaño de poro de 300 A. La temperatura de la columna se mantiene a > 60°C a través de toda la purificación. Se purifican tres mililitros de solución de péptido crudo (5 mg/mL en ácido fórmico:agua 75:25) por inyección. Los discos que contienen el o los productos de cada corrida se combinan y liofilizan. Todas las corridas preparativas se corren a 20 mL/min con los eluyentes como Amortiguador A: TFA al0.1% en agua y Amortiguador B: acetonitrilo utilizando un gradiente de 1%/minuto de B hasta que eluyen los productos.

Procedimiento general para HPLC analítica La HPLC analítica se efectúa un sistema de HPLC analítico Hitachi D-7000 con un detector de longitud de onda que ejecuta el software D-7000 en una columna Agilent de 0.46 x 250 mm empacada con Zorbax®-C3, partículas de 5 pm, tamaño de poro 300 A eluida con uno de los métodos por gradiente listados más adelante después de pre-equilibrar a las condiciones de partida durante 7 minutos. Todas las corridas analíticas se corren a 1 mL/min con eluyentes como Amortiguador A: TFA al 0.1% en agua y Amortiguador B: acetonitrilo utilizando un gradiente de 2%/minuto de B durante 45 minutos a 75°C.

En lo que sigue, los péptidos y oligómeros ?ß son referidos como péptidos y oligómeros (xXaal, yXaa2) ?ß(?-?), en los cuales ?ß(?-?) se refiere a la secuencia de aminoácido desde la posición de aminoácido X hasta la posición de aminoácido Y de la proteína ß amiloide de humano incluyendo tanto a X como a Y como se indica en SEQ ID NO: 1 (que corresponde a las posiciones de aminoácido 1 a 43), y Xaa1 y Xaa2 designan los aminoácidos que reemplazan al aminoácido en la posición x y "y", respectivamente, en SEQ ID NO: 1. El término "(xXaal, yXaa2) ?ß(?-?)" es sinónimo con el término "?ß(?-?) (xXaa1/yXaa2)". a) (17C. 34C) N-Met ?ß(1-42) (1a) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA (SEQ ID NO: 961) se prepara de la siguiente manera.

La resina precargada (0.59 g, 100 µ?-noles) se extiende utilizando el procedimiento de síntesis de péptido general para obtener el péptido unido a resina protegido (0.989 g, 57%). La resina se corta y desprotege utilizando el procedimiento general para obtener el péptido crudo 1a como un sólido de color blanco (0.319 g, 62.6%). El péptido crudo 1a se disuelve en ácido fórmico sin diluir (6.7 mg/ml) y se diluye con agua (hasta 5 mg/mL) inmediatamente antes de purificación con HPLC y la recolección se basa en la absorbancia a 260 nm. El pico principal se aisla y se liofiliza lo que da 1a como un sólido de color blanco (0.0274 g, 8.5%).

ESI-MS m/z desconvolucionado = 4625.4 [(M + H)+].

Los siguientes péptidos (1b) a (1j) se sintetizan mediante síntesis en fase sólida estándar con Fmoc desde el extremo C- terminal hacia el extremo N-terminal. Después de la síntesis, los péptidos se purifican mediante HPLC de fase inversa. Con el fin de mantener los grupos sulfhidrilo libres en las cisteínas (evitar la oxidación), se mantiene un pH ácido durante la producción (procedimiento normal). Brevemente, el grupo protector FMOC se elimina del aminoácido que está en la resina. Se agrega el siguiente aminoácido en la secuencia y se copula con el primer aminoácido utilizando HBTU. El grupo protector FMOC se elimina del segundo aminoácido. Se agrega el siguiente aminoácido en la secuencia y se copula con el aminoácido previo utilizando HBTU. Los pasos 4 y 5 se repiten hasta que se completa la secuencia. El péptido se corta de la resina utilizando TFA. El péptido se purifica mediante HPLC de fase inversa utilizando un sistema amortiguador de TFA/Acetonitrilo (sistema amortiguador ácido). Las fracciones de purificación que satisfacen las especificaciones de masa y pureza, se combinan y liofilizan. El análisis de espectrometría de masas y RP-HPLC confirman la identidad del péptido. b) (14C. 37C) N-Met ?ß(1-42) (1b) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHCQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVCGVVIA (SEQ ID NO: 962) se prepara utilizando química de péptido estándar. c) (15C.36C) N- et ABM-42) (1c) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHCKLVFFAEDVGSNKGAI IGLMCGG VVIA (SEQ ID NO: 963) se prepara utilizando química de péptido estándar. d) (16C.35C) N-Met ABM-42) Md) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQCLVFFAEDVGSNKGAI IGLCVGG VVIA (SEQ ID NO: 964) se prepara utilizando química de péptido estándar. e) (17C.34C) N-Met ABM-42) de) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA (SEQ ID NO: 965) se prepara utilizando química de péptido estándar. f) (18C.33C) N-Met ABM-42) (1f) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKLCFFAEDVGSNKGAIICLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 966) se prepara utilizando química de péptido estándar. g) (19C.32C) N-Met ?ß(1-42) (1q) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKLVCFAEDVGSNKGAICGLMVGG VVIA (SEQ ID NO: 967) se prepara utilizando química de péptido estándar. h) (20C.31 C) N-Met ?ß(1-42) (1h) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFCAEDVGSNKGACIGLMVGG VVIA (SEQ ID NO: 968) se prepara utilizando química de péptido estándar. i) (21C.30C) N-Met ?ß(1-42) Mi) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFCEDVGSNKGCIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 969) se prepara utilizando química de péptido estándar. j) (22C.29C) N-Met ?ß(1-42) (1¡) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFACDVGSNKCAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 970) se prepara utilizando química de péptido estándar. k) (17C. 34C) ?ß(12-42) (1k) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido VHHQKCVFFAEDVGSNKGAI IGCMVGGVVIA (SEQ ID NO: 971) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. P calculado [g/mol]: 3186.73; ALDI-MS: observado 3186.7 [(M + H)+].

I) (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35)-amida (11) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KC(ACM)VFFAEDVGSNKGAI IGC(ACM)M-amida (SEQ ID NO: 972) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Rink-Amida-MBHA. PM calculado [g/mol]: 2230,67; MALDI-MS: observado 2231.4, 2228.9 [(M + H)+]. m) AB(16-35)-amida (1m) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KLVFFAEDVGSNKGAI IGLM-amida (SEQ ID NO: 973) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Rink-Amida-MBHA. PM calculado [g/mol]: 2108,5; MALDI-MS: observado 2108.1 [(M + H)+], 2130 [(M + Na)+]. n) (17K. 34K) ?ß(16-35)-amida (1n) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KKVFFAEDVGS KGAI IGKM-amida (SEQ ID NO: 974) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Rink-Amida-MBHA. PM calculado [g/mol]: 2135,53; MALDI-MS: observado 2137.962137.91 [(M + H)+]. o) (17C. 34C) A6(16-35)-amida, cíclica (1o) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KC VFFAEDVGSNKGAI IGC M-amida (SEQ ID NO: 975) se prepara mediante el procedimiento general señalado anteriormente. La ciclización con disulfuro se logra disolviendo el péptido precursor lineal (17C, 34C) ?ß(16-35)-amida (1p) a 18 mg/mL en sulfóxido de dimetilo y se agrega en una alícuota a una solución 3:2 de bicarbonato de amonio 100 mM:acetonitrilo de desgasificada al vacío (200 mL, v:v). Se agrega solución de ferricianuro de potasio (0.05% p/v en agua, 44.3 mL) en una porción y la reacción se agita durante 22 horas a temperatura ambiente. La solución amarilla se liofiliza hasta sequedad antes de la purificación y análisis utilizando los procedimientos generales descritos anteriormente para obtener la (17C, 34C) A (16-35)-amida ciclizada. PM calculado [g/mol]: 2086.46; MALDI-MS: observado 2086.6 [(M + H)+], 2108.6 [(M + Na)+]. p) (17C, 34C) AB(16-35)-amida (1p) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KCVFFAEDVGSNKGAI IGCM-amida (SEQ ID NO: 976) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Rink-Amida-MBHA. PM calculado [g/mol]: 2088.47; MALDI-MS: observado 2087.99 [(M + H)+], 2109.98 [(M + Na)+]- q) (17K.34K) N-Met ABM-42) da) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKKVFFAEDVGSNKGAIIGKMVGGVVIA (SEQ ID NO: 977) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina H-Ala-HMPB NovaPEG. PM calculado [g/mol]: 4675,26; MALDI-MS: observado 4680.16 [(? + ??- r) (17KC. 34C) ABM3-42) (1r) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido HHQKKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGG VVIA (SEQ ID NO: 978) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. PM calculado [g/mol]: 3215.77; MALDI-MS: observado 3214.72 [(M + H)+]. s) (17C. 34C) ?ß(16-42) (1s) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KCVFFAEDVGSNKGAI IGCMVGGVVIA (SEQ ID NO: 979) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. PM calculado [g/mol]: 2685.19; MALDI-MS: observado 2683.82 [(M + H)+], 2705.84 [(M + Na)+]. t) (17C(ACIvn. 34C(ACIVn. 35M(S-óxido)) ?ß( 16-35)-amida (1t) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KC(ACM)VFFAEDVGSNKGAI IGC(ACM)M(S-óxido)-amida (SEQ ID NO: 980) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. PM calculado [g/mol]: 2246.67; MALDI-MS: observado 2245.48 [(M + H)+]. u) (17CÍACM).34CÍACM)) ?ß(16-35)-amida Mu) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KC(ACM)VFFAEDVGSNKGAIIGC(ACM)M-amida (SEQ ID NO: 981) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Rink Amida MBHA. PM calculado [g/mol]: 2230.67; MALDI-MS: observado 2229.45 [(M + H)+]. v) (17K. 34E AB(16-35)-amida (1v) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KKVFFAEDVGSNKGAIIGEM-amida (SEQ ID NO: 982) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina PEGA-Novabiochem. PM calculado [g/mol]: 2139.47; MALDI-MS: observado 2161.1 [(M + Na)+]. w) (17K. 34C) N-Met ABM-42) (1 ) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKKVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGG VVIA (SEQ ID NO: 983) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. PM calculado [g/mol]: 4650.23; MALDI-MS: observado 4651.07 [(M + H)+]. x) (17K, 34E) N-Met ???-42) (1x) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKKVFFAEDVGSNKGAIIGEMVGGVVIA (SEQ ID NO: 984) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. PM calculado [g/mol]: 4676.21; MALDI-MS: observado 4676.2 [(M + H)+]. y) (17C. 34C) N-Met ?ß(1 -42) (1v) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA (SEQ ID NO: 985) se prepara mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. PM calculado [g/mol]: 4625.21; MALDI-MS: observado 4625.52 [(M + H)+]. z) (22C'. 29C') AB(16-35)-amida. ciclizada (1z) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KKVFFAC* DVGSNKC*AIIGKM-a mida (SEQ ID NO: 986) se puede preparar mediante el procedimiento general esbozado anteriormente y utilizando el método de ciclización descrito para el péptido (1o). aa) (22C. 29C) ?ß(16-35)-amida (1aa) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido KKVFFACDVGSNKCAI IGKM-amida (SEQ ID NO: 987) se puede preparar mediante el procedimiento general señalado anteriormente. ab) (F20?FA19501. L17C. L34C) N-Met ?ß(1 -42) (1ab) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKCVF-FA19501 - AEDVGSNKGAIIGCMVGGVVIA (SEQ ID NO: 988) se puede preparar mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. FA19501 es el número de catálogo para el ácido Fmoc-cis-3-fenil-pirrolidin-2-carboxílico que se puede incorporar como para los aminoácidos normales en el péptido. ac) (22C. 29C) ?ß(20-35) Mac) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia aminoácido FACDVGSNKCAIIGLM (SEQ ID NO: 989) se puede preparar mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. ad) (22C. 29C) ?ß(20-42) dad) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido FACDVGSNKCAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 990) se puede preparar mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. ae) (17C. 22C. 29C. 34C) AB(20-42) N-Met ?ß(1-42) (1ae) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFACDVGSNKCAI IGCMVGG VVIA (SEQ ID NO: 991) se puede preparar mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. af) (K28G29?FA12401. L17C, L34C) N-Met ???-42) (1af) El análogo de péptido ß amiloide que tiene la secuencia de aminoácido MDAEFRHDSGYEVHHQKCVFFAEDVGSN-FA12401 -Al IGCMVGG VVIA (SEQ ID NO: 992) se puede preparar mediante el procedimiento general esbozado anteriormente utilizando una resina Fmoc-Ala-Wang. FA12401 es el número de catálogo para Fmoc-3-amino-1 -carboximetil-piridin-2-ona que se puede incorporar como para los aminoácidos normales en el péptido.

EJEMPLO 2 Preparación del oligómero a) Oliqómero (17C. 34C) N-Met ABd-42) estabilizado con disulfuro (2a) 83.1 mg de (17C.34C) N-Met ?ß(1-42) (1a) sintético del ejemplo 1a, sal de TFA se trata con HFIP, (1 mi por cada 6 mg de péptido) y el solvente se elimina mediante liofilización. Esto se disuelve en 4.0 mi de DMSO. Esta solución en DMSO del péptido se agrega después lentamente a 45 mi de PBS 20 mM (NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4), que contiene 0.2% de SDS (dodecilsulfato de sodio), con agitación. Esta solución después se hace 5 mM en DTT (ditiotrietol) y se incuba 6 horas a 37°C.

La muestra después se diluye con 3 partes de agua, y se dializa durante la noche a temperatura ambiente contra PBS a 1/4 de concentración con 0.05% de SDS, utilizando una membrana para diálisis con corte de peso molecular (MWCO) de 3500. La diálisis se continúa a la siguiente mañana contra 1 litro de solución amortiguadora nueva a 4°C durante 2 horas.

La muestra después se concentra utilizando una membrana YM10 en una celda Amicon agitada. Se dializa una alícuota de 0.5 mi durante la noche a 4°C contra PBS a 1/4 de la concentración sin SDS utilizando un aparato "Pierce 10K slidelyzer".

EJEMPLO 3 Preparación de los oliqómeros a) Oliqómero (14C. 37C) N-Met ABd-42) (3a) El péptido (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) (1b) del ejemplo 1b se suspende en 1 , ,1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) al 100% a 4 mg/ml y se incuba para solubilización completa bajo agitación a 37°C durante 2 horas. El HFIP actúa como un disociador de puente de hidrógeno y se utiliza para eliminar las inhomogeneidades estructurales pre-existentes en el péptido ?ß. HFIP se elimina mediante evaporación en un aparato SpeedVac y el péptido ?ß se disuelve o suspende a una concentración de 5 mM en sulfóxido de dimetilo y se le aplica energía sónica 20 segundos. Se diluyen 20 µ? del péptido ?ß pretratado con HFIP en DMSO hasta una concentración de péptido de 400 µ? con 230 µ? de solución salina regulada con fosfato (PBS) + 0.2% de SDS + DTT 2 mM (9.8 mi de NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM aireado con helio, pH 7.4 + 0.2 mi de solución de SDS al 10% disuelto en H20 + 3 mg de DTT, Serva, No. de Catálogo: 20710). Una incubación durante 6 horas a 37°C da como resultado el intermediario de 16/20-kDa (xC, yC) N-Met ?ß(1-42) y el intermediario ?ß(1-42). El oligómero (xC, yC) N-Met ?ß(1-42) de 38/48-kDa se genera mediante una dilución adicional con tres volúmenes de H20 aireada con helio e incubación durante 18 horas a 37°C. Después de centrifugar a 10,000 g durante 10 minutos se retiran los sobrenadantes y se almacenan a -30°C hasta uso posterior. b) Oligómero (15C. 36C) N-Met ?ß(1-42) (3b) El péptido (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) (1c) del ejemplo 1c se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. c) Oligómero (16C. 35C) N-Met ?ß(1-42) (3c) El péptido (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) (1d) del ejemplo 1d se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. d) Oligómero (17C. 34C) N-Met ABd-42) (3d) El péptido (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (1e) del ejemplo 1e se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. e) Oligómero (18C. 33C) N-Met ABd-42) (3e) El péptido (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) (1f) del ejemplo 1f se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. f) Oligómero (19C. 32C) N-Met ABd-42) (3f) El péptido (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42) (1g) del ejemplo 1g se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. g) Oliaómero (20C. 31C) N-Met ?ß(1-42) (3q) El péptido (20C, 31C) N-Met ?ß(1-42) (1h) del ejemplo 1h se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. h) Oliqómero (21C. 30C) N-Met ABd-42) (3h) El péptido (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42) (1i) del ejemplo 1i se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. i) Oliqómero (22C. 29C) N-Met ???-42) (3i) El péptido (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) (1j) del ejemplo 1j se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. j) Globulómero ABCI-42) (3i) Elpéptido de tipo silvestre ?ß(1-42) (Bachem H-1368) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3a. k) Oliqómero (17C. 34C) ABM2-42) (3I El péptido (17C, 34C) ?ß(12-42) (1k) del ejemplo 1k se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 2a, con la siguiente modificación. Después del tratamiento con HFIP, el péptido se disuelve en amoniaco al 1% en 35% de acetonitrilo/65% de agua y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para formar la sal de amonio. Esta sal después se congela en coraza (shell frozen) y se liofiliza hasta sequedad durante la noche. La oligomerización después se completa hasta el paso de 0.05% de SDS como se describe en el ejemplo 2a.

El péptido (17C, 34C) ?ß(12-42) (1k) del ejemplo 1k se trata con HFIP (1 mi por cada 6 mg de péptido) y el solvente se elimina mediante liofilización. Después del tratamiento con HFIP, el péptido se disuelve en amoniaco al 1% en 35% acetonitrilo/65% de agua y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para formar la sal de amonio. Esta sal después se congela en coraza y se liofiliza hasta sequedad durante la noche. Esto después se disuelve en 4.0 mi de DMSO. Esta solución de péptido en DMSO se agrega después lentamente a 45 mi de PBS 20 mM (NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4), que contiene 0.2% de SDS (dodecilsulfato de sodio), con agitación. Esta solución después se hace 5 mM en DTT (ditiotrietol) y se incuba 6 horas a 37°C.

I) Oliqómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ???6-35) (31) El péptido (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) (11) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. m) Oligómero de ?ß(16-35)-amida (3m) El péptido ?ß(16-35)-amida (1m) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. n) Oligómero (17K.34K) ?ß(16-35)-amida (3n) Someter el péptido (17K, 34K) ?ß(16-35)-amida (1n) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k (sin que se utilice DTT) produce el oligómero. o) Oligómero í(17C.34C) ??? 6-35)-amida. cíclicol (3o) El péptido [(17C, 34C) ?ß(16-35)-amida, cíclico] (1o) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. p) Oligómero (17C.34C) ?ß(16-35)-amida (3p) El péptido (17C, 34C) ?ß(16-35)-amida (1p) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k. q) Oligómero (17K.34K) N-Met ?ß(1 -42) (3g) Someter el péptido (17K, 34K) N-Met ?ß(1-42) (1q) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k (sin que se utilice DTT) produce el oligómero. r) Oliqómero (17KC. 34C) ABCI3-42) (3r) (17KC, 34C) ?ß(13-42) El péptido (1 r) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k. s) Oliqómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (3s) El péptido (17C, 34C) ?ß(16-42) (1s) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k. t) Oliqómero (17C(ACM). 34C(ACM). 35M(S-0xido)) ABM6-35)-amida (3t) Someter el péptido (17C(ACM), 34C(ACM), 35M(S-óxido)) (1t) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k (sin que se utilice DTT) produce el oligómero. u) Oliqómero (17C(ACM). 34C(ACM)) ?ß(16-35)-amida (3ui El péptido (17C(ACM), 34C(ACM)) (1u) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. v) Oliqómero (17K. 34E) ABCI6-35) (3v) El péptido (17K, 34E) ?ß(16-35) (1v) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. w) Oliqómero (17K. 34C) N-Met ???-42) (3w) El péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (1w) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. x) Oliqómero (17K. 34E) N-Met ABM-42) (3x) El péptido (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (1x) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k, excepto que no se utiliza DTT. y) Oliqómero (17C. 34C) N-Met ABM-42) (3y) El péptido (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (1y) se somete a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k. z) Oliqómero f(22C*. 29C*) ABM 6-35)-amida. ciclizadol (3zi Someter el péptido [(E22C*, G29C*) A3(16-35)-amida, ciclizado] (1z) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero. aa) Oliqómero (22C. 29C) ABM 6-35)-amida (3aa) Someter el péptido (22C, 29C) ?ß(16-35)-amida (1aa) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero. ab) Oligómero ( F20?FA19501. L17C. L34C) N-Met ?ß(1- 42) (3ab) Someter el péptido (F20?FA19501 , L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) (1ab) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero. ac) Oligómero (22C. 29C) ?ß(20-35) (3ac) Someter el péptido (22C, 29C) ?ß(20-35) (1ac) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero. ad) Oligómero (22C. 29C) ?ß(20-42) (3ad) Someter el péptido (22C, 29C) ?ß(20-42) (1ad) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero. ae) Oligómero (17C. 22C. 29C. 34C) ?ß(20-42) N-Met ???-42) (3ae) Someter el péptido (17C, 22C, 29C, 34C) ?ß(20-42) N-Met ?ß(1-42) (1ae) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero. af) Oligómero (K28G29?FA12401. L17C. L34C) N-Met ABd-42) (3af) Someter el péptido (K28G29?FA12401 , L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) (1af) a oligomerización utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3k produce el oligómero.

EJEMPLO 4 Formación del enlazamiento a) Oligómero (14C, 37C) N-Met ABd-42) estabilizado con disulfuro (4a) Se descongela 1 mi del oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1- 42) (3a) del ejemplo 3a y se dializa en un tubo de diálisis dos veces durante 2 horas a temperatura ambiente contra 2 L de NaH2P04 5 mM.NaCI 35 mM, pH 7.4. Posteriormente los dializados se retiran y se determinan las concentraciones de proteína mediante la prueba de proteína Bio-Rad, BioRad, No. de Catálogo: 500-0006. b) Oligómero (15C. 36C) N-Met ABd-42) estabilizado con disulfuro (4b) El oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) (3b) del ejemplo 3b se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. c) Oligómero (16C. 35C) N-Met ABd-42) estabilizado con disulfuro (4c) El oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) (3c) del ejemplo 3c se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. d) Qliqómero (17C. 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4d) El oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (3d) del ejemplo 3d se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. e) Oligómero (18C, 33C) N-Met ABCI-42) estabilizado con disulfuro (4e) El oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) (3e) del ejemplo 3e se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. f) Oligómero (19C, 32C) N-Met ABCI-42) estabilizado con disulfuro (4f) El oligómero (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42) (3f) del ejemplo 3f se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. g) Oligómero (20C. 31C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4g) El oligómero (20C, 31C) N-Met ?ß(1-42) (3g) del ejemplo 3g se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. h) Oligómero (21C. 30C) N-Met ASd-42) estabilizado con disulfuro (4h) El oligómero (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42) (3h) del ejemplo 3h se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. i) Oligómero (22C. 29C) N-Met ABCI-42) estabilizado con disulfuro (4i) El oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) (3i) del ejemplo 3i se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. j) Globulómero ABH-42) (4\) El globulómero de tipo silvestre ?ß(1-42) (Bachem H-1368) (3j) del ejemplo 3j se somete a oxidación utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 4a. k) Oligómero (17C. 34C) ?ß(12-42) estabilizado con disulfuro (4k) El oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) (3k) se diluye con 3 partes de agua, y se dializa durante la noche a temperatura ambiente contra PBS a 1/4 de concentración con 0.05% de SDS, utilizando una membrana para diálisis con corte de peso molecular (MWCO) de 3500. La diálisis se continúa a la siguiente mañana contra 1 litro de solución amortiguadora nueva a 4°C durante 2 horas.

La muestra después se concentra utilizando una membrana YM10 en una celda Amicon agitada. La muestra también se puede concentrar utilizando concentradores centrífugos Millipore UltraMax con una membrana con corte de 10 kDa.

I) Oliqómero (17C(ACM). 34C(ACM)) ?ß(16-35) (41) El oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) (31) no forma puentes de cisteína. m) Oliqómero ?ß(16-35)-amida (4m) El oligómero ?ß(16-35)-amida (3m) no forma entrelazamientos. n) Oliqómero (17K. 34K) AB(16-35)-amida entrelazado Í4ni Someter el oligómero (17K, 34K) ?ß(16-35)-amida (3n) a condiciones apropiadas para entrelazar dos grupos amina permite obtener el producto. o) Oliqómero r(17C. 34C) AB(16-35)-amida. cíclicol (4o) El oligómero [(17C, 34C) ?ß(16-35)-amida, cíclico] (3o) ya contiene un enlazamiento. p) Oliqómero (17C, 34C) ?ß(16-35)-amida estabilizado con disulfuro (4p) El oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35)-amida (3p) se somete a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k. q) Oliaómero (17K. 34K) N-Met ABCI-42) entrelazado (4g) Someter el oligómero (17K, 34K) N-Met ?ß(1-42) (3q) a condiciones apropiadas para entrelazar dos grupos amina permite obtener el producto. r) Oliqómero (17KC, 34C) ???3-42) estabilizado con disulfuro (4r) El oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) (3r) se somete a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k. s) Oliaómero (17C. 34C) ?ß(16-42) estabilizado con disulfuro (4s) El oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (3s) se somete a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k. t) Oligómero (17C(ACM). 34C(ACM), 35M(S-óxido)) AB(16-35)-amida (4t) El oligómero (17C(ACM), 34C(ACM), 35M(S-óxido)) ?ß(16-35)-amida (3t) no forma puentes de cisteína. u) Oligómero (17C(ACM). 34C(ACM)) AB( 6-35)-amida Í4ui El oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35)-amida (3u) no forma puentes de cisteína. v) Oligómero (17K. 34E) ???6-35) enlazado con EDC/NHS (4v) Someter el oligómero (17K, 34E) ?ß(16-35) (3v) al procedimiento del ejemplo 4x permite obtener el producto. w1) Oligómero (17K. 34C) N-Met ABM-42) ligado con SMCC (4w1) El oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (3w) del ejemplo 3w en 0.05% de SDS (péptido 2.37 mM) se entrelaza con sulfo-SMCC 11 mM (No. de catálogo #22622 Pierce, suministrado a partir de una solución de reserva 100 mM en DMSO anhidro) durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se extingue mediante la adición de etanolamina 10 mM proveniente de una solución acuosa de reserva 100 mM, pH 8. El exceso, de reactivo y los productos de reacción se eliminan mediante diálisis contra NaP0 5 mM, NaCI 35 mM, 0.05% de SDS, pH 7.4 utilizando un aparato Slide-A-Lyzer con una membrana de corte de peso molecular de 2000 Da. La concentración final se determina utilizando la prueba de proteína BCA (Pierce). w2) Oliqómero (17K. 34C) N-Met ABM-42) ligado con MBS (4w2) El oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (3w) del ejemplo 3w en 0.05% de SDS (péptido 2.47 mM) se entrelaza con sulfo-MBS 12 mM (cat. #22312 Pierce, suministrado a partir de una solución de reserva 100 mM en DMSO anhidro) durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se extingue mediante la adición de etanolamina 10 mM proveniente de una solución acuosa de reserva 100 mM, pH 8. El exceso de reactivo y los productos de reacción se eliminan mediante diálisis contra NaP04 5 mM, NaCI 35 mM, 0.05% de SDS, pH 7.4 utilizando un aparato Slide-A-Lyzer con una membrana con corte de peso molecular de 2000 Da. La concentración final se determina utilizando la prueba de proteína BCA (Pierce). w3) Oliqómero (17K, 34C) N-Met ???-42) ligado con SIAB (4w3) El oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (3w) del ejemplo 3w en 0.05% de SDS (péptido 2.47 mM) se entrelaza con sulfo-SlAB 12 mM (cat. #22327 Pierce, suministrado a partir de una solución de reserva 100 mM en DMSO anhidro) durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se extingue mediante la adición de etanolamina 10 mM proveniente de una solución acuosa de reserva 100 mM, pH 8. El exceso de reactivo y los productos de reacción se eliminan mediante diálisis contra NaP04 5 mM, NaCI 35 mM, 0.05% de SDS, pH 7.4 utilizando un aparato Slide-A-Lyzer con una membrana con corte de peso molecular de 2000 Da. La concentración final se determina utilizando la prueba de proteína BCA (Pierce). x) Oliqómero (17K. 34E) N-Met ???-42) ligado con EDC/NHS (4x) El oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (3x) del ejemplo 3x en 0.05% de SDS (péptido 2.14 mM) se entrelaza utilizando EDC 20 mM (cat. #22980 Pierce, suministrado a partir de una solución de reserva acuosa 100 mM) y sulfo-NHS 50 mM (cat. #24520 Pierce, suministrado a partir de una solución de reserva acuosa 100 mM) durante 1 hora a temperatura ambiente. El exceso de reactivo y los productos de reacción se eliminan mediante diálisis contra NaP04 5 mM, NaCI 35 mM, 0.05% de SDS, pH 7.4 utilizando un aparato Slide-A-Lyzer con una membrana con corte de peso molecular de 2000 Da. La concentración final se determina utilizando la prueba de proteína BCA (Pierce). y) Oliqómero (17C. 34C) N-Met ???-42) estabilizado con disulfuro (4y) El oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (3y) se somete a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k. z) Oliqómero r(E22C*. G29C*) ??? 6-35)-amida. ciclizadol (4zl El oligómero [(22C\ 29C*) ?ß(16-35)-amida, ciclizado] (3z) ya contiene un enlazamiento. aa) Oligómero (22C. 29C) ?ß(16-35)-amida estabilizado con disulfuro (4aa) Someter el oligómero (22C, 29C) ?ß(16-35)-amida (3aa) a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k, permite obtener el producto. ab) Oliqómero (F20?FA19501. 17C. 34C) N-Met ABM-42) estabilizado con disulfuro (4ab) Someter el oligómero (F20?FA19501 , L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) (3ab) a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k, permite obtener el producto. ac) Oliqómero (22C. 29C) ?ß(20-35) estabilizado con disulfuro (4ac) Someter el oligómero (22C, 29C) ?ß(20-35) (3ac) a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k, permite obtener el producto. ad) Oliqómero (22C. 29C) ?ß(20-42) estabilizado con disulfuro (3ad) Someter el oligómero (22C, 29C) ?ß(20-42) (3ad) a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k, permite obtener el producto. ae) Oliqómero (17C, 22C. 29C. 34C) ?ß(20-42) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4ae) Someter el oligómero 17C, 22C, 29C, 34C) ?ß(20-42) N-Met ?ß(1-42) (3ae) a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k, permite obtener el producto. af) Oliqómero (K28G29?FA12401. 17C. 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4af) Someter el oligómero (K28G29?FA12401 , 17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (3af) a diálisis para eliminar el DTT y efectuar la formación de disulfuro, como se describe en el ejemplo 4k, permite obtener el producto.

EJEMPLO 5 Truncamiento con termolisina a) Truncamiento con termolisina del oliqómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (5a) 0.5 mi del oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4a) del ejemplo 4a se adicionan con termolisina 1/91 p/p (Roche, No. de Catálogo: 161586). La termolisina se disuelve con una concentración de 1 mg/ml en H20 (recién preparada). Las muestras se incuban bajo agitación durante 20 horas a 30°C. Después se agregan 2.5 µ? de una solución 100 mM de EDTA, pH 7.4, en agua y las muestras se agitan durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se ajustan posteriormente hasta un contenido de SDS de 0.1% con 5 µ? de una solución de SDS con concentración del 10%. Las muestras se agitan durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se concentran hasta aproximadamente 20 µ? a través de un tubo de 0.4 mi Ultrafree-MC de 30 kDa (Amicon, No. de Catálogo: UFC3LTK00). Los concentrados se mezclan con 0.2 mi de solución amortiguadora (NaH2P04 5 mM, NaCI 35 mM, pH 7.4) y de nuevo se concentran hasta 20 µ? utilizando los tubos Ultrafree-MC de 30 kDa (Amicon, No. de Catálogo: UFC3LTK00). Después los concentrados se ajustan con 0.38 mi de solución amortiguadora (NaH2P04 5 mM, NaCI 35 mM, pH 7.4) hasta un volumen final de 0.4 mi. Posteriormente, las muestras se ajustan hasta un contenido de SDS de 0.05% con 2 µ? de una solución de SDS con concentración del 10% y se almacenan a -30°C hasta uso posterior. b) Truncamiento con termolisina del oligómero (15C. 36C) N- et ABM-42) estabilizado con disulfuro (5b) El oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4b) del ejemplo 4b se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. c) Truncamiento con termolisina del oligómero (16C. 35C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (5c) El oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4c) del ejemplo 4c se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. d) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C. 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (5d) El oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4d) del ejemplo 4d se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. e) Truncamiento con termolisina del oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (5e) El oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4e) del ejemplo 4e se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. f) Truncamiento con termolisina del oligómero (19C. 32C) N-Met ?ß?-42) estabilizado con disulfuro (5f) El oligómero (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4f) del ejemplo 4f se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. g) Truncamiento con termolisina del oligómero (20C. 31C) N-Met ABCI-42) estabilizado con disulfuro (5g) El oligómero (20C, 31C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4g) del ejemplo 4g se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. h) Truncamiento con termolisina del oligómero (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (5h) El oligómero (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4h) del ejemplo 4 se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. i) Truncamiento con termolisina del oligómero (22C. 29C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (50 El oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (4i) del ejemplo 4i se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. j) Truncamiento con termolisina del qlobulómero de ?ß(1-42) tipo silvestre (50 El globulómero ?ß(1-42) de tipo silvestre (Bachem H-1368) (4j) del ejemplo 4j se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. k) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C. 34C) ABCI2-42) estabilizado por disulfuro (5k) El oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado con disulfuro (4k) del ejemplo 4k se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a.

I) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C(ACM). 34C(ACM)) ABCI6-35) (51) El oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) (31) se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. m) Truncamiento con termolisina del oligómero AB(16-35)-amida (5m) El oligómero ?ß(16-35)-amida (3m) del ejemplo 3m se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. n) Truncamiento con termolisina del oligómero (17K, 34K) AB(16-35)-amida (5n) Someter el oligómero (17K, 34K) AB(16-35)-amida (3n) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. o) Truncamiento con termolisina del oligómero \(MC. 34C) AB(16-35)-amida, cíclicol (5o) El oligómero [(17C, 34C) ?ß(16-35)-amida, cíclico] (3o) del ejemplo 3o se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. p) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C. 34C) ?ß(16-35)-amida estabilizado por disulfuro (5p) El oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35)-amida estabilizado con disulfuro (4p) del ejemplo 4p se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. q) Truncamiento con termolisina del oligómero (17K, 34K) N-Met AB(1-42) (5g) Someter el oligómero (17K, 34K) N-Met ?ß(1-42) (3q) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. r) Truncamiento con termolisina del oligómero (17KC. 34C) ???3-42 estabilizado por disulfuro (5r) Someter el oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) estabilizado por disulfuro (4r) del ejemplo 4r a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. s) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C. 34C) ?ß(16-42) estabilizado por disulfuro (5s) El oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado por disulfuro (4s) del ejemplo 4s se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. t) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C(ACM). 34C(ACM). 35M(S-óxido)) ?ß(16-35)-amida (53U Someter el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM), 35M(S-óxido)) ?ß(16-35)-amida (3t) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. u) Truncamiento con termolisina del oligómero M7C(ACM). 34C(ACM)) ?ß(16-35)-amida (5u) Someter el oligómero (17C(ACM), 34C(AC )) ?ß(16-35)-amida (3u) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. v) Truncamiento con termolisina del oliqómero (17K, 34E) AB(16-35) (5v) Someter el oligómero (17K, 34E) ?ß(16-35) (3v) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. w1 ) Truncamiento con termolisina del oligómero (17K. 34C) N-Met ABM-42) ligado con SMCC (5w) Someter el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) ligado con SMCC (4w1) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. w2) Truncamiento con termolisina del oligómero (17K. 34C) N-Met ABM-42) ligado con MBS (5w) Someter el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) ligado con MBS (4w2) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. w3) Truncamiento con termolisina del oligómero (17K. 34C) N-Met ABM-42) ligado con SIAB (5w) Someter el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) ligado con SIAB (4w3) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. x) Truncamiento con termolisina del oligómero (17K. 34E) N-Met ???-42) ligado con EDC/NHS (5x) Someter el oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) ligado con EDC/NHS (4x) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. y) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C. 34C) N-Met ABd-42) estabilizado por disulfuro (5y) El oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro (4y) del ejemplo 4y se somete a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a. z) Truncamiento con termolisina del oligómero f(22C*. 29C') AB(16-35)-amida. ciclizadol (5z) Someter el oligómero [(22C\ 29C*) ?ß(16-35)-amida, ciclizado] (3z) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. aa) Truncamiento con termolisina del oligómero (22C, 29C) AB(16-35)-amida estabilizado por disulfuro (5aa) Someter el oligómero (22C, 29C) ?ß(16-35)-amida 22C, 29C) ?ß(16-35)-amida estabilizado por disulfuro (4aa) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. ab) Truncamiento con termolisina del oliqómero (F20?FA19501. 17C. 34C) N-Met ABM-42) estabilizado por disulfuro (5ab) Someter el oligómero (F20?FA19501 , 17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro (4ab) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. ac) Truncamiento con termolisina del oligómero (22C. 29C) AS(20-35) estabilizado por disulfuro (5ac) Someter el oligómero (22C, 29C) ?ß(20-35) estabilizado por disulfuro (4ac) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. ad) Truncamiento con termolisina del oligómero (22C, 29C) AB(20-42) estabilizado por disulfuro (5ad) Someter el oligómero (22C, 29C) ?ß(20-42) estabilizado por disulfuro (4ad) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. ae) Truncamiento con termolisina del oligómero (17C, 22C. 29C. 34C) A6(20-42) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro (5ae) Someter el oligómero (17C, 22C, 29C, 34C) ?ß(20-42) N- Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro (4ae) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto. af) Truncamiento con termolisina del oligómero (K28G29?FA12401. 17C. 34C) N-Met A6M-42) estabilizado por disulfuro (5af) Someter el oligómero (K28G29?FA12401 , 17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado por disulfuro (4af) a truncamiento con termolisina utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5a permite obtener el producto.

CARACTERIZACION BIOFISICA Y BIOQUIMICA EJEMPLO 7 Análisis SDS PAGE a) SDS-PAGE (gel de tricina al 10-20%) del oliaómero (17C.34C) N-Met ABM-42) El análisis SDS-PAGE se corre utilizando un gel de tricina al 10-20%, 1.0 mm, 15 cavidades (Invitrogen, Cat # EC66255), utilizando solución amortiguadora 2-x de tricina para muestra ( (Invitrogen, Cat # LC1676) y solución amortiguadora para corrida de tricina (Invitrogen, Cat # LC1675). Las muestras se mezclan con partes iguales de solución amortiguadora para muestra y se cargan sin calentamiento. El gel se desarrolla a temperatura ambiente durante 100 minutos utilizando un voltaje constante de 125 V. Después de desarrollar, el gel se tiñe utilizando una tinción de Coomassie R-250 basada en metanol-ácido acético (Azul Brillante de R250 al 0.1%, metanol al 30%, ácido acético al 10%, en agua), y se destiñe utilizando metanol al 30%/ácido acético al 10%/agua. Patrones de referencia utilizados: Patrones de referencia pre-teñidos SeeBlue Plus2 (Invitrogen, Cat # LC5925), que consiste de miosina (210 kDa), fosforilasa (98 kDa), BSA (78 kDa), Glutámico Deshidrogenasa (55 kDa), Alcohol Deshidrogenasa (45 kDa), Anhidrasa Carbónica (34 kDa), Mioglobina Roja (17 kDa), Lisozima (16 kDa), Aprotinina (7 kDa) e Insulina (4 kDa).

El oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (2a) del ejemplo 2a muestra el patrón de bandas típico del globulómero ?ß (figuras 2A-2B). b) SDS-PAGE (gel de Tris/Glicina al .4-20%) de los oliqómeros (xC. vC) N-Met-AS(1-42) Se corre SDS-PAGE utilizando los siguientes parámetros: SDS-solución amortiguadora para muestra: - 0.3 g de SDS - 4 mi de 1 M Tris/HCI pH 6.8 - 8 mi de glicerol - 70 µ? de azul de bromofenol al 1% en etanol - se agrega H20 hasta 50 mi Solución amortiguadora para corrida: - 7.5 g de Tris - 36 g de Glicina -2.5 g de SDS - se agrega H20 hasta 2.5 L Sistema de gel SDS-PAGE: - Gel de Tris/Glicina al 4-20%: (Invitrogen Inc., No. de Catálogo: EC60255BOX) Se agrega 10 µ?_ de la preparación de oligómero (xC, yC) N-Met-A (1 -42) o de globulomero ?ß(1-42) antes y después de la digestión con termolisina a 10 µ?_ de SDS-solución amortiguadora para muestra. La muestra resultante de 20 µ? se carga en un gel de Tris/Glicina al 4-20% (Invitrogen Inc., No. de Catálogo: EC60255BOX). El análisis SDS-PAGE se conduce a una corriente constante de 25 mA.

Tinción de Coomassie: Solución para tinción: - 2500 mi de metanol - 500 mi de ácido acético - 5 g de Azul Brillante de Coomassie R250, Fa.Bio-Rad, Cat. no.161-0400 - 2000 mi de H20 Solución para desteñir: - 875 mi de metanol - 250 mi de ácido acético - 3925 mi de H20 Posterior a la electroforesis el gel se incuba en la solución para tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo agitación en una plataforma oscilatoria. Después de la tinción, el fondo del gel se destiñe durante la noche a temperatura ambiente en la solución para desteñir.

El oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4a, oligómero (14C, 37C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5a, oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4b, oligómero (15C, 36C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5b, oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4c, oligómero (16C, 35C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5c, oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4d, oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5d, oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4e, y oligómero (18C, 33C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5e (figura 2B) así como el oligómero (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4f, oligómero (19C, 32C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5f, oligómero (20C, 31 C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4g, oligómero (20C, 31 C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5g, oligómero (21C, 30C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4h, oligómero (21 C, 30C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5h, oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 3i, y oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5h (figura 2C) muestran el patrón de bandas típico de globulomero ?ß del globulomero ?ß(1-42) o del globulomero ?ß(1-42) truncado con termolisina (aunque hay algunos corrimientos aparentes de la altura de la banda a la cual corren los oligómeros (YC, YC) N-Met ?ß(1-42) y los oligómeros (YC, YC) N-Met ?ß(1-42) truncados con termolisina).

Además, el oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (0.2% de SDS) del ejemplo 3x, el oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (0.05% de SDS) del ejemplo 3x, el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) (0.2% de SDS) del ejemplo 3u, el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) (0.05% de SDS) del ejemplo 3u, el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (0.2% de SDS) del ejemplo 3w, el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (0.05% de SDS) del ejemplo 3w, el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (0.2% de SDS) del ejemplo 3s, el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (0.05% de SDS) del ejemplo 3s, el oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) (0.2% de SDS) del ejemplo 3r, y el oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) (0.05% de SDS) del ejemplo 3r (figura 2D) muestran el patrón de bandas típico de globulomero ?ß del globulomero N-Met ?ß(1-42).

EJEMPLO 8 ELISA directa La inmunoreactividad del oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) (2a) del ejemplo 2a se caracteriza adicionalmente utilizando un anticuerpo que es > 1000 veces selectivo para la forma de globulómero ?ß(1-42) sobre la fibrilla y péptido libre (anticuerpo monoclonal 5F7).

Materiales Las placas de microtitulación son Nunc Immuno Píate, Maxi-Sorb Surface, de fondo plano, (Catálogo #439454). El conjugado (anticuerpo secundario) es el conjugado anti-HRPO de ratón, de asno, Jackson Immuno Research, (Catálogo #715-035-150). El substrato para HRPO es Substrato líquido de 3,3',5'5'-tetrametilbencidina (TMB por sus siglas en inglés), Sigma, (Catálogo #T4444). La leche en polvo descremada (NFDM por sus siglas en inglés), proviene de BioRad, (Catálogo #170-6404). Todos los otros productos químicos provienen de fuentes convencionales.

Amortiguadores v soluciones Solución amortiguadora de PBST: PBS de Sigma elaborada con 0.05% de Tween 20. La PBST con 0.5% de BSA se elabora disolviendo 0.5 mg de BSA en 100 mL de PBST. La solución para bloqueo es NFDM al 3% en PBST. El diluyente para el conjugado es NFDM al 1% en PBST. La solución amortiguadora para revestimiento es NaHC03 100 mM, pH 8.2. La solución de detención de HRPO es H2S042 M.

Revestimiento de las placas El globulómero ?ß a ser analizado se diluye hasta 1.0 pg/mL en solución amortiguadora para revestimiento. Se agregan 100 pL a cada cavidad que se va a revestir. Las placas se sellan con película selladora y se deja a 4°C durante toda la noche.

Bloqueo de las placas La solución para revestimiento se retira de las cavidades. Cada cavidad se lava opcionalmente 2-3 X con 150 pL de PBST. Se agregan 300 pL de solución para bloqueo (NFDM al 3% en PBST). Las placas se revisten con película selladora de placa y se incuban durante ~2 horas a temperatura ambiente, con agitación.

Anticuerpo primario La solución para bloqueo se retira de las cavidades. Cada cavidad se lava opcionalmente 2-3 X con 150 pL de PBST. Se agregan 100 pL de las soluciones de anticuerpo primario. Para el globulómero N-Met ?ß(1-42) de longitud completa, se utilizan soluciones de 0.04 a 100 pg/mL del anticuerpo 5F7. El anticuerpo se diluye utilizando PBST con 0.5% de BSA. La placa se cubre con película selladora de placa y se incuba durante ~2 a 3 hrs a temperatura ambiente con agitación.

Anticuerpo secundario (conjugado de HRPO) La solución de anticuerpo primario se retira de las cavidades. Cada cavidad se lava 2-3 X con 150 µ? de PBST. Se agregan 200 µ? de solución de anticuerpo secondario (conjugado de HRPO) diluida 1:5000 en PBST con NFDM al 1%. La placa se cubre con película selladora de placa y se incuba durante ~1 hora a temperatura ambiente con agitación.

Revelado del substrato La solución de conjugado se retira de las cavidades. Cada cavidad se lava 2-3 X con 200 µ? de PBST. Se agregan 100 µ? de solución de substrato de HRPO a cada cavidad. Se permite que el color se revele bajo observación. Este se torna azul. La reacción normalmente se lleva a cabo en 5-10 minutos a temperatura ambiente. Se agregan 50 µ? de solución de detención a cada cavidad. El color azul se torna amarillo. Se lee la absorbancia a 450 nm utilizando una lectora de placa de microtitulación dentro de 30 minutos de la adición de la solución de detención.

La unión del anticuerpo monoclonal 5F7 específico de globulómero al globulómero N-Met ?ß(1-42) y del oligómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) al 5F7 son casi idénticas (figura 3A) lo que indica que el oligómero mutante (L17C.L34C) N-Met ?ß(1-42) sigue desplegando el epítope específico de globulómero.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4y contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5y se muestra en la figura 3B.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4y contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5y se muestra en la figura 3C.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4y contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5y se muestra en la figura 3D.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4p contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5p se muestra en la figura 3E.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulomero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4p contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5p se muestra en la figura 3F.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4p contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5p se muestra en la figura 3G.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulomero hacia el oligómero ?ß(16-35) del ejemplo 4m contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5m se muestra en la figura 3H.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulomero hacia el oligómero ?ß(16-35) del ejemplo 4m contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5m se muestra en la figura 31.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero hacia el oligómero ?ß(16-35) del ejemplo 4m contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5m se muestra en la figura 3J.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero hacia el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) del ejemplo 41 contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 medíante corte enzimático con termolisina del ejemplo 51 se muestra en la figura 3K.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero hacia el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) del ejemplo 41 contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 51 se muestra en la figura 3L.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero hacia el oligómero (17C(ACM), 34C(ACM)) ?ß(16-35) del ejemplo 41 contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 51 se muestra en la figura 3M.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) del ejemplo 4o contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5o se muestra en la figura 3N.

! Una comparación de los resultados de ELISA directa que 5 compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) del ejemplo 4o contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5o se muestra j 10 en la figura 30; Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal j de conejo específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) I ' ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro (ciclizado antes de la formación ¡ 15 del oligómero) del ejemplo 4o contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5o se muestra en la figura 3P; j í I Una comparación de los resultados de ELISA directa que i compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de ¡ 20 globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado ' con disulfuro (ciclizado antes de la formación del oligómero) del ejemplo 4o contra los oligómeros (17C, 34C) ?ß(16-42), (17C, 34C) ! ?ß(16-35) y (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro (todos ciclizados después de la formación del oligómero) de los 25 ejemplos 4s, 4p y 4y se muestra en la figura 3Q.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) estabilizado con disulfuro truncado con termolisina (ciclizado antes de la formación del oligómero) del ejemplo 5o contra los oligómeros (17C, 34C) ?ß(16-42), (17C, 34C) ?ß(16-35) y (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) truncados con termolisina estabilizados con disulfuro (todos ciclizados después de la formación del oligómero) de los ejemplos 5s, 5p y 5y se muestra en la figura 3R.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4s contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5s se muestra en la figura 3S.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4s contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5s se muestra en la figura 3T.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4s contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5s se muestra en la figura 3U.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulomero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4k contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5k se muestra en la figura 3V.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulomero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4k contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5k se muestra en la figura 3W.

Una comparación de los resultados de ELISA directa que compara la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero hacia el oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4k contra el mismo oligómero truncado en el residuo 20 mediante corte enzimático con termolisina del ejemplo 5k se muestra en la figura 3X.

Los resultados de ELISA directa de la afinidad de unión aparente del mAb 5F7 específico de globulomero hacia el oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4r se muestran en la figura 3Y.

Los resultados de ELISA directa de la afinidad de unión aparente del mAb 7C6 específico de globulomero hacia el oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4r se muestran en la figura 3Z.

Los resultados de ELISA directa de la afinidad de unión aparente del antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero hacia el oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4r se muestran en la figura 3AA.

Las figuras 13A-13C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento del ejemplo 3w con el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 4y para (figura 13A) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7; (figura 13B) el. anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6; y (figura 13C) el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero.

Las figuras 14A-14C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento del ejemplo 3w con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con SMCC antes (del ejemplo 4w1) y después (del ejemplo 5w1) del truncamiento con termolisina para (figura 14A) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7; (figura 14B) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6; y (figura 14C) el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero.

Las figuras 15A-15C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento del ejemplo 3w con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con MBS antes (del ejemplo 4w2) y después (del ejemplo 5w2) del truncamiento con termolisina para (figura 15A) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7; (figura 15B) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6; y (figura 15C) el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero.

Las figuras 16A-16C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento del ejemplo 3w con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con SIAB antes (del ejemplo 4w3) y después (del ejemplo 5w3) del truncamiento con termolisina para (figura 16A) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7; (figura 16B) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6; y (figura 16C) el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero.

Las figuras 17A-17C muestran una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 3x sin entrelazamiento con el oligómero (17C, 34C) N-Met ?ß(1-42) estabilizado con disulfuro del ejemplo 3y para (figura 17A) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 5F7; (figura 17B) el anticuerpo monoclonal específico de globulomero 7C6; y (figura 17C) el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulomero.

Las figuras 18A-18C muestren una comparación de la respuesta ELISA directa del oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) sin entrelazamiento con el oligómero (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) entrelazado con EDC/NHS antes y después del truncamiento con termolisina para (figura 18A) el anticuerpo monocional específico de globulómero 5F7; (figura 18B) el anticuerpo monocional específico de globulómero 7C6; y (figura 18C) el antisuero 5599 policlonal de conejo específico de globulómero.

Algunos de los resultados obtenidos son: Se demuestra que el péptido (17C, 34C) ?ß(16-42) (ejemplo 3s) forma oligómeros (ejemplo 4s) que contienen el puente de disulfuro esperado (figuras 4E & F) y que despliegan el epítope de globulómero (figuras 3S-3U). Después del truncamiento con termolisina (ejemplo 5s), se observa el incremento esperado en afinidad hacia los anticuerpos específicos de globulómero (figuras 3S-3U).

Se demuestra que el péptido (17C, 34C) ?ß(12-42) (ejemplo 3k) forma oligómeros (ejemplo 4k) que contienen el puente de disulfuro esperado (figuras 4G & 4H) y que despliegan el epítope de globulómero (figuras 3V-3X). Después del truncamiento con termolisina (ejemplo 5k), se observa el incremento esperado en afinidad hacia los anticuerpos específicos de globulómero (figuras 3V-3X).

Se demuestra que el péptido (17C, 34C) ?ß(16-35) (ejemplo 3o) forma oligómeros (ejemplo 4o) que contienen el puente de disulfuro esperado (figuras 4C & D) y que despliegan el epítope de globulómero (figuras 3E-3G). Después del truncamiento con termolisina (ejemplo 5o), se observa el incremento esperado en afinidad hacia los anticuerpos específicos de globulómero (figuras 3E-G). Sin embargo, los péptidos ?ß(16-35) que están impedidos para formar este enlazamiento de disulfuro, ya sea a través de la carencia de residuos cys (?ß(16-35) de tipo silvestre (wt), ejemplo 3m), o protección con ACM del -SH del residuo cys ((17C ACM/34C ACM) ?ß(16-35), ejemplo 31), no pueden formar oligómeros que despliegan el epítope de globulómero (figuras 3H-3M).

Mediante introducción de una lisina en la posición 17 y una cisteína en la posición 34, se pueden utilizar una variedad de reactivos de entrelazamiento heterobifuncionales para un puente entre las cadenas laterales de estos dos residuos, incluyendo sulfo-SMCC, sulfo-MBS, y sulfo-SIAB. Por ejemplo, el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) (ejemplo 3w) puede formar oligómeros que despliegan el epítope de globulómero (figuras 13A-13C). Asimismo, estos oligómeros se pueden someter a entrelazamiento utilizando sulfo-SMCC (ejemplo 4w1), sulfo-MBS (ejemplo 4w2), y sulfo-SIAB (ejemplo 4w3), y formar el entrelazamiento covalente intra-molecular deseado (figuras 12A-12C). Estos oligómeros ?ß entrelazados siguen desplegando la reactividad apropiada hacia los anticuerpos específicos de globulómero (figuras 14A-14C, 15A-15C, y 16A-16C, respectivamente). Asimismo, estos oligómeros ?ß se pueden someter a truncamiento con termolisina (ejemplos 4w1, 4w2, & 4w3), con lo que se obtiene el incremento esperado en afinidad hacia los anticuerpos específicos de globulomero (figuras 14A-14C, 15A-15C, y 16A-16C).

Mediante introducción de una lisina en la posición 17 y un ácido glutámico en la posición 34, se puede utilizar una variedad de estrategias de entrelazamiento para un puente entre las cadenas laterales de estos dos residuos, incluyendo la activación de la cadena lateral glutamato mediante reacción con EDC, seguido por sulfo-NHS. Esta cadena lateral activada puede reaccionar posteriormente con la amina primaria del residuo lisina introducido en la posición 17. Por ejemplo, el péptido (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) (ejemplo 3x) puede formar oligomeros que despliegan el epítope de globulomero (figuras 17A-17C). Asimismo, estos oligomeros se pueden someter a entrelazamiento utilizando EDC y sulfo-NHS, con lo cual resultan los entrelazamientos covalentes intra-moleculares (figura 12D). Estos oligomeros ?ß entrelazados siguen desplegando la reactividad apropiada hacia los anticuerpos específicos de globulomero (figuras 18A-18C). Asimismo, estos oligomeros ?ß se pueden someter a truncamiento con termolisina (ejemplos 4x), con lo que se obtiene el incremento esperado en afinidad hacia los anticuerpos específicos de globulomero (figuras 18A-18C).

EJEMPLO 9 Espectroscopia de masas La espectrometría de masas del oligómero (17C, 34C) N-Met AN-Met ?ß(1-42) (2a) del ejemplo 2a confirmar que la formación de oligómeros con el péptido mutante (L17C,L34C) N-Met ?ß(1-42) (1a) del ejemplo 1a dirige la formación eficiente de puentes de disulfuro intra-péptido entre los dos residuos Cys (figura 4A). La masa se centra alrededor de 4622 Da, la masa esperada para el péptido mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42), con la formación de sólo un puente de disulfuro. No se observan señales de péptido dimérico covalente en el espectro de masas. Después de reducción con ditiotreitol (DTT), la masa se centra alrededor de 4624 Da, como es de esperar para el péptido mutante (L17C.L34C) N-Met ?ß(1-42) sin ningún puente de disulfuro, y cada masa observada en la desconvolución isotópica gana dos Da, como es de esperar a partir de la reducción de un puente de disulfuro (figura 4B).

La espectrometría de masas del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) (3p) del ejemplo 3p confirma que la formación de oligómeros con el péptido (17C, 34C) ?ß(16-35) (1p) del ejemplo 1p dirige la formación eficiente de puentes de disulfuro intra-péptido entre los dos residuos Cys (figura 4C). La masa se centra alrededor de 2085 Da, la masa esperada para el péptido (17C, 34C) ?ß(16-35), con sólo un puente de disulfuro formado. No se observa señal de péptido dimérico covalente en el espectro de masas. Después de reducción con ditiotreitol (DTT), la masa se centra alrededor de 2086 Da, como es de esperar para el péptido (17C, 34C) ?ß(16-35), ningún puente de disulfuro, y cada masa observada en la desconvolución isotópica gana uno a dos Da, como es de esperar a partir de la reducción de un puente de disulfuro (figura 4D).

La espectrometría de masas del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-42) (3s) del ejemplo 3s confirma que la formación de oligómeros con el péptido (17C, 34C) ?ß(16-42) (1s) del ejemplo 1s dirige la formación eficiente de puentes de disulfuro intra-péptido entre los dos residuos Cys (figura 4E). La masa se centra alrededor de 2683 Da, la masa esperada para el péptido (17C, 34C) ?ß(16-35), con sólo un puente de disulfuro formado. No se observa señal de péptido dimérico covalente en el espectro de masas. Después de reducción con ditiotreitol (DTT), la masa se centra alrededor de 2684 Da, como es de esperar para el péptido (17C, 34C) ?ß(16-42) con ningún puente de disulfuro, y cada masa observada en la desconvolución isotópica gana uno a dos Da, como es de esperar a partir de la reducción de un puente de disulfuro (figura 4F).

La espectrometría de masas del oligómero (17C, 34C) ?ß(12-42) (3k) del ejemplo 3k confirma que la formación de oligómeros con el péptido (17C, 34C) ?ß(12-42) (1k) del ejemplo 1k dirige la formación eficiente de puentes de disulfuro intra-péptido entre los dos residuos Cys (figura 4G). No se observa señal de péptido dimérico covalente en el espectro de masas. Después de reducción con ditiotreitol (DTT), la masa se centra alrededor de 3186 Da, como es de esperar para el péptido (17C, 34C) ?ß(12-42) con ningún puente de disulfuro, y cada masa observada en la desconvolución isotópica gana uno a dos Da, como es de esperar a partir de la reducción de un puente de disulfuro (figura 4H).

La espectrometría de masas (ESI) del oligómero (17KC, 34C) ?ß(13-42) (3r) del ejemplo 3r confirma que la formación de oligómeros con el péptido (17KC, 34C) ?ß(13-42) (1r) del ejemplo 1r dirige la formación eficiente de puentes de disulfuro intra-péptido entre los dos residuos Cys (figura 41). Aunque se observan cantidades significativas de péptido dimérico covalente en el espectro de masas (datos no mostrados), el puente de disulfuro intramolecular deseado es evidente. Después de reducción con ditiotreitol (DTT), la masa se centra alrededor de 3215 Da, como es de esperar para el péptido (17KC, 34C) ?ß(13-42) con ningún puente de disulfuro, y cada masa observada en la desconvolución isotópica gana uno a dos Da, como es de esperar a partir de la reducción de un puente de disulfuro (figura 4J).

Las masas de péptido de los oligómeros (xC, yC) N-Met ?ß(1-42) antes (de los ejemplos 4a-4j) y después (de los ejemplos 5a-5j) de la digestión con termolisina según se detectan mediante SELDI-MS se indican en la figura 6.

El espectro de masas (ESI) de oligómeros elaborados con el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional sulfo-SMCC del ejemplo 4w1 se muestra en la figura 12A. La especie predominante parece ser el producto deseado.

El espectro de masas (MALDI) de los globulómeros elaborados con el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional sulfo-MBS del ejemplo 4w2 se muestra en la figura 12B. Existe evidencia de que se forma el entrelazamiento deseado (4852 Da), sin embargo también se observa masas que corresponden a la adición del MBS seguido por hidrólisis de la maleimida (4869 Da), adición de dos aducios de MBS seguido por hidrólisis (5088 Da), y péptido sin reaccionar (4652 Da).

El espectro de masas (ESI) de globulómeros elaborados con el péptido (17K, 34C) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional sulfo-SIAB del ejemplo 4w3 se muestra en la figura 12C. La flecha indica la masa esperada después que se forma el entrelazamiento (p.m. = 4810 Da).

El espectro de masas (MALDI) de globulómeros elaborados con el péptido (17K, 34E) N-Met ?ß(1-42) después de la reacción de entrelazamiento con el reactivo de entrelazamiento heterobifuncional EDC y NHS del ejemplo 4x se muestra en la figura 12D. Las flechas indican masas que sugieren que se han formado dos entrelazamientos (p.m. = 4637 Da), y tres entrelazamientos (p.m. = 4620 Da).

EJEMPLO 10 Análisis hidrodinámico Las muestras se cargan en celdas de dos sectores estándar utilizando ventanas de zafiro. Todas las muestras se examinan utilizando un rotor ya sea de 4 agujeros o uno de 8 agujeros.

Las condiciones son las siguientes: temperatura: 20°C, velocidad del rotor: 42,000 rpm, los datos de interferencia se recolectan, los datos de absorbancia se recolectan a 280 nm en modo continuo con un tamaño de paso radial de 0.003 cm. se recolecta un punto de datos por cada paso (sin promediar la señal). Típicamente, se recolectan 200 barridos o menos a través del curso de no más de 9 horas.

Se efectúa un análisis de distribución S continuo (análisis C(s)) tal como está inplementado en Sedfit v8.9 (P. Schuck (2000), "Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling", Biophysical Journal 78:1606-1619) para entender la heterogeneidad global de las muestras. Se ajustan tanto el ruido radial y el ruido independiente del tiempo y se eliminan de los datos utilizando un algoritmo de entropía máxima.

Los experimentos de velocidad de sedimentación muestra que tanto el globulomero N-Met ?ß(1-42) como el oligómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) (2a) del ejemplo 2a forman oligómeros homogéneos (figura 5A). Sin embargo, el oligómero mutante (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) despliega mejores propiedades hidrodinámicas.

Los experimentos de velocidad de sedimentación también muestra que tanto el globulomero N-Met ?ß(1-42) truncado como el oligómero (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina (5y) del ejemplo 5y forman oligómeros homogéneos (figuras 5B y 5C). Sin embargo, el oligómero truncado con termolisina (L17C, L34C) N-Met ?ß(1-42) despliega mejores propiedades hidrodinámicas.

La introducción de un puente de disulfuro en el oligómero N-Met (17C/34C) ?ß(1-42) (ejemplo 4y) estabiliza la agregación con relación al oligómero N-Met ?ß(1-42) de tipo silvestre, en Na-P04 5mM, NaCI 35mM, pH 7.4 (figura 5A). Asimismo, el oligómero (17C/34C) N-Met ?ß (1-42) estabilizado con disulfuro permanece significativamente más homogéneo desde el punto de vista hidrodinámico después de truncamiento en el recibo 20 con termolisina (ejemplo 5y), con relación al oligómero N-Met ?ß(1-42) de tipo silvestre. Esto es evidente tanto en presencia (figura 5B) como en ausencia (figura 5C) de 0.05% de SDS. De hecho, después del tratamiento con termolisina del oligómero N-Met ?ß(1-42) de tipo silvestre se tiene una preparación que es bastante homogénea para ser examinada en ausencia de 0.05% de SDS (datos no mostrados).

EJEMPLO 11 Alauilación con vodoacetamida de oligómeros fxC. yC) N-Met ?ß(1-42) truncados con termoiisina y análisis SELDI-MS A: Oligómeros (xC, yC) N-Met ?ß(1-42) truncados con termoiisina v globulomeros N-Met ?ß(1-42) utilizados para la alquilacion Las siguientes oligómeros y globulomeros truncados con termoiisina se someten a alquilacion con yodoacetamida 1) Oligómero (14C.37C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5a 2) Oligómero (15C.36C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5b 3) Oligómero (16C.35C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5c 4) Oligómero (17C.34C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5d 5) Oligómero (18C,33C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5e 6) Oligómero (19C.32C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5f 7) Oligómero (20C, 31 C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5g 8) Oligómero (21 C.30C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termoiisina del ejemplo 5h 9) Oligomero (22C.29C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5i 10) Globulómero ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5j B: Alquilación con yodoacetamida B1: Muestras de control - se diluyen 2.5 µ? del oligomero o globulómero truncado con termolisina con 5 µ? 50 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, pH 8.6 (aireado 5 min con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 2 µ? de H20 - 1 h de incubación a temperatura ambiente - se agregan 115 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% B2: Muestras de alquilación con yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligomero o globulómero truncado con termolisina con 5 µ? de 50 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, pH 8.6 (aireado con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 2 µ? de solución de yodoactamida 100 mM en H20 (Sigma; No. de Catálogo 11149) - 1 h de incubación a temperatura ambiente - se agregan 115 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% B3: Reducción con DTT seguido por muestras de alquilación con yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligómero o globulomero truncado con termolisina con 5 µ? de 50 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, 2 mM DTT, pH 8.6 (aireada con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 2 µ? de solución 100 mM de yodoactamida (Sigma; No. de Catálogo 11149) en H20 - 1 hora de incubación a temperatura ambiente - se agregan 1 5 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% C: Cuantificación mediante espectrometría de masas por ionización de desorción de láser incrementada en superficie (SELDI-MS) del péptido ?ß(20-42) inmunoprecipitado - Se aplican de manera puntiforme 2 µ? de muestra en un arreglo de Chip de Proteína H4 (BioRad; No. de Catálogo C573-0028).

- Las manchas se deja secar en una placa de incubadora caliente.

- Solución de CHCA: • Se disuelven 5 mg de CHCA en 150 µ? de acetonitrilo + 150 µ? de TFA al 1% = solución de reserva; se almacena a -20°C • De la solución de reserva se diluyen 10 µ? con 20 µ? de acetonitrilo y 20 µ? de TFA al 1% = solución de trabajo de CHCA.

• Se aplican 2 µ? de la solución de trabajo de CHCA sobre las manchas - Las manchas se dejan secar sobre una placa de incubadora caliente y se analizan mediante SELDI-MS (espectrometría de masas por ionización de desorción de láser incrementada en superficie; Edición enterprise del sistema Protein chip SELDI de BioRad)).

• Condiciones: intervalo de masas: 800 a 10000 Da; masas del foco: 2220 Da; atenuación de matriz: 500 Da; velocidad de muestreo: 400 MHz; disparos de calentamiento: 2 con energía: 1100 nj; disparos de datos: 10 con energía de 1000 nJoule; Partición 1 de 3.

• Análisis: se detecta la intensidad de pico de los picos de masas respectivos de péptido doble alquilado (2xCM), alquilado (1xCM) o no alquilado (OxCM).

Los resultados se muestran en la figura 7.

En ausencia de DTT como agente reductor la yodoacetamida no puede alquilar al grupo -SH de la cisteína si ésta ha formado puente de S-S covalente, las cistina, con otra cisteína. Por lo tanto, la ausencia de reacción de alquilación con yodoacetamida (como se indica mediante OxCM en la figura 7) del oligómero (xC, yC) N-Met-Ap(1 -42) después de tratamiento con termolisina analizada mediante SELDI-MS muestra que ha ocurrido la formación de S-S en el oligómero (xC, yC) N-Met-AP(1 -42). Que la reacción de alquilación con yodoacetamida pueda en principio ocurrir se verifica bajo condiciones reductoras utilizando DTT para destruir S-S y generar grupos -SH libres los cuales se encuentra después que son susceptibles para alquilación con yodoacetamida (Figura 7).

EJEMPLO 12 Análisis Dot Blot de oligómeros (xC, yC) N-Met A3M-42) y globulómeros ?ß(1-42) antes v después del truncamiento con termolisina Método Patrones de referencia de ?ß para dot blot: 1. Oligómero (14C.37C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4a 2. Oligómero (14C,37C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5a 3. Oligómero (15C,36C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4b 4. Oligómero (15C,36C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5b 5. Oligómero (16C,35C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4c 6. Oligómero (16C.35C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5c 7. Oligómero (17C,34C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4d 8) Oligómero (17C.34C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5d 9. Oligómero (18C.33C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4e 10. Oligómero (18C.33C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5e 11. Oligómero (19C.32C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4f 12. Oligómero (19C.32C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5f 13. Oligómero (20C, 31 C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4g 14. Oligómero (20C, 31 C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5g 15. Oligómero (21 C.30C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4h 16. Oligómero (21 C,30C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5h 17. Oligómero (22C, 29C) N-Met ?ß(1-42) del ejemplo 4i 18. Oligómero (22C.29C) N-Met ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5i 19. Globulómero ?ß(1-42) del ejemplo 4j 20. Globulómero ?ß(1-42) truncado con termolisina del ejemplo 5j Materiales para dot blot Patrones de referencia de ?ß: - Dilución en serie de los antígenos de ?ß en columnas 1-20 en NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4 + 0.2 mg/ml de BSA: 1) 10 pmol/µ? 2) 1 pmol/µ? 3) 0.1 pmol/µ? 4) 0.01 pmol/µ? 5) 0.001 pmol/µ? Nitrocelulosa: - Medio de transferencia Trans-Blot, membrana ntrocelulosa Pura (0.45 µp?); BioRad Anti-ratón-AP: AP326A (Chemicon) Anti-conejo-AP: AP304A (Chemicon) Reactivo de detección: Tabletas de NBT/BCIP (Roche) Seroalbúmina de bovino, (BSA): 11926 Serva Reactivo para bloqueo: 5% de leche baja en grasa en TBS Soluciones amortiguadoras: - TBS Solución amortiguadora de 25 mM Tris/HCI, pH 7.5 + NaCI 150 mM TTBS Solución amortiguadora 25 mM Tris/HCI, pH 7.5 + NaCI 150 mM + 0.05% de Tween 20 PBS + 0.2 mg/ml de BSA Solución amortiguadora de NaH2P0420 mM, pH 7.4 + NaCI 140 mM + 0.2 mg/ml BSA Solución de anticuerpo I - Se utilizan ya sea muestras de suero de conejo o anticuerpos monoclonales de ratón como la Solución de Anticuerpo I y se prepara como sigue: - Muestras de suero de conejo (diluida 1:200 en 20 mi de leche baja en grasa al 1% en TBS) - Anticuerpos monoclonales de ratón (diluidos hasta 0.2 µg/ml en 20 mi de leche baja en grasa al 1% en TBS) Solución de anticuerpo II - En caso que la solución de anticuerpo I sea muestras de suero de conejo entonces la solución de anticuerpo II es anti-conejo-AP. En caso que la solución de anticuerpo I sea anticuerpos monoclonales de ratón entonces la solución de anticuerpo II es anti-ratón-AP La solución de anticuerpo dos se prepara de la siguiente manera: - Anti-ratón-AP: dilución 1:5000 en leche baja en grasa al 1% en TBS - Anti-conejo-AP: dilución 1:5000 en leche baja en grasa al 1% en TBS Procedimiento de Dot blot 1) 1 µ? de cada uno de los diferentes patrones de referencia de ?ß (en sus 5 diluciones en serie) se aplican en formapuntiforme sobre la membrana de nitrocelulosa a una distancia de aproximadamente 1 cm uno del otro. 2) Los puntos de los patrones de referencia de ?ß se dejan secar en la membrana de nitrocelulosa al aire durante por lo menos 10 min a temperatura ambiente (RT) (= dot blot) 3) Bloqueo El dot blot se incuba con 30 mi de leche baja en grasa al 5% en TBS durante 1.5 horas a RT. 4) Lavado: La solución de bloqueo se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi de TTBS durante 10 minutos a RT. 5) Solución de anticuerpo I: La solución amortiguadora de lavado se desecha y el dot blot se incuba con solución de anticuerpo I durante 2 horas a RT. 6) Lavado: La solución de anticuerpo I se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi de TTBS durante 10 minutos a RT. La solución de lavado se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi de TTBS durante 10 minutos a RT. La solución de lavado se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi TBS durante 10 minutos a RT. 7) Solución de anticuerpo II: La solución amortiguadora de lavado se desecha y el dot blot se incuba con solución de anticuerpo II durante 1 hora a RT 8) Lavado: La solución de anticuerpo II se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi de TTBS durante 10 minutos a RT. La solución de lavado se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi de TTBS durante 10 minutos a RT. La solución de lavado se desecha y el dot blot se incuba bajo agitación con 20 mi TBS durante 10 minutos a RT. 9) Revelado: La solución de lavado se desecha. Se disuelve 1 tableta de NBT/BCIP en 20 mi de H20 y el dot blot se incuba durante 4 min con esta solución. El revelado se detiene mediante lavado intensivo con H20.

Los resultados se muestran en la figura 8. Los oligómeros (xC, yC) N-Met-A3(1 -42) truncados con termolisina muestran un reconocimiento comparable por parte del anticuerpo 7C6 específico del globulomero ?ß y el suero policlonal de conejo 5599 como el del globulomero ?ß(1-42) truncado con termolisina. Una excepción es el oligómero (15C, 36C) N-Met-AP(1 -42) truncado con termolisina el cual solamente es reconocido por el suero policlonal de conejo 5599. Esto se puede ver a la mutación de cisteína en la posición 36 en el oligómero (15C, 36C) ?-?ß?-?ß(1 -42) truncado con termolisina la cual puede interferir con el reconocimiento del epítope del globulomero ?ß por parte de 7C6. Asimismo, el anticuerpo 7C6 y el suero policlonal de conejo 5599 no detectan los oligómeros (xC, yC) ?-?ß?-?ß(1 -42) sin tratamiento con termolisina los cuales comparable con el globulomero ?ß(1-42). Nótese que el suero policlonal de conejo 5599 presentan en general una alta reacción de fondo para todos los péptidos aplicados en forma puntiforme lo cual no se puede atribuir a un reconocimiento específico del epítope del globulomero ?ß (Figura 8).

EJEMPLO 13 Alquilación con vodoacetamida del oligómero (17C, 34C) ?ß(16- 35) con análisis SELDI-MS A: Oligómero (17C, 34C) ABM6-35) utilizado para alquilación Se utiliza el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) (4p) del ejemplo 4p.

B: Alquilación con vodoacetamida B1: muestras de control sin alquilación con yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligómero con 50 µ? de 100 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, pH 8.6 (aireado 5 min con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 20 µ? de H20 - 6 horas de incubación a temperatura ambiente - se diluye 1 µ? de la muestra en 49 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% B2: Muestras de alquilación con yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligómero con 50 µ? de 100 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, pH 8.6 (aireado 5 min con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 20 µ? de solución 100 mM de yodoactamida (Sigma; Cat.no.: 11 149) en H20 - 6 horas de incubación a temperatura ambiente - se diluye 1 µ? de la muestra en 49 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% B3: Reducción con DTT seguido por muestras de alquilación con yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligómero con 50 µ? de 100 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, DTT 2 mM, pH 8.6 (aireado con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 20 µ? de solución 100 mM de yodoacetamida (Sigma; Cat.no.: 11149) en H20 - 6 horas de incubación a temperatura ambiente - se diluye 1 µ? de la muestra en 49 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% C: Cuantificación del oligómero mediante espectrometría de masas por ionización de desorción de láser incrementada en superficie (SELDI-MS) - Se aplican individualmente de manera puntiforme 2 µ? de las muestras B1 y B2 y B3 en un arreglo de Chip de Proteína H4 (BioRad; No. de Catálogo C573-0028).

- Las manchas se dejan secar en una placa de incubadora caliente.

« Se aplican 2 µ? de la solución de trabajo de CHCA sobre las manchas - Las manchas se dejan secar sobre una placa de incubadora caliente y se analizan mediante SELDI-MS (espectrometría de masas por ionización de desorción de láser incrementada en superficie; Edición Enterprise del sistema Protein chip SELDI de BioRad)).

• Condiciones: intervalo de masas: 800 a 10000 Da; masas del foco: 2220 Da; atenuación de matriz: 500 Da; velocidad de muestreo: 400 MHz; disparos de calentamiento: 2 con energía: 1100 nj; disparos de datos: 10 con energía de 1000 nJoule; Partición 1 de 2.

• Análisis: se detecta la intensidad de pico de los picos de masas respectivos de oligómero doble alquilado (2xCM), alquilado (1xCM) o no alquilado (OxCM).

Los resultados se muestran en la figura 9.

En ausencia de DTT como agente reductor la yodoacetamida no puede alquilar al grupo -SH de la cisteína si ésta ha formado puente de S-S covalente, la cistina, con otra cisteína. Por lo tanto, la ausencia de reacción de alquilacion con yodoacetamida del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) según se analiza mediante SELDI muestra que ha ocurrido la formación de S-S en el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35). Que la reacción de alquilación con yodoacetamida pueda en principio ocurrir se verifica bajo condiciones reductores utilizando DTT para destruir S-S y generar grupos -SH libres los cuales se encuentra después que son susceptibles para alquilación con yodoacetamida (Figure 9).

EJEMPLO 14 Reconocimiento del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) por parte de anticuerpos específicos del globulómero A3 utilizando inmunoprecipitación con detección SELDI-MS A: Activación de glóbulos Dvnabeads con anticuerpos monoclonales de ratón - La suspensión de reserva de glóbulos dynabeads (anti-IgG de ratón, de oveja, Dynabeads -280, Invitrogen; No. de Catálogo: 112.02) se agita cuidadosamente para evitar la formación de espuma.

- Se retira asépticamente 1 mL y se transfiere a un frasco de reacción de 1.5 mL.

- Los glóbulos dynabead se lavan 3 veces 5 minutos con 1 mL de solución amortiguadora para inmuno-precipitación (IP)-lavado (solución amortiguadora de IP-lavado: PBS (NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4), 0.1% de BSA). Durante el procedimiento de lavado, el sobrenadante se retira cuidadosamente al tiempo que los glóbulos dynabeads se inmovilizan al lado del frasco de reacción con una caseta de separador magnético (MSS siglas).

- Los glóbulos dynabeads lavados se incuban con 40 ig de anticuerpo ?ß en 1 mL de PBS, 0.1% de BSA - La activación se efectúa mediante incubación durante la noche bajo agitación a 4°C.

- Los glóbulos dynabeads activados se lavan 4 veces 30 minutos (de nuevo utilizando la MSS) con 1 mL de solución amortiguadora para IP-lavado (PBS (NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4), 0.1% de BSA).

- Los glóbulos dynabeads activados se vuelven a suspender con 1 mL de PBS, 0.1% de BSA, 0.02% de Azida de sodio; se someten a acción de remolino y se centrifugan brevemente.

- Los glóbulos dynabeads activados con anticuerpo se almacenan a 4°C hasta uso posterior.

B: Preparación de las muestras utilizadas para inmunoprecipitación: 1: Oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) sin alquilación de yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) (4p) del ejemplo 4p con 50 µ? de 100 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, pH 8.6 (aireado 5 min con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 20 µ? de H20 - 6 horas de incubación a temperatura ambiente - diálisis durante la noche contra NaH2P04 5 mM, NaCI 35 mM, pH 7.4 en unidades para mini-diálisis más flotador Slide-A-Lyzer, MWCO de 3500 (Thermo Scientific, #69558) 2: Oliaómero (17C. 34C^ AB(16-35) con DTT v alauilación con yodoacetamida - se diluyen 2.5 µ? del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) (4p) del ejemplo 4p con 50 µ? de 100 mM Tris/HCI, EDTA 1 mM, DTT 2 mM, pH 8.6 (aireados con helio) - 20 min de incubación a 37°C - se agregan 20 µ? de solución 100 mM de yodoacetamida (Sigma; Cat.no.: 11 149) en HzO - 6 horas de incubación a temperatura ambiente - diálisis durante la noche contra NaH2P04 5 mM, NaCI 35 mM, pH 7.4 en unidades para mini-diálisis más flotador Slide-A-Lyzer, MWCO de 3500 (Thermo Scientific, #69558) C: Inmunoprecipitación (IP) - Las muestras B1 y B2 del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) se diluyen con NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM; 0.05% de Tween 20, pH 7.4 + 0.1% de BSA hasta una concentración final de 1 µg/ml. - 25 µ? de cada uno de los glóbulos dynabeads activados con anticuerpo de la siguiente lista se incuban con 0.1 mi de las muestras diluidas: • 10F11-Dynabead • 7C6-Dynabeads • lgG2a-Dynabeads (utilizados como un control de isotipo para el fondo de IP) • lgG2b-Dynabeads (utilizados como un control de isotipo para el fondo de IP) La inmunoprecipitacion se efectúa mediante 18 horas de incubación bajo agitación a 6°C.

- Los dynabeads se inmovilizan con la MSS.

- El sobrenadante se retira cuidadosamente y se desecha.

- Los dynabeads se lavan de la siguiente manera: • 2 veces 5 minutos con 500 µ? de NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4 + 0.1% de BSA; · 1 vez 3 minutos con 500 µ? de NaH2P042 mM, NaCI 14 mM, pH 7.4; • importante: después de la última remoción de la solución amortiguadora de lavado los frascos de reacción se centrifugan, se colocan de nuevo en la MSS y las gotas remanentes de fluido se retira cuidadosamente; • se agregan 10 µ? de CH3CN al 50%, TFA al 0.5% en H20 al frasco de reacción y se somete a acción de remolino; • los frascos de reacción se incuban 10 minutos a TA bajo agitación; • los glóbulos dynabeads se inmovilizan con la MSS; • el sobrenadante que comprende la especie de ?ß eluida ¡munoprecipitada se retira cuidadosamente (= IP-eluato).

D: Cuantificación del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) inmunoprecipitado mediante espectrometría de masas por ionización de desorción de láser incrementada en superficie (SELDI-MS) - Se aplican de manera puntiforme 2 µ? del IP-eluato en un arreglo de Chip de Proteína H4 (BioRad; No. de Catálogo C573-0028).

- Las manchas se dejan secar en una placa de incubadora caliente.

• Condiciones: intervalo de masas: 800 a 10000 Da; masas del foco: 2220 Da; atenuación de matriz: 500 Da; velocidad de muestreo: 400 MHz; disparos de calentamiento: 2 con energía: 1350 nj; disparos de datos: 10 con energía de 1300 nJoule; Partición 1 de 2.

• Análisis: se cuantifica la intensidad de pico de los picos de masas respectivos del péptido ?ß(16-35).

Los resultados se muestran en las figuras 10A y 10B.

El oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) es reconocido por los anticuerpos 7C6 y 10F11 específicos de epítope de globulómero ?ß. El nivel de fondo inespecífico durante la inmunoprecipitación se controla mediante los anticuerpos de control de isotipo lgG2a e lgG2b los cuales muestran una intensidad de señal significativamente más bajo en el análisis SELDI-MS (Figura 10A). Si el S-S covalente de la Cisteína S-S se reduce mediante DTT hasta -SH libre y se efectúa una reacción subsiguiente con yodoacetamida en el -SH libre, la IP subsiguiente revela que la conformación del oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) ha sido destruida ya que el péptido(17C, 34C) ?ß(16-35) con uno o dos grupos -SH alquilados (1 x o 2xCM) ya no es reconocido por 7C6 o 10F11. Sólo debido a reducción con DTT y/o reacción con yodoacetamida insuficientes, el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) no alquilado remanente con enlace covalente S-S de cisteína intacto (OxCM) se inmunoprecipita. En conclusión, el oligómero (17C, 34C) ?ß(16-35) contiene el epítope de globulómero ?ß mientras que u n péptido ( 1 7C, 34C) ?ß(1 6-35) Mnealizado no lo contiene.

EJ EMPLOS DE REFERENCIA Péptido N-Met ?ß (1 -42) recombinante Clonación y Expresión La secuencia que codifica para el péptido beta amiloide se clona y expresa en E. col¡ utilizando un vector pET29. El péptido expresado conserva completamente su residuo metionina N-terminal y representa la secuencia original del amiloide beta desde la posición 0 hasta la posición 42 (del interior de la Proteína Precursora de Amiloide, APP). El péptido se expresa utilizando células BL21 (DE3) de E. coli. Las células se cultivan a 30°C hasta q ue se alcanza u na D Oeoonm de cultivo de 0.45, después se induce la expresión de ?ß mediante adición de I PTG 1 mM , y los matraces se transfiere hacia un ag itador orbital a 41 °C . Las células se recolectan 3 horas después de la ind ucción . La fracción insoluble prod uce un prod ucto del tamaño esperado, tal como se visualiza en un gel de SDS-proteína teñido con tinción de Comassie.

Pu rificación de ?ß expresado en forma recombi nante El material de partida para todas las muestras aisladas es la pasta celu lar congelada a -80°C obtenida a partir de las cosechas de los cultivos de células de E. coli. La pasta de célula congelada se agrega a 5-10 volúmenes de solución amortiguadora para lisis (Tris 100 mM, pH final = 7.5) a 4°C. Se agrega Ben-zonasa, (EMD Biosciences, Madison, Wl) a una concentración de 0.1 µ?/ml de lisado celular y se agita hasta que el comprimido se vuelve a suspender uniformemente (45-60 min). La lisis celular se efectúa utilizando un microfluidizador M-110L (Microfluidics, Newton, PA). El material lisado a 15°C se centrifuga a 23000 x G en un rotor JLA 16.25 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) durante 30 minutos a 4°C. El material se lava tres veces agregando solución amortiguadora Tris 50 mM fría a pH 7.5 a 7.8 y después los comprimidos re-suspendidos se homogenizan y centrifugan a 23000 x G en un rotor JLA 16.25. Esto es seguido por un lavado con agua para eliminar la solución amortiguadora Tris. El comprimido se vuelve a suspender en agua que contiene 0.1% de ácido trifluoroacético. La muestra re-suspendida se congela en coraza y se coloca en un liofilizador.

Se agregan 10-20 g del material liofilizado a DMSO a 37°C y se homogeniza utilizando un homogenizador de tejido y se agita durante 1 hora después se deja reposar durante la noche. La muestra después se centrifuga en dos botellas Nalgene de 250 mL a 25°C durante 30 minutos, 23000 x G en un rotor JLA 16.25. El sobrenadante de DMSO se decanta y se agregan otros 50 mL de DMSO a cada botella, se homogeniza y centrifuga y después este DMSO se decanta y también se guarda. Los comprimidos se desechan.

El extracto de DMSO se vierte cuidadosamente en una membrana para diálisis con corte de 6000-8000, (Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA), suficiente para contener aproximadamente 1.5 L. Este se dializa contra 10 L de acetonitrilo al 15% al cual se han agregado 10 mi de amoniaco concentrado (0.1% v/v). Esto se deja dializar durante cuatro horas en la mesa de trabajo. Periódicamente, se saca la membrana de diálisis para redistribuir el DMSO denso y acelerar el proceso de diálisis. Al final de las cuatro horas, la membrana se coloca en un cambio nuevo de 10 L de solución amortiguadora y el proceso continúa durante otras dos horas. Al final de la diálisis, la muestra se retira y se centrifuga a 23000 x G durante 30 minutos a 25°C. La muestra se transfiere a un cilindro de 2 L y se diluye dos veces con amoniaco al 0.1% en agua hasta un volumen total tan grande como 2000 mi.

Se empaca manualmente una columna de acero inoxidable de 2.2 X 25 cm, (95 mi) con resina de fase inversa PLPR-S de 15-20 mieras, 300 A, de Polymer Labs (Amherst, MA). Esta se lleva a través de un ciclo de 75% de acetonitrilo + 0.1% de amoniaco, (75%B) y se equilibra hasta 10%B. la columna se conecta a una bomba Pharmacia P500 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), y se bombean 1400 mL de la solución del péptido a través de la columna durante la noche en la mesa de trabajo a temperatura ambiente a través de -16.7 horas. A la mañana siguiente, la columna se lava con la bomba P500 con aproximadamente 250 mL de 10%B y después se conecta a un aparato de HPLC de Beckman (Palo Alto, CA). El lavado se continúa con 10%B hasta que la absorbancia a 280 nm llega hasta la línea basal y después se inicia un gradiente desde 10%B hasta 30%B en el transcurso de 200 minutos (gradiente de 0.1%). La absorbancia a escala completa se mantiene a 1 unidad de absorbancia y el flujo a 5 mL/min. El material se recolecta manualmente en aproximadamente 50 fracciones de aproximadamente 10 mL. 100 uL de cada una de las fracciones se colocan en un concentrador speed vac, se secan y a los tubos se agregan 100 uL de solución amortiguadora para muestra 1X. El material se concentra en una membrana con corte de 3500 en una celda agitada Amicon (Millipore Inc, Billerica, CA) y se concentra desde -350 hasta 50 mL, después se liofiliza hasta sequedad durante la noche.

El péptido ?ß purificado producido presenta una masa observada de 4645 a 4648 Da. Esto es consistente con la presencia de metionina N-terminal como se esperaba a partir de la secuencia de expresión de ADN utilizada.

EJEMPLOS DE REFERENCIA EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Globulómero ABd-42 El péptido ?ß(1-42) sintético (H-1368, Bachem, Bubendorf, Suiza) se suspende en 1 ,1 ,1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) al 100% a 6 mg/mL y se incuba para solubilización completa bajo agitación a 37°C durante 1.5 horas. El HFIP actúa como un disociador de puente de hidrógeno y se utiliza para eliminar las inhomogeneidades estructurales pre-existentes en el péptido ?ß. HFIP se elimina mediante evaporación en un concentrador SpeedVac y ?ß(1-42) se vuelve a suspender a una concentración de 5 mM en sulfóxido de dimetilo y se le aplica energía sónica durante 20 segundos. El ?ß(1-42) pre-tratado con HFIP se diluye en solución salina regulada con fosfato (PBS) (NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4) hasta 400 µ? y se agrega 1/10 del volumen de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2% (en H20) (concentración final de 0.2% de SDS). Una incubación durante 6 horas a 37°C da como resultado al intermediario de globulómero ?ß(1-42) de 16/20-kDa. El globulómero ?ß(1-42) de 38/48-kDa se genera mediante una dilución adicional con tres volúmenes de H20 e incubación durante 18 horas a 37°C. Después de centrifugar a 3000 g durante 20 minutos la muestra se concentra mediante ultrafiltración (corte de 30-kDa), se dializa contra NaH2P04 5 mM, NaCI 35 mM, pH 7.4, se centrifuga a 10,000 g durante 10 minutos y se retira el sobrenadante que comprende al globulómero ?ß(1-42) de 38/48-kDa.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2 Globulómero N-Met ABCI-42) Se agitan 6 mg de péptido ß(1-42) amiloide de humano (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA) o péptido N-Met ?ß(1-42) recombinante + 2 X 500 µ? de HFIP (hexafluoroisopropanol) (suspensión de 6 mg/mL) en dos Eppitubos de 1.6 mi (porciones de 2 x 500 µ?) (Eppendorf Northamerica, Westbury, NY) durante 1.5 horas a 37°C, se secan en el concentrador speedvac durante 1.5 horas y después se vuelven a suspender en 2 alícuotas de 132 µ? cada una de DMSO, se les aplica energía sónica en un baño de agua durante 20 segundos, se agitan suavemente durante 10 minutos en un agitador de placa; y se almacenan a -20°C. Se colocan 690 µ? de solución amortiguadora de NaP0420 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4 en un tubo Falcon de 15 mi, se agregan 60 µ? de suspensión de reserva 5 mM de amiloide en DMSO (amiloide 400 µ?) y después 75 µ? de SDS al 2% en agua (0.2% de SDS). La mezcla se incuba durante 6-8 horas a 37°C y se agregan 2475 µ? de agua (dilución de 4 veces con agua) para un volumen final de 3.3 mi. La mezcla se incuba durante 18-20 horas a 37°C, se centrifuga 10 minutos a 3000 x G y por último el sobrenadante se concentra hasta 1 mi mediante Centriprep de 30 kDa (Millipore Inc, Billerica, CA). La muestra se dializa durante la noche en PBS/4 (PBS = solución salina regulada con fosfatos, KCI 1 mM, NaCI 154 mM, fosfato 4 mM, pH 7.4; PBS/4 = PBS diluida 1 a 4 con agua destilada, pH 7.4 final) a 4°C en una tubería para diálisis con corte de 12-15 kDa. El concentrado se centrifuga a 10,000 x G durante 10 minutos en un tubo de Eppendorff (comprimido transparente), se divide en alícuotas de 250 µ? y se congela a -20°C.

EJEMPLO DE REFERENCIA 3 Globulómero ABÍ20-42) Se mezclan 1.59 mi de la preparación de globulómero ?ß(1-42) del ejemplo de referencia 3 con 38 mi de solución amortiguadora (50 mM MES/NaOH, pH 7.4) y 200 µ? de una solución de termolisina de 1 mg/ml (Roche) en agua. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 20 horas. Después se agregan 80 µ? de una solución de EDTA 100 mM, pH 7.4, en agua y la mezcla se ajusta adicionalmente hasta un contenido de SDS de 0.01% con 400 µ? de una solución de SDS a una concentración de 1%. La mezcla de reacción se concentra hasta aproximadamente 1 mi a través de un tubo Centriprep 30 kDa de 15 mi. El concentrado se mezcla con 9 mi de solución amortiguadora (50 mM MES/NaOH, 0.02% de SDS, pH 7.4) y de nuevo se concentra hasta 1 mi. El concentrado se dializa a 6°C contra 1 litro de solución amortiguadora (fosfato de sodio 5 mM, NaCI 35 mM) en un tubo para diálisis durante 16 horas. El dializado se ajusta a un contenido de SDS de 0.1% con una solución de SDS a una concentración del 2% en agua. La muestra se centrifuga a 10,000 g durante 10 minutos y se retira el sobrenadante de globulómero ?ß(20-42).

EJEMPLO DE REFERENCIA 4 Globulómero ABM2-42) Se mezclan 2 mi de la preparación de globulómero ?ß(1- 42) del ejemplo de referencia 3 con 38 mi de solución reguladora (fosfato de sodio 5 mM, cloruro de sodio 35 mM, pH 7.4) y 150 µ? de una GluC endoproteinasa (Roche) a 1 mg/ml en agua. La mezcla de reacción se agita durante 6 horas a temperatura ambiente, y posteriormente se agregan otros 150 µ? de una GluC endoproteinasa (Roche) a 1 mg/ml en agua. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante otras 16 horas, seguido por adición de 8 µ? de una solución 5 M de DIFP. La mezcla de reacción se concentra hasta aproximadamente 1 mi a través de un tubo Centriprep de 30 kDa de 15 mi. El concentrado se mezcla con 9 mi de solución amortiguadora (fosfato de sodio 5 mM, cloruro de sodio 35 mM, pH 7.4) y de nuevo se concentra hasta 1 mi. El concentrado se dializa a 6°C contra 1 litro de solución amortiguadora (fosfato de sodio 5 mM, NaCI 35 mM) en un tubo para diálisis durante 16 horas. El dializado se ajusta hasta un contenido de SDS de 0.1% con una solución de SDS a una concentración de 1% en agua. La muestra se centrifuga a 10,000 g durante 10 minutos y se retira el sobrenadante del globulómero ?ß(12-42).

EJEMPLO DE REFERENCIA 5 Monómero de ABM-40) (NaOH al 0.1%) Se disuelve 1 mg de ?ß(1-40) (Bachem Inc., no. de cat. H-1 194) en 232.6 µ? de NaOH al 0.1% en H20 (recién preparada) (= 4.3 mg/ml = 1 nmol/1 µ?) e inmediatamente se agita durante 30 segundos a temperatura ambiente para obtener una solución clara. La muestra se almacena a -20°C para uso posterior.

EJEMPLO DE REFERENCIA 6 Monómero ABM-42) (NaOH al 0.1%) Se disuelve 1 mg de ?ß(1-42) (Bachem Inc., no. de cat. H-1368) en 222.2 µ? de NaOHal 0.1% en H20 (recién preparada) (= 4.5 mg/ml = 1 nmol/1 µ?) e inmediatamente se agita durante 30 segundos a temperatura ambiente para obtener una solución clara. La muestra se almacena a -20°C para uso posterior.

EJEMPLO DE REFERENCIA 7 Fibrillas de AS Se disuelve 1 mg de ?ß(1-42) (Bachem Inc., no. de Cat.: H-1368) en 500 µ? de NH4OH al 0.1% acuoso (tubo de Eppendorff) y la muestra se agita durante 1 minuto a temperatura ambiente. La muestra se centrifuga durante 5 minutos a 10,000 x g y se retira el sobrenadante. 100 µ? de esta solución de ?ß(1-42) recién preparada se neutralizan con 300 µ? de NaH2P04 20 mM¡ NaCI 140 mM, pH 7.4. El pH se ajusta a pH 7.4 con HCI al 1%. La muestra se incuba durante 24 horas a 37°C y se centrifuga (10 minutos a 10,000 x g). El sobrenadante se desecha y el comprimido de fibrillas se lava dos veces con 400 µ? de NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4 y por último después se vuelve a suspender con 400 µ? de NaH2P0 20 mM; NaCI 140 mM, pH 7.4 mediante acción de remolino durante 1 minuto.

EJEMPLO DE REFERENCIA 8 sAPPct Obtenida a partir de Sigma (no. de cat. S9564; 25 pg en NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4). La sAPPa se diluye con NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4, 0.2 mg/ml de BSA hasta 0.1 mg/ml (= 1 pmol/µ?).

EJEMPLO DE REFERENCIA 9 Antisuero policlonal 5599 El antisuero policlonal 5599 se obtiene en la misma manera que el antisuero policlonal 5600 descrito en el documento WO 2004/067561, Ejamplo 25a, Suero a1 5600, excepto que se utiliza de globulómero ?ß(20-42) en lugar del globulómero ?ß(20-42) conjugado con 5600 LPH.

Claims

REIVIN DICACIONES

1 .- U n análogo de péptido ß amiloide que comprende una secuencia de aminoácido , en donde la secuencia (i) forma un bucle , (ii) tiene por lo menos 66% de identidad con el péptido ?ß original de humano o una porción del mismo, (iii) comprende por los menos 6 resid uos de aminoácido contiguos y (iv) tiene por lo menos 2 residuos de aminoácido no contig uos los cuales están ligados cova lentemente uno al otro.

2.- Un análogo de péptido ß amiloide que comprende un peptidomimético de una secuencia de aminoácido, en donde la secuencia (i) forma un bucle, (ii) tiene por lo menos 66% de identidad con el péptido ?ß origi nal de humano o u na porción del mismo, (iii) comprende por los menos 6 residuos de aminoácido contiguos y (iv) tiene por lo menos 2 residuos de aminoácido no contiguos los cuales están ligados covalentemente uno al otro.

3 - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con la reivindicación 1 o 2 , en donde el bucle es un bucle de horquilla ß.

4.- El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el péptido ?ß original de h umano o la porción del mismo es ?ß(? .. Y) , X se selecciona a partir del g rupo que consiste de los n úmeros 1 .. 23, 1 5 .. 23, o 1 8 .. 22 y Y se selecciona a partir del g rupo que consiste de los n úmeros 28 .. 43, o 28 .. 43.

5.- El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los 6 residuos de aminoácido contiguos comprenden la secuencia VGSN o DVGSNK o AED.

6. - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia F19X2oA2i-Q-A3ol3 l32, en la que X2o representa un aminoácido y Q es una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia VGSN.

7. - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con la reivindicación 6, en donde por lo menos parte de la secuencia de aminoácido Q forma el bucle y las secuencias de aminoácido F19X20 21 y A30I31I32 están en orientación anti-paralela.

8. - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-368, por lo menos dos residuos de aminoácido de dicha secuencia están modificados para formar un enlazamiento covalente intra-secuencia.

9. - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide es una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 369-698, en las cuales Xi2 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X13 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X14 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X15 es glutamina, asparagina, metionina, serina, o un aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X 6 es lisina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X17 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X18 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; Xig es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X20 es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X21 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X22 es ácido glutámico, ácido aspártico, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X29 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X30 es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X31 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X32 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X33 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X34 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X35 es metionina, valina, leucina, isoleucina, alanina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X36 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X37 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X38 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; y X39 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia, por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 2, X13, Xi4, X15, X16, Xi7, Xi8> Xi9, ?S?, X21 y X22 y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29. X30. 3i> X32. X331 X34. X35, 361 X37. 381 X39 están ligados covalentemente entre sí.

10.- El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide comprende la secuencia X20-Q-X24X25 26X27X28 29A30I31, en la cada uno de X20. 24 X25, X26, X27, X28, X29 representa de manera independiente un aminoácido y Q es una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia AED.

11. - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con la reivindicación 10, en donde por lo menos parte de la secuencia de aminoácido X24 25 26 27 forma el bucle y las secuencias de aminoácido X 20 21E22D23 y 28 29A30I31 están en orientación antiparalela.

12. - El análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia de aminoácido del análogo de péptido ß amiloide es una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 699-960, en las cuales X 2 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X13 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X 4 es histidina, tirosina, serina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X15 es glutamina, asparagina, metionina, serina, o un aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X16 es Usina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X17 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X18 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X19 es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X2o es fenilalanina, tirosina, valina, leucina, isoleucina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X24 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X25 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X26 es serina, glicina, alanina, treonina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X27 es asparagina, glutamina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X28 es Usina, arginina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X29 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X3o es alanina, valina, glicina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X31 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X32 es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X33 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X34 es leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X35 es metionina, valina, leucina, isoleucina, alanina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X36 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X37 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; X38 es glicina, alanina, serina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia; y X39 es valina, leucina, isoleucina, alanina, metionina, o un residuo de aminoácido que está ligado covalentemente a otro residuo de aminoácido de la secuencia, por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X 2, X13, 14, X15, X-ie, X17, ?-?ß, X19, X20, y por lo menos un residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de X29, X30, X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38, X39 están ligados covalentemente entre sí.

13.- Un oligómero que comprende una pluralidad de análogos de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14.- Un procedimiento para preparar un análogo de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, cuyo procedimiento comprende (iii) proveer un péptido o peptidomimético del mismo; (iv) someter el péptido o peptidomimético a condiciones suficientes para la formación del enlazamiento.

15. - Un procedimiento para preparar un oligómero de conformidad con la reivindicación 13, cuyo procedimiento comprende (i) proveer un péptido o peptidomimético del mismo; (ii) someter el péptido o peptidomimético a condiciones 5 suficientes para la formación del oligómero y el enlazamiento.

16. - Una composición tal como una vacuna que comprende un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y opcionalmente un vehículo farmacéutico aceptable. 10

17.- El uso de un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para preparar una composición farmacéutica para inmunización activa para tratar o prevenir una amiloidosis tal como enfermedad de Alzheimer o la amiloidosis del Síndrome de Down. Í5

18.- El uso de un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para preparar una composición para diagnosticar una amiloidosis tal como enfermedad de Alzheimer o la amiloidosis del Síndrome de Down. 20

19.- Un método para identificar un agente que se puede unir a un análogo u oligómero de péptido ß amiloide de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, cuyo método comprende los pasos de: a) exponer uno o más agentes de interés al análogo u oligómero de péptido ß amiloide durante un tiempo y bajo 25 condiciones suficientes para que dichos uno o más agentes se una(n) al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; y b) identificar a aquellos agentes que se unan al análogo u oligómero de péptido ß amiloide.

20.- U n método para proveer un anticuerpo q ue se pueda unir a u n análogo u oligómero de péptido ß amiloide de conformidad con cualqu iera de las reivindicaciones 1 a 1 3, que comprende i) proveer un antígeno que comprende al análogo u oligómero de péptido ß amiloide; ii) exponer un repertorio de anticuerpos a dicho antígeno; y iii) seleccionar a parti r de dicho repertorio un anticuerpo que se u ne al análogo u oligómero de péptido ß amiloide.