BR112017000428B1

BR112017000428B1 - Produto imunogênico com base em sequências de aminoácidos muteína amiloide beta, composição compreendendo o produto e uso do mesmo para tratar ou prevenir amiloidose

Info

Publication number: BR112017000428B1
Application number: BR112017000428-3A
Authority: BR
Inventors: Stefan Barghorn; Heinz Hillen; Andreas Striebinger; Simone Giaisi
Original assignee: AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2024-05-07

Abstract

?PRODUTOS IMUNOGÊNICOS COM BASE EM SEQUÊNCIAS DE AMINO ÁCIDOS MUTEÍNA B (AB) AMILOIDE E USO DOS MESMOS? A presente invenção refere-se a produtos imunogênicos com base em se-quências de amino ácido muteína amiloide β(Aβ), em particular a oligômeros de Aβ muteínas e ao uso dos referidos produtos em diagnóstico, tratamento e prevenção de condições tais como amiloidoses e para identificar agentes capazes de se ligar aos referidos produtos.

Description

Listagem de Sequência

[001]O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 27 de Agosto de 2015, é nomeada ABV12075WOO1_SL.txt e é de tamanho de 14,095 bytes.

Campo da Invenção

[002]A presente invenção se refere a produtos imunogênicos com base em sequências de aminoácidos muteína β (Aβ) amiloide, em particular a oligômeros de muteínas Aβ e ao uso dos referidos produtos em diagnóstico, tratamento e prevenção de condições tais como amiloidoses e para identificar agentes capazes de se ligar aos referidos produtos.

Antecedentes da invenção

[003] Doença de Alzheimer (AD) é uma desordem neurodegenerativa caracte-rizada por uma perda progressiva de habilidades cognitivas e por funcionalidades neu- ropatológicas características que compreendem depósitos de peptídeo beta amiloide (Aβ), emaranhados neurofibrilares e perda neuronal em diversas regiões do cérebro (Hardy e Selkoe, Science 297: 353, 2002; Mattson, Nature 431: 7004, 2004. Depósitos amiloides cerebrais e danos cognitivos muito similares aos observados em Doença de Alzheimer são também marcas da Síndrome de Down (trissomia 21), o que ocorre a uma frequência de erca de 1 em 800 nascimentos.

[004]O peptídeo Aβ surge a partir da proteína precursora de amiloide (APP) por processamento proteolítico. O referido processamento é efetuado pela atividade cooperativa de diversas proteases chamadas α-, β- e Y-secretase e leva a um número de fragmentos específicos de diferentes comprimentos. Os depósitos de peptídeo Aβ consistem em sua maioria de peptídeos com um comprimento de 40 ou 42 aminoáci- dos (Aβ (1-40), Aβ (1-42)). A referida proteína, que tenda a polimerizar em um ambiente aquoso, pode estar presente em formas moleculares muito diferentes que incluem as formas insolúveis, tal como Fibrilas Aβ, assim como as formas solúveis, tal como oligômeros Aβ.

[005] Uma simples correlação da deposição de proteína insolúvel com a ocor-rência ou a progressão de desordens de demência tal como, por exemplo, Doença de Alzheimer, provou não ser convincente (Terry et al., Ann. Neurol. 30: 572-580, 1991; Dickson et al., Neurobiol. Aging 16: 285-298, 1995). De modo diferente, a perda de sinapses e da percepção cognitiva parece estar melhor correlacionada com as formas Aβ solúveis (Lue et al., Am J Pathol 155: 853-862, 1999; McLean et al., Ann Neurol 46: 860-866, 1999).

[006]Os oligômeros Aβ solúveis foram gerados sinteticamente (Barghorn et al., J Neurochem 95: 834-847, 2005), coletados a partir de culturas celulares transfec- tadas com APP (Walsh et al., Nature 416: 535-539, 2002) e isolados a partir do cérebro de camundongos transgênicos para APP (Lesne et al., Nature 440: 352-357, 2006). WO 2004/067561 se refere a oligômeros globulares ("globulômeros") de peptídeo Aβ (1-42) e um processo para a preparação dos mesmos. WO 2006/094724 se refere a oligômeros globulares Aβ (X - 38 .. 43) não difusíveis em que X é selecionado a partir do grupo que consiste de números 1.. 24. WO 2004/067561 e WO 2006/094724 adi-cionalmente descrevem que a proteólise limitada dos globulômeros produz versões truncadas dos referidos globulômeros tal como o globulômero Aβ (20-42) ou o globu- lômero Aβ (12-42). WO 2007/064917 descreve a clonagem, expressão e isolamento das formas recombinantes de peptídeo β amiloide (referido daqui em diante como N- Met Aβ (1-42)) e as formas globuloméricas dos mesmos.

[007]Os dados sugerem a existência de um trajeto independente de fibrila ami- loide da duplicação de Aβ e montagem em oligômeros Aβ que exibem um ou mais epítopos únicos (daqui em diante referido como os epítopos de globulômero). Os re-feridos epítopos de globulômero foram detectados no cérebro de pacientes com AD e ratos transgênicos para APP e globulômero Aβ foi observado se ligar especificamente a neurônios e de bloquear a potenciação a longo prazo do hipocampo. Foi observado que globulômero Aβ solúvel exerce os seus efeitos prejudiciais por interação com o canal de cálcio pré-sináptico do tipo P/Q e que os inibidores dessa interação são por-tanto uteis para o tratamento de amiloidoses tais como Doença de Alzheimer (WO 2008/104385).

[008]Anticorpos monoclonais capazes de discriminar entre globulômeros Aβ solúveis e outras espécies de Aβ tais como monômeros e fibrilas foram descritos an-teriormente, por exemplo, em WO 2007/062852. Anticorpos monoclonais seletivos para globulômeros Aβ foram mostrados evitar os efeitos patológicos dos oligômeros Aβ in vitro e in vivo (Hillen et al., J Neurosci 30(31): 10369-10379, 2010). Os referidos resultados indicam que anticorpo-efetuou a neutralização dos globulômeros Aβ é efi-ciente em um modelo de AD pré-clínico e pode assim também ser eficiente no trata-mento e prevenção de AD e de outras amiloidoses.

[009]Além dos anticorpos monoclonais anti-Aβ para a imunização passiva, o uso de preparações de Aβ para a imunização ativa for um assunto de pesquisa de AD. Os resultados da referida pesquisa corroboram que o índice terapêutico de uma vacina de oligômero Aβ é dependente de sua capacidade de suscitar respostas imunes que são específicas para as espécies Aβ patogênicas. A importância da especificidade é corroborada pelos resultados de estudos anteriores de vacinação. O uso de Aβ pré-agregada (1-42) em um estudo clínico de imunização ativa em pacientes com Alzheimer, por exemplo, resultou em consideráveis efeitos colaterais (meningoence- falite, hemorragias) em alguns dos pacientes uma vez que os anticorpos formados também reconheceram as formas Aβ (1-42) presumivelmente necessárias para o re-vestimento celular, o que resultou em reações inflamatória (D. Schenk.; Nat. Rev. Neurosci. 3, 824-828 (2002)).

[010]Uma vacina de oligômero Aβ deve evidentemente não só evitar suscitar ligação de auto-anticorpos a outras formas de Aβ diferentes das patogênicas mas em geral não devem induzir a formação de auto-anticorpos que são capazes de reações cruzadas patogênicas. Em determinados casos, entretanto, foi observado que os an-ticorpos monoclonais identificados usando preparações de oligômeros Aβ do tipo sel-vagem podem exibir reatividade cruzada ao fator plaquetário 4 (PF-4). PF-4 se liga a heparina, assim formando neo-epítopos. Isso pode suscitar uma resposta imune que resulta em uma necessária desordem trombótica conhecida como trombocitopenia in-duzida por heparina (HIT). A HIT é conhecida por ser engatilhada por tratamento com heparina. No entanto, os sintomas de HIT, trombocitopenia e trombose, assim como auto-anticorpos anti-PF-4 têm também sido observado em pacientes sem administra-ção anterior de heparina (Warkentin et al., Am J Med 121 (7): 632-6, 2008).

[011]Existe uma tremenda, necessidade terapêutica não alcançada para o de-senvolvimento de uma vacina de oligômero Aβ que é eficaz contra Doença de Alzheimer e desordens relacionadas, ao mesmo tempo em que não induz efeitos colaterais letais e potencialmente negativos tal como respostas patológicas autoimunes no corpo do paciente. A referida necessidade é particularmente evidente em vista de aumentar a longevidade da população em geral e, com esse aumento, uma elevação associada no número de pacientes anualmente diagnosticado com Doença de Alzheimer ou de-sordens relacionadas.

Sumário da presente invenção

[012]A presente invenção vai de encontro a referida necessidade por propor-cionar um novo produto imunogênico que é capaz de suscitar um antissoro que espe-cificamente se liga a epítopos de globulômero Aβ, mas tem nenhuma ou baixa reativi- dade cruzada ao fator plaquetário 4 (PF-4). Assim sendo o novo produto imunogênico compreende um ou mais epítopos que são reconhecidos por anticorpos específicos de globulômero. Anticorpos monoclonais que se ligam aos referidos epítopos incluem 7C6, 4D10 e 5F7 que foram descritos em WO 2007/062852 e podem ser obtidos a partir dos hibridomas designados por números de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240, PTA-7405 e PTA-7241, respectivamente.

[013]Assim, a presente invenção proporciona um produto imunogênico que compreende uma sequência de aminoácido β (Aβ) amiloide tendo 62,5% ou identidade superior à sequência de aminoácido

[014]V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G29A30I31I32G33 [SEQ ID NO:2; Aβ (18-33)],

[015]em que o produto i)é reativo com um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpo monoclonal 7C6 que pode ser obtido a partir de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240; anticorpo monoclonal 4D10 que pode ser obtido a partir de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405, ou anticorpo monoclonal 5F7 que pode ser obtido a partir de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA- 7241; e ii)é capaz de suscitar um antissoro policlonal que tem nenhuma ou pouca re- atividade cruzada ao fator plaquetário 4 (PF-4)

[016]A presente invenção também se refere a uma composição que compre-ende um produto imunogênico como descrito aqui.

[017]A presente invenção adicionalmente se refere a um método de tratar ou evitar uma amiloidose em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar um produto imunogênico como descrito aqui ao indivíduo. Em um aspecto relacionado, a presente invenção se refere a um produto imunogênico como descrito aqui para uso em tratar ou evitar uma amiloidose.

[018]A presente invenção também se refere a um método de diagnosticar uma amiloidose que compreende proporcionar uma amostra a partir do indivíduo com suspeita de ter a amiloidose, colocar em contato a amostra com um produto imunogênico como descrito aqui por um tempo e sob condições suficientes para a formação de um complexo que compreende o produto e um anticorpo, a presença do complexo indicando que o indivíduo tem a amiloidose. Em um aspecto relacionado, a presente invenção se refere a um produto imunogênico como descrito aqui para uso em diagnosticar uma amiloidose.

[019]A presente invenção também se refere a um método de identificar um agente capaz de se ligar a um produto imunogênico como descrito aqui, cujo método compreende as etapas de: a) expor um ou mais agentes de interesse ao produto por um tempo e sob condições suficientes para os um ou mais agentes se ligarem ao produto; e b) identificar os referidos agentes que se ligam ao produto.

[020]Em um aspecto relacionado, a presente invenção proporciona um método de proporcionar um anticorpo capaz de se ligar a um produto imunogênico como descrito aqui, que compreende i)proporcionar um antígeno que compreende o produto; ii)expor um repertório de anticorpo ao referido antígeno; e iii)selecionar a partir do referido repertório um anticorpo que se liga ao produto.

[021]A presente invenção adicionalmente se refere a uma molécula que com preende uma sequência de aminoácido idêntica à porção (X-Y) de uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de: D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18A19F20A21E22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:13; Aβ(1-43)F19A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19A20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:14; Aβ(1-43)F20A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:15; Aβ(1-43)E22A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21F22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:16; Aβ(1-43)E22F]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21V22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:17; Aβ(1-43)E22V]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21L22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:18; Aβ(1-43)E22L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22K23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:19; Aβ(1-43)D23K]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22L23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:20; Aβ(1-43)D23L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24V25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:21; Aβ(1-43)G25V]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G2 9G30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:22; Aβ(1-43)A30G]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19G20A21A22D23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:23; Aβ(1-43)F20G E22A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19A20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30A31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:24; Aβ(1-43)F20A I31A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19C20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30C31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:25; Aβ(1-43)F20C I31C]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20Q21L22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:26; Aβ(1-43)A21Q E22L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20L21Q22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:27; Aβ(1-43)A21L E22Q]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20Q21E22N23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:28; Aβ(1-43)A21Q D23N]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24A25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:29; Aβ(1-43)E22A G25A]; e D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25A26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:30; Aβ(1-43)E22A S26A],

[022]com X sendo selecionado a partir do grupo que consiste dos números 1.. 18, 4 .. 18, 12 .. 18, ou é 18 e Y sendo selecionado a partir do grupo que consiste dos números 33 .. 43, 33 .. 42, 33 .. 41, ou 33 .. 40; ou um derivado de ligação cruzada dos mesmos, em que pelo menos 2 resíduos não contíguos da sequência de amino- ácido são covalentemente ligados um com o outro.

Breve Descrição das Figuras

[023]A figura 1 mostra um cromatograma de exclusão de tamanho (SEC) em Superose 12 HR 10/300 GL de A) globulômero Aβ (20-42) de tipo selvagem; B) oligô- mero de muteína Aβ E22A truncado; e C) oligômero de muteína Aβ F20G E22A trun-cado.

[024]A figura 2 é uma tabela indicando se as formas truncadas dos oligômeros de muteína Aβ listados foram observados ser reativos com globulômero Aβ (20-42) reativo de murino, anticorpos monoclonais m7C6 e m4D10 em um ELISA (+++: forte reatividade; ++: boa reatividade; +: moderada reatividade; +/-: nenhuma ou pouca re- atividade).

Descrição Detalhada da Invenção

[025]A não ser que de outro modo definido aqui, os termos técnicos e científi-cos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. O significado e o âmbito dos termos deve ser claro, entretanto, no evento de qualquer ambiguidade latente, as de-finições proporcionadas aqui têm precedência em relação a qualquer definição de di-cionário ou extrínseca. Ademais, a não ser que seja de algum modo necessário pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. No presente pedido, o uso de "ou" quer dizer "e/ou", a não ser que determinado de outro modo. Ademais, o uso do termo "que inclui", assim como de outras formas, tal como "inclui" e "incluído", não é limitante. Também, termos tais como "elemento" ou "componente" engloba não só os elementos mas também os componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que com-preendem mais do que uma subunidade a não ser que especificamente determinado de outro modo.

[026]Em geral, nomenclaturas usadas em conexão com e técnicas de, cultura celular e de tecido, a biologia molecular, imunologia, microbiologia, genéticas, proteína e química de ácido nucleico e hibridização descritos aqui são os bem conhecidos e comumente usados na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são em geral realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e dis-cutidas através da presente especificação a não ser que indicado de outro modo. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. As nomenclaturas usadas em conexão com e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e medicinal e química farma-cêutica descritos aqui são os bem conhecidos e comumente usados na técnica. As técnicas padrão são usadas para as sínteses químicas, as análises químicas, as pre-parações farmacêuticas, a formulação e envio e o tratamento de pacientes.

[027]A presente invenção proporciona um produto imunogênico que é por um lado reativo com anticorpos que se ligam a epítopos de globulômero tal como o anti-corpo monoclonal 7C6, o anticorpo monoclonal 4D10, ou o anticorpo monoclonal 5F7 e por outro lado é capaz de suscitar um antissoro policlonal que tem nenhuma ou pouca reatividade cruzada a PF-4. [1]PF-4 é uma pequena citocina de 70-aminoácido que pertence à família das quimiocinas CXC e é também conhecida como quimiocina (C-X-C motivo) ligante 4 (CXCL4). PF-4 é liberada a partir de alfa-grânulos de plaquetas ativadas durante a agregação plaquetária e promove coagulação do sangue por moderar os efeitos de moléculas similares a heparina. Em virtude das referidas funções, é previsto estar envolvida no reparo de lesão e inflamação (Eisman et al., Blood 76(2): 336-44, 1990). PF-4 é em geral obaservada em um complexo com proteoglicano e pode formar complexos com a anticoagulante heparina que está em uso como um tratamento farmacológico de trombose. A mesma tem uma função patológica bem descrita trombocito- penia induzida a heparina (HIT), uma reação autoimune idiossincrática para a administração do anticoagulante heparina (Warkentin, N. Engl. J. Med. 356(9): 891-3, 2007), em que o complexo de heparina:PF4 é o antígeno. Auto-anticorpos PF4 foram também observados em pacientes com trombose e características que se assemelham a HIT mas nenhuma administração anterior de heparina (Warkentin et al., Am. J. Med. 121 (7): 632-6, 2008). Trombocitopenia induzida a heparina é caracterizada pelo desenvolvimento de trombocitopenia (uma contagem plaquetária baixa) e adicio-nalmente a HIT predispõe a trombose. Em vista das referidas funções e o envolvi-mento de PF-4 em processos patológicos, pode ser concluído que a administração de antígenos (por exemplo, vacinas) que suscitam um antissoro policlonal que mostra uma ligação (por exemplo, reatividade cruzada) à PF-4 presente em um indivíduo pode afetar as referidas funções de PF-4 e assim resultar em efeitos adversos (colaterais). O grau e a natureza dos referidos efeitos adversos pode variar dependendo dos parâmetros tais como o local e o tamanho do epítopo na PF-4, resistência da ligação e natureza do respectivo antissoro.

[028]O produto imunogênico da presente invenção é capaz de suscitar um antissoro policlonal que tem nenhuma ou pouca reatividade cruzada ao fator plaque- tário 4 (PF-4). Assim, o desenvolvimento de reações adversas tal como HIT que deve resultar a partir de imunização com produtos tendo reatividade cruzada a PF-4 pode ser evitado quando se usa o produto imunogênico da presente invenção para a imu-nização ativa de um indivíduo.

[029]Em um aspecto da presente invenção, o antissoro policlonal tendo ne-nhuma ou pouca reatividade cruzada a PF-4 suscitado pelo produto imunogênico des-crito aqui é um antissoro policlonal a partir de um rato ou um coelho. Preferivelmente, o antissoro policlonal é um antissoro purificado por afinidade enriquecido em anticorpos que se ligam ao produto.

[030]Em diferentes aspectos da presente invenção, a PF-4 é selecionada a partir de uma PF-4 em plasma de cinomolgo e a PF-4 em plasma humano.

[031]A capacidade de um produto imunogênico de suscitar um antissoro poli- clonal que tenha nenhuma ou pouca reatividade cruzada ao fator plaquetário 4 (PF-4) pode ser testada usando métodos padrão bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o produto imunogênico pode ser usado para imunizar um rato ou um coelho de modo a subsequentemente obter um antissoro policlonal dos mesmos. Como em geral co-nhecido, entre antissoros individuais podem haver variações com relação a quantidade de anticorpos elevados contra o produto imunogênico usado para imunização. De modo a evitar resultados falsos negativos no teste para reatividade a PF-4, o an- tissoro policlonal pode ser, portanto, enriquecido em anticorpos ligação ao produto imunogênico. O referido enriquecimento pode ser alcançado usando métodos padrão de purificação por afinidade que, por exemplo, compreendem imobilizar o produto imu- nogênico em um veículo sólido (por exemplo, contas de sefarose), colocar em contato o veículo com o antissoro tal como para permitir a ligação de anticorpos ao produto imunogênico imobilizado e eluir os anticorpos ligados a partir do veículo (por exemplo, usando um tampão de elução acídico), em que o eluado é o antissoro purificado por afinidade enriquecido em anticorpos que se ligam ao produto imunogênico. Se o pro-duto imobilizado é um (truncado) oligômero de muteína Aβ a muteína Aβ compreendida no produto imunogênico pode opcionalmente ser adicionalmente imobilizada no veículo em forma monomérica de modo a garantir que todos os anticorpos anti-Aβ são purificados por afinidade que potencialmente podem também se ligar às formas Aβ não oligoméricas tais como as formas monoméricas ou fibrilares.

[032] Em um aspecto específico da presente invenção, a reatividade cruzada é determinada como a ligação do antissoro policlonal ao plasma PF-4, com o antissoro policlonal sendo imobilizado, por exemplo, por ligação ao anticorpo anti-lgG imobili-zado. A PF-4 ligada pode ser detectada como um anticorpo anti-PF-4 ligado a referida PF-4. O anticorpo anti-PF-4 pode ser um anticorpo monoclonal ou um antissoro poli- clonal e em particular é reativo com PF-4 tendo a sequência de aminoácido EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAP LYKKIIKKLLES (SEQ ID NO:12). O anticorpo anti-PF-4 pode ser um anticorpo marcado e a detecção é medindo o sinal gerado pela marcação. Alternativamente, o anticorpo anti-PF-4 ligado pode ser detectado como um anticorpo marcado anti-lgG ligado um anticorpo anti-PF-4 e a detecção é medindo o sinal gerado pela marcação.

[033] De acordo com outra modalidade particular, a reação cruzada a PF-4 de antissoros suscitada pelo produto imunogênico da presente invenção se refere a uma relação de valores de AUC para os referidos antissoros e um anticorpo anti-PF-4 de referência obtido por (i) realizar uma ELISA do tipo sanduíche alinhada com plasma humano ou de cinomolgo e séries de diluições de proteína de ligação e anticorpo anti- PF-4 de referência, (ii) traçar o sinal detectado (eixo y) contra concentrações de log transformado de antissoro ou anticorpo anti-PF-4 de referência (eixo x) e (iii) determinar a área sob a curva (AUC, ou área de pico total) a partir dos referidos dados adaptados de não curva na faixa medida.

[034] Um "anticorpo anti-PF-4 de referência", como usado aqui, é um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal, que é especificamente reativo com PF- 4, em particular (HPF4) humano. O referido anticorpo pode ser obtido por proporcionar um antígeno que compreende PF-4 humano, por exemplo, PF-4 humano tendo sequência de aminoácido EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICL DLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ ID NO:12), expor um repertório de anticorpo ao referido antígeno e selecionar a partir do referido repertório de antígeno um anticorpo que se liga especificamente a PF-4 humano. O anticorpo pode opcionalmente ser purificado por afinidade usando o imunogênio (PF-4 humano). Such anticorpos anti-PF4 de referência são oferecidos no comércio, por exemplo, anticorpo anti-HPF4 monoclonal, Abcam cat no.: ab49735.

[035]Em um aspecto particular da presente invenção, o produto imunogênico descrito aqui é capaz de suscitar um antissoro policlonal tendo a reatividade cruzada a PF-4 que é pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 00000 vezes menor do que a reatividade cruzada de um anticorpo anti-PF-4 de referência a PF-4.

[036]Adicionalmente, os produtos imunogênicos da presente invenção são ca-racterizados por sua reatividade com anticorpos particulares. Os referidos anticorpos incluem em anticorpos particulares que se ligam a epítopos de globulômero, em par-ticular anticorpos tendo uma afinidade de ligação a um globulômero Aβ (20-42) que é maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a um globulômero Aβ (1 -42).

[037]Anticorpos tendo uma afinidade de ligação a um globulômero Aβ (20-42) que é maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a um globulômero Aβ (142) são descritos em WO 2007/062852, que são incorporados aqui por referência e incluem, por exemplo, um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste de 7C6, 4D10 und 5F7.

[038]Assim, de acordo com uma modalidade da presente invenção, o produto imunogênico da presente invenção é reativo com um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpo monoclonal 7C6 que pode ser obtido a partir de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240; ou anticorpo monoclonal 4D10 que pode ser obtido a partir de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405, ou anticorpo monoclonal 5F7 que pode ser obtido a partir de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7241.

[039]Em um aspecto da presente invenção, o anticorpo monoclonal 7C6 se liga ao produto imunogênico descrito aqui com alta afinidade, por exemplo, com a KD de 1 x10-6 M ou maior afinidade ou com a KD de 1 x10-7 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-8 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-8 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-9 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10- 9 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-10 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-10 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-11 M ou maior afinidade, ou com a KD de 1x10-11 M ou maior afinidade.

[040] Em outro aspecto da presente invenção, o anticorpo monoclonal 4D10 se liga ao produto imunogênico descrito aqui com alta afinidade, por exemplo, com a KD de 1 x10-6 M ou maior afinidade ou com a KD de 1 x10-7 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-8 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-8 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-9 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10- 9 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-10 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-10 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-11 M ou maior afinidade, ou com a KD de 1x10-11 M ou maior afinidade.

[041] Em ainda outro aspecto da presente invenção, o anticorpo monoclonal 5F7 se liga ao produto imunogênico descrito aqui com alta afinidade, por exemplo, com a KD de 1 x10-6 M ou maior afinidade ou com a KD de 1 x10-7 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-8 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-8 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-9 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-9 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-10 M ou maior afinidade, com a KD de 1 x10-10 M ou maior afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-11 M ou maior afinidade, ou com a KD de 1x10-11 M ou maior afinidade.

[042]Os produtos imunogênicos da presente invenção que reagem com anti-corpos específicos de globulômero acredita-se que exibam pelo menos um epítopo de globulômero. Portanto, os produtos imunogênicos da presente invenção são capazes de suscitar uma resposta imune tendo um perfil similar que o da resposta imune suscitada quando os globulômeros Aβ (20-42) ou outro globulômeros truncados são usados como imunogênio.

[043]O termo "epítopo" inclui qualquer polipeptídeo determinante capaz de li-gação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em determinadas modalidades, determinantes de epítopos incluem os agrupamentos quimicamente ati-vos em superfície de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar , fosforila, ou sulfonila, e, em determinadas modalidades, pode ter características es-truturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por uma proteína de ligação, em particular por um anticorpo. Em determinadas modalidades, a proteína de ligação ou um anticorpo é dito especificamente se ligar a um antígeno quando o mesmo preferi-velmente reconhece o seu antígeno alvo em uma complexa mistura de proteínas e/ou macromoléculas.

[044]De acordo com uma modalidade particular, os produtos imunogênicos da presente invenção são caracterizados por sua capacidade de suscitar a referida resposta imune particular, por exemplo, se um mamífero, por exemplo, um coelho ou um rato, é imunizado com um produto imunogênico da presente invenção.

[045] Uma resposta imune pode ser vista como uma mistura de anticorpos que resulta a partir de desafiar (imunização) um hospedeiro com um antígeno (o imunogê- nio). A referida mistura de anticorpos pode ser obtida a partir do hospedeiro e é aqui referido como o antissoro policlonal.

[046]Em um aspecto, a referida resposta imune particular, isto é, o antissoro policlonal correspondente, é caracterizada por compreender um anticorpo tendo uma afinidade de ligação a um produto imunogênico da presente invenção ou a um globu- lômero Aβ que é maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a pelo menos uma forma de Aβ selecionada a partir do grupo que consiste de Aβ (1-42) monoméri- cas, Aβ (1-40) monoméricas, Aβ (20-42) monoméricas, Aβ (1-42) fibrilomérica e Aβ (1-40) fibrilomérica e preferivelmente a todas as referidas formas de Aβ.

[047]De acordo com uma modalidade particular, a resposta imune, isto é, o antissoro policlonal correspondente, é caracterizado por ter uma afinidade a um produto imunogênico da presente invenção ou a um globulômero Aβ que é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 100000 vezes maior do que uma afinidade de ligação do antissoro to pelo menos uma forma de Aβ selecionado a partir do grupo que consiste de monoméricas Aβ (1- 42), Aβ (1-40) monoméri- cas, Aβ (20-42) monoméricas, Aβ (1-42) fibrilomérica e Aβ (1-40) fibrilomérica e preferivelmente a todas as referidas formas de Aβ.

[048]Em aspectos relacionados da presente invenção, o referido globulômero Aβ é selecionado a partir do grupo que consiste de um globulômero Aβ (1-42), um globulômero Aβ (12-42) e um globulômero Aβ (20-42).

[049]Como usado aqui, a elipse A .. B denota o conjunto que compreende todos os números naturais a partir de A a B, que incluem ambos, por exemplo, "17 .. 20" assim denota o grupo dos números 17, 18, 19 e 20. O hífen denota uma sequência de aminoácidos contíguos, isto é, "X - Y" compreende a sequência a partir de amino- ácido X para aminoácido Y, que inclui ambos. Assim, "A .. B - C .. D" compreende todas as possíveis combinações entre membros dos referidos dois conjuntos, por exemplo, "17 .. 20 - 40 .. 42" compreende todos os a seguir: 17 - 40, 17 - 41, 17 - 42, 18 - 40, 18 - 41, 18 - 42, 19 - 40, 19 - 41, 19 - 42, 20 - 40, 20 - 41 e 20 - 42. A não ser que determinado de outro modo, todos os números se referem ao início do peptídeo maduro, 1 indicando o aminoácido N-terminal.

[050]O termo "Aβ (X-Y)" como usado aqui se refere a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido a partir de posição X do aminoácido to posição Y do aminoácido da proteína beta amiloide humana (Aβ) que inclui ambos X e Y, em parti-cular à sequência de aminoácido a partir de posição X do aminoácido to posição Y do aminoácido da sequência de aminoácido D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO:1) (que corresponde às posições de aminoácido 1 a 43 da proteína Aβ humana), ou a muteína dos mesmos.

[051]O termo "monômero Aβ (X-Y)" ou " Aβ (X-Y) monomérica" aqui se refere à forma isolada do peptídeo Aβ (X-Y), preferivelmente a forma do peptídeo Aβ (X-Y) que não é engatado em interações essencialmente não covalente com outros peptí- deos Aβ. Praticamente, o monômero Aβ (X-Y) é em geral proporcionado na forma de uma solução aquosa. Em uma modalidade particularmente preferida da presente in-venção, a solução de monômero aquoso contém 0,05% a 0,2%, mais preferivelmente cerca de 0,1 % de NH4OH. Em outra modalidade particularmente preferida da presente invenção, a solução de monômero aquoso contém 0,05% a 0,2%, mais preferivelmente cerca de 0,1 % de NaOH. Quando usado (por exemplo, para determinar as afinidades de ligação dos anticorpos da presente invenção), pode ser interessante se diluir a referida solução em um modo adequado. Adicionalmente, é em geral conveniente se usar a referida solução dentro de 2 horas, em particular dentro de 1 hora e especialmente dentro de 30 minutos após a sua preparação.

[052] Mais especificamente, o termo "monômero Aβ (1-40)" aqui se refere a uma preparação de monômero Aβ (1-40) preparação como descrito no exemplo de referência 1 aqui e o termo "monômero Aβ (1-42)" aqui se refere a uma preparação de Aβ (1-42) como descrito no exemplo de referência 2 aqui.

[053]O termo "fibrila" aqui se refere a uma estrutura molecular que compreende conjuntos de peptídeos não covalentemente associados, de Aβ (X-Y) individuais, que mostram estruturas fibrilares no microscópio eletrônico, que ligam Congo vermelho e então exibem birrefringência sob luz polarizada e cujo padrão de difração de raio X é uma β cruzada.

[054]Em outro aspecto da presente invenção, a fibrila é uma estrutura molecular que pode ser obtida por um processo que compreende a agregação polimérica auto-induzida de um peptídeo Aβ adequado na ausência de detergentes, por exemplo, em 0,1 M HCI, o que leva à formação de agregados de mais do que 24, preferivelmente mais do que 100 unidades. O referido processo é bem conhecido na técnica. Convenientemente, fibrilas Aβ (X-Y) são usadas na forma de uma solução aquosa. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a solução de fibrila aquosa é produzida por dissolver o peptídeo Aβ em 0,1 % de NH4OH, diluindo o mesmo 1:4 com 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4, seguido por reajustar o pH a 7.4, incubar a solução a 37°C por 20 h, seguido por centrifugação a 10,000 g por 10 min e ressuspensão em 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4.

[055]O termo "fibrila de Aβ (X-Y)" aqui se refere a uma fibrila que consiste essencialmente de subunidades Aβ (X-Y), onde é preferido se em média pelo menos 90% das subunidades são do tipo Aβ (X-Y), mais preferido se pelo menos 98% das subunidades são do tipo Aβ (X-Y) e ainda mais preferido se o teor de peptídeos não- Aβ (X-Y) for abaixo do limiar de detecção.

[056] Mais especificamente, o termo "fibrila Aβ (1-42)" aqui se refere a uma preparação de fibrila Aβ (1-42) como descrito no exemplo de referência 6 aqui.

[057]Em outro aspecto, a referida resposta imune é caracterizada por compre-ender um anticorpo tendo uma afinidade de ligação a um produto imunogênico da presente invenção ou a um globulômero Aβ (20-42) que é maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a um globulômero Aβ (1-42) ou globulômero Aβ (12-42).

[058]Assim sendo, em um aspecto adicional da presente invenção, o produto imunogênico descrito aqui é capaz de suscitar um antissoro policlonal tendo uma afi-nidade a um produto imunogênico da presente invenção ou um globulômero Aβ (2042) que é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 100000 vezes maior do que a afinidade do antissoro to pelo menos um globulô- mero Aβ selecionado a partir do grupo que consiste de globulômero Aβ (1-42) e glo- bulômero Aβ (12-42).

[059]As afinidades de ligação de anticorpos (monoclonal ou policlonal) a um determinado antígeno (tal como os produtos imunogênicos da presente invenção) pode ser avaliada por usar imunotestes padronizados in vitro tal como ELISA, dot blot ou análises de ressonância de plasmon de superfície. O termo "ressonância de plasmon de superfície", como usado aqui, se refere a um fenômeno ótico que permite a análise de interações biespecíficas de tempo real por detecção de alterações em con-centrações de proteína dentro de uma matriz de biosensor, por exemplo, usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden e Piscataway, NJ). Para descrições adicionais, vide Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotecniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

[060]De acordo com uma modalidade particular, as afinidades definidas aqui se referem aos valores obtidos por realizar um dot blot como descrito aqui e avaliar o mesmo por densitometria. De acordo com uma modalidade particular da presente in-venção, determinar uma afinidade de ligação por dot blot compreende o a seguir: uma determinada quantidade do antígeno (por exemplo, o produto imunogênico da presente invenção; oligômero Aβ (X-Y), monômero Aβ (X-Y) ou fibrilas Aβ (X-Y), como definido acima) ou, Convenientemente, uma diluição apropriada dos mesmos, por exemplo, em 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4, 0,2 mg/mL de BSA a uma concentração de antígeno de, por exemplo, 100 pmol/μL, 10 pmol/μL, 1 pmol/μL, 0,1 pmol/μL e 0,01 pmol/μL, é ponteada sobre uma membrana de nitrocelulose, a membrana é então bloqueada com leite para evitar ligação não específica e lavada, então posta em contato com o anticorpo ou antissoro de interesse seguido por detecção do último por meio de um anticorpo secundário conjugado a enzima e uma reação colo- rimétrica; em concentrações de anticorpo definidas, a quantidade de anticorpo ligada permite a determinação de afinidade. Assim a afinidade relativa de dois diferentes anticorpos ou antissoros a um antígeno, ou de um anticorpo ou antissoro a dois diferentes antígenos, é definida aqui como a relação das respectivas quantidades de anticorpo ligado a antígeno observado com as duas combinações de anticorpo/antis- soro-antígeno sob condições de dot blot de outro modo idênticas. Diferente de uma abordagem similar com base em Western blotting, a abordagem de dot blot irá deter-minar a afinidade do anticorpo a um determinado antígeno na última conformação natural; diferente da abordagem de ELISA, a abordagem de dot blot não sofre a partir de diferenças nas afinidades entre diferentes alvos e a matriz, desse modo permitindo comparações mais precisas entre os diferentes antígenos.

[061]O termo "maior afinidade" aqui se refere a um grau de interação onde o equilíbrio entre anticorpo não ligado e produto imunogênico não ligado ou globulômero por um lado e o complexo de anticorpo-produto imunogênico/globulômero no outro é adicionalmente em favor do complexo. Da mesma forma, o termo "menor afinidade" aqui se refere a um grau de interação onde o equilíbrio entre anticorpo não ligado e produto imunogênico não ligado ou globulômero por um lado e complexo de anticorpo- produto imunogênico/globulômero pelo outro é adicionalmente em favor do anticorpo não ligado e produto imunogênico não ligado/globulômero. O termo "maior afinidade" é sinônimo com o termo "maior afinidade" e o termo "menor afinidade" é sinônimo com o termo "menor afinidade".

[062]O termo "KD" (também "Kd" ou "KD"), como usado aqui, é pretendido se referir a "constante de dissociação em equilíbrio" e se refere ao valor obtido em uma medição de titulação em equilíbrio, ou por dividir a constante do coeficiente de disso-ciação (koff) pela constante do coeficiente de associação (kon). A constante do coefici-ente de associação (kon), a constante do coeficiente de dissociação (koff) e a constante de dissociação em equilíbrio (KD) são usados para representar uma afinidade de liga-ção de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) a um antígeno. Métodos para determinar as constantes dos coeficientes de associação e dissociação são bem conhecidos na técnica. O uso de técnica com base em fluorescência oferece alta sensibilidade e a capacidade de examinar amostras em tampões fisiológicos em equi-líbrio. Outras abordagens experimentais e instrumentos tal como um teste BIAcore® (análise de interação biomolecular) pode ser usado (por exemplo, instrumento oferecido pela BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Adicionalmente, um teste KinExA® (Teste de Exclusão Cinética), oferecido pela Sapi- dyne Instruments (Boise, Idaho) pode também ser usado.

[063] De acordo com uma modalidade particular, os produtos imunogênicos da presente invenção são solúveis, em particular solúveis em meio aquoso (por exemplo, uma solução aquosa de 5 mM de NaH2PO4 e 35 mM de NaCI, mais especificamente uma solução aquosa de 5 mM de NaH2PO4 e 35 mM de NaCI que compreende um agente anfipático em uma concentração como indicado abaixo ou uma solução aquosa de 5 mM de NaH2PO4 e 35 mM de NaCI tendo a pH de 8 a 10, 8,0 a 9,5, ou 8,0 a 9,0). Solubilidades de pelo menos 0,1, 1, ou 5 mg de proteína por mL de solução são convenienteses. A solubilidade pode ser checada por centrifugação. Um produto imunogênico é solúvel se o mesmo não se precipitar com a centrifugação a 10,000 x g e uma temperatura na faixa de 10 a 40 °C, por exemplo, a 37 °C.

[064]Adicionalmente, é preferido que o produto imunogênico da presente in-venção compreenda uma pluralidade, por exemplo, 2 a 28, das sequências de amino- ácidos Aβ descritas aqui.

[065]Assim, o produto imunogênico da presente invenção é, em particular, um oligômero de muteínas Aβ, que pode opcionalmente ser truncado e/ou reticulado.

[066]Os termos "oligômero Aβ " ou "oligômero de muteína Aβ" como usado aqui se refere um polipeptídeos Aβ e muteínas Aβ solúveis, (na ausência de reticula- ção deliberada) de associação não-covalente como definido acima. De acordo com um aspecto, os oligômeros Aβ são conjuntos não fibrilares estáveis, de polipeptídeos Aβ (muteína) que podem ser obtidos por incubação com detergentes aniônicos. O termo "globulômero Aβ" como usado aqui se refere a um oligômero Aβ tendo uma estrutura de tipo globular tridimensional ("glóbulo fundido", vide Barghorn et al., J Neu- rochem 95: 834-847, 2005). Oligômeros Aβ (muteína) podem ser caracterizados por um ou mais das características a seguir: -pelo menos capacidade de clivagem parcial de aminoácidos N-terminais X24 com proteases promíscuas (tal como termolisina ou endoproteinase GluC) que pro-duzem formas truncadas de oligômeros Aβ (muteína); -não acessibilidade dos aminoácidos C-terminais 25-Y com proteases promís-cuas e anticorpos; -formas truncadas dos referidos oligômeros mantêm a estrutura de núcleo 3-dimensional dos referidos oligômeros com uma melhor acessibilidade do epítopo Aβ do núcleo (18-33).

[067]O termo " oligômero Aβ truncado" ou " oligômero de muteína Aβ truncado" como usado aqui se refere a uma forma truncada de oligômero Aβ (muteína) que pode ser obtido por submeter o oligômero Aβ a digestão proteolítica limitada. Mais especificamente, oligômeros Aβ (X-Y) (muteína) truncados incluem formas N-termi- nais truncadas em que X é selecionado a partir do grupo que consiste dos números 2 .. 24 e Y é como definido aqui, que são obtidos por truncagem de oligômeros Aβ (1- Y) (muteína) por tratamento com proteases adequadas. Por exemplo, um oligômero Aβ (20-42) pode ser obtido por submeter um oligômero Aβ (1-42) a proteólise de ter- molisina e um oligômero Aβ (12-42) pode ser obtido por submeter um oligômero Aβ (1-42) a proteólise de endoproteinase GluC. Quando o grau desejado de proteólise é alcançado, a protease é inativada em um modo em geral conhecido. Os oligômeros resultantes podem então ser isolados em seguida dos procedimentos já descritos aqui e, se necessária, processados adicionalmente por etapas de trabalho e de purificação adicional.

[068]Os oligômeros da presente invenção são obtidos por oligomerização do peptídeo Aβ muteína correspondente que compreende a sequência de aminoácido Aβ. A oligomerização compreende a agregação não covalente de peptídeo Aβ mute- ína monomérica de modo que os oligômeros da presente invenção podem ser assu-midos ser compostos de uma pluralidade de peptídeo Aβ muteínas.

[069]O material de partida, isto é peptídeo Aβ muteína, pode ser preparado por métodos de síntese de peptídeo conhecidos ou de modo recombinante. Adicional-mente, um número das referidas proteínas é oferecido no comércio. Em uma modali-dade particular, um peptídeo Aβ muteína é peptídeo Aβ muteína sintético.

[070]O referido peptídeo pode ser produzido por síntese química usando várias técnicas de fase sólida tais como as descritas em G. Barany e R.B. Merrifield, "The peptides: Análise, Synthesis, Biology"; Volume 2 - "Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A", pp. 3-284, E. Gross e J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980; e em J. M. Stewart e J. D. Young, "Solid-Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984. Essa estratégia é com base no grupo Fmoc (9-Fluorenilmetil metil-oxicarbonil) para a proteção temporária do grupo α-amino rupo, em combinação com o grupo terc-butila para a proteção temporária das cadeias laterais do aminoácido (vide, por exemplo, E. Atherton e R. C. Sheppard, " The Fluo- renil-methoxycarbonyl Amino Protecting Group", em "The Peptides: Análise, Synthesis, Biology"; Volume 9 -"Special Methods in Peptide Synthesis, Parte C", pp. 1-38, S. Undenfriend e J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987.

[071]Os peptídeos podem ser sintetizados em um modo em etapas em um suporte de polímero insolúvel (também referido como "resina") iniciando a partir do C- termino do peptídeo. A síntese é iniciada por anexar o aminoácido C-terminal do pep- tídeo à resina através da formação de uma amida ou ligação éster. Isso permite a eventual liberação do peptídeo resultante como uma amida C-terminal ou ácido car- boxílico, respectivamente. Alternativamente, em casos onde um amino álcool C-termi- nal está presente, o resíduo C-terminal pode ser fixado a resina de álcool 2-Metoxi-4- alcoxibenzila (SASRIN™, Bachem Bioscience, Inc., King de Prussia, PA) como descrito aqui e, após a conclusão do conjunto de sequência de peptídeo, o álcool de peptídeo resultante é liberado com LiBH4 em THF (vide J. M. Stewart e J. D. Young, supra, p. 92).

[072]O aminoácido C-terminal e todos os outros aminoácidos usados na sín-tese são necessários ter os seus grupos α-amino e as funcionalidades de cadeia lateral (se presentes) protegidos de modo diferencial de modo que o grupo de proteção α-amino pode ser removido de modo seletivo durante a síntese. O acoplamento de um aminoácido é realizado por ativação do seu grupo carboxila como um éster ativo e reação dos mesmos com o grupo α-amino desbloqueado do aminoácido N-terminal anexado à resina. A sequência de desproteção do grupo α-amino e acoplamento é repetida até que toda a sequência de peptídeo é montada. O peptídeo é então liberado a partir da resina com a concomitante desproteção das funcionalidades de cadeia la-teral, em geral na presença de lavadores apropriados para limitar as reações laterais. O peptídeo resultante é finalmente purificado por HPLC de fase reversa.

[073]A síntese das resinas peptidil necessária como precursores para os pep- tídeos finais utiliza as resinas de polímero de poliestireno reticuladas oferecidos no comércio (Novabiochem, San Diego, CA; Aplicada Biosystems, Foster City, CA). Su-portes sólidos preferidos são: resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxia- cetil-p-metil benzidrilamina (resina Rink amida MBHA); resina 9-Fmoc-amino-xanten- 3-iloxi-Merrifield (resina Sieber amida); resina 4-(9-Fmoc)aminometil-3,5-dimetoxife- noxi)valeril-aminometil-Merrifield (resina PAL), para as carboxamidas C-terminais. Acoplamento do primeiro e dos subsequentes aminoácidos pode ser realizado usando HOBT ou HOAT éster ativos produzidos a partir de DIC/HOBT, HBTU/HOBT, BOP, PyBOP, ou a partir de DIC/HOAT, HATU/HOAT, respectivamente. Suportes sólidos preferidos são: resina cloreto de 2-Clorotritil e resina 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi- Merrifield (resina Sieber amida) para os fragmentos de peptídeo protegido. O carre-gamento do primeiro aminoácido sobre a resina de cloreto de 2-clorotritil é melhor alcançado por reagir o aminoácido Fmoc-protegido com a resina em diclorometano e DIEA. Se necessário, uma pequena quantidade de DMF pode ser adicionada para facilitar a dissolução do aminoácido.

[074]As sínteses podem ser realizadas por usar um sintetizador de peptídeo, tal como um Advanced Chemtech Multiple Peptide Synthesizer (MPS396) ou um sin- tetizador de peptídeo da Aplicada Biosystems Inc. (ABI 433a).

[075]Alternativamente, qualquer outra metodologia apropriada conhecida da-queles versados na técnica pode ser usada, que inclui: 1) síntese de múltiplas copias do peptídeo desejado separado por campos de clivagem apropriados para a clivagem enzimática ou química de ligações de peptídeo, que resulta no peptídeo desejado, 2) a expressão recombinante de APP em qualquer sistema conhecido daqueles versados na técnica e contendo a sequência de aminoácido, seguido seja por processamento enzimático ou químico para produzir o peptídeo desejado, 3) a expressão re- combinante do peptídeo desejado como uma proteína de fusão em qualquer sistema conhecido daqueles versados na técnica, 4) a expressão recombinante do peptídeo desejado diretamente em qualquer sistema conhecido daqueles versados na técnica.

[076]A expressão recombinante de peptídeo β amilóides é descrita em WO 2007/064917. Ademais, métodos gerais para a expressão de proteínas heterólogas em hospedeiros recombinantes, síntese química de polipeptídeos e translação in vitro são bem conhecidos na técnica e são descritos adicionalmente em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif. ; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiken 1. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243: 187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957; and Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing).

[077]O peptídeo obtido é então submetido a condições que permitem que o oligômero se forme. Condições adequadas para a formação do oligômero são descri-tas em, por exemplo, WO 2004/067561; WO 2006/094724; S. Barghorn et al., J. Neu- rochem. 95, 834 (2005) e WO 2007/064917, que são incorporados aqui por referência.

[078] Em uma primeira etapa, peptídeo Aβ muteína monomérica é dissolvido em um solvente. Preferivelmente, o solvente é um agente de ruptura de ligação de hidrogênio. O objetivo desse tratamento é de proporcionar a solução do peptídeo não duplicado.

[079]Agentes de ruptura de ligação de hidrogênio adequados são conhecida na técnica. Os referidos incluem compostos orgânicos tais como 1,1,1,3,3,3-hexaflu- oro-2-propanol (HFIP) e solução aquosas de bases tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ácido fórmico, 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), ureia e cloreto de gua- nidina.

[080] De acordo com uma modalidade particular, o agente de ruptura de liga-ção de hidrogênio é HFIP.

[081] De modo a ajudar um peptídeo Aβ muteína dissolver no agente de ruptura de ligação de hidrogênio a mistura pode ser submetida a agitação, por exemplo, agitação. Tempos de dissolução de uns poucos minutos a poucas horas, por exemplo, 15 minutos a 5 horas, são suficientes quando a temperatura é a partir de 22 a 50°C. Por exemplo, o peptídeo pode ser convenientemente dissolvido por agitação do mesmo em HFIP por cerca de 2,5 horas a cerca de 37°C.

[082]A quantidade de peptídeo Aβ muteína pode ser de modo que 2 mg/mL a 50 mg/mL, 5 mg/mL a 40 mg/mL, ou 5 mg/mL a 30 mg/mL de peptídeo são dissolvidos no agente de ruptura de ligação de hidrogênio. Por exemplo, a concentração de pep- tídeo Aβ muteína dissolvido no agente de ruptura de ligação de hidrogênio pode ser convenientemente ajustada a cerca de 6 mg/mL em HFIP.

[083] É conveniente se uma solução clara é obtida por dissolver um peptide Aβ muteína no agente de ruptura de ligação de hidrogênio.

[084]O agente de ruptura de ligação de hidrogênio é então removido, por exemplo, por evaporação e o resíduo é resuspenso em um solvente adequado, por exemplo, DMSO. A quantidade de peptídeo Aβ muteína pode ser de modo que 1 mM a 10 mM, 2 mM a 8 mM, ou 4 mM a 6 mM de peptídeo são resuspensos no solvente. Por exemplo, a concentração de peptídeo Aβ muteína resuspenso pode ser conveni-entemente ajustada a cerca de 5 mM em DMSO.

[085] Em uma etapa adicional, um agente anfipático é adicionado a uma solu-ção de peptídeo Aβ muteína no agente de ruptura de ligação de hidrogênio. A adição do agente anfipático induz a oligomerização do peptídeo para dar os oligômeros.

[086]Agentes anfipáticos incluem ácidos graxos ou detergentes, alguns dos quais são listados em WO 2007064917, que são incorporados aqui por referência.

[087] Por exemplo, sulfatos, em particular sulfatos de alquila e éter sulfatos de alquila; sulfonatos, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), ácidos carboxílicos, tais como ácidos graxos, por exemplo, ácido láurico, sarcosinas, por exemplo, N-lau- roilsarcosina (também conhecida como sarcosil NL-30 ou Gardol®), éteres polioxieti- leno de álcool de alquilarila, tal como éteres polioxietileno de octilfenol, por exemplo, terc-octilfenol x 9-10EO (também conhecida como Triton® X100), ou éteres polioxie- tileno alquilaril nonilfenol, por exemplo, nonilfenol x 20EO (também conhecido como Tergitol® NP-40), sulfonato de 3-(3-colamidopropildimetilamonio-1-propano (CHAPS), sulfonato de dodecil-N,N-dimetil-3-amino-1-propano (DDAP) e aminas, em particular alquil aminas, por exemplo, dodecilamina, pode ser convenientemente usado como agente anfipático no processo da presente invenção. Também, tensoativos de açúcar, em particular ésteres de sorbitol polietoxilados, tais como, por exemplo, ésteres de ácido graxo de sorbitol polietoxilado, por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbi- tano (também conhecido como Polisorbat 80 ou Tween® 80), pode ser conveniente-mente usado como agente anfipático no processo da presente invenção.

[088] De acordo com uma modalidade particular, o agente anfipático é adicio-nado na forma de uma solução aquosa que compreende o agente anfipático. A referida solução pode ser tamponada. Um valor de pH na faixa a partir de 6.0 a 10,0, 6.5 a 9,5, ou 7.0 a 9,0 provou ser conveniente. Por exemplo, uma solução aquosa tampo- nada tendo um valor de pH de cerca de 7.4 pode convenientemente ser usado. Soluções aquosas tamponadas são conhecidas na técnica. Por exemplo, uma solução aquosa que compreende 5 mM de NaH2PO4 e 35 mM de NaCI pode convenientemente ser usada.

[089] Por adicionar a solução aquosa a um peptídeo Aβ muteína é diluído. Uma quantidade de solução aquosa adicionada na faixa de 5 a 50, 7 a 30, ou 8 a 25 vezes o volume do peptídeo Aβ muteína resuspenso provou ser conveniente. Por exemplo, a quantidade de solução aquosa a ser adicionada pode convenientemente ser cerca de 10 vezes o volume do peptídeo Aβ muteína resuspenso.

[090]A concentração de agente anfipático a ser escolhida depende do agente usado. Se SDS é usado, a concentração na faixa a partir de 0,05 a 0,7% em peso, a partir de 0,075 a 0,4% em peso, ou a partir de 0,1 a 0,3% em peso na mistura de incubação provou ser conveniente. Por exemplo, a solução aquosa tamponada que compreende cerca de 0,2 % em peso de SDS pode convenientemente ser usado. Se ácido láurico ou N-lauroilsarcosina é usado, concentrações relativamente mais altas são convenientes, por exemplo, em uma faixa a partir de 0,1 a 1,0% em peso, a partir de 0,25 a 0,75% em peso, ou a partir de 0,4 a 0,6% em peso. Por exemplo, uma solução aquosa tamponada que compreende cerca de 0,5 % em peso de ácido láurico ou N-lauroilsarcosina pode convenientemente ser usado. Se monooleato de polioxie- tileno sorbitano (por exemplo, Tween® 80) é usado, a concentração na faixa a partir de 0,05 a 1 % em peso, a partir de 0,075 a 0,5% em peso, ou a partir de 0,1 a 0,3% em peso na mistura de incubação provou ser conveniente.

[091]Em geral, o peptídeo Aβ muteína resuspenso e a solução aquosa tamponada são misturados, convenientemente sob agitação, por exemplo, centrifugação.

[092]Antes da mistura ser incubada para completar formação de oligômero, pode ser conveniente se remover os sólidos a partir da mistura.

[093]Os tempos de incubação para a formação de oligômero podem variar a partir de uns poucos minutos a poucas horas. 1 hora a 48 horas, 2 horas a 36 horas, ou 5 horas a 24 horas são suficientes quando a temperatura de incubação é a partir de 15 a 50°C, a partir de 18 a 45°C ou a partir de 20 a 40°C. Por exemplo, a formação de oligômero é completa se a mistura é incubada por cerca de 24 horas a cerca de 37°C.

[094]Convenientemente, a incubação é realizada em duas etapas, isto é, após um primeiro período de incubação a preparação é diluída (por exemplo, com água) seguido por um segundo período de incubação.

[095]Os tempos de incubação no primeiro período podem variar a partir de uns poucos minutos a poucas horas. 1 hora a 24 horas, 2 horas a 12 horas, ou 4 horas a 8 horas são suficientes quando a temperatura de incubação é a partir de 15 a 50°C, a partir de 18 a 45°C ou a partir de 20 a 40°C. Por exemplo, a mistura é incubada por cerca de 6 horas a cerca de 37°C

[096]A diluição da mistura de incubação pode ser efetuada em modo conhe-cido em si. De acordo com uma modalidade particular, a diluição compreende adicio-nar água. Convenientemente, a mistura de incubação é diluída cerca de 2 vezes a 20 vezes, 3 vezes a 15 vezes, ou 4 vezes a 10 vezes, por exemplo, 4 vezes (1:3).

[097]Os tempos de incubação no segundo período para completar a formação de oligômero podem variar a partir de uns poucos minutos a poucas horas. 1 hora a 36 horas, 2 horas a 24 horas, ou 4 horas a 18 horas são suficientes quando a temperatura de incubação é a partir de 15 a 50°C, a partir de 18 a 45°C ou a partir de 20 a 40°C. Por exemplo, a formação de oligômero é completa se a mistura é incubada por cerca de 18 horas a cerca de 37°C.

[098]Uma vez que a formação de oligômero é completa, pode ser conveniente se centrifugar a mistura de incubação e obter o sobrenadante da mistura de incubação centrifugada. Por exemplo, a centrifugação por cerca de 20 minutos a cerca de 3,000xg provou ser conveniente.

[099]De acordo com uma modalidade particular, o sobrenadante de mistura de incubação centrifugada pode então ser congelado. Por exemplo, o sobrenadante de mistura de incubação centrifugada pode convenientemente ser congelado a -30°C por 30 minutos. O sobrenadante congelado pode então ser descongelado e opcionalmente o sobrenadante descongelado é mais uma vez centrifugado (por exemplo, por 10 minutos a 10,000xg) e uma mistura do sobrenadante centrifugado é obtida.

[0100]A preparação do oligômero que pode ser obtida pelo referido processo pode ser usada como tal ou submetida a adicionalmente trabalhada, por exemplo, de modo a concentrar e/ou purificar os oligômeros.

[0101]De acordo com uma modalidade particular, o processo da presente in-venção compreende uma etapa de concentrar a mistura de incubação.

[0102]Concentrar a mistura de incubação pode ser efetuada em um modo co-nhecido em si. De acordo com uma modalidade particular, a concentração é realizada por ultracentifugação. Ultracentifugação é um método bem conhecido na técnica. Ul- tracentifugação que compreende a 10 a 100, a 20 a 80, ou a 25 a 50 corte de kDa provou ser conveniente. Por exemplo, os oligômeros da presente invenção podem ser convenientemente concentrados por ultracentifugação que compreende cerca de 30 de corte de kDa.

[0103]A ultracentrifugação reduz o volume da mistura de incubação ao mesmo tempo em que mantém a quantidade de oligômero que é presente na mistura de incu-bação. Assim, é conveniente se reduzir o volume para 1 a 40 %, 2 a 35 %, ou 4 a 33 %. Por exemplo, o volume da mistura de incubação pode convenientemente ser reduzido por ultracentrifugação a cerca de 32%, 10% ou 5%.

[0104]De acordo com uma modalidade particular, o processo da presente in-venção compreende a etapa de reduzir a concentração de sal da mistura de incubação ou da mistura de incubação concentrada.

[0105]Uma redução da concentração de sal (e do agente anfipático, a redução do qual é particularmente importante para um uso em imunização ativa) pode ser efe-tuada em modo conhecido em si. De acordo com uma modalidade particular, a con-centração de sal é reduzida por submeter a mistura de incubação ou a mistura de incubação concentrada a diálise. Diálise é um método bem conhecido na técnica. Por exemplo, a diálise da mistura de incubação ou da mistura de incubação concentrada pode convenientemente ser realizada contra uma solução que compreende 5 mM de NaH2PO4 e 35 mM de NaCI. A solução pode também compreender um agente anfipá- tico em uma quantidade adequada. Durante a diálise pode ser conveniente se substituir a solução por uma fresca.

[0106]A diálise é realizada até que a redução do sal seja completa. Por exem-plo, cerca de 2,5 horas a cerca de 22°C provou ser conveniente.

[0107]Pode adicionalmente ser conveniente se centrifugar o dialisado e se obter o sobrenadante de dialisado centrifugado. Por exemplo, centrifugação por cerca de 10 minutos a cerca de 10,000xg provou ser conveniente.

[0108]Assim, de acordo com uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um processo para a preparação um oligômero de muteína Aβ, cujo processo compreende (i)dissolver o peptídeo Aβ muteína monomérica em um agente de ruptura de ligação de hidrogênio; (ii)adicionar um agente anfipático, misturar e incubar; (iii)diluir e incubar; e (iv)opcionalmente um ou mais dos a seguir, centrifugar, reduzir a concentração de sal e/ou de agente anfipático por diálise, concentrar por ultracentri- fugação, e (v)obter o sobrenadante.

[0109]De acordo com uma modalidade particular, o produto imunogênico é um oligômero de muteína Aβ truncado.

[0110]O referido oligômero de muteína Aβ truncado é obtido por um processo para a preparação oligômero de muteína Aβ, cujo processo adicionalmente compre-ende a etapa de (d) clivar de modo proteolítico o oligômero. Preferência é dada às endopeptidases, por exemplo, com uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de: tripsina, quimiotripsina, termolisina, elastase, papaina e endoproteinase GluC. As condições adequadas para clivar de modo proteolítico o oligômero são des-critas, por exemplo, em WO 2004/067561; WO 2006/094724; e WO 2007/064917, que são incorporados aqui por referência. Oligômeros truncados particulares da presente invenção são os que podem ser obtidos pela ação de termolisina.

[0111]O produto imunogênico da presente invenção compreende uma se-quência de aminoácido Aβ tendo 62,5% ou identidade superior à sequência de ami- noácido Aβ (18-33) determinada em SEQ ID NO:1. Assim sendo, o produto imunogê- nico descrito aqui compreende uma sequência de aminoácido Aβ tendo 62.6% ou su-perior, 68.75% ou superior, 75% ou superior, 81.25% ou superior, 87.5% ou superior, ou 93.75 ou identidade superior à sequência de aminoácido V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G29A30I31I32G33 [SEQ ID NO:2; Aβ (1833)].

[0112]O termo "identidade" se refere à relação de duas sequências em uma base de aminoácido-por-aminoácido em uma janela ou segmento de comparação par-ticular. Assim, a identidade é definida como o grau de igualdade, correspondência ou equivalência entre duas sequências de aminoácido. "Percentual de identidade de se-quência" é calculado por comparar duas sequências otimamente alinhadas sobre uma região particular, determinar o número de posições nas quais o aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências de modo a produzir o número de posições corres-pondidas, dividir o número das referidas posições pelo número total de posições no segmento sendo comparado e multiplicar o resultado por 100. O alinhamento ótimo das sequências pode ser conduzido pelo algoritmo de Smith & Waterman, Appl. Math. 2: 482, 1981, pelo algoritmo de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, pelo método de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444, 1988 e por programas de computador que implementam os algoritmos relevantes (por exemplo, Clustal Macaw Pileup (http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11 Multiples.pdf; Higgins et al., CABIOS. 5L151-153, 1989), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25: 3389-3402, 1997), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, Wl) ou GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wl)).

[0113]De acordo com uma modalidade da presente invenção, a sequência de aminoácido compreendida pelo produto imunogênico da presente invenção é carac-terizada por uma estrutura secundária particular que compreende uma alça (sinônimo: volta). Uma alça (ou volta) como usado aqui quer dizer definir a abordagem próxima (em geral < 7 Á) de pelo menos dois átomos Cα.

[0114]Alças adequadas incluem as alças α, β-, Y- e TT-. De acordo com uma modalidade da presente invenção, a alça é a alça β. A alça β como usado aqui quer dizer que define uma alça que é caracterizada por ligação(s) de hidrogênio na qual os resíduos de doador e de aceitante são separados por três resíduos (i^ i +/- 3 H-liga- ção).

[0115]De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, a alça é uma alça de β-hairpin. Uma alça de β-hairpin como usado aqui quer dizer que define uma alça, na qual a direção da estrutura de peptídeo se reverte e os elementos de estrutura secundária de borda interagem.

[0116]De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, a alça, que pode preferivelmente ser uma alça de β-hairpin, compreende a sequência selecionada a partir de V24G25S26N27 [SEQ ID NO:10; Aβ(24-27)] e D23V24G25S26N27K28 [SEQ ID NO:11; Aβ(23-28)].

[0117]Em particular, a sequência de aminoácido do produto imunogênico des-crito aqui forma uma folha β antiparalela intramolecular. Uma folha β antiparalela como usado aqui quer dizer que define um conjunto de pelo menos duas fitas β conectadas lateralmente por três ou mais ligações de hidrogênio, formando uma folha em geral torcida, laminada. A fita β é uma extensão de aminoácidos que compreende tipica-mente 3-10 aminoácidos cujas estruturas de peptídeo são quase completamente es-tendidas.

[0118]Em um aspecto relacionado da presente invenção, o produto imunogê- nico descrito aqui compreende uma sequência de aminoácido na qual as fitas β for-mando a folha β antiparalela são conectadas via a alça, preferivelmente a alça de β- hairpin definida aqui.

[0119]De acordo com uma modalidade particular do referido aspecto, as por-ções de sequência de aminoácido do produto que corresponde a F19F20A21 [SEQ ID NO:8; Aβ(19-21)] e A30I31I32 [SEQ ID NO:9; Aβ(30-32)] estão em uma orientação anti- paralela.

[0120]Os oligômeros de peptídeos Aβ muteína podem ser adicionalmente ca-racterizados por interações particulares entre dois ou mais peptídeos Aβ muteína.

[0121]Em um aspecto da presente invenção, o produto imunogênico descrito aqui compreende uma sequência de aminoácido Aβ tendo 72% ou superior, 77% ou superior, 81 % ou superior, 86% ou superior, 90% ou superior, ou 95% ou identidade superior para a sequência de aminoácido V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39 [SEQ ID NO:3; Aβ (18-39)].

[0122]Em um aspecto relacionado da presente invenção, o referido produto imunogênico compreende uma primeira sequência de aminoácido LA34MA35VA36GA37GA38 [SEQ ID NO:5; Aβ(34-38)] que está em uma orientação paralela à segunda sequência de aminoácido LB34MB35VB36GB37GB38 (SEQ ID NO: 5). No referido caso, a distância entre prótons para pelo menos um par de átomos selecionado a partir do grupo que consiste de MA35(NH)-VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)- LB34(CδH3), MA35(NH)-VB36(CYH3) pode ser 1.8 a 6.5 Angstroms.

[0123]Em um aspecto adicional relacionado da presente invenção, o referido produto imunogênico compreende uma primeira sequência de aminoácido GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 [SEQ ID NO:6; Aβ (33-38)3 que está em uma orientação paralela à segunda sequência de aminoácido GB33LB34MB35VB36GB37GB38VB39 (SEQ ID NO: 6). No referido caso, a distância entre prótons para pelo menos um par de átomos selecionado a partir do grupo que consiste de GA33(NH)-GB34(NH), MA35(NH)-VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)-LB34(CδH3), MA35(NH)-VB36(CYH3), GA38(NH)-VB39(CYH3) e VA39(NH)-VB39(CYH3) pode ser 1.8 a 6.5 Angstroms.

[0124]Em um aspecto adicional relacionado da presente invenção, o referido produto imunogênico compreende uma folha β paralela intermolecular entre duas se-quências de aminoácido Aβ. Em um aspecto particular da presente invenção, a referida folha β paralela intermolecular compreende uma primeira sequência de aminoá- cido GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 [SEQ ID NO:7; Aβ (33-39)] e a segunda sequência de aminoácido GB33LB34MB35VB36GB37GB38VB39 (SEQ ID NO: 7). No referido caso, os pares de átomos GA33(CO)-LB34(N), LB34(CO)-MA35(N), MA35(CO)-VB36(N), VB36(CO)- GA37(N) e GB37(CO)-GA38(N) podem estar a uma distância de 3.3 ± 0,5 A, em que CO indica a estrutura do átomo de oxigênio e os ângulos phi (Φ) dos resíduos variam a partir de -180 a -30 e os ângulos psi (Φ) dos resíduos variam a partir de aproximadamente 60 a 180 ou a partir de aproximadamente -180 a -150.

[0125]As distâncias entre prótons que definem a estrutura da folha β antipa- ralela podem ser determinadas pelos efeitos Overhauser nucleares intramoleculares (NOEs) entre as amidas da estrutura e entre as amidas da estrutura e as cadeias laterais.

[0126]As distâncias entre prótons que definem a estrutura da folha β paralela podem ser determinadas por NOEs intermoleculares entre a estrutura de NH-NH e entre a estrutura de NH e os grupos metila das cadeias laterais.

[0127]As intra- vs. NOEs intermoleculares podem ser distinguidas usando di-ferentes amostras marcadas com isótopo, como descrito, por exemplo, em WO 2007/064917, em particular Exemplo V, parte G, Características NMR, que é aqui in-corporada por referência.

[0128]Usando as restrições de distância derivada de NOE a partir da análise dos dados de NMR, as estruturas podem ser calculadas, por exemplo, usando o pro-grama CNX [A.T. Brunger, et al., Acta Crystallogr. D54 (Pt 5), 905-21, (1998)] por usar um protocolo de recozimento simulado [M. Nilges, et al., FEBS Lett. 229, 317-324, (1988)], desse modo proporcionando distâncias adicionais intramoleculares e/ou in- termoleculares entre dois átomos.

[0129]Em um aspecto da presente invenção, o produto imunogênico descrito aqui compreende uma sequência de aminoácido Aβ tendo 62,5% ou superior, 64% ou superior, 67% ou superior, 71% ou superior, 75% ou superior, 78% ou superior, 82% ou superior, 85% ou superior, 89% ou superior, 92% ou superior, ou 96% ou identidade superior para a porção (X-Y) de sequência de aminoácido V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G3 8V39[SEQ ID NO:4; Aβ (12-39)],

[0130]X sendo selecionado a partir do grupo que consiste dos números 12 .. 18 e Y sendo selecionado a partir do grupo que consiste dos números 33 .. 39.

[0131]Em um aspecto relacionado da presente invenção, pelo menos 2 resíduos não contíguos da referida sequência de aminoácido são covalentemente li-gados um com o outro, por exemplo, via uma ligação covalente direta ou via um ele-mento de ligação. Em particular, pelo menos um dos resíduos de aminoácido que corresponde a V12, H13, H14, Q15, K16, L17, V18, F19, F20, A21 E22 ou D23 de [resíduos 212 de SEQ ID NO:4; Aβ (12-39)] e pelo menos um dos resíduos de aminoácido que corresponde a K28, G29, A30, I31, I32, G33, L34, M35, V36, G37, G38, V39 de [resíduos 17-28 de SEQ ID NO:4; Aβ (12-39)] são covalentemente ligados um com o outro.

[0132]Uma ligação covalente entre dois resíduos de aminoácido pode ser es-tabelecida por uma variedade de meios bem conhecidos na técnica, por exemplo, por formação de ponte de dissulfeto ou técnicas de reticulação. Em particular, as cadeias laterais de resíduos de aminoácido podem ser ligadas uma com a outra. Especialmente cadeias laterais com um grupo funcional, por exemplo, um grupo tiol, amino, carboxila ou hidroxila, podem ser ligados um com o outro diretamente, tal como dois resíduos de cisteína que formam uma ponte de dissulfeto, ou indiretamente via um elemento de ligação. Assim sendo, o resíduo de aminoácido que é covalentemente ligado aos outros resíduos de aminoácido podem em particular ser aqueles de um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste de cisteína, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico.

[0133]A reticulação de proteínas tem um histórico longo e exaustivo, com grandes quantidades de literatura precedente. Qualquer metodologia conhecida da-queles versados na técnica que permita que reticulações covalentes específicas sejam produzidas entre cadeias laterais de aminoácido natural ou não natural pode ser usada para formar as reticulações específicas de posição previstas na presente invenção. Alguns exemplos da referida metodologia são listados abaixo.

[0134]Há um grande número de agentes químicos de reticulação que são co-nhecidos daqueles versados na técnica. Para a presente invenção, os agentes de re- ticulação preferidos incluem os reticuladores homobifuncionais e heterobifuncionais, com os reticuladores heterobifuncionais sendo os preferidos em virtude de sua capa-cidade de se ligar a aminoácidos em um modo em etapas.

[0135]Também, os reticuladores heterobifuncionais proporcionam a capaci-dade de estabelecer ligações mais específicas, desse modo reduzindo as ocorrências de reações laterais indesejadas.

[0136]Uma grande variedade de reticuladores heterobifuncionais é conhecida na técnica.

[0137]Os referidos incluem reticuladores heterobifuncionais para a formação de ligações entre dois grupos amino (-NH2), um grupo amino e um tiol (ou sulfidrila, isto é, -SH), ou dois grupos tiol.

[0138]Um grupo reativo útil como uma parte de um reticulador heterobifuncio- nal é um grupo amino reativo. Grupos amino reativos comuns incluem ésteres de N- hidroxisuccinimida (NHS). Ésteres de NHS reagem especificamente com as aminas livres (por exemplo, resíduos de lisina) em minutos, sob condições relativamente ací- dicas a neutro (pH 6.5 - 7. 5).

[0139]É observado que os agentes de reticulação tendo frações de N-hidroxi- succinimida podem também ser usados na forma de seus análogos de N-hidroxisulfo- succinimida, que em geral têm maior solubilidade a água.

[0140]Outro grupo reativo útil como parte de um reticulador heterobifuncional é um grupo tiol reativo. Grupos tiol reativos comuns incluem maleimidas, halogênios e dissulfetos de piridila. As maleimidas reagem especificamente com grupos tiol livres (por exemplo, em resíduos de cisteína) em minutos, preferivelmente sob condições relativamente acídicas a neutra (pH 6.5 - 7.5).

[0141]Halogênios (funções iodoacetil) reage com os grupos -SH pH fisiológico. Ambos os referidos grupos reativos resultam na formação de ligações tio éter estáveis.

[0142]Por exemplo, succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1- carboxilate (SMCC) ou sulfo-SMCC pode ser usado para formar uma reticulação entre a amina, por exemplo, de uma cadeia lateral Lys e o -SH livre, por exemplo, da cadeia lateral Cys. Um éster de N-hidroxisuccinimida amina reativo (NHS) irá reagir com um grupo amino (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida estável. O peptídeo ativado a maleimida resultante irá então reagir com um grupo sulfidrila do mesmo peptídeo (por exemplo, aquele de um resíduo Cys) para formar uma ligação dissulfeto, desse modo estabelecendo uma ligação covalente. A referida química é bem descrita na literatura; vide, por exemplo: Uto, I., et al. (1991). J. Immunol. Methods 138, 87-94; Bieniarz, C, et al. (1996). Extended Length Heterobifunctional Coupling Agents for Protein Conjugations. Bioconjug. Chem. 7, 88-95; Chrisey, L.A., et al. (1996). Nucleic Acids Res. 24(15), 3031-3039; Kuijpers, W.H., et al. (1993). Bioconjug. Chem. 4(1), 94-102; Brinkley, M.A. (1992). A survey of methods for preparing protein conjugados with dyes, haptens and reticulação reagentes. Bioconjugate Chem. 3, 2-13; Hashida, S., et al. (1984). More useful maleimide compostos for the conjugation of Fab to peroxidase de rábano silvestre through thiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem. 6, 56-63; Mattson, G., et al. (1993). A practical abordagem to retic- ulação. Molecular Biology Reports 17, 167-183; Partis, M.D., et al. (1983). Reticulação of proteins by omega-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimide esters. J. Protein. Chem. 2, 263-277; Sa-moszuk, M.K., et al. (1989). A peroxide-gerar immunoconjugate direcionada to eosinophil peroxidase is cytotoxic to Hodgkin's disease cells in vitro. Antibody, Immuno-conjugates and Radiopharmaceuticals 2, 37-45; Yoshitake, S., et al. (1982). Mild and efficient conjugation of coelho Fab and peroxidase de rábano silvestre using a maleimide composto and its use for enzima imunoteste. J. Biochem. 92, 1413-1424.

[0143]Adicionalmente reticuladores heterobifuncionais podem ser usados em um modo similar, por exemplo, éster de ([N-ε-maleimidocaproiloxijsuccinimida, éster de N-[Y-maleimidobutyriloxi]succinimida, éster de N-[K- maleimidoundecanoiloxi]sulfosuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuc- cinimida (MBS), ou os seus análogos sulfosuccinimida (por exemplo, sulfo-MBS).

[0144]Um exemplo adicional de um reticulador heterobifuncional que pode ser usado para formar uma reticulação entre a amina, por exemplo, de uma cadeia lateral Lys e o -SH livre, por exemplo, de uma cadeia lateral Cys, é succinimidil-6-[(3-(2-piri- dilditio)-propionato]-hexanoato (LC-SPDP) ou sulfo-LC-SPDP. Um éster de N-hidroxi- succinimida amina reativo (NHS) irá reagir com um grupo amino (por exemplo, aqueel de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida estável. O peptídeo resultante tem um grupo de sulfeto de piridila que irá então reagir com um grupo sulfidrila do mesmo peptídeo (por exemplo, aquele de um resíduo Cys) para formar uma ligação dissulfeto, desse modo estabelecendo uma ligação covalente. A referida química é bem descrita na literatura; vide, por exemplo: Carlsson, J., et al. (1978) Biochem. J. 173, 723-737; Stan, R.V. (2004) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H1347-H1353; Mader, C, et al. (2004) J. Bacteriol. 186, 1758-1768.

[0145]Adicionalmente reticuladores heterobifuncionais podem ser usados em um modo similar, por exemplo, 4-succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)-tolu- eno (SMPT) ou sulfo-SMPT, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) ou sulfo-SPDP.

[0146]Um exemplo adicional de um reticulador heterobifuncional que pode ser usado para formar uma reticulação entre a amina, por exemplo, de uma cadeia lateral Lys e o -SH livre, por exemplo, de uma cadeia lateral Cys é N-succinimidil-S-acetiltio- acetato (SATA) ou sulfo-SATA. Um éster de N-hidroxisuccinimida amina reativo (NHS) irá reagir com um grupo amino (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida estável. O grupo -SH protegido do peptídeo resultante será então desprotegido por tratamento com hidroxilamina e o -SH livre resultante irá então reagir com um grupo sulfidrila do mesmo peptídeo (por exemplo, aquele de um resíduo Cys) para formar uma ligação dissulfeto, desse modo estabelecendo uma ligação covalente.

[0147]Adicionalmente reticuladores heterobifuncionais podem ser usados em um modo similar, por exemplo, N-succinimidil-S-acetiltiopropionato ou o seu análogo sulfosuccinimida.

[0148]Reticuladores heterobifuncionais adicionais adequados incluem N-suc- cinimidil-(4-iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB) ou sulfo-SIAB.

[0149]Reticulações em etapas específicas podem também ser formadas entre os grupos amino (-NH2) e carboxi (-COOH).

[0150]Por exemplo, hidrocloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodii- mida (EDC) pode ser usado para formar uma reticulação entre a amina, por exemplo, de uma cadeia lateral Lys e o -COOH livre de uma cadeia lateral acídica. A carbodii- mida carboxi-reativa irá reagir com um grupo carboxi (por exemplo, aquele de um Asp, Glu, Dab (ácido 2,4-diaminobutírico), Dap (ácido 2,4-diaminopropiônico), ou resíduo de ornitina) para formar um éster o-acilisoureia instável. O éster reativo o-acilisoureia irá então reagir com um grupo amino do mesmo peptídeo (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida, desse modo estabelecendo uma ligação covalente. Alternativamente, o éster reativo o-acilisoureia pode ser reagido com N- hidroxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimida ou sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida para se obter o éster NHS amino reativo semi-estável que irá então reagir com um grupo amino do mesmo peptídeo (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida, desse modo estabelecendo uma ligação covalente. A referida química é bem descrita na literatura; vide, por exemplo: DeSilva, N.S. (2003) Interactions of Surfactant Protein D with Fatty Acids. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 29, 757-770; Grab- arek, Z. and Gergely, J. (1990) Zero-length reticulação procedure with the use of active esters. Anal. Biochem. 185, 131-135; Sinz, A. (2003). J. Mass Spectrom. 38, 12251237. Staros, J.V., Wright, R.W. and Swingle, D.M. (1986) Enhancement by N-hy- droxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.Anal. Biochem. 156, 220-222; Taniuchi, M., et al. (1986). Induction of nerve growth factor receptor in Schwann cells after axotomy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA83, 40944098.

[0151]Reticuladores heterobifuncionais também incluem a reação dos amino- ácidos Lys(N3) e propargil glicina. A referida reação pode ser realizada em solução ou em resina (como descrito, por exemplo, em Jiang, S., (2008) Curr. Org. Chem. 12, 1502-1542 e referências no mesmo).

[0152]Uma classe particular de reticuladores, em particular reticuladores he- terobifuncionais, inclui reticuladores fotoreativos.

[0153]Por exemplo, (SDA) pode ser usado para formar uma reticulação entre a amina, por exemplo, de uma cadeia lateral Lys e a amina de, por exemplo, outra cadeia lateral Lys. Um éster de N-hidroxisuccinimida amina reativo (NHS) irá reagir com um grupo amino (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida estável. O peptídeo resultante tem uma fração diazirina fotolábil que, com exposição a luz UV, irá reagir com um grupo amino (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) do mesmo peptídeo para formar uma ligação estável, desse modo estabelecendo uma ligação covalente.

[0154]Reticuladores fotoreativos adicionais adequados incluem bis-[3-(4-azi- dosalicylamido)-etil]-disulfeto (BASED) e N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenil- amino)-hexanoato (SANPAH).

[0155]Além dos reticuladores heterobifuncionais, existe um número de outros agentes de reticulação que incluem os reticuladores homobifuncionais.

[0156]Os referidos incluem os reticuladores homobifuncionais para a formação de ligações entre dois grupos amino (-NH2).

[0157]Por exemplo, suberato de disuccinimidila (DSS) pode ser usado para formar uma reticulação entre a amina, por exemplo, de uma cadeia lateral Lys e a amina, por exemplo, de outra cadeia lateral Lys. Um éster de N-hidroxisuccinimida amina reativo (NHS) irá reagir com um grupo amino (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar uma ligação amida estável. O peptídeo resultante irá então reagir com outro grupo amina do mesmo peptídeo (por exemplo, aquele de um resíduo Lys) para formar a adicionalmente ligação amida estável, desse modo estabelecendo uma ligação covalente.

[0158]Reticuladores homobifuncionais adicionais adequados incluem bisma- leimidohexano (BMH) e dimetilpimelimidato (DMP).

[0159]Reticuladores homobifuncionais adicionais adequados incluem uma li-gação metilenoditioeter entre duas cisteínas. A reação do peptídeo com TBAF (fluo- reto de tetrabutilamônio) pode ser realizada em resina contendo o peptídeo parcial-mente desprotegido seguido por clivagem (vide, por exemplo, Ueki et al., (1999) Bio- org. Med. Chem. Lett., 9, 1767-1772 e Ueki et al. em Peptide Science, 1999, 539-541).

[0160]Sistemas de reticulação homobifuncionais adicionais adequados incluem reações de metátese de fechamento de anel entre alilglicinas (vide, por exemplo, Wels, B. et al., (2005) Bioorg. Med. Chem. 13, 4221-4227) ou aminoácidos modificados, por exemplo, (S)-Fmoc-a(2'pentenil)alanina (vide, por exemplo, Walensky, L.D., et al., (2004) Science 305, 1466-1470; Schafmeister, C.E., et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892; Qiu, W., et al., (2000) Tetrahedron 56, 2577-2582; Belokon, Y.N., et al., (1998) Tetrahedron: AsymMetri, 9, 4249-4252); Qiu W., (2008) Anaspec poster at 20th American Peptide Society Annual Meeting). As referidas reações podem ser realizadas em solução no fragmento de peptídeo protegido ou na resina, respectivamente.

[0161]Reticulador homo- e hetero-bifuncional pode compreender um braço ou ponte de espaçamento. A ponte é uma estrutura que conecta as duas extremidades reativas. O atributo mais aparente da ponte é o seu efeito no impedimento estérico. Em alguns casos, uma ponte mais longa pode mais facilmente expandir a distância necessária para ligar dois resíduos de aminoácido.

[0162]Embora uma ligação covalente entre 2 resíduos de aminoácido não contíguos possa proporcionar estabilização suficiente, os produtos imunogênicos da presente invenção podem compreender mais do que uma ligação covalente.

[0163]As condições que permitem que uma ligação se forme, serão, eviden-temente dependentes do tipo de ligação para formar e pode ser facilmente determinada por aqueles versados na técnica. Referência é feita à descrição de ligações e de suas químicas proporcionados aqui.

[0164]A formação de oligômero e de ligação pode ser usada de modo inde-pendente para garantir que os produtos imunogênicos da presente invenção tenham a desejada estrutura secundária. Assim, a presente invenção proporciona oligômeros de muteína Aβ com as referidas ligações e peptídeos Aβ muteína monoméricos tendo as referidas ligações.

[0165]Adicionalmente, a formação de oligômero e ligação pode ser usada para garantir que o produto imunogênico da presente invenção tenha a desejada estrutura secundária. Por exemplo, a formação de ligação pode ajudar a promover a adequada formação de oligômero e vice-versa.

[0166]Em princípio, a formação de oligômero pode preceder a formação de ligação. Isso é vantajoso se o oligômero pré-formado direciona ou promove as ligações a serem formadas. Alternativamente, a formação de ligação pode preceder a formação de oligômero. Isso é vantajoso se ligações pré-formadas direcionam ou promovem a formação de oligômero. A formação de oligômero e de ligação pode também ocorrer concomitantemente.

[0167]Ambos o peptídeo Aβ muteína e o oligômero podem ser preparados usando um peptídeo que difere a partir da sequência de aminoácido compreendida pelo produto imunogênico final. Por exemplo, o peptídeo iicial pode compreender ami- noácidos adicionais em seu C- e/ou N-termenos que então serão removidos durante a síntese, por exemplo, por clivagem proteolítica.

[0168]Em uma modalidade da presente invenção, oligômeros são formados com um peptídeo e subsequentemente estabilizados por uma ou mais ligação(s) co-valente intra-peptídeo.

[0169]Em outra modalidade da presente invenção, oligômeros são formados com um peptídeo, estabilizado por uma ou mais ligação(s) covalente intra-peptídeo e subsequentemente processado por meios químicos ou enzimáticos a uma forma trun-cada que melhor exibe os elementos estruturais relevantes. Alternativamente, oligô- meros são formados com um peptídeo, processado por meios químicos ou enzimáti- cos a uma forma truncada que melhor exibe elementos estruturais relevantes e sub-sequentemente estabilizados por um ou mais ligação(s) covalente intra-peptídeo.

[0170]Em ainda outra modalidade da presente invenção, um peptídeo é usado para formar os elementos estruturais relevantes, em que o peptídeo seria mantido em uma conformação adequada por um ou mais ligação(s) covalente intra-peptídeo, em vez de por interação com peptídeos adjacentes em um oligômero. É previsto que os referidos produtos imunogênicos, estabilizados com a ligação(s) covalente intra-pep- tídeo apropriada, irão apresentar os elementos estruturais relevantes como um monô- mero.

[0171]O termo "Aβ muteína" como usado aqui se refere a uma variante de polipeptídeo Aβ que difere a partir da proteína beta amiloide humana (Aβ) por uma ou mais substituições de aminoácido. Em particular, uma muteína Aβ é uma Aβ que difere a partir do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido determinada em SEQ ID NO:1 por uma, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais mutações pontuais. As referidas mutações pontuais são preferivelmente localizadas em hot spots dentro de Aβ (1833), Aβ (18- 25), Aβ (19-24) e especialmente de modo preferido dentro de Aβ (20-22).

[0172]Exemplos de substituições de aminoácido que podem estar presentes em sequências de aminoácido Aβ compreendidas pelos produtos imunogênicos des-critos aqui são resumidos na Tabela 1.

[0173]Tabela 1: Exemplos de substituições de aminoácido presentes em sequências de aminoácido Aβ de acordo com a presente invenção. Substituições de aminoácido que são preferidas em seus respectivos hot spots são indicadas em negrito.

[0174]Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácido Aβ compreendida pelo produto imunogênico descrito aqui é uma variante de Aβ (18-33) que difere a partir da sequência de aminoácido determinada em SEQ ID NO:2 por um, dois, três, quatro, cinco ou seis aminoácidos sendo substituído por outro aminoácidos.As referidas substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir de mutações pontuais determinadas na Tabela 1. Por exemplo, onde a sequência de aminoá- cido Aβ compreendida pelo produto imunogênico descrito aqui difere a partir da sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 por ter duas substituições de aminoácido, uma ou ambas das referidas substituições de aminoácido pode ser selecionada a partir de mutações pontuais determinadas na Tabela 1. As referidas duas substituições de aminoácido são preferivelmente em t hot spots que correspondem às posições de aminoácido E22/G25, F20/E22, F20/I31, A21/E22, A21/D23 e E22/S26 de SEQ ID NO:2, em particular em hot spots que corresponde às posições de aminoácido E22/G25 e F20/E22. Onde a sequência de aminoácido Aβ compreendida pelo produto imunogênico descrito aqui difere a partir da sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 por ter três, quatro, cinco ou seis substituições de aminoácido, uma ou mais do que uma, ou todas as referidas substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir de mutações pontuais determinadas na Tabela 1.

[0175]Em modalidades particulares da presente invenção, a sequência de aminoácido Aβ compreendida pelo produto imunogênico descrito aqui difere a partir da sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 por ter uma substituição de aminoácido selecionada a partir de E22A e E22V.

[0176]Em modalidades particulares adicionais da presente invenção, a se-quência de aminoácido Aβ compreendida pelo produto imunogênico descrito aqui di-fere a partir da sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 por ter duas substituições de aminoácido selecionadas a partir das mutações duplas F20G/E22A e E22A/G25A.

[0177]Em um aspecto relacionado da presente invenção, a sequência de ami- noácido Aβ compreendida pelo produto imunogênico descrito aqui difere a partir da sequência de aminoácido V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G29A30I31I32G33 (SEQ ID NO:2; Aβ (18-33)]), por um, dois, três, quatro, cinco ou seis aminoácidos sendo subs-tituídos por diferentes aminoácidos. Exemplos das referidas sequências de aminoácido compreendem as sequências de aminoácido, em que

[0178]O aminoácido que corresponde a V18 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, prolina, fenilalanina, tirosina e triptofano;

[0179]O aminoácido que corresponde a F19 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, alanina, glicina, prolina, valina, leucina, meti- onina e isoleucina;

[0180]O aminoácido que corresponde a F20 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, prolina, alanina, glicina, valina, leucina, meti- onina e isoleucina;

[0181]O aminoácido que corresponde a A21 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, glicina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâ- mico, fenilalanina, tirosina e triptofano;

[0182]O aminoácido que corresponde a E22 é selecionado a partir do grupo que consiste de valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, serina, treonina, prolina e glutamina;

[0183]O aminoácido que corresponde a D23 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenila- lanina, tirosina, triptofano, prolina, cisteína, asparagina, serina, treonina e glutamina;

[0184]O aminoácido que corresponde a V24 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, prolina, fenilalanina, tirosina e triptofano;

[0185]O aminoácido que corresponde a G25 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenila- lanina, tirosina, triptofano, prolina, ácido aspártico e ácido glutâmico;

[0186]O aminoácido que corresponde a S26 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, tirosina, triptofano;

[0187]O aminoácido que corresponde a N27 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenila- lanina, tirosina, triptofano, prolina, ácido aspártico e ácido glutâmico;

[0188]O aminoácido que corresponde a K28 é selecionado a partir do grupo que consiste de ácido aspártico, ácido glutâmico, alanina, glicina, valina, leucina, me- tionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, cisteína, asparagina, serina, treonina e glutamina;

[0189]O aminoácido que corresponde a G29 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenila- lanina, tirosina, triptofano e prolina;

[0190]O aminoácido que corresponde a A30 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, glicina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano e prolina;

[0191]O aminoácido que corresponde a l31 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, aspa- ragina, serina, treonina, glutamina, prolina, fenilalanina, tirosina e triptofano;

[0192]O aminoácido que corresponde a l32 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, aspa- ragina, serina, treonina, glutamina, prolina, fenilalanina, tirosina e triptofano;

[0193]O aminoácido que corresponde a G33 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, valina, leucina, metionina, isoleucina,fenilalanina, tirosina, triptofano e prolina;

[0194]O aminoácido que corresponde a F20 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, prolina, alanina, glicina, valina, leucina, meti- onina e isoleucina; e o aminoácido que corresponde a E22 é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina, valina, prolina, fenilalanina, metionina, isoleucina, trip- tofano, cisteína, asparagina, serina, treonina, tirosina e leucina;

[0195]O aminoácido que corresponde a F20 é glicina e o aminoácido que cor-responde a E22 é alanina;

[0196]O aminoácido que corresponde a F20 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, asparagina, serina, treonina, glutamina, prolina, alanina, glicina, valina, leucina, meti- onina e isoleucina; e o aminoácido que corresponde a l31 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cis- teína, asparagina, serina, treonina, glutamina, prolina, fenilalanina, tirosina e tripto- fano;

[0197]O aminoácido que corresponde a A21 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, glicina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâ- mico, fenilalanina, tirosina e triptofano; e o aminoácido que corresponde a E22 é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina, valina, prolina, fenilalanina, metio- nina, isoleucina, triptofano, cisteína, asparagina, serina, treonina, tirosina e leucina;

[0198]O aminoácido que corresponde a A21 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, glicina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâ- mico, fenilalanina, tirosina e triptofano; e o aminoácido que corresponde a D23 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, cisteína, asparagina, serina, treonina e glutamina;

[0199]O aminoácido que corresponde a E22 é selecionado a partir do grupo que consiste de valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, serina, treonina, prolina e glutamina; e o aminoácido que corresponde a G25 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, ácido aspártico e ácido glutâmico; ou

[0200]O aminoácido que corresponde a E22 é selecionado a partir do grupo que consiste de valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, serina, treonina, prolina e glutamina; e o aminoácido que corresponde a S26 é selecionado a partir do grupo que consiste de histidina, arginina, lisina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, tirosina, triptofano.

[0201]Mais especificamente, os produtos imunogênicos da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácido β (Aβ) amiloide que é idêntico para a porção (X-Y) de uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que con-siste de:

[0202]D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18A19F20A21E22D23V24 G25S26N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:13; Aβ(1- 43)F19A];D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19A20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:14; Aβ(1-43)F20A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:15; Aβ(1-43)E22A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21F22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:16; Aβ(1-43)E22F]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21V22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:17; Aβ(1-43)E22V]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21L22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:18; Aβ(1-43)E22L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22K23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:19; Aβ(1-43)D23K]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22L23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:20; Aβ(1-43)D23L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24V25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:21; Aβ(1-43)G25V]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G2 9G30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:22; Aβ(1-43)A30G]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19G20A21A22D23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:23; Aβ(1-43)F20G E22A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19A20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30A31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:24; Aβ(1-43)F20A I31A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19C20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30C31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:25; Aβ(1-43)F20C I31C]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20Q21L22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:26; Aβ(1-43)A21Q E22L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20L21Q22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:27; Aβ(1-43)A21L E22Q]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20Q21E22N23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:28; Aβ(1-43)A21Q D23N]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24A25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:29; Aβ(1-43)E22A G25A]; e D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25A26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:30; Aβ(1-43)E22A S26A],

[0203]em que X é selecionado a partir do grupo que consiste dos números 1.. 18, 4 .. 18, 12 .. 18 ou 18 e Y é selecionado a partir do grupo que consiste dos números 33 .. 43, 33 .. 42, 33 .. 41, ou 33 .. 40 . Em uma modalidade particular, (X-Y) é selecionado a partir do grupo que consiste de (1-42), (4-42), (12-42), ou (18- 42).

[0204]Os produtos imunogênicos da presente invenção são, em particular, oli- gômeros que compreendem uma pluralidade de sequência de aminoácido β amiloide (Aβ) particular como definido acima.

[0205]A presente invenção também se refere a produtos imunogênicos purifi-cados da presente invenção. De acordo com uma modalidade da presente invenção, um produto imunogênico purificado é um que tem uma pureza de mais do que 80 % em peso de peptídeo Aβ total, preferivelmente de mais do que 90 % em peso de pep- tídeo Aβ total, preferivelmente de mais do que 95 % em peso de peptídeo Aβ total.

[0206]Pode ser conveniente que os produtos imunogênicos da presente in-venção compreendem, em adição à sequência de aminoácido derivada de β amiloide, uma ou mais frações adicionais. Por exemplo, as aplicações em diagnóstico podem requerer a marcação dos produtos imunogênicos. Também, em imunização ativa pode ser de vantagem se fixar as frações que provaram ser convenientes em aplicações em imunização ativa.

[0207]Assim, a presente invenção também se refere a produtos imunogêni- cos, como definido aqui, que compreendem um grupo covalentemente ligado que fa-cilita a detecção, preferivelmente um fluoróforo, por exemplo, isotiocianato de fluores- ceína, ficoeritrina, Alexa-488, proteína fluorescente de Aequorea victoria, proteína flu-orescente de Dictyosoma ou qualquer combinação ou derivados ativos de fluorescência dos mesmos; um cromóforo; um quimioluminóforo, por exemplo, luciferase, prefe-rivelmente Photinus pyralis luciferase, Vibrio fischeri luciferase, ou qualquer combinação ou derivado ativo de quimioluminescência dos mesmos; um grupo enzimatica- mente ativo, por exemplo, peroxidase, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, ou qualquer derivado enzimaticamente ativo do mesmo; um grupo eletron-denso, por exemplo, um grupo que contém metal pesado, por exemplo, um grupo que contém ouro; um hapteno, por exemplo, um hapteno derivado de fenol; uma estrutura fortemente antigênica, por exemplo, sequência de peptídeo prevista ser antigênica, por exemplo, prevista ser antigênica pelo algoritmo de Kolaskar e Tongaonkar; uma molécula que ajuda a suscitar uma resposta imune aos produtos imunogênicos, por exemplo, albumina do soro, ovalbumina, hemocianina de chavehole limpet, tiroglobu- lina, um toxóide a partir de bactéria tal como toxóide tetânico e toxóide diftérico, um epítopo de célula T de ocorrência natural, um epítopo de célula T auxiliadora de ocorrência natural; um epítopo de célula T artificial, tal como o epítopo pan DR ("PADRE"; WO 95/07707), ou outro agente imunoestimulatório, por exemplo, manano, tripalmitoil- S-glicerina cisteína e semelhante; um aptâmero para outra molécula; um grupo que- lante, por exemplo, hexahistidinil; uma estrutura de proteína derivada da natureza ou natural que media as interações adicionais específicas de proteína-proteína, por exemplo, um membro do par fos/jun; um grupo magnético, por exemplo, um grupo ferromagnético; ou um grupo radioativo, por exemplo, um grupo que compreende 1H, 14C, 32P, 35S ou 1251 ou qualquer combinação dos mesmos. Com um propósito de evitar o trajeto Th-1 da resposta imune pró-inflamatória, os produtos imunogênicos que compreendem a molécula que é capaz de direcionar a resposta imune ao trajeto antiinflamatório (trajeto Th2), por exemplo, moléculas que compreendem um epítopo de célula B tal como PADRE são esperadas proporcionar vantagens particulares em imunização ativa (vide também, PetrushinaI., et al., The Journal of Neuroscience 2007, 27(46): 12721-12731; Woodhouse A., et al., Drugs Aging 2007; 24(2): 107-119).

[0208]Os referidos grupos e métodos para a ligação dos mesmos aos produtos imunogênicos são conhecidos na técnica.

[0209]Os produtos imunogênicos da presente invenção têm muitas utilidades. Por exemplo, os mesmos podem ser usados em: 1) terapias de intervenção com base em imunização (por exemplo, os produtos imunogênicos podem ser usados em imu-nização ativa para tratar ou evitar uma amiloidose); 2) teste diagnóstico (por exemplo, os produtos imunogênicos podem ser usados para diagnosticar uma amiloidose; 3) proporcionar agentes tais como anticorpos e aptâmeros que se ligam aos produtos imunogênicos; e 4) pesquisa de configuração com base em estrutura com base em NMR ou cristalográfica para o desenvolvimento de agentes tais como anticorpos e aptâmeros que se ligam ao produtos imunogênicos.

[0210]Em imunização ativa, globulômero Aβ (20 - 42) foi mostrado ser eficaz em reverter defeitos cognitivos em Doença de Alzheimer Doença em ratos transgêni- cos. Os produtos imunogênicos da presente invenção são capazes de suscitar uma resposta imune cujo perfil é similar ao perfil da resposta imune suscitada pelo globu- lômero Aβ (20 - 42).

[0211]Assim, a presente invenção também se refere aos produtos imunogêni- cos como definidos aqui para usos terapêuticos.

[0212]Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma composição que compreende um produto imunogênico como descrito aqui, em particular uma compo-sição que é uma vacina, isto é, pode ser usada para imunização ativa. De acordo com uma modalidade particular, as referidas composições são composições farmacêuticas que adicionalmente compreendem um veículo farmacêutico aceitável. A composição pode adicionalmente compreender um adjuvante farmacêutico aceitável tal como o Adjuvante Completo de Freund (CFA) ou um adjuvante que compreende um sal de alumínio.

[0213]A presente invenção também se refere a um método de tratar ou evitar uma amiloidose em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende admi-nistrar uma quantidade eficaz de produto imunogênico como descrito aqui ao indivíduo. Preferivelmente, o produto é para imunização ativa.

[0214]Em um aspecto relacionado, a presente invenção se refere a um produto imunogênico como descrito aqui para uso em tratar ou evitar uma amiloidose e em particular para imunização ativa.

[0215]O termo "amiloidose" aqui denota a número de desordens caracteriza-das por duplicação anormal, agrupamento, agregação e/ou acumulação de proteínas particulares (amiloides, proteínas fibrosas e seus precursores) em vários tecidos do corpo. Em Doença de Alzheimer e em Síndrome de Down, o tecido nervoso é afetado e em angiopatia amiloide cerebral (CAA) os vasos sanguíneos são afetados. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, uma amiloidose é selecionada a partir do grupo que consiste de Doença de Alzheimer (AD) e a amiloidose de Síndrome de Down.

[0216]No contexto de imunização ativa, é particularmente preferido que o pro-duto imunogênico não seja capaz de entrar no SNC do paciente em significantes quan-tidades.

[0217]É também particularmente preferido que a composição farmacêutica que compreende o produto imunogênico seja capaz de induzir uma forte resposta imune contra oligômeros Aβ, preferivelmente uma forte resposta imune direcionada contra oligômeros Aβ apenas, mais preferivelmente uma forte resposta imune com base em anticorpo não inflamatória contra oligômeros Aβ apenas. Assim, em uma modalidade da presente invenção a composição farmacêutica compreende um adjuvante imunológico, preferivelmente um adjuvante e uma molécula de sinalização, por exemplo, uma citocina, que direciona a resposta imune em direção ao tipo com base em anticorpo não inflamatória. Os referidos adjuvantes e moléculas de sinalização são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[0218]É particularmente preferido que a composição farmacêutica para imu-nização ativa seja administrada por meio de uma via selecionada a partir do grupo que consiste de via intravenosa, a via intramuscular, a via subcutânea, a via intranasal e por inalação. É também particularmente preferido que a composição seja administrada por um método selecionado a partir de injeção, infusão de bolus e infusão contínua, cada um dos quais pode ser realizado uma vez, repetidamente ou em intervalos regulares.

[0219]Em uma modalidade particular da presente invenção, a infusão a longo prazo contínua é alcançada por empregar um dispositivo implantável. Em uma moda-lidade adicional particular da presente invenção, a composição é aplicada como uma formulação de liberação sustentada implantável ou como uma formulação de depot de liberação controlada. Formulações adequadas e dispositivos são conhecidos daqueles versados na técnica. Os detalhes do método a ser usado para qualquer determinada via dependerá do estágio e da gravidade da doença e dos parâmetros médicos gerais do indivíduo e são preferivelmente decididos individualmente a critério do médico ou do veterinário.

[0220]Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção, a composição farmacêutica para imunização ativa compreende uma ou mais substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste de conservantes farmaceuticamente aceitáveis, colorantes farmaceuticamente aceitáveis, coloides de proteção farmaceu- ticamente aceitáveis, reguladores de pH farmaceuticamente aceitáveis e reguladores de pressão osmótica farmaceuticamente aceitáveis. As referidas substâncias são des-critas na técnica.

[0221]Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" se refere a uma quanti-dade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou melhorar a gravidade e/ou a duração de uma desordem ou um ou mais sintomas dos mesmos, evitar o avanço de uma desordem, causar a regressão de uma desordem, evitar a recorrência, desenvol-vimento, início ou progressão de um ou mais sintomas associados com uma desordem, detectar a desordem, ou aumentar ou aprimorar o(s) efeito(s) profilático ou terapêutico de outra terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico).

[0222]Em linha com a hipótese de globulômero, acredita-se que indivíduos que sofrem a partir de uma amiloidose que desenvolve uma resposta imune contra epítopos endógenos de globulômero. Na medida em que os produtos imunogênicos da presente invenção reagem com anticorpos que são especificamente reativos com os referidos epítopos acredita-se que os oligômeros exibam o mesmo epítopo ou um epítopo muito similar.

[0223]A presente invenção assim também se refere aos produtos imunogêni- cos como definido aqui para usos diagnósticos.

[0224]Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método de diag-nosticar uma amiloidose que compreende proporcionar uma amostra a partir do indi-víduo com suspeita de ter a amiloidose, colocar em contato a amostra com um produto imunogênico como descrito aqui por um tempo e sob condições suficientes para a formação de um complexo que compreende o produto e um anticorpo, a presença do complexo indicando o indivíduo tem a amiloidose. De acordo com uma modalidade particular, pelo menos a etapa de colocar em contato a amostra é realizada ex vivo e em particular in vitro.

[0225]Em um aspecto relacionado, a presente invenção se refere a um produto imunogênico como descrito aqui para uso em diagnosticar uma amiloidose.

[0226]Assim, os produtos imunogênicos da presente invenção podem ser usa-dos em uma variedade de métodos e testes de diagnóstico.

[0227]De acordo com uma modalidade, o método de diagnosticar uma amiloi- dose em um paciente com suspeita de ter a referida doença compreende as etapas de: a) isolar uma amostra biológica a partir do paciente; b) colocar em contato a amostra biológica com um produto imunogênico da presente invenção por um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos de anticorpo/produto; c) adicionar um conjugado aos complexos de anticorpo/produto resultantes por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o conjugado se ligue ao anticorpo ligado, em que o conjugado compreende um anticorpo fixado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e d) detectar a presença de anticorpos que podem estar presentes na amostra biológica por detectar um sinal gerado pelo composto de geração de sinal, o sinal indicando um diagnóstico de uma amiloidose no paciente. De acordo com uma modalidade particular, pelo menos uma das etapas b), c) e d) é realizada ex vivo e em particular in vitro. De acordo com a modalidade adicional particular, o método não compreende a etapa a).

[0228]De acordo com a adicionalmente modalidade, o método de diagnosticar uma amiloidose em um paciente com suspeita de ter a referida doença compreende as etapas de: a) isolar a amostra biológica a partir do paciente; b) colocar em contato a amostra biológica com anti-anticorpo específico para anticorpos em uma amostra por um tempo e sob condições suficientes para permitir a formação de complexos anti- anticorpo/anticorpo; b) adicionar um conjugado aos complexos anti-anticorpo/anti- corpo resultantes por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o conjugado se ligue ao anticorpo ligado, em que o conjugado compreende um produto imunogênico da presente invenção fixado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e c) detectar um sinal gerado pelo composto de geração de sinal, o sinal indicando um diagnóstico de uma amiloidose no paciente. De acordo com uma modalidade particular, pelo menos uma das referidas etapas b) e c) é realizada ex vivo e em particular in vitro. De acordo com a modalidade adicional particular, o método não compreende a etapa a).

[0229]Mais especificamente, na medida em que os produtos imunogênicos da presente invenção exibem o epítopo de globulômero e acredita-se que o epítopo de globulômero seja um antígeno endógeno que acarreta em uma resposta imune endó-gena, o diagnóstico de amiloidoses pode estar relacionado à determinação da pre-sença de auto-anticorpos que especificamente se ligam aos produtos imunogênicos da presente invenção.

[0230]A presente invenção assim também se refere ao uso dos produtos imu- nogênicos como definidos aqui para a preparação de uma composição para detectar em um indivíduo auto-anticorpos que se ligam ao produto imunogênico. Assim sendo, a presente invenção também se refere a um método de detectar auto-anticorpos em um indivíduo, cujo método compreende administrar ao indivíduo um produto imuno- gênico como definido aqui e detectar um complexo formado pelo anticorpo e o produto imunogênico, a presença do complexo indicando a presença dos auto-anticorpos. De acordo com uma modalidade particular, pelo menos a etapa de colocar em contato a amostra é realizada ex vivo e em particular in vitro. Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo está com suspeita de ter qualquer forma de amiloidose, por exemplo, Doença de Alzheimer e detectar auto-anticorpos é para diagnosticar a presença ou ausência de qualquer forma de amiloidose, por exemplo, Doença de Al-zheimer, no indivíduo.

[0231]O termo "amostra", como usado aqui, é usado em seu sentido mais am-plo. Uma "amostra biológica", como usado aqui, inclui, mas é não limitado a qualquer quantidade de uma substância a partir de um ser vivo ou de um ser que já foi vivo. Os referidos seres vivos incluem, mas não são limitados a seres humanos, camundongos, ratos, macacos, cães, coelhos e outros animais. As referidas substâncias incluem, mas não são limitadas a sangue, soro, urina, fluido sinovial, células, órgãos, tecidos, medula óssea, nodos linfáticos e baço.

[0232]Amostras adequadas incluem em particular fluidos biológicos que podem ser testados nos métodos descritos aqui. Os referidos incluem plasma, sangue total, sangue total seco, soro, fluido cerebrospinal ou extratos aquosos ou organo- aquosos de tecidos e células.

[0233]É particularmente preferido se o indivíduo com suspeita de ter uma ami- loidose for um indivíduo tendo a amiloidose ou estando em grande risco de ter a ami- loidose.

[0234]De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, de-tectar auto-anticorpos como descrito aqui adicionalmente compreende um pré-trata-mento de uma preparação (amostra) que causa dissociação dos complexos de auto- anticorpo/antígeno. Um método que compreende um referido pré-tratamento pode, portanto, ser usado de modo a determinar a quantidade total de auto-anticorpos pre-sentes na preparação (amostra) enquanto um método que não compreende o referido pré-tratamento pode ser usado de modo a determinar a quantidade de auto-anticorpos que pode ainda se ligar ao antígeno. Adicionalmente, ambos os métodos irão permitir indiretamente determinar a quantidade de auto-anticorpos complexados.

[0235]Condições adequadas para induzir a dissociação dos complexos de auto-anticorpo/antígeno são conhecidas daqueles versados na técnica. Por exemplo, tratar a preparação (amostra) com ácido, por exemplo, usando um tampão de modo que o pH da preparação resultante (amostra) é na faixa de 1 a 5, preferivelmente na faixa de 2 a 4 e em particular na faixa de 2 a 3, pode ser conveniente. Tampões ade-quados incluem sais em uma concentração fisiológica, por exemplo, NaCI e ácido acético. Um método para a separação de complexos de anticorpo/antígeno foi descrito em WO 2005/037209, que é aqui incorporado em sua totalidade.

[0236]Em suma, a dissociação do anticorpo a partir do antígeno no complexo de anticorpo/antígeno compreende as etapas de: colocar em contato a amostra con-tendo um complexo de anticorpo/antígeno com um tampão de dissociação; incubar a amostra; e opcionalmente concentrar a amostra.

[0237]O tampão de dissociação pode ser um tampão de Tampão de PBS que tem a pH na faixa como indicado aqui. Por exemplo, um tampão de PBS contendo cerca de 1,5 % de BSA e 0,2 M de glicina-acetato pH 2,5, ou 140 mM de NaCI e 0,58 % de ácido acético é adequado.

[0238]A incubação por diversas minutos, por exemplo, tal como 10 a 30, por exemplo, 20 minutos a uma temperatura na faixa de 20 a 40 °C provou ser suficiente.

[0239]A concentração pode ser alcançada em a modo conhecido em si, por exemplo, por passar a amostra sobre a Centriprep YM30 (Amincon Inc.).

[0240]Em uma modalidade da presente invenção, os produtos imunogênicos da presente invenção são revestidos em uma fase sólida. A amostra (por exemplo, sangue total, fluido cerebrospinal, soro, etc.) é então posta em contato com a fase sólida. Se os anticorpos, por exemplo, os auto-anticorpos, estão presentes na amostra, os referidos anticorpos se ligam ao produto imunogênico na fase sólida e são então detectados seja por um método direto ou indireto. O método direto compreende simplesmente detectar a presença do complexo em si e assim a presença dos anti-corpos. No método indireto, um conjugado é adicionado ao anticorpo ligado.

[0241]O conjugado compreende um segundo anticorpo, que se liga ao primeiro anticorpo ligado, fixado a um composto gerador de sinal ou marcação. Caso o segundo anticorpo se ligue a um primeiro anticorpo ligado, o composto gerador de sinal gera um sinal mensurável. O referido sinal então indica a presença dos primeiros anticorpos na amostra.

[0242]Exemplos de fase sólidas usados em imunoteste de diagnóstico são os materiais porosos e não porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropar- tículas (vide Patente U.S. No. 5,705,330), contas, membranas, cavidades de microti- tulação e tubos de plástico. A escolha do material de fase sólida e do método de mar-cação do antígeno ou dos anticorpos presentes no conjugado, se desejado, são de-terminados com base nas características de desempenho do formato de teste dese-jado.

[0243]Como observado aqui, o conjugado (ou reagente indicador) irá compre-ender um anticorpo (ou talvez anti-anticorpos, dependendo do teste), fixado a um com-posto gerador de sinal ou de "marcação". O referido composto gerador de sinal ou de marcação é em si detectável ou pode ser reagido com um ou mais compostos adicio-nais para gerar um produto detectável. Exemplos de compostos geradores de sinal são descritos aqui e em particular incluem cromóforos, radioisótopos (por exemplo, 1251, 1311, 32P, 3H, 35S e 14C), compostos quimioluminescentes (por exemplo, acri- díno), partículas (visíveis ou fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes de complexação, ou catalisadores tais como enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, peroxidase de rábano silvestre, beta-galactosidase e ribonuclease). No caso de uso de enzima (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre), a adição de um substrato de cromo-, fluro-, ou lumo-gênico resulta na geração de um sinal detectável. Outros sistemas de detecção tais como fluorescência resolvida no tempo, fluorescência de reflexão interna, amplificação (por exemplo, reação e cadeia de polimerase) e espectroscopia de Raman são também úteis.

[0244]Kits são também incluídos dentro do âmbito da presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção inclui kits para determinar a presença de anti-corpos tais como auto-anticorpos em um indivíduo. Em particular, um kit para determinar a presença dos referidos anticorpos em uma amostra compreende a) um produto imunogênico como definido aqui; e opcionalmente b) um conjugado que compreende um anticorpo fixado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável. O kit pode também conter um controle ou calibrador que compreende um reagente que se liga ao antígeno.

[0245]A presente invenção também inclui outro tipo de kit para detectar anti-corpos tais como auto-anticorpos em uma amostra. O kit pode compreender a) um anti-anticorpo específico para o anticorpo de interesse e b) um produto imunogênico como definido aqui. Um controle ou calibrador que compreende um reagente que se liga ao produto imunogênico pode também ser incluído. Mais especificamente, o kit pode compreender a) um anti-anticorpo específico para o auto-anticorpo e b) um conjugado que compreende o produto imunogênico, o conjugado sendo fixado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável. Mais uma vez, o kit pode também compreender um controle ou calibrador que compreende um reagente que se liga ao antígeno.

[0246]O kit pode também compreender um recipiente tal como a frasco, garrafa ou tira, com cada recipiente com uma fase sólida pré-ajustada e outros recipientes contendo os respectivos conjugados. Os referidos kits podem também conter frascos ou recipientes de outros reagentes necessários para realizar o teste, tal como lavagem, processamento e indicadores de reagente.

[0247]Os produtos imunogênicos da presente invenção são também úteis para proporcionar agentes que são capazes de se ligar aos produtos imunogênicos. Os referidos agentes incluem, por exemplo, anticorpos (daqui em diante também referido como anticorpo anti-produto), moléculas de ligação a não-anticorpo (tal como afficorpos, moléculas de afinila, AdNectinas, Anticalinas, DARPins, anticorpos de do-mínio, evicorpos, knotinas, domínios do tipo Kunitz, maxicorpos, tetranectinas, trans- corpos e V(NAR)s, como descrito, por exemplo, no Handbook of Therapeutic Antibo-dies, ed. por Stefan Dubel, Volume II, Capítulo 7, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007), aptâmeros ou compostos de baixo peso molecular.

[0248]Em um aspecto, a presente invenção assim se refere ao uso dos pro-dutos imunogênicos para a triagem de um agente que é capaz de se ligar ao produto imunogênico. Assim sendo, a presente invenção também se refere a um método de identificar um agente capaz de se ligar a um produto imunogênico como descrito aqui, cujo método compreende as etapas de: a) expor um ou mais agentes de interesse ao produto por um tempo e sob condições suficientes para os um ou mais agentes se ligarem ao produto; e b) identificar os referidos agentes que se ligam ao produto.

[0249]O referido agente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de um anticorpo, uma molécula de ligação a não-anticorpo, um aptâmero ou um composto de baixo peso molecular.

[0250]Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso dos produtos imunogênicos para enriquecer um agente que é capaz de se ligar ao produto imuno- gênico em uma preparação que compreende o referido agente. Assim sendo, a pre-sente invenção também se refere a um método de enriquecer o referido agente em uma preparação que compreende o referido agente, cujo método compreende as etapas de: a) expor ao produto imunogênico a preparação que compreende o agente que é capaz de se ligar ao produto imunogênico por um tempo e sob condições sufi-cientes para o agente se ligar ao produto imunogênico; e b) obter o agente em forma enriquecida. Mais particularmente, o produto imunogênico pode ser imobilizado (por exemplo, em uma resina), que permite que o agente seja capturado. Obter o agente em forma enriquecida pode então compreender a dessorção do agente capturado, preferivelmente de tal modo que a dessorção do agente capturado compreende colocar em contato o agente capturado com um tampão com alto teor de sal ou uma solução acídica. O referido método pode, por exemplo, ser usado para enriquecer auto- anticorpos como descrito aqui por submeter preparações de imunoglobulina comercial tal como IVIG ou Octagam® (Octapharma Inc. Vienna, Austria) ao referido método. Acredita-se que as referidas preparações imunoglobulina contenham auto-anticorpos para Aβ e por tratar indivíduos se eleva o nível de anti-Aβ anticorpos em seu corpo. A preparação que é enriquecida para os referidos auto-anticorpos seria esperada ser mais eficaz.

[0251]Em um aspecto adicional, a presente invenção assim se refere ao uso dos produtos imunogênicos para proporcionar um anticorpo que se liga aos produtos imunogênicos. Assim sendo, a presente invenção proporciona um método de propor-cionar um anticorpo capaz de se ligar a um produto imunogênico da presente invenção, que compreende i)proporcionar um antígeno que compreende o produto; ii)expor um repertório de anticorpo ao referido antígeno; e iii)selecionar a partir do referido repertório um anticorpo que se liga ao produto.

[0252]Aqui deve ser entendido que um "repertório potencial de anticorpo" se refere a qualquer biblioteca, coleção, conjunto ou grupo de aminoácido ou sequências de ácido nucleico correspondente ou a qualquer gerador da referida biblioteca, coleção, conjunto ou grupo de sequências de aminoácido que pode ser usado para produzir um repertório de anticorpo in vivo ou in vitro. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o gerador é o sistema imune adaptativo de um animal, em particular a parte de produção de antígeno do sistema imune de um mamífero que gera diversidade de anticorpo por um processo de recombinação bem conhecido daqueles versados na técnica. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o gerador é um sistema para a inoculação de sequências de ácido nucleico aleatórias que pode então, por inserção em uma estrutura de anticorpo adequada, ser usado para produzir um repertório de anticorpo in vitro.

[0253]Em uma modalidade preferida da presente invenção, o repertório de anticorpo ou repertório potencial de anticorpo é exposto ao antígeno in vivo por imu-nização de um organismo com o referido antígeno. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o repertório potencial de anticorpo é uma biblioteca de ácidos nu- cleicos adequados que é exposta ao anticorpo por triagem de afinidade in vitro como descrito na técnica, por exemplo, um sistema de phage display e de panning.

[0254]Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona anticorpos que se ligam aos produtos imunogênicos como definido aqui.

[0255]Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo é ob-tido por um método que compreende selecionar o anticorpo a partir de um repertório ou repertório potencial como descrito aqui.

[0256]De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção proporciona anticorpos específicos de produto imunogênico. Os referidos incluem anticorpos particulares tendo uma afinidade comparativamente menor para ambas as formas monoméricas e fibrilloméricas de peptídeo Aβ do que para o produto imunogênico da presente invenção. Em determinadas modalidades, um anticorpo é dito se ligar especificamente a um antígeno quando o mesmo preferivelmente reconhece o seu antígeno alvo em um complexo de mistura de proteínas e/ou macromo- léculas.

[0257]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a afinidade do an-ticorpo ao produto imunogênico é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 100000 vezes maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a Aβ (1-42) monoméricas.

[0258]Em a modalidade preferida da presente invenção, a afinidade do anti-corpo ao produto imunogênico é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 100000 vezes maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a um Aβ (1-40) monoméricas.

[0259]Convenientemente, o anticorpo da presente invenção se liga a um ou, mais preferivelmente, ambos os monômeros com baixa afinidade, especialmente de modo preferido com a KD de 1 x10-8 M ou menor afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-8 M ou menor afinidade, com a KD de 1 x10-7 M ou menor afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-7 M ou menor afinidade, ou com a KD de 1 x10-6 M ou menor afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-5 M ou menor afinidade, ou com a KD de 1 x10-5 M ou menor afinidade.

[0260]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a afinidade do an-ticorpo ao produto imunogênico é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 100000 vezes maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a um Aβ (1-42) fibrilomérica.

[0261]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a afinidade do an-ticorpo ao produto imunogênico é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e especialmente de modo preferido pelo menos 100000 vezes maior do que uma afinidade de ligação do anticorpo a um Aβ (1-40) fibrilomérica.

[0262]Convenientemente, o anticorpo da presente invenção se liga a uma ou mais preferivelmente, ambas as fibrilas com baixa afinidade, especialmente de modo preferido com a KD de 1 x10-8 M ou menor afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-8 M ou menor afinidade, com a KD de 1 x10-7 M ou menor afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-7 M ou menor afinidade, ou com a KD de 1 x10-6 M ou menor afinidade, por exemplo, com a KD de 3x10-5 M ou menor afinidade, ou com a KD de 1 x10-5 M ou menor afinidade.

[0263]O termo "anticorpo", como usado aqui, amplamente se refere a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) compreendida de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), ou qualquer fragmento funcional, mutante, variante, ou derivação dos mesmos, que retém as características essenciais de ligação a epítopo de uma molécula de Ig. Os referidos formatos de fragmento fun-cional, mutante, variante, ou derivado de anticorpo são conhecidos na técnica. Moda-lidades não limitantes dos quais são discutidas abaixo. Um "anticorpo de comprimento total", como usado aqui, se refere a uma molécula Ig que compreende quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As cadeias são em geral ligadas uma a outro por meio de ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é compre-endida de uma região variável de cadeia pesada (também referido aqui como "cadeia pesada variável", ou abreviado aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domí-nios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (também referido aqui como "cadeia leve variável", ou abreviado aqui como LCVR ou VL) e a região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominada regiões de determinação de complementariedade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas a partir de amino-termenos para carboxi-termenos na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As moléculas de imuno- globulina podem ser de qualquer tipo de classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), (por exemplo, IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) ou subclasse.

[0264]Os termos "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simples-mente "porção de anticorpo "), "fração de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "fração de anticorpo "), como usado aqui, se refere a um ou mais frag-mentos de um anticorpo que retêm a capacidade de especificamente se ligar a um antígeno (isto é o produto imunogênico da presente invenção), isto é são fragmentos funcionais de um anticorpo. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por um ou mais fragmentos de um anticorpo de compri-mento total. As referidas modalidades de anticorpo podem também ser bispecíficas, dupla específicas, ou multi-específicas, especificamente se ligando a dois ou mais diferentes antígenos. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb {Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989; Winter et al, WO 90/05144 A1, aqui incorporado por referência), que compreende um único domínio variável; e (vi) uma região de determinação de complementariedade isolada (CDR). Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um elemento de ligação sintético que permite que os mesmos sejam produzidos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Os referidos anticorpos de cadeia única são também englobados dentro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como os diacorpos, são também englobados. Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespe- cíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia de poli- peptídeo, mas usando um elemento de ligação que é muito curto para permitir o pa- reamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçar os domínios a parear com domínios complementares de outra cadeia e criando dois campos de liga-ção a antígeno (vide, por exemplo, Holliger ef a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). As referidas porções de liga-ção um anticorpo são conhecidas na técnica (Konterman e Dubel eds., Antibody En-gineering, Springer-Verlag. New York. 790 pp., 2001, ISBN 3-540-41354-5).

[0265]O termo "anticorpo", como usado aqui, também compreende construto-res de anticorpo. O termo "construtor de anticorpo" como usado aqui se refere a um polipeptídeo que compreende uma ou mais das porções de ligação a antígeno da presente invenção ligadas a um elemento de ligação de polipeptídeo ou um domínio constante de imunoglobulina. Elementos de ligação de polipeptídeo compreendem dois ou mais resíduos de aminoácido unidos por ligações de peptídeo e são usados para ligar uma ou mais porções de ligação a antígeno. Os referidos elementos de ligação a polipeptídeo são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993; Poljak et al, estrutura 2: 11211123, 1994).

[0266]Um domínio constante de imunoglobulina se refere a domínio constante de cadeia pesada e cadeia leve. Sequências de aminoácido de domínio constante de cadeia leve e de cadeia pesada de IgG humano são conhecidas na técnica.

[0267]Ainda adicionalmente, a proteína de ligação da presente invenção (por exemplo, um anticorpo) pode ser parte de uma molécula de imunoadesão maior, for-madas por associação covalente ou não covalente de uma proteína de ligação da presente invenção com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos das referidas moléculas de imunoadesão incluem o uso de uma região de núcleo de es- treptavidina para fazer uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101, 1995) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma marcação de polihistidina C-terminal para produzir moléculas bivalentes e biotiniladas scFv (Kipriyanov et al., Mol. Imunol. 31: 1047-1058, 1994). Porções de anticorpo, tal como os fragmentos Fab e F(ab’)2, podem ser preparado a partir de anticorpos totais usando técnicas convencionais, tal como papaína ou digestão de pepsina, respectivamente, dos anticorpos totais. Ademais, anticorpos, porções de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinante padrão, como descrito aqui.

[0268]Um "anticorpo isolado", como usado aqui, é pretendido para se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes es-pecificidades antigênicas. Um anticorpo isolado que especificamente se liga ao produto imunogênico da presente invenção pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como globulômero Aβs, por exemplo, globulômero Aβ (20-42) ou outras formas de Aβ. Ademais, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos e/ou qualquer outra forma de Aβ alvo.

[0269]O termo "anticorpo humano", como usado aqui, é pretendido incluir an-ticorpos tendo regiões constante e variável derivadas a partir das sequências de imu- noglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos humanos da presente invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglo- bulina da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagê- nese aleatória ou específica de campo in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, em CDRs e em particular em CDR3. Entretanto, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, é não pretendido incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas a partir da linha germinal de outras espécies de mamífero, tal como um rato, foram enxertadas sobre sequências de estrutura humana.

[0270]O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, é preten-dido incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrito adi-cionalmente em Seção B, abaixo), anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante combinatorial (Hoogenboom, TIB Tech. 15: 62-70, 1997; Azzazy e Highsmith, Clin. Biochem. 35: 425-445, 2002; Gavilondo J.V. e Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H. e Chames P. (2000) Imuno- logy Today 21:371-378), anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um rato) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Tailor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellerman S-A. e Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Imunology Today 21:364-370) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Os referidos anticorpos recombinantes humanos têm regiões constante e variável derivadas a partir de sequências de imunoglo- bulina da linha germinal humana. Em determinadas modalidades, entretanto, os referidos anticorpos recombinantes humanos são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas a partir de e relacionadas às sequências VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de anticorpo da linha germinal humana in vivo.

[0271]O termo "anticorpo quimérico" se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada a partir de uma espécie e sequências de região constante a partir de outra espécie, tal como anticor-pos tendo regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada de murino ligados a regiões constantes humanas.

[0272]O termo "Anticorpo enxertado com CDR" se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada a partir de uma espécie mas na qual as sequências de uma ou mais das regiões de CDR de VH e/ou VL são substituídas com sequências de CDR de outra espécie, tal como anticorpos tendo CDRs de murino (por exemplo, CDR3) nas quais uma ou mais das regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada de murino foram substituídas com sequências de cadeia leve e de cadeia pesada humanas.

[0273]O termos "Numeração de Kabat", "definições de Kabat” e "marcação de Kabat" são usados de modo intercambiável aqui. Os referidos termos, que são reco-nhecidos na técnica, se referem a um sistema de numeração de resíduos de aminoá- cido que são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) do que outros resíduos de amino- ácido nas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno dos mesmos (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 e , Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interesse, Quinta edição, U.S. Department de Health e Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, a região hipervariável varia a partir de posições de aminoácido 31 a 35 para a CDR1, posições de aminoá- cido 50 a 65 para a CDR2 e posições de aminoácido 95 a 102 para a CDR3. Para a região variável de cadeia leve, a região hipervariável varia a partir de posições de aminoácido 24 a 34 para a CDR1, posições de aminoácido 50 a 56 para a CDR2 e posições de aminoácido 89 a 97 para a CDR3.

[0274]Como usado aqui, os termos "aceitante" e "anticorpo aceitante" se refere ao anticorpo ou sequência de ácido nucleico que proporciona ou codifica pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% das sequências de aminoácido de uma ou mais das regiões de estrutura. Em algumas modalidades, o termo "aceitante" se refere ao aminoácido do anticorpo ou sequência de ácido nucleico que proporciona ou codifica a(s) região(s) cons- tante(s). Em ainda outra modalidade, o termo "aceitante" se refere ao aminoácido do anticorpo ou sequência de ácido nucleico que proporciona ou codifica uma ou mais das regiões de estrutura e a(s) região(s) constante(s). Em uma modalidade específica, o termo "aceitante" se refere a um aminoácido de anticorpo humano ou sequência de ácido nucleico que proporciona ou codifica pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100% das sequências de aminoácido de uma ou mais das regiões de estrutura. De acordo com a referida modalidade, um aceitante pode conter pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácido que não ocorre em uma ou mais posições específicas de um anticorpo humano. Uma região de estrutura do aceitante e/ou região(s) constante(s) do aceitante pode ser, por exemplo, derivadas ou obtidas a partir de um gene de anticorpo da linha germinal, um gene de anticorpo maduro, um anticorpo funcional (por exemplo, anticorpos bem conhecido na técnica, anticorpos em desenvolvimento, ou anticorpos oferecidos no comércio).

[0275]Como usado aqui, o termo "CDR" se refere à região de determinação de complementariedade dentro de sequências variáveis de anticorpo. Há três CDRs em cada das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designados CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. O termo "conjunto de CDR" como usado aqui se refere a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de ligação ao antígeno. Os limites exatos das referidas CDRs foram definidos de modo diferente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) não só proporciona um sistema de numeração de resíduo não ambíguo aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também proporciona limites precisos dos resíduos que definem as três CDRs. As referidas CDRs podem ser referidas como as CDRs de Kabat. Chothia e coworkers (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) observou que determinadas sub-porções dentro das CDRs de Kabat adotam conformações de estrutura de peptídeo quase idênticas, apesar de terem uma grande diversidade a nível da sequência de aminoá- cido. As referidas sub-porções foram designadas como L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3 onde o "L" e o "H" designam as regiões de cadeia leve e de cadeias pesadas, respectivamente. As referidas regiões podem ser referidas como CDRs de Chothia, que têm limites que se sobrepõem com as CDRs de Kabat. Outro limites que definem as sobreposições de CDRs com as CDRs de Kabat foram descritos por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) e MacCallum (J Mol Biol 262(5)732-45 (1996)). Ainda outras definições do limite de CDR podem não estritamente seguir um dos sistemas acima, mas no entanto irá se sobrepor com as CDRs de Kabat, embora as mesmas possam ser encurtadas ou alongadas na luz dos achados de previsão ou experimentais de que resíduos particulares ou grupos de resíduos ou mesmo todas as CDRs não significan- temente impactam a ligação ao antígeno. Os métodos usados aqui podem utilizar as CDRs definidas de acordo com qualquer um dos referidos sistemas, modalidades particulares usando as CDRs definidas em Kabat ou Chothia.

[0276]Como usado aqui, o termo resíduo "canônico" se refere a um resíduo em uma CDR ou estrutura que define uma estrutura de CDR particular canônica como definido por Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992), ambos são incorporados aqui por referência). De acordo com Chothia et al., porções fundamentais das CDRs de muitos anticorpos têm conformações de estrutura de peptídeo quase idênticas apesar da grande diversidade a nível de se-quência de aminoácido. Cada estrutura canônica especifica principalmente um conjunto de ângulos de torsão de estrutura de peptídeo para um segmento contíguo de resíduos de aminoácido formando uma alça.

[0277]Como usado aqui, os termos "doador" e "anticorpo doador" se refere a um anticorpo que proporciona uma ou mais CDRs. Em uma modalidade, o anticorpo doador é um anticorpo a partir de uma espécie diferente a partir do anticorpo a partir do qual as regiões de estrutura são obtidas ou derivadas. No contexto de um anticorpo humanizado, o termo "anticorpo doador" se refere a um anticorpo não-humano que proporciona uma ou mais CDRs.

[0278]Como usado aqui, o termo "estrutura" ou "sequência de estrutura" se refere às sequências restantes da região variável menos as CDRs. Em virtude da exata definição de uma sequência de CDR poder ser determinada por diferentes sistemas, o significado da sequência de estrutura é submetido a interpretações de modo correspondente diferentes. As seis CDRs (CDR-L1, -L2 e -L3 de cadeia leve e CDR- H1, -H2 e -H3 de cadeia pesada) também dividem as regiões de estrutura na cadeia leve e na cadeia pesada em quatro sub-regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que a CDR1 é posicionada entre FR1 e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3 e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FR4, a região de estrutura, como referidas por outros, representa as FR's combinadas dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina de ocor-rência natural. Como usado aqui, a FR representa uma das quatro sub-regiões e FRs representa duas ou mais das quatro sub-regiões que constituem a região de estrutura.

[0279]Sequências aceitantes humanas de cadeia pesada e cadeia leve são conhecidas na técnica.

[0280]Como usado aqui, o termo "gene de anticorpo da linha germinal" ou "fragmento de gene" se refere a uma sequência de imunoglobulina codificada por cé-lulas não linfoides que não sofreram o processo de maturação que leva ao rearranjo genético e mutação para a expressão de uma imunoglobulina particular. (Vide, por exemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Imunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Uma das vantagens proporcionadas pelas várias modalidades da presente invenção se baseia a partir do reconhecimento de que os genes de anticorpo da linha germinal são mais prováveis do que os genes de anti-corpo maduro de conservar as características estruturais da sequência de aminoácido essencial de indivíduos na espécie, desse modo menos provável de ser reconhecido como uma fonte estranha quando usado terapeuticamente naquela espécie.

[0281]Como usado aqui, o termo resíduos "chave" se refere a determinados resíduos dentro da região variável que têm mais impacto na especificidade e/ou afini-dade de ligação de um anticorpo, em particular um anticorpo humanizado. Um resíduo chave inclui, mas não é limitado a um ou mais dos a seguir: um resíduo que é adjacente a uma CDR, um campo potencial de glicosilação (pode ser um campo de glico- silação ou N- ou O-), um resíduo raro, um resíduo capaz de interagir com o antígeno, um resíduo capaz de interagir com a CDR, um resíduo canônico, um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, um resíduo dentro da zona de Vernier e um resíduo em uma região que se sobrepõe entre a definição de Chothia de uma cadeia pesada variável CDR1 e a definição de Kabat da primeira estrutura de cadeia pesada.

[0282]Como usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" é um anticorpo ou a variante, derivado, análogo ou porção dos mesmos que imunoespecificamente se liga a um antígeno de interesse e que compreende a região de estrutura (FR) tendo subs-tancialmente a sequência de aminoácido de um anticorpo humano e a região de de-terminação complementar (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácido de um anticorpo não-humano. Como usado aqui, o termo "substancialmente" no con-texto de uma CDR se refere a uma CDR que tem uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à se-quência de aminoácido de uma CDR de anticorpo não-humano. Um anticorpo huma-nizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas das regiões de estrutura são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. De acordo com um aspecto, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imuno- globulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém não só a cadeia leve mas também pelo menos o domínio variável da cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões de CH1, articulação, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado apenas contém a cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado apenas contém a cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado apenas contém um domínio variável humanizado da cadeia leve e/ou da cadeia pesada.

[0283]O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, que inclui IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isotipo, que inclui sem limitação IgG 1, lgG2, lgG3 e lgG4. O anticorpo humanizado pode compre-ender sequências a partir de mais do que uma classe ou isotipo e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções executoras desejadas usando técnicas bem conhecidas na técnica.

[0284]As regiões de estrutura e de CDR de um anticorpo humanizado não precisam corresponder com precisão às sequências parentais, por exemplo, o anti-corpo doador CDR ou a estrutura de consenso pode sofrer mutação por substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido de modo que a CDR ou resíduo de estrutura naquele campo não corresponda ou ao anticorpo doador ou a estrutura de consenso. Em uma modalidade, as referidas mutações, entretanto, não serão extensivas. Em geral, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% dos resíduos de anticorpo humanizado irão corresponder àqueles de FR parental e das sequências de CDR. Como usado aqui, o termo "estrutura de consenso" se refere à região de estrutura na sequência de imunoglobulina de consenso. Como usado aqui, o termo "sequência de imunoglobulina de consenso" se refere a uma sequência formada a partir dos aminoácidos de ocorrência mais frequente (ou nucleotídeos) em uma família de sequências de imunoglobulina relacionadas (Vide, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Ver-lagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). Em uma família de imunoglobulinas, cada posição na sequência de consenso é ocupada pelo aminoácido de ocorrência mais frequente naquela posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem com igual frequência, qualquer um pode ser incluído na sequência de consenso.

[0285]Como usado aqui, zona de "Vernier" se refere a um subconjunto de re-síduos de estrutura que pode ajustar a estrutura da CDR e fazer a sintonia fina da adaptação ao antígeno como descrito por Foote e Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, que é aqui incorporada por referência). Os resíduos da zona de Vernier formam uma camada que recobre as CDRs e pode impactar na estrutura das CDRs e a afini-dade do anticorpo.

[0286]O termo "anticorpo", como usado aqui, também compreende proteínas de ligação multivalentes. O termo "proteína de ligação multivalente" é usado na presente especificação para denotar a proteína de ligação que compreende dois ou mais campos de ligação a antígeno. A proteína de ligação multivalente é modificada por engenharia genética para ter os três ou mais campos de ligação a antígeno e é em geral um anticorpo de ocorrência não natural. O termo "proteína de ligação multiespe- cífica" se refere a uma proteína de ligação capaz de ligação a dois ou mais alvos relacionados ou não relacionados. Proteínas de ligação de domínio variável duplo (DVD) como usado aqui, são proteínas de ligação que compreendem dois ou mais campos de ligação a antígeno e são tetravalentes ou proteínas de ligação multivalentes. As referidas DVDs podem ser monoespecíficas, isto é, capazes de ligação um antígeno ou multiespecífico, isto é, capaz de ligação a dois ou mais antígenos. As proteínas de ligação DVD que compreende dois polipeptídeos de cadeia pesada DVD e dois polipeptídeos de cadeia leve DVD são referidos como uma DVD Ig. Cada me-tade da DVD Ig compreende um polipeptídeo de cadeia pesada DVD e um polipeptí- deo de cadeia leve DVD e dois campos de ligação a antígeno. Cada campo de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve com um total de 6 CDRs envolvidas em campo de ligação a antígeno por ligação a antígeno. As proteínas de ligação DVD e métodos de produção das proteínas de ligação DVD são descritos no Pedido de Patente US No. 11/507,050 e aqui incorpo-rado por referência.

[0287]O termo "proteína de ligação marcada", como usado aqui, se refere a uma proteína de ligação com uma marcação incorporada que proporciona a identifi-cação da proteína de ligação. Da mesma forma, o termo "anticorpo marcado" como usado aqui, se refere a um anticorpo com uma marcação incorporada que proporciona a identificação do anticorpo. Em um aspecto, a marcação é um marcador detectável, por exemplo, incorporação de um aminoácido radiomarcado ou fixação a um polipep- tídeo de frações de biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos óticos ou colorimétricos). Exemplos de marca-ções para polipeptídeos incluem, mas não são limitadas aos a seguir: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm); marcações fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforo de lantanida), marcações enzimáticas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, luciferase, fos- fatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos biotinila; predeterminados epítopos de polipeptídeos reconhecidos por um reportador secundário (por exemplo, sequencias pares de zíper de leucina, campos de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, marcações de epítopo); e agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio.

[0288]O termo "anticorpo", como usado aqui, também compreende anticorpo conjugados. O termo "anticorpo conjugado" se refere a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, quimicamente ligado a uma segunda fração química, tal como um agente terapêutico.

[0289]Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer uma de um número de técnicas conhecidas na técnica.

[0290]Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma grande variedade de técnicas conhecidas na técnica que inclui o uso de hibridoma, tecnologias recombinantes e de phage display, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma que incluem as conhecida na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodides: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (as referidas referências incorporadas por referência em suas totalidades). O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui não é limitado a anti-corpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo que é derivado a partir de um único clone, que inclui qualquer clone eucariótico, procariótico, ou clone de fago e não o método pelo qual o mesmo é produzido.

[0291]Métodos para produzir e fazer a triagem para anticorpos específicos usando tecnologia de hibridoma são rotina e bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de gerar anticorpos monoclo- nais assim como anticorpos produzidos pelo método que compreende cultivar uma célula de hibridoma que secretam um anticorpo da presente invenção em que, por exemplo, o hibridoma é gerado por fusão de esplenócitos isolados a partir de um rato imunizado com um antígeno da presente invenção com células de mieloma e então fazer a triagem dos hibridomas que resultam a partir da fusão for clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar a um polipeptídeo da presente invenção. Em suma, camundongos podem ser imunizados com um produto imunogênico da pre-sente invenção. Em uma modalidade particular, o antígeno é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Os referidos adjuvantes incluem o adjuvante completo ou incompleto de Freund, RIBI (dipeptídeos muramila) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Os referidos adjuvantes podem proteger o polipeptí- deo a partir de rápida dispersão por sequestrar o mesmo em um depósito local, ou os mesmos podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que são quimiotácticos para os macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferivelmente, se um polipeptídeo está sendo administrado, o programa de imuni-zação irá envolver duas ou mais administrações do polipeptídeo, espalhadas por di-versas semanas.

[0292]Após a imunização de um animal com um produto imunogênico da pre-sente invenção, anticorpos e/ou células que produzem anticorpos podem ser obtidos a partir do animal. Um soro contendo anticorpo anti-produto- é obtido a partir do animal por sangramento ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado como é obtido a partir do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida a partir do soro, ou o anti-corpo anti-produtos pode ser purificado a partir do soro. Soro ou imunoglobulinas ob-tidas desse modo são policlonais, assim tendo uma estrutura de propriedades hetero-gêneas.

[0293]Uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para o produto imunogênico da presente invenção são detectados no soro do rato, o baço do rato é coletado e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bem conhecidas a quaisquer células de mieloma adequa-das, por exemplo, células a partir da linhagem celular SP20 oferecido pela ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então testados por métodos conhecidos na técnica para as células que secretam anticorpos capazes de ligação ao produto imunogênico da presente invenção. Fluido de ascites, que em geral contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado por imu-nização de camundongos com clones positivos de hibridoma.

[0294]Em outra modalidade, hibridomas imortalizados que produzem anticorpo podem ser preparados a partir do animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e as células B do baço são fundidas às células de mieloma imortalizadas como é bem conhecido na técnica (Vide, por exemplo, Harlow e Lane, supra). Em uma modalidade particular, as células de mieloma não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem celular não-secretória). Após a fusão e a seleção do antibiótico, os hibridomas são classificados usando o produto imunogênico da presente invenção, ou uma porção dos mesmos, ou uma célula que expressa o produto imunogênico da presente invenção. Em uma modalidade particular, a triagem inicial é realizada usando uma imunoteste ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoteste (RIA). Um exemplo de triagem de ELISA é proporcionado em WO 00/37504, aqui incorporado por referência.

[0295]Hibridomas de produção de anticorpo anti-produto são selecionados, clonados e adicionalmente classificados para as características desejáveis, que in-cluem desenvolvimento de hibridoma robusto, alta produção de anticorpo e caracte-rísticas desejáveis de anticorpo, como discutido adicionalmente abaixo. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singenêicos, em animais des-providos de um sistema imune, por exemplo, camundongos nus, ou em cultura celular in vitro. Métodos de selecionar, clonagem e de expandir hibridomas são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[0296]Em uma modalidade particular, os hibridomas são hibridomas de rato, como descrito acima. Em outra modalidade particular, os hibridomas são produzidos em uma espécie não-humana, não-rato tal como ratos, ovelha, porcos, cabras, vacas ou cavalos. Em outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos, nos quais um mieloma não secretório humano é fundido com uma célula humana que expressa um anticorpo anti-produto.

[0297]Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab’)2 da presente invenção podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir os fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

[0298]Em outro aspecto da presente invenção, anticorpos recombinantes são gerados a partir de um único linfócito isolado usando um procedimento referido na técnica como o método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM), como descrito na Patente U.S. No. 5,627,052, Publicação PCT WO 92/02551 e Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. No referido método, células simples que secretam os anticorpos de interesse, por exemplo, linfócitos derivados a partir de qualquer um dos animais imunizados descritos na Seção 1, são classificados usando um teste de placa hemolítica específica de antígeno, em que o produto imunogênico da presente invenção, ou uma subunidade do mesmo, é acoplado a células sanguíneas vermelhas de ovelha usando um elemento de ligação, tal como biotina e usado para identificar a células única que secreta os anticorpos com especificidade para o produto imunogênico da presente invenção. Em seguida da identificação das células que secretam o anticorpo de interesse, os cDNAs de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada são recuados a partir das células por PCR de transcriptase reversa e as referidas regiões variáveis podem então ser expressas, no contexto de regiões constantes de imunoglobulina apropriado (por exemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamífero, tais como as células COS ou CHO. As células hospedeiras transfectadas com a sequências de imunoglobulinas amplificadas, derivadas a partir de linfócitos selecionados in vivo, pode então sofrer análise adicional e seleção in vitro, por exemplo, por panning the transfectadas células para isolar as células que expressam os anticorpos para globulômero Aβ (20-42). As se-quências de imunoglobulinas amplificadas adicionalmente podem ser manipuladas in vitro, tal como por métodos de maturação de afinidade in vitro tais como os descritos na Publicação PCT WO 97/29131 e Publicação PCT WO 00/56772.

[0299]Em outra modalidade da presente invenção, os anticorpos são produzido por imunização de um animal não-humano que compreende alguns, ou todos, dos locus de imunoglobulina humana com um antígeno de produto imunogênico. Em uma modalidade particular, o animal não-humano é um rato transgênico XENOMOUSE, uma cepa de rato modificada por engenharia genética que compreende grandes fragmentos dos loci de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpo de rato. Vide, por exemplo, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) e Patentes US Nos. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 e 6,130,364. Vide também WO 91/10741, publicada em 25 de Julho de 1991, WO 94/02602, publicada em 3 de Fevereiro de 1994, WO 96/34096 e WO 96/33735, ambas publicadas em 31 de Outubro de 1996, WO 98/16654, publicada em 23 de Abril de 1998, WO 98/24893, publicada em 11 de Junho de 1998, WO 98/50433, publicada em 12 de Novembro de 1998, WO 99/45031, publicada em 10 de Setembro de 1999, WO 99/53049, publicada em 21 de Outubro de 1999, WO 00/09560, publicada em 24 de Fevereiro de 2000 e WO 00/037504, publicada em 29 de Junho de 2000. O rato transgênico XENOMOUSE produz um repertório humano semelhante a adulto de anticorpo completamente humanos e gera anticorpos humanos monoclonais específicos a antígeno. O rato transgênico XENOMOUSE contém aproximadamente 80% do repertório de anticorpo humano através da introdução de fragmentos YAC de configuração da linha germinal dimensionados de loci de cadeia pesada humana e loci x de cadeia leve. Vide Mendez et al., Nature Genetics 15:146156 (1997), Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), as descrições dos quais estão aqui incorporadas por referência.

[0300]Os métodos in vitro também podem ser usados para a produção dos anticorpos da presente invenção, em que uma biblioteca de anticorpos é classificada para identificar um anticorpo tendo a desejada ligação especificidade. Métodos para a referida triagem de bibliotecas de anticorpo recombinante são bem conhecidos na técnica e incluem os métodos descrito, por exemplo, em Ladner et al. Patente U.S. No. 5,223,409; Kang et al. Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT No. WO 91/17271; Winter et al. Publicação PCT No. WO92/20791; Markland et al. Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:12751281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, Publicação de pedido de patente US 20030186374 e Publicação PCT No. WO 97/29131, os conteúdos de cada um dos quais estão incorporados aqui por referência.

[0301]A biblioteca de anticorpo recombinante pode ser a partir de um indivíduo imunizado com o produto imunogênico da presente invenção, ou uma porção do produto imunogênico da presente invenção. Alternativamente, a biblioteca de anticorpo recombinante pode ser a partir de um indivíduo simples, isto é, um que não foi imuni-zado com o produto imunogênico da presente invenção, tal como uma biblioteca de anticorpo humano a partir de um indivíduo humano que não foi imunizado com o produto imunogênico da presente invenção. Os anticorpos da presente invenção são se-lecionados por fazer uma triagem na biblioteca de anticorpo recombinante com o peptídeo que compreende o produto imunogênico da presente invenção para desse modo selecionar os anticorpos que reconhecem o produto imunogênico da presente invenção e discrimina outras formas Aβ tais como Aβ (1-40) e monômero Aβ (1-42), as fibrilas Aβ- e sAPPα. Métodos para conduzir a referida triagem e seleção são bem conhecidos na técnica, tal como o descrito nas referências no parágrafo precedente.

[0302]Em um aspecto, a presente invenção pertence a um anticorpo isolado, ou uma porção de ligação a antígeno dos mesmos, que liga o produto imunogênico da presente invenção e discrimina os monômeros Aβ (1-40) e Aβ (1-42), fibrilas Aβ e sAPPα. De acordo com um aspecto, o anticorpo é um anticorpo de neutralização. Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo mono-clonal.

[0303]Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem também ser gerados usando vários métodos de phage display conhecidos na técnica. Em métodos de phage display, os domínios do anticorpo funcional são exibidos na superfície das partículas de fago que portam as sequências de polinucleotídeo que codificam as mesmas. Em um fago particular pode ser utilizado se exibir domínios de ligação a antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatorial de anticorpos (por exemplo, humano ou murino). O Fago que expressa um domínio de ligação a antígeno que liga o antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou conta. O Fago usado nos referidos métodos são tipicamente fagos filamentosos que incluem os domínios de ligação fd e M13 expressos a partir do fago com domínios de anticorpos Fv estabilizados com Fab, Fv ou disulfeto fundidos de modo recombinante à proteína seja do gene III ou gene VIII do fago. Exemplos de métodos de phage display que podem ser usados para a produção dos anticorpos da presente invenção incluem os descritos em Brinkman et al., J. Imunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Imunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Imunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Imunology 57:191-280 (1994); Pedido PCT No. PCT/GB91/01134; Publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e patentes U.S. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 e 5,969,108; cada uma das quais está aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0304]Como descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regi-ões que codificam o anticorpo a partir do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos totais que incluem anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação a antígeno desejado e expressos em qualquer hospedeiro desejado, que in-cluem células de mamífero, células de inseto, células vegetais, leveduras e bactérias, por exemplo, como descrito em detalhes abaixo. Por exemplo, as técnicas para produzir de modo recombinante os fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregadas usando os métodos conhecidos na técnica tal como os descritos na Pu-blicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (as referidas referências incorporadas por referência em suas totalidades). Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia única e anticorpos incluem os descritos nas Patentes U.S. 4,946,778 e 5,258, 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

[0305]Uma alternativa para fazer a triagem de bibliotecas de anticorpo recom- binante por phage display, outras metodologias conhecidas na técnica para a triagem de grandes bibliotecas combinatoriais podem ser aplicadas na identificação de anti-corpos de dupla especificidade da presente invenção. Um tipo de sistema de expres-são alternativo é um no qual a biblioteca de anticorpo recombinante é expressa como as fusões de RNA-proteína, como descrito na Publicação PCT No. WO 98/31700 por Szostak e Roberts e em Roberts, R.W. e Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. No referido sistema, uma fusão covalente é criada entre um mRNA e o peptídeo ou proteína que a mesma codifica por translação in vitro dos mRNAs sintéticos que portam puromicina, a antibiótico peptidil aceitante, em sua ex-tremidade 3'. Assim, um mRNA específico pode ser enriquecido a partir de uma com-plexa mistura de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatorial) com base nas propriedades do peptídeo codificado ou proteína, por exemplo, anticorpo, ou porção do mesmo, tal como ligação do anticorpo, ou porção do mesmo, ao antígeno de dupla especificidade. Anticorpos que codificam sequências de ácido nucleico, ou porções das mesmas, recuperados a partir da triagem das referidas bibliotecas podem ser ex-pressos por meios recombinantes como descrito acima (por exemplo, em células hos-pedeiras de mamífero) e, ademais, podem ser submetidos a maturação de afinidade adicional seja por rodadas adicionais de triagem de fusões de mRNA-peptídeo nas quais as mutações foram introduzidas na(s) sequência(s) originalmente selecio- nada(s), ou por outros métodos por maturação de afinidade in vitro de anticorpos re- combinantes, como descrito acima.

[0306]Em outra abordagem os anticorpos da presente invenção podem tam-bém ser gerados usando métodos de yeast display conhecidos na técnica. Nos méto-dos de yeast display, métodos genéticos são usados para amarrar domínios de anti-corpo a uma parede celular de uma levedura e exibir a mesma na superfície da leve-dura. Em particular, a referida levedura pode ser utilizada par exibir os domínios de ligação a antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatorial de anticorpos (por exemplo, humana ou murino). Exemplos de métodos de yeast display que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem os descritos em Wittrup, et al. Patente U.S. No. 6,699,658 aqui incorporada por referência.

[0307]Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer uma de um número de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a expressão a partir de células hospedeiras, em que o(s) vetor(s) de expressão codifica as cadeias pesadas e cadeias leves é (são) transfectados em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" são pretendidas de modo a englobar uma grande variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exó-geno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletropora- ção, precipitação de cálcio-fosfato, transfecção de DEAE-dextrano e semelhante. É possível se expressar os anticorpos da presente invenção seja em células hospedeiras procarióticas ou células hospedeiras eucarióticas. De acordo com um aspecto par-ticular da presente invenção, a expressão de anticorpos é realizada usando células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, pelo fato de que as refe-ridas células eucarióticas (e em particular células de mamífero) são mais prováveis do que as células procarióticas para se assemelhar e secretar um anticorpo adequada-mente duplicado e imunologicamente ativo.

[0308]De acordo com um aspecto, as células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção incluem Chinese Hamster Ovary (células CHO) (que incluem as células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, como descrito em R.J. Kaufman e P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS e células SP2. Quando vetores de expressão recombinantes codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos por cultivar as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão dos anticorpos nas células hospedeiras ou a secreção dos anticorpos em um meio de cul-tura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser re-cuperados a partir do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteína.

[0309]Células hospedeiras podem também ser usadas para produzir fragmen-tos de anticorpo funcional, tais como moléculas de fragmentos Fab ou scFv. Será en-tendido que variações nos procedimentos acima estão dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável se transfectar uma célula hospedeira com fragmentos funcionais que codificam DNA seja de uma cadeia leve e/ou de uma cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção. Tecnologia de DNA Recombi- nante pode também ser usada para remover algum, ou todos, dos DNAs de codificação uma ou ambas das cadeias leves e cadeias pesadas que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir das referidas moléculas de DNA truncado são também englobadas pelos anticorpos da presente invenção. Adicionalmente, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos nos quais uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo da presente invenção e a outra cadeia pesada e cadeia leve são específicas para um antígeno diferente dos antígenos de interesse por reticulação de um anticorpo da presente invenção a um segundo anticorpo por métodos químicos de reticulação padrão.

[0310]Em um sistema particular para a expressão recombinante de um anti-corpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, da presente invenção, um vetor de expressão recombinante codifica não só o anticorpo cadeia pesada mas também o anticorpo cadeia leve é introduzido em células dhfr- CHO por transfecção mediada a cálcio fosfato. Dentro de um vetor de expressão recombinante, os genes do anticorpo de cadeia pesada e cadeia leve são cada um dos quais ligados de modo operacional aos elementos reguladores do promotor intensificador CMV/AdMLP para acionar altos níveis de transcrição dos genes. Um vetor de expressão recombinante também porta um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção/amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transfor- mantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesadas e cadeias leves do anticorpo e um anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas padrão de biologia molecular são usadas para preparar um vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar os transfor- mantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Ainda adicionalmente a presente invenção proporciona um método de sintetizar um anticorpo recombinante da presente invenção por cultivar uma célula hospedeira da presente invenção em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante da presente invenção é sintetizado. O método pode adicionalmente compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

[0311]Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas a partir de diferentes espécies animais, tal como anticorpos tendo uma região variável derivada a partir de uma região constante de anticorpo mo-noclonal de murino e de imunoglobulina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica e são discutidos em detalhes aqui. Vide, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Imunol. Methods 125:191-202; Patentes U.S. Nos. 5,807,715; 4,816,567; e 4,816,397, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades. Adicionalmente, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454 que são incorporados aqui por referência em suas totalidades) por junção de genes a partir de uma molécula de anticorpo de rato de apropriada especificidade a antígeno junto com genes a partir de uma molécula de anticorpo humano de apropriada atividade biológica pode ser usado.

[0312]Anticorpo enxertado com CDRs da presente invenção compreendem sequências de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada a partir de um anti-corpo humano em que uma ou mais das regiões de CDR de VH e/ou VL são substitu-ídas com sequências de CDR de anticorpos de murino da presente invenção. A sequência de estrutura a partir de qualquer anticorpo humano pode servir como uma matriz para o enxerto de CDR. Entretanto, a substituição de cadeia retilínea sobre a referida estrutura com frequência leva a alguma perda de afinidade de ligação ao an- tígeno. Quanto mais homólogo o anticorpo humano é ao anticorpo de murino original, menos provável a possibilidade de combinar as CDRs de murino com a estrutura hu-mana irá introduzir distorções nas CDRs que podem reduzir a afinidade. Portanto, a estrutura humana variável escolhida para substituir a estrutura variável de murino a partir das CDRs tem, por exemplo, pelo menos a 65% de identidade de sequência com a estrutura de região variável de anticorpo de murino. As regiões variáveis de murino e humana diferentes a partir das CDRs têm, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75% de identidade de sequência, ou pelo menos 80% de identidade de sequência. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica e discutidos em detalhes aqui, (vide também EP 239,400; Publicação PCT WO 91/09967; Patentes U.S. Nos. 5,225,539; 5,530,101; e 5,585,089), revestimento ou recobrimento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Imunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)) e embaralhamento de cadeia (Patente U.S. No. 5,565,352).

[0313]Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo a partir de anticorpos de espécies não-humanas que se ligam ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complementariedade (CDRs) a partir de espécies não- humanas e regiões de estrutura a partir de uma molécula de imunoglobulina humana.

[0314]Sequências conhecidas de Ig humana são descritas, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sci- quest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidel- berg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/l mMune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikei- mages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/l mMuno- lo- gy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl. edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; ax- imtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; bas-erv.uci.kun.nl/.about.jra- ats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc- cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/l NTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; anti- body.bath.ac.uk/; [2]abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.hone- gger/AHOsem-inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; [3]www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; [4]www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc. cam. ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immu-nological Interesse, U.S. Dept. Health (1983), cada um dos quais aqui incorporada por referência em sua totalidade. As referidas sequências importadas podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, aumentar ou modificar a ligação, afinidade, on-rate, off-rate, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, como conhecida na técnica.

[0315]Resíduos de estrutura nas regiões de estrutura humana podem ser substituídos com o resíduo correspondente a partir de um anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente aprimorar a ligação a antígeno. As referidas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações de uma CDR e resíduos de estrutura para identificar resíduos de estrutura importantes para a ligação a antígeno e comparação de sequên-cia para identificar resíduos de estrutura não usuais em posições particulares. (Vide, por exemplo, Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechman et al., Nature 332:323 (1988), que são incorporados aqui por referência em suas totalidades.) modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente oferecidos e são familiares daqueles versados na técnica. Programas de computador são oferecidos que ilustram e exibem estruturas prováveis de conformação tridimensional de sequências de imunoglobulina selecionadas candidatas. A inspeção das referidas exibições permite a análise do pa-pel de similitude dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina can-didata, isto é, a análise de resíduos que influencia a capacidade da imunoglobulina candidata se liga ao seu antígeno. Desse modo, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do consenso e importa as sequências de modo que a desejada característica de anticorpo, tal como maior afinidade para o antígeno alvo(s), seja al-cançado. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação a antígeno. Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, tais como mas não limitadas às descritas em Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Sims et al., J. Imunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Imunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Imunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); PCT publication WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, Patentes U.S. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, cada uma das quais aqui incorporada totalmente por referência, incluídas as referências citadas nos mesmos.

[0316]Em determinadas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada, tal como uma região constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. De acordo com um aspecto, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada IgG1 ou uma região constante de cadeia pesada lgG4. De acordo com um aspecto adicional, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve, ou uma região constante de cadeia leve kappa ou uma região constante de cadeia leve lambda. De acordo com um aspecto, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve kappa. Um anticorpo porção pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou um único fragmento de cadeia Fv.

[0317]Substituições de resíduos de aminoácido na porção Fc para alterar a função executora do anticorpo são conhecidas na técnica (Winter, et al. Patentes US Nos. 5,648,260 e 5,624,821). A porção Fc de um anticorpo media diversas importante funções executoras, por exemplo, indução de citocina, ADCC, fagocitose, citotoxici- dade dependente de complemento (CDC) e meia-vida/ coeficiente de depuração de anticorpo e complexos de antígeno-anticorpo. Em alguns casos as referidas funções executoras são desejáveis para um anticorpo terapêutico mas em outros casos deve ser desnecessário ou mesmo prejudicial, dependendo dos objetivos terapêuticos. De-terminados isotipos IgG humanos, particularmente lgG1 e lgG3, mediam ADCC e CDC via ligação a FcyRs e complemento C1q, respectivamente. Receptores de Fc Neonatal (FcRn) são os componentes fundamentais que determinam a meia-vida circulante dos anticorpos. Em ainda outra modalidade pelo menos um resíduo de aminoácido é subs-tituído na região constante do anticorpo, por exemplo, a região Fc do anticorpo, de modo que as funções executoras do anticorpo são alteradas.

[0318]Uma modalidade proporciona um anticorpo marcado em que um anti-corpo da presente invenção é derivado ou ligados a outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Por exemplo, um anticorpo marcado da presente invenção pode ser derivado por ligar de modo funcional um anticorpo da presente invenção (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a um ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente detectável, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo com outra molécula (tal como a região nuclear de estreptavidina ou a marcação de polihistidina).

[0319]Agentes detectáveis uteis com os quais um anticorpo da presente in-venção pode ser derivado incluem compostos fluorescentes. Exemplos de agentes fluorescentes detectáveis incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, roda- mina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonila, ficoeritrina e semelhante. Um an-ticorpo pode também ser derivado com enzimas detectáveis, tais como fosfatase al-calina, peroxidase de rábano silvestre, glicose oxidase e semelhante. Quando um an-ticorpo é derivado com uma enzima detectável, a mesma é detectada por adicionar reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectá- vel. Por exemplo, quando o agente detectável peroxidase de rábano silvestre é pre-sente, a adição de peroxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo pode também ser derivado com biotina e detectada através de medição indireta de ligação de avidina ou estreptavidina.

[0320]Outra modalidade da presente invenção proporciona um anticorpo cris-talizado. De acordo com um aspecto, a presente invenção se refere a cristais de glo- bulômero anti-Aβ (20-42) total e fragmentos dos mesmos como descrito aqui e formu-lações e composições que compreendem os referidos cristais. De acordo com um aspecto adicional, o anticorpo cristalizado tem uma maior meia-vida in vivo do que as contrapartes solúveis do anticorpo. De acordo com um aspecto adicional, o anticorpo retém a atividade biológica após a cristalização.

[0321]Anticorpo cristalizado da presente invenção pode ser produzido de acordo com os métodos conhecidos na técnica e como descrito em WO 02/072636, aqui incorporado por referência.

[0322]Outra modalidade da presente invenção proporciona um anticorpo gli- cosilado em que o anticorpo compreende um ou mais resíduos de carboidrato. A pro-dução de proteína in vivo nascente pode sofrer processamento adicional, conhecido como modificação pós-translacional. Em particular, os resíduos de açúcar (glicosil) podem ser adicionados enzimaticamente, um processo conhecido como glicosilação. As proteínas resultantes que suportam as cadeias laterais de oligossacarídeos cova- lentemente ligados são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas.

[0323]Anticorpos são glicoproteínas com um ou mais resíduos de carboidrato no domínio Fc, assim como no domínio variável. Resíduos de carboidrato no domínio Fc têm um importante efeito na função executora do domínio Fc, com efeito minmo na ligação a antígeno ou meia-vida do anticorpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). De modo diferente, a glicosilação do domínio variável pode ter um efeito na atividade de ligação a antígeno do anticorpo. A glicosilação no domínio variável pode ter um efeito negativo na afinidade de ligação ao anticorpo, provavelmente em virtude de impedimento estérico (Co, M.S., et al., Mol. Imunol. (1993) 30:1361-1367), ou resulta em maior afinidade para o antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).

[0324]Um aspecto da presente invenção é direcionado para gerar mutantes de campo de glicosilação nos quais o campo de ligação O- ou N-ligados do anticorpo sofreu mutação. Aqueles versados na técnica podem gerar os referidos mutantes usando tecnologias padrão bem conhecidas. A criação do campo de glicosilação mu-tante que retém a atividade biológica mas que que tem maior ou menor atividade de ligação é outro objetivo da presente invenção.

[0325]Em ainda outra modalidade, a glicosilação do anticorpo da presente in-venção é modificada. Por exemplo, um anticorpo glicosilado pode ser produzido (isto é, o anticorpo que é desprovido de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. As referidas modifi-cações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, por alterar um ou mais campos de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser produzidas que resultam na eliminação de um ou mais campos de região variável de glicosilação para desse modo eliminar a glico- silação naquele campo. A referida glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. A referida abordagem é descrita em detalhes adicionais em Publica-ção de Pedido Internacional No. WO 03/016466A2 e Patentes U.S. Nos. 5,714,350 e 6,350,861, cada uma das quais se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0326]Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo modificado da pre-sente invenção pode ser produzido o qual tem um tipo de glicosilação alterado, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo reduzidas quantidades de resíduos de fuso- sila ou um anticorpo tendo maior estruturas GlcNAc de bissecção. Os referidos padrões alterados de glicosilação foram demonstrados aumentar a capacidade ADCC dos anticorpos. As referidas modificações dos carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, por expressar o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterada. As células com maquinário de glicosilação alterada foram des-critas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais se expressa os anticorpos recombinantes da presente invenção para desse modo produzir um an-ticorpo com glicosilação alterada. Vide, por exemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, assim como, European Patent NO.: EP1,176,195; Publicações de pedido Internacional Nos.WO03/035835 e W099/54342 80, cada uma das quais se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0327]Glicosilação de proteína depende da sequência de aminoácido da pro-teína de interesse, assim como a célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Diferentes organismos podem produzir diferentes enzimas de glicosilação (por exem-plo, glicosiltransferases e glicosidases) e têm diferentes substratos (açúcares de nu- cleotídeo) oferecidos. Em virtude dos referidos fatores, padrão de glicosilação de pro-teína e a composição dos resíduos de glicosila, podem diferir dependendo do sistema hospedeiro no qual a proteína particular proteína é expressa. Os resíduos de glicosila úteis na presente invenção podem incluir, mas não são limitados a glicose, galactose, manose, fucose, n-acetilglucosamina e ácido siálico. De acordo com um aspecto, o anticorpo glicosilado compreende resíduos de glicosila de modo que o padrão de gli- cosilação é humano.

[0328]É conhecido daqueles versados na técnica que diferentes proteínas de glicosilação podem resultar em diferentes características de proteína. Por exemplo, a eficácia de uma proteína terapêutica produzida em um microrganismo hospedeiro, tal como levedura e glicosilada utilizando o trajeto de levedura endógeno pode ser reduzida comparada àquela da mesma proteína expressa em uma célula de mamífero, tal como uma Linhagem de célula CHO. As referidas glicoproteínas podem também ser imunogênicas em seres humanos e mostram reduzida meia-vida in vivo após a admi-nistração. Receptores específicos em seres humanos e outros animais podem reco-nhecer resíduos de glicosila específicos e promover a rápida depuração da proteína a partir da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos podem incluir mudanças na du-plicação da proteína, solubilidade, susceptibilidade a proteases, tráfego, transporte, compartimentalização, secreção, reconhecimento por outras proteínas ou fatores, an- tigenicidade ou alergenicidade. Assim sendo, um técnico pode preferir uma proteína terapêutica com uma composição específica e padrão de glicosilação, por exemplo, composição de glicosilação e padrão idêntico, ou pelo menos similar, àquele produzido em células humanas ou em células específicas de espécie do animal pretendido.

[0329]Proteínas glicosiladas que se expressam diferentes a partir daquela de uma célula hospedeira podem ser alcançadas por geneticamente modificar a célula hospedeira para expressar enzimas glicosiladas heterólogas. Usando técnicas conhe-cidas na técnica um técnico pode gerar anticorpos que exibem glicosilação de proteína humana. Por exemplo, cepas de levedura foram geneticamente modificadas para ex-pressar enzimas de glicosilação de ocorrência não natural de modo que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas nas referidas cepas de levedura exibem gli- cosilação de proteína idêntica àquela de células animais, especialmente células hu-manas (Publicações de Pedidos de Patente US Nos. 20040018590 e 20020137134; e WO 05/100584).

[0330]Outra modalidade é direcionada a um anticorpo anti-idiotípico (anti-Id) específico para os referidos anticorpos da presente invenção. Um anticorpo anti-Id é um anticorpo, que reconhece determinantes únicos em geral associados com a região de ligação a antígeno de outro anticorpo. O anti-Id pode ser preparado por imunização em animal com o anticorpo ou a região contendo CDR dos mesmos. O animal imunizado irá reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo de imunização e produz um anticorpo anti-Id. O anticorpo anti-Id pode também ser usado como um "imunogênio" para induzir uma resposta imune em ainda outro animal, que produz o assim chamado anticorpo anti-anti-ld.

[0331]Adicionalmente, será observado por aqueles versados na técnica que a proteína de interesse pode ser expressa usando a biblioteca de células hospedeiras geneticamente modificadas por engenharia genética para expressar as várias enzimas de glicosilação, de modo que membros das células hospedeiras da biblioteca produzem a proteína de interesse com padrões de variante de glicosilação. Um técnico pode então selecionar e isolar a proteína de interesse com padrões particulares de nova glicosilação. De acordo com um aspecto adicional, a proteína tendo um padrão novo de glicosilação particularmente selecionado exibe propriedades biológicas aprimoradas ou alteradas.

[0332]Em um aspecto adicional, a presente invenção também se refere ao uso do produto imunogênico da presente invenção para proporcionar um aptâmero que se liga ao produto imunogênico (daqui em diante também referido como um aptâmero anti-produto). Assim sendo, a presente invenção se refere também a um método para proporcionar um aptâmero tendo especificidade para o produto imunogênico como definido aqui, cujo método compreende pelo menos as etapas de a)proporcionar uma ligação alvo que compreende o produto imunogênico;b)expor um repertório de aptâmero ou potencial repertório de aptâmero ao referido alvo de ligação; ec)selecionar a partir do referido repertório um aptâmero que especificamente se liga ao referido produto imunogênico.

[0333]Um "aptâmero" aqui se refere a ácido oligonucleico ou moléculas de peptídeo que são capazes de ligação específica, não-covalente ao seu alvo. O aptâ- mero preferivelmente compreende uma sequência de peptídeo, DNA ou RNA, mais preferivelmente uma sequência de peptídeo, DNA ou RNA de cerca de 3 a 100 mo- nômeros, que pode em uma extremidade ou em ambas as extremidades ser fixada a uma molécula maior, preferivelmente uma molécula maior que media as funções bio-químicas, mais preferivelmente uma molécula maior que induz a inativação e/ou a desagregação, especialmente de modo preferido ubiquitina, ou preferivelmente uma molécula maior que facilita a destruição, mais preferivelmente uma enzima ou uma proteína fluorescente.

[0334]Aqui deve ser entendido que um "potencial repertório de aptâmero" se refere a qualquer biblioteca, coleção, conjunto ou grupo de sequências de aminoácido ou sequência de ácidos nucleicos ou a qualquer gerador da referida biblioteca, coleção, conjunto ou grupo de sequências de aminoácido que podem ser usadas para produzir um repertório de aptâmero in vivo ou in vitro.

[0335]Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona aptâmeros que se ligam aos produtos imunogênicos como definidos aqui.

[0336]Em uma modalidade preferida da presente invenção, o aptâmero é ob-tido por um método que compreende selecionar o aptâmero a partir de um repertório ou repertório potencial como descrito aqui.

[0337]De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção proporciona produto imunogênico-específico aptâmeros. Os referidos incluem em particular aptâmeros tendo uma afinidade comparativamente menor para ambas as formas monoméricas e fibrilloméricas de peptídeo Aβ do que para o produto imunogênico da presente invenção.

[0338]Os agentes que são capazes de se ligar ao produto imunogênico da presente invenção também têm muitas aplicações potenciais, algumas das quais são descritas no a seguir. As mesmas são especialmente úteis para fins terapêuticos e de diagnóstico.

[0339]A presente invenção adicionalmente se refere a uma molécula que com-preende uma sequência de aminoácido idêntica à porção (X.-Y) de uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de:

[0340]D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18A19F20A21E22D23V24 G25S26N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:13; Aβ(1- 43)F19A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19A20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:14; Aβ(1-43)F20A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:15; Aβ(1-43)E22A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21F22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:16; Aβ(1-43)E22F]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21V22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:17; Aβ(1-43)E22V]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21L22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:18; Aβ(1-43)E22L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22K23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:19; Aβ(1-43)D23K]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22L23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:20; Aβ(1-43)D23L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24V25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:21; Aβ(1-43)G25V]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24G25S26N27K28G2 9G30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:22; Aβ(1-43)A30G]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19G20A21A22D23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:23; Aβ(1-43)F20G E22A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19A20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30A31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:24; Aβ(1-43)F20A I31A]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19C20A21E22D23V24G25S26N27K28G 29A30C31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:25; Aβ(1-43)F20C I31C]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20Q21L22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:26; Aβ(1-43)A21Q E22L]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20L21Q22D23V24G25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:27; Aβ(1-43)A21L E22Q]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20Q21E22N23V24G25S26N27K28G 29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:28; Aβ(1-43)A21Q D23N]; D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24A25S26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:29; Aβ(1-43)E22A G25A]; e D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25A26N27K28G2 9A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 [SEQ ID NO:30; Aβ(1-43)E22A S26A],

[0341]com X sendo selecionado a partir do grupo que consiste dos números 1.. 18, 4 .. 18, 12 .. 18 ou sendo 18 e Y sendo selecionado a partir do grupo que consiste dos números 33..43, 33 .. 42, 33 .. 41, ou 33 .. 40; ou um derivado de ligação cruzada dos mesmos, em que pelo menos 2 resíduos não contíguos da sequência de aminoácido são covalentemente ligados um com o outro.

[0342]Em uma modalidade particular da referida molécula ou derivado de li-gação cruzada da mesma, (X-Y) é selecionado a partir do grupo que consiste de (142), (4-42), (12-42), ou (18- 42).

EXEMPLOS Aβ muteína peptídeos foram sintetizados usando métodos padrão. EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE OLIGÔMERO DE MUTEÍNA Aβ a) oligômero de muteína Aβ (1-42) E22A:

[0343]O peptídeo Aβ (1-42) E22A que foi obtido via síntese de peptídeo (Mo- BiTec GmbH, Gottingen, Germany) foi suspenso em 100% 1,1, 1,3,3, 3-hexafluoro-2- propanol (HFIP) a 6 mg/mL e incubado por completa solubilização sob agitação a 37°C por 2,5 h. O HFIP age como um rompedor de ligação de hidrogênio e é usado para eliminar as heterogeneidades estruturais pré-existentes no peptídeo Aβ. HFIP foi re-movido por evaporação em a SpeedVac e Aβ (1-42) E22A resuspenso a uma concen-tração de 5 mM em sulfóxido de dimetila e sonicado por 20 s. A Aβ (1-42) E22A pré- tratada com HFIP foi diluída em salina tamponada a fosfato (PBS) (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) a 400 μM e 1/10 volume 2% dodecil sulfato de sódio (SDS) (em H2O) adicionada (concentração final de 0,2% de SDS). A solução foi incubada por 6 h a 37°C. Em seguida, a solução foi adicionalmente diluída com três volumes de H2O e incubada por 18 h a 37°C o que levou a geração do oligômero de muteína Aβ (1-42) E22A. Após a centrifugação a 3000 g por 20 min a amostra foi duas vezes dialisada a temperatura ambiente contra 0,5 I de tampão (5 mM de fosfato de sódio, 35 mM de NaCI, pH 7.4) em um tubo de diálise por 2,5 h. O dialisado foi 15 vezes concentrado por ultrafiltragem (30 corte de kDa), centrifugado a 10,000 g por 5 min e o sobrenadante que compreende o oligômero de muteína Aβ (1-42) E22A retirado.

b) Oligômero de muteína Aβ E22A truncado:

[0344]30 μL de uma solução de 1 mg/mL de termolisina (Sigma) em H2O foram adicionados a 0,8 mL de preparação do oligômero Aβ (1-42) E22A muteína preparado de acordo com Exemplo 1 a. A mistura de reação foi agitada a 30°C por 20 h. Então, 4 μL de uma solução de 100 mM de EDTA, pH 7.4, em água foram adicionados e a mistura foi adicionalmente ajustada a um teor de SDS de 0,1 % com 8 μL de uma solução de SDS de 10% de resistência. A mistura de reação foi agitada por 10 min a temperatura ambiente e então dialisada a temperatura ambiente contra 0,5 I de tampão (5 mM de fosfato de sódio, 35 mM de NaCI, 0,1 % de SDS, pH 7.4) em um tubo de diálise por 6 h e após troca do tampão de diálise por 20 h adicionais. O dialisado foi removido e armazenado a -80°C para uso adicional.

c) Oligômero de muteína Aβ E22A truncado precipitado por etanol:

[0345]Para o uso de antígeno em imunização ativa o oligômero de muteína Aβ E22A truncado a partir do exemplo 1 b foi precipitado por etanol. Para esse fim uma parte (volume/volume; por exemplo, 1 mL) de oligômero de muteína Aβ truncado com a concentração de 0,5-10 mg/mL foi descongelado a temperatura ambiente. Então 8 partes (volume/volume; por exemplo, 8 mL) etanol resfriado com gelo foram adicionadas à amostra. A foi brevemente misturada e 1 parte (volume/volume, com base no volume inicial de oligômero de muteína Aβ truncado; por exemplo, 1 mL) 10x-PBS (Fa. Gibco, cat.no.14200-067) foi adicionada. Subsequentemente a amostra foi suavemente misturada mais uma vez e incubada por 30 min em um banho de gelo. A amostra foi centrifugada por 20 min a 3000 g e o sobrenadante foi descartado. O grânulo restante foi suspenso com um volume adequado de 5 mM

[0346]NaH2PO4, 35 mM de NaCI, pH 7.4 a uma concentração final de 1 mg/mL. Após 10 min de resfriamento em um banho de gelo a amostra foi sonicada com um ultra sonicador (UP 200s Dr. Hielscher GmbH) por 5 x 3 segundos a 0°C em um banho de gelo (com resfriamento intermediário por 10 segundos em gelo) a 50% da potência máxima. Após a referida etapa a amostra foi dividida e congelado a -80°C até uso adicional.

[0347]Ao se usar os procedimentos dos exemplos 1 a, 1 b e 1 c, os oligômeros de muteína Aβ listados na Tabela 2 abaixo foram preparados, submetidos a digestão proteolítica e precipitados a partir de etanol.

EXEMPLO 2: ESPECTROMETRIA DE IONIZAÇÃO DE MASSA DE DESSOSRÇÃO A LASER AUMENTADA EM SUPERFÍCIE (SELDI-MS) DETERMINAÇÃO SEMI-QUANTITATIVA DE COMPOSIÇÃO DE PEPTÍDEO Aβ DE OLIGÔMEROS TRUNCADOS DE MUTEÍNA Aβ

[0348]1 μL de oligômero de muteína Aβ E22A truncado a partir do exemplo 1 b foi diluído com 249 μL 50% de acetonitrila; 0,5% de TFA (500 μL de acetonitrila + 500 μL 1 % de TFA). 1 μL da amostra foi ponteada sobre uma Estrutura de Chip de Proteína H4 (BioRad; Cat. no. C57-30028). Os pontos foram permitidos secar em uma placa incubadora quente a 40°C. solução de CHCA foi preparada como a seguir: 5 mg de CHCA (BioRad; Cat. no. C30-00001) foram dissolvidos em 150 μL de acetonitrila + 150 μL 1 % de TFA = solução de estoque (armazenada a -20°C). 10 μL da solução de estoque foram diluídos com 20 μL de acetonitrila e 20 μL 1 % de TFA para se obter a solução de trabalho de CHCA. 2 μL da solução de trabalho de CHCA foi aplicada sobre os pontos. Os pontos foram permitidos secar em uma placa incubadora quente a 40°C e analisados por SELDI-MS (Espectrometria de ionização de massa dessorção a laser aumentada em superfície; BioRad, sistema de chip de Proteína SELDI edição de empresa) usando os parâmetros a seguir: faixa de massa: 500 a 10000 Da; massa de foco: 2220 Da; atenuação da matriz: 500 Da; coeficiente de amostragem: 400 MHz; disparos de aquecimento: 2 com energia: 1100 nj; disparos de dados: 10 com energia 1000 nJoule; divisão 1 de 3. As formas truncadas dos outros oligômeros de muteína Aβ listados na Tabela 2 foram submetidas ao mesmo procedimento.

[0349]Foi observado que as composições de peptídeo Aβ dos oligômeros de muteína Aβ truncados variam. Na Tabela 2, as quantidades de característica de frag-mentos de Ae-peptídeo para cada oligômero de muteína Aβ truncado são indicadas.Tabela 2: Análise Seldi-MS de diferentes oligômeros truncados de muteína Aβ

EXEMPLO 3: CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHO DE OLIGÔMEROS TRUNCADOS DE MUTEÍNA Aβ

[0350]Cromatografia de exclusão de tamanho foi realizada usando uma coluna de SEC Superose 12 HR 10/300 GL (GE Health Care, catalogo no. 17-5173-01) e um coeficiente de fluxo de 0,5 mL/min. A fase móvel foi 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, 0,5% de SDS, pH 7.4. 30 μg de oligômero de Aβ muteína truncado a partir do exemplo 1 b foi diluído com a fase móvel para se obter 150 μL com uma concentração de 200 μg/mL. 100 μL da referida mistura foram carregados sobre a coluna. Peptídeo com extinção a 215 nm foi detectado.

[0351]A cromatograma de exclusão de tamanho resultante (Figura 1 B) para o oligômero de muteína Aβ E22A truncado mostra um grande pico a 11,37 mL que corresponde a 26 kDa e picos menores a 45 kDa, 120 kDa e 4 kDa. O oligômero de muteína Aβ F20G, E22A truncado (Figura 1 C) mostra uma distribuição de tamanho mais uniforme com um pico maior a 10,83 mL que corresponde a 32 kDa e apenas um pequeno pico a 5 kDa. Como uma referência, a cromatograma de exclusão de tamanho de globulômero Aβ (20-42) de tipo selvagem (Figura 1A) é mostrada tendo um pico duplo maior a 11,04 mL e 11,85 mL que corresponde a 30 kDa e 21 kDa, respectivamente e picos menores a 150 kDa e 4 kDa. Juntos, cromatografia de exclusão de tamanho confirmou que a natureza oligomérica dos oligômeros de muteína Aβ truncados se assemelha ao globulômero Aβ (20-42) de tipo selvagem.

EXEMPLO 4: ELISA DIRETO DE OLIGÔMEROS DE MUTEÍNA Aβ TRUNCADOS

[0352]A imunoreatividade de oligômeros de muteína Aβ truncados a partir do exemplo 1 b foi adicionalmente caracterizada por usar o globulômero Aβ (20-42) reativo de murino, anticorpos monoclonais m7C6 e m4D10 de modo a prever a propensão de oligômeros de muteína Aβ truncados para suscitar uma reatividade cruzada poli- clonal indesejada a PF-4. O anticorpo m7C6 foi mostrado ter uma reação cruzada com PF-4 enquanto o m4D10 provou não ter reação cruzada com PF-4.

[0353]Protocolo ELISA-Direto usado para a determinação do reconhecimento de oligômero de muteína Aβ truncado:

[0354]Reagentes: 1. F96 Cert. Maxisorp NUNC-lmuno placa Cat.No.: 439454 2. Antígeno: oligômero de muteína Aβ truncado a partir do exemplo 1 b 3. Tampão de revestimento: 100 mM de carbonato de hidrogênio sódico; pH 8.2 4. Reagente de bloqueio para ELISA; Roche Diagnostics GmbH Cat. No.: 1112589 5. tampão PBST: 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0,05 % de Tween 20; pH 7.4 6. PBST + 0,5 % de BSA-Tampão: 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0,05 % de Tween 20; pH 7.4 + 0,5 % de BSA; Serva cat.11926 7. Anticorpos principais: Anti-Aβ mAb clone 7C6; conc: 2,83 mg/mL OD 280 nm; armazenado a -80°C Anti-Aβ mAb clone 4D10; conc: 8,60 mg/mL OD 280 nm; armazenado a -80°C 8. Reagente de Marcação: conjugado anti-rato-POD; Jackson ImmunoResearch Ltd. Cat. No.: 715-035-150 9. Coloração: TMB; Roche Diagnostics GmbH Cat. No.: 92817060; 42 mM em DMSO; 3 % H2O2 em água; 100 mM de acetato de sódio, pH 4.9 10. Solução de parada: 2M ácido sulfônico

[0355]Método usado em preparação de reagentes: 1. Solução de Antígeno: 12 μg de oligômero de muteína Aβ truncado foram diluídos com 12 mL de tampão de revestimento a 1 μg mL 2. Reagente de bloqueio: O reagente de bloqueio foi dissolvido em 100 mL de água para preparar a solução de estoque de bloqueio e alíquotas de 10 mL foram armazenadas a -20°C. 3 mL de solução de estoque de bloqueio foi diluído com 27 mL de água para cada placa para bloquear. 3. Diluição de anticorpo principal: A)Anti-Aβ mAb clone 7C6 foi diluído em PBST + 0,5 % de BSA a uma concen-tração de 100ng/mL (= Solução de estoque A). B)Anti-Aβ mAb clone 4D10 foi diluído em PBST + 0,5 % de BSA a uma con-centração de 100ng/mL (= Solução de estoque B).

[0356]Curva de anticorpo principal (preparada para A) clone 7C6 e B) clone 4D10):

[0357]4. Reagente de Marcação: Liofilizado de conjugado anti-rato-POD foi reconstituído em 0,5 mL água. 500 μL de Glicerol foi adicionada e alíquotas de 100 μL foram armazenadas a -20°C para uso adicional. O reagente de marcação concentrado foi diluído 1/10000 em tampão PBST. O reagente foi usado imediatamente.

[0358]5. Solução TMB olução: 20 mL 100 mM de acetato de sódio, pH 4.9, foram misturados com 200 μL de solução TMB e 29,5 μL 3% de solução de H2O2. A solução foi usada imediatamente.

[0359]Ajuste da Placa Padrão. Os números indicam a concentração final do anticorpo em ng/mL. O padrão para cada anticorpo foi rodado em duplicata. Procedimento: 1 . 100 μL de solução de antígeno por cavidade foram aplicados e incubados durante a noite a 4°C. 2 .A solução de antígeno foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 3 .265 μL de solução de bloqueio por cavidade foram adicionados e incubados por 2 h a temperatura ambiente. 4 .A solução de bloqueio foi descartada e as cavidades foram lavadas três ve-zes com 250 μL de tampão PBST. 5 .Após a preparação das curvas de anticorpo, 100 μL por cavidade da série de diluições foram aplicados na placa. A placa foi incubada por 2 h a temperatura ambiente. 6 .A solução de anticorpo foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 7 .200 μL solução de marcação por cavidade foram adicionados e incubados por 1 h a temperatura ambiente. 8 .A solução de marcação foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 9 . 100 μL de solução TMB foram adicionados a cada cavidade e incubada 5-15 min a temperatura ambiente. 10 .A cor da coloração foi observada e 50 μL da solução de parada por cavi-dade foram aplicados. 11.A absorção a 450 nm foi medida.

Resultados:

[0360]Por introduzir um único ou duplo mutação de ponto de aminoácido em uma região de posições de aminoácido 20-23 o reconhecimento dos oligômeros de muteína Aβ truncados resultantes por anticorpo m7C6 foi reduzido, enquanto que o reconhecimento por m4D10 não é reduzido ou foi reduzido apenas a uma extensão limitada (vide a figura 2). De modo diferente, o reconhecimento de um oligômero Aβ (20-42) pelo anticorpo 4D10 de reação cruzada não PF-4 é reduzido por mutações pontuais principalmente em uma região de posições de aminoácido 27-30, embora o epítopo não pode ser mapeado com tanta precisão. A região de reconhecimento m7C6 reduzida, mas mantendo o reconhecimento de m4D10, pode ser interpretada como compreendendo hot-spots que são relevantes para suscitar uma resposta imune poli- clonal com a imunização com um respectivo oligômero de muteína Aβ (20-42)que não suscita concomitantemente a reatividade cruzada de PF-4.

EXEMPLO 5: OLIGÔMERO DE MUTEÍNA Aβ E22A TRUNCADO INDUZ UMA RESPOSTA IMUNE ESPECÍFICA PARA GLOBULÔMERO Aβ

[0361]A antigenicidade da reatividade dos oligômeros de muteína Aβ foi tes-tada por imunização ativa de roedores (coelhos, camundongos). Os antissoros poli- clonais obtidos a partir dos referidos animais foram purificados por afinidade e subse-quentemente testados para a sua especificidade para as diferentes formas de Aβ usando o método de dot blot. As formas individuais de Aβ foram blotted em diluições em série e incubadas com os antissoros de rato purificados por afinidade correspon-dentes contendo anticorpos anti-Aβ produzidos na reação imune. Os dot blots indivi-duais correspondem a diferentes indivíduos dos roedores imunizados.

EXEMPLO 5A: IMUNIZAÇÃO ATIVA DE camundongos COM Oligômero de Aβ E22A muteína truncado

[0362]Os camundongos (Camundongos Balb/c) receberam 30 μg de the oligômero de Aβ E22A muteína truncado precipitado por etanol preparado de acordo com exemplo 1 c e misturados com adjuvante completo de Freund, adjuvante Alum ou nenhum adjuvante por via subcutânea no dia 0. Os camundongos foram reforçados de acordo com o esquema a seguir: reforço 1: no dia 17, reforço 2: no dia 35 e reforço 3 no dia 52. Para a determinação da titulação, o plasma foi retirado 7-10 dias após o reforço 2 e/ou 3.

Preparação de adjuvantes:

[0363]Preparação de adjuvante Alum: 1 mL 1.4 M de solução de NaCI pH7.4 foram adicionados a 9 mL gel de hidró-xido de alumínio (Sigma; cat.no.A8222-250ml). A mistura foi incubada por 24 h a tem-peratura ambiente antes do uso.

[0364]Adjuvante completo de Freund (CFA): CFA foi obtido como uma solução de adjuvante pronta para uso e foi usado para a imunização inicial. Para todas as imunizações de reforço subsequentes Adju-vante incompleto de Freund (IFA) foi usado.

[0365]Sem adjuvant:

[0366]Em casos onde nenhum adjuvante foi usado, % Tampão de PBS (5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; pH7.4) foi usado em vez.

[0367]Antes da imunização ativa, 100 μL do oligômero de muteína Aβ truncado (o antígeno) foi misturado com um volume igual dos respectivos adjuvantes. A mistura de antígeno/adjuvante foi incubada a temperatura ambiente por 1 h e agitada brevemente. Então, o volume total de 200 μL foi injetado por via subcutânea no pescoço do rato. Onde CFA ou IFA foi usado como adjuvante, as soluções de antígeno e adjuvante CFA ou IFA foram misturadas até que uma suspensão se formou que foi então usada imediatamente para injeção.

EXEMPLO 5B-1: PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE DE ANTICORPOS POLICLONAIS A PARTIR DE AMOSTRAS DE PLASMA DE RATO POR MEIO DE CONTAS DE SEFAROSE

[0368]Imobilização de Oligômero de Aβ (20-42) muteína em contas de sefa- rose

[0369]Reagentes: 30% de Isopropanol em 1 mM de HCI em H2O (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo) 1 mM de HCI em H2O (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo) 50 mM de NaHCO3; pH 7.5 (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo) 50 mM de NaHCO3/250 mM de etanolamina; pH 7.5 % PBS (5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; pH 7.4) Contas de sefarose ativadas por NHS (Fa. GE #17-0906-01) em 100% de iso-propanol TBS: (25 mM Tris; 150 mM de NaCI; pH7.5)

[0370]Procedimento:

[0371]2 mL contas de sefarose ativadas por NHS (= 2,8 mL de suspensão em isopropanol) foram lavadas 4x com 10 mL 30% de isopropanol em 1 mM de HCI em H2O (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo), 4x com 10 mL 1 mM de HCI em H2O (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo) e 4x com 10 mL 50 mM de NaHCO3, pH 7.5 (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo). 0,2 mg de oligômero de muteína Aβ truncado a partir do exemplo 1 b foram diluídos com 50 mM de NaHCO3 pH 7.5 + 0,1 % de SDS para se obter a concentração de 0,5 mg/mL. A solução de oligômero de muteína Aβ truncado foi adicionada a 0,2 g de contas de sefarose ativadas por NHS lavadas e a mistura foi agitada a temperatura ambiente por 2 h. Após a centrifugação a 3000 g por 5 min, 1 mL 50 mM de NaHCO3/250 mM de etanolamina, pH 7.5 + 0,1 % de SDS foi adicionado às contas de sefarose e a mistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 h. A amostra foi transferida para a Coluna de Cromatografia PoliPrep (Fa. Biorad #731-1550) e lavada 5x com 1 mL de PBS (5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; pH7.4) + 0,1 % de SDS e então 5x com 1 mL de TBS. Após a última etapa de lavagem, as contas de sefarose que portam o oligômero de muteína Aβ (20-42) imo-bilizado foram transferidas para um tubo de 1,5 mL e armazenadas a 6°C para uso adicional.

[0372]Imobilização de monômero de Aβ(1-42) em contas de sefarose:

[0373]Reagentes: vide acima

[0374]Procedimento:

[0375]2 mL de contas de sefarose ativadas por NHS (= 2,8 mL de suspensão em isopropanol) foram lavadas com 4 x com 10 mL 30% de isopropanol em 1 mM de HCI em H2O (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo), 4 x com 10 mL 1 mM de HCI em H2O (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo) e 4 x com 10 mL 50 mM de NaHCO3, pH 7.5 (pré-resfriado a 0°C em um banho de gelo). 0,81 mg de peptídeo sintético A β(1 -42) (H-1368, Bachem, Bubendorf, Switzerland) foram dissolvidos em 80 μL 0,1% de NaOH em H2O. 50 μL da referida solução de monômero 10 mg/mL de Aβ(1-42) foram diluídos com 950 μL 50 mM de NaHCOs; pH 7.5 para se obter a concentração de 0,5 mg/mL. A solução de monômero Aβ (1 -42) foi adicionada a 0,5 g das contas de sefarose lavadas ativadas por NHS e a mistura foi agitada a temperatura ambiente por 2 h. Após a centrifugação a 3000 g por 5 min, 1 mL 50 mM de NaHCO3/250 mM de etanolamina, pH 7.5 foi adicionada às contas de sefarose e a mistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 h. A amostra foi preenchida dentro de uma Coluna de Cromatografia PoliPrep e lavada 5x com 1 mL de PBS (5 mM de NaH2PO4; 35 mM de NaCI; pH7.4) e então 5x com 1 mL de TBS. Após a última etapa de lavagem, as contas de sefarose que portam o monômero Aβ (1-42) foram transferidas para um tubo de 1,5 mL e armazenadas a 6°C para uso adicional.

[0376]Purificação por afinidade de anticorpos policlonais a partir de amostras de plasma de rato:

[0377]Reagentes: TBS (25 mM Tris; 150 mM de NaCI; pH7.5) Completo; Tabletes de Coquetel Inibidor de Protease; Roche, cat.no.11697498001 1/10 TBS (2,5 mM Tris; 15 mM de NaCI; pH7.5) tampão de elução: 0,58% de CH3COOH/140 mM de NaCI tampão de neutralização : 2 M Tris/HCI; pH 8.5 contas de sefarose que portam oligômero de muteína Aβ truncado imobilizado contas de sefarose que portam monômero Aβ (1-42)

[0378]Antígeno-anticorpos específicos gerados por imunização de camundon-gos com oligômero de muteína Aβ truncado foram purificados por afinidade usando a mistura do respectivo oligômero de muteína Aβ truncado e peptídeo Aβ (1-42) mono- mérico como proteína de captura por afinidade. O peptídeo Aβ (1-42) monomérico foi usado para garantir que todos os anticorpos anti-Aβ sejam purificados por afinidade, que inclui anticorpos ligação a não-epítopos de globulômero, por exemplo, a sAPPα, monoméricas ou peptídeo Aβ fibrilares, que devem potencialmente estar presentes no antissoro.

[0379]Procedimento:

[0380]250 μL de cada amostra de plasma de rato foram misturados com 250 μL de TBS + 1/50 Completo (1 tablete dissolvido em 1 mL H2O) e a solução foi centri-fugada por 10 min a 10000 g. O sobrenadante foi removido e 50 μL de contas de sefarose foram adicionados que portaram o oligômero de muteína Aβ truncado que corresponde ao antígeno usado para imunização do rato. Após 5 min de agitação a temperatura ambiente, 12,5 μL de contas de sefarose que portam o monômero Aβ (1-42) foram adicionadas. A mistura foi agitada por 20 h a temperatura ambiente e 1100 rpm em um Eppendorf Thermomixer Comfort. Então, as contas de sefarose foram transferidas usando 2 x 100 μL de TBS em uma Coluna de Cromatografia PoliPrep, lavada 4 x com 250 μL de TBS e 2 x com 250 μL 1/10 de TBS. Após a última etapa de lavagem, as contas foram eluídas duas vezes com 100 μL e então uma vez com 120 μL 0,58% de CH3COOH/140 mM de NaCI. O eluado (aproximadamente 250-270 μL) foi coletado em um tubo de 1,7 mL pré-carregado com 22 μL 2M de Tris/HCI, pH 8.5. Após a etapa de elução, a amostra foi imediatamente misturada e então armazenada a -80°C para uso adicional. A concentração de proteína dos anticorpos policlo- nais purificados por afinidade a partir de plasma de rato foi determinada por medir a absorção de cada eluado purificação por afinidade a 280nm contra uma matriz de referência apenas de TBS. A ligação dos anticorpos policlonais purificados por afinidade para globulômero Aβ foi confirmada por meio de ELISA direto.

EXEMPLO 5B-2: PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE DE ANTICORPOS POLICLONAIS A PARTIR DE AMOSTRAS DE PLASMA DE RATO VIA DINACONTAS MAGNÉTICAS

[0381]Imobilização de oligômero de muteína Aβ truncado em dinacontas ati-vadas a tosila

[0382]Reagentes: Dinacontas M-280 ativads a Tosila, Invitrogen, cat.no.142-04; 2 x 1 E09 con- tas/mL 100 mM de borato de sódio, pH 9,5 100 mM de borato de sódio, pH 9,5 + 0,5% de BSA PBS (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) PBS (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) + 0,1 % de BSA PBS (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) + 0,1 % de BSA + 0,02% de azeda de sódio

[0383]Procedimento:

[0384]A suspensão de estoque de dinacontas foi homogenizada por agitada cuidadosa para evitar a formação de espuma. 66 μL de suspensão foram removidos e transferidos para um frasco de reação de 1,5 mL. As dinacontas foram lavadas 2x 2 min com 200 μL 100 mM de borato de sódio, pH 9,5. No procedimento de lavagem o sobrenadante foi cuidadosamente removido ao mesmo tempo em que as dinacontas foram imobilizadas na parede do frasco de reação usando um suporte separador mag-nético (MSS). As dinacontas lavadas foram incubadas com 100 μg oligômero de mu- teína Aβ truncado em 100 mM de borato de sódio, pH 9,5. A amostra foi agitada por 20 min a 37°C. Então, a amostra foi diluída 1:2 com 100 mM de borato de sódio, pH 9,5 + 0,5% de BSA e foi agitada durante a noite a 37°C. As dinacontas que portam o oligômero de muteína Aβ truncado imobilizado foram lavadas 2x 5 min (mais uma vez usando o MSS) com 200 μL de PBS e 2x 5 min com 200 μL PBS, 0,1 %BSA e foram finalmente resuspensos em 0,2 mL PBS, 0,1 % de BSA, 0,02% de azeda de sódio e centrifugado brevemente. As dinacontas lavadas que portam o oligômero de muteína Aβ truncado imobilizado foram armazenadas a 4°C até uso adicional.

[0385]Purificação por afinidade de pMAb's a partir de amostras de plasma de rato:

[0386]Reagentes: PBS (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) PBST (PBS + 0,05% de Tween 20) PBST + 0,5% de BSA Tampão de elução: 0,58% CH3COOH/140 mM de NaCI Tampão de neutralização: 2 M Tris/HCI; pH 8.5 Dinacontas que portam imobilizada truncado Aβ muteína oligômero

[0387]Procedimento:

[0388]10 μL de amostra de plasma de rato foram diluídos com 80 μL de PBST + 0,5% de BSA. 10 μL de dinacontas que portam oligômero de muteína Aβ truncado imobilizado foram adicionadas. A imunoprecipitação foi realizada por agitação durante a noite (-20 h) a temperatura ambiente. As dinacontas foram imobilizadas usando o MSS. O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e as dinacontas foram lavadas 1 x 5 min com 500 μL PBST, 1x 5 min com 500 μL PBS e 1x 3 min com 500 μL 2 mM de NaH2PO4, 14 mM de NaCI, pH 7.5. Após a última remoção do tampão de lavagem, os frascos de reação foram mais uma vez centrifugados e o líquido restante foi cuidadosamente e vigorosamente removido. As dinacontas foram suspensas em 25 μL de tampão de elução e agitadas por 2 min a temperatura ambiente. A frascos de reação foram centrifugados por 15 s a 4000 rpm, dispostos de volta no MSS e o sobrenadante (isto é o eluado) foi cuidadosamente removido e adicionada a 975 μL de PBST + 0,5% de BSA. 1 μL de tampão de neutralização foi adicionado e a amostra misturada imediatamente por cerca de 2-3 s. A ligação de anticorpos policlonais puri-ficados por afinidade a globulômero Aβ foi confirmada por meio de ELISA direto.

[5]EXEMPLO 5C: ANÁLISE DE SELETIVIDADE ANTICORPO VIA DOT BLOT

[0389]De modo a caracterizar se a seletividade do globulômero de Aβ (20-42) muteína induziu a resposta imune, os antissoros policlonais purificados por afinidade foram testados para a ligação a diferentes formas de Aβ. Para esse fim, diluições em série das formas individuais de Aβ que variam a partir de 100 pmol/μL a 0,00001 pmol/μL em PBS suplementadas com 0,2 mg/mL de BSA foram preparadas. 1 μL de cada diluição foi blotted sobre a membrana de nitrocelulose. Detecção foi realizada por incubar com os anticorpos policlonais purificados por afinidade resposta correspondentes (0,2 μg mL) seguido por imunocoloração com IgG conjugado com peroxi- dase-(POD-) (anti-rato-POD para antissoros a partir de camundongos, anti-coelho- POD para antissoros de coelho) e BM Blue POD Substrato (Roche).

[0390]Padrões Aβ para dot-blot: Aβ (12-42) globulômero Aβ (12-42) globulômero foi preparado como descrito no exemplo de referência 4 2. globulômero Aβ (1-42) Aβ (1-42) globulômero foi preparado como descrito no exemplo de referência 3 3. globulômero Aβ (20-42) Aβ (20-42) globulômero foi preparado como descrito no exemplo de referência 5. 4. monômero Aβ (1-40), 0,1 % de NaOH Aβ (1-40) monômero foi preparado como descrito no exemplo de referência 1. 5. Aβ (1-42) monômero, 0,1 % de NaOH Aβ (1-42) monômero, 0,1 % de NaOH foi preparado como descrito no exemplo de referência 2 6. fibrilas Aβ (1-42) Fibrilas Aβ (1-42) foram preparadas como descrito no exemplo de referência 6 7. sAPPα

[0391]sAPPα foi preparado como descrito no exemplo de referência 7

[0392]Materiais para dot blot: Diluição em série de padrões Aβ (vide acima 1. a 7.) em 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4 + 0,2 mg/mL de BSA para se obter concentrações de: 100 pmol/μL, 10 pmol/μL, 1 pmol/μL, 0,1 pmol/μL, 0,01 pmol/μL, 0,001 pmol/μL, 0,0001 pmol/μL e 0,00001 pmol/μL. Nitrocelulose: meio de transferência Trans-Blot, Membrana de nitrocelulose pura (0,2 μnn); BIO-RAD Anti-rato-POD: cat no: 715-035-150 (Jackson Imuno Research) Reagente de Detecção: BM Blue POD Substrato, precipitação, cat no:11442066001 (Roche) Albumina do soro bovino (BSA): cat no: 11926 (Serva) Reagente de bloqueio: 5% de leite desnatado em TBS

[0393]Soluções de Tampão: TBS: 25 mM Tris / HCI tampão pH 7.5 + 150 mM de NaCI TTBS: 25 mM Tris / HCI - tampão pH 7.5 + 150 mM de NaCI + 0,05% de Tween 20 PBS + 0,2 mg/mL de BSA: 20 mM de NaH2PO4 tampão pH 7.4 + 140 mM de NaCI + 0,2 mg/mL de BSA Solução I de anticorpo: 0,2 μg/mL de anticorpo em 20 mL 1 % de leite desna-tado em TBS

[0394]Anticorpos: Clone de anticorpo monoclonal de Anti-Aβ rato 6E10; conc: 1 mg/mL; cat. no.: SIG- 39320 (Covance); armazenado a -80°C Anticorpos policlonais anti-Aβ de murino purificados por afinidade a partir do exemplo 5B-1, armazenados a -80°C Solução II de anticorpo: para a detecção de anticorpos de rato: 1:5000 diluição de anti-rato-POD em 1 % de leite desnatado em TBS

[0395]Procedimento de Dot blot: 1)1 μL de cada uma das 8 concentrações de diferentes padrões de Aβ (obtido por diluição em série) foi ponteada sobre a membrana de nitrocelulose em uma dis-tância de aproximadamente 1 cm um a partir do outro. 2)Os pontos de padrões de Aβ foram permitidos secar na membrana de nitro- celulose em ar por pelo menos 10 min a temperatura ambiente (= dot blot) 3)Bloqueio: o dot blot foi incubado com 30 mL 5% de leite desnatado em TBS por 1,5 h a temperatura ambiente. 4)Lavagem: A solução de bloqueio foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TTBS por 10 min a temperatura ambiente. 5)Solução I de anticorpo: O tampão de lavagem foi descartado e o dot blot foi incubado com solução I de anticorpo por 2 h a temperatura ambiente 6)Lavagem: A solução de anticorpo I foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TTBS por 10 min a temperatura ambiente. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TTBS por 10 min a temperatura ambiente. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TBS por 10 min a temperatura ambiente. 7)Solução II de anticorpo: O tampão de lavagem foi descartado e o dot blot foi incubado com solução II de anticorpo por 1 h a temperatura ambiente. 8)Lavagem: A solução de anticorpo II foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TTBS por 10 min a temperatura ambiente. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TTBS por 10 min a temperatura ambiente. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL de TBS por 10 min a temperatura ambiente. 9)Desenvolvimento: A solução de lavagem foi descartada. O dot blot foi de-senvolvido com 7,5 mL de Substrato BM Blue POD por 5 min. O desenvolvimento foi parado por intensa lavagem do dot blot com H2O pH 5.3 (pH ajustado com cristais de sal de dihidrogenfosfato de sódio). 10)A avaliação quantitativa foi realizada com base em uma análise densito- métrica da intensidade do ponto usando um densitômetro GS800 (BioRad) e software package Quantity one, Version 4.5.0 (BioRad). Apenas os pontos foram avaliados que tinham uma densidade relativa de mais do que 20% de densidade relativa do último ponto oticamente identificado sem dúvida do globulômero Aβ (20-42). O referido valor limiar foi determinado para cada dot blot independentemente. O valor calculado indica a relação entre o reconhecimento de globulômero Aβ (20-42) e a respectiva forma Aβ para o determinado anticorpo.

[0396]A análise de dot blot foi realizada com diferentes anticorpos monoclo- nais de murino (m6E10) e anticorpos policlonais anti-Aβ. Anticorpos policlonais anti- Aβ foram obtidos por imunização ativa de camundongos com oligômeros de muteína Aβ truncados seguido por purificação por afinidade (vide exemplo 5). As formas indi-viduais de Aβ foram aplicados em diluições em série e incubadas com os respectivos anticorpos para reação imune (1 = globulômero Aβ (1-42); 2 = globulômero Aβ (2042); 3 = monômero Aβ (1-40), 0,1 %NaOH; 4 = Aβ (1-42) monômero, 0,1 % de NaOH; 5 = preparação de fibrila Aβ (1-42); 6 = sAPPα (Sigma) (primeiro dot: 1 pmol); 7 = globulômero Aβ (12-42)). Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3: Dados de quantificação de dot blot de anticorpos policlonais de rato Imunização com oligômero de muteína Aβ E22A truncado (rato, adjuvante Alum) A)Imunização com oligômero de muteína Aβ E22A truncado (rato, adjuvante Alum) B) Imunização com globulômero Aβ E22A muteína truncado (rato, sem adjuvante) C) Imunização com oligômero Aβ F20G, E22A muteína truncado rato, Adjuvante Alum) D) Imunização com truncado Aβ G25V muteína oligômero (rato, Adjuvante Alum) E) Imunização com oligômero Aβ E22V muteína truncado (rato, Adjuvante Alum) F) Imunização com oligômero Aβ E22A, G25A muteína truncado (rato, Adjuvante Alum) G) Imunização com oligômero Aβ E22A, S26A muteína truncado (rato, Adjuvante Alum) H) Imunização com oligômero Aβ E22F muteína truncado (rato, Adjuvante Alum)

[0397]Os resultados do dot-blot mostram que a imunização de camundongos com oligômeros de muteína Aβ truncados suscita uma resposta imune altamente seletiva para o globulômero epítopo Aβ, que foi também mostrado anteriormente com o globulômero Aβ (20-42) de tipo selvagem. No dot blot, o reconhecimento da resposta imune policlonal foi testado contra o globulômero Aβ (20-42) de tipo selvagem que apresenta o epítopo de globulômero como presente no cérebro de Doença de pacientes com Alzheimer. Presumimos que os oligômeros de muteína Aβ truncados não ocorrem no corpo humano. Entretanto, a imunização com os oligômeros de muteína Aβ truncados suscitou uma resposta imune que, como desejado, foi ainda capaz de reconhecer o epítopo Aβ do globulômetro de tipo selvagem. Uma imunização ativa com oligômeros de muteína Aβ truncados pode assim ser esperada ser eficaz em reverter os déficits cognitivos em modelos de rato transgênico de Doença de Alzheimer pelo fato de que o perfil de dot blot do antissoro policlonal da resposta de anticorpo suscitada será comparável àquele da resposta suscitada por uma imunização ativa com globulômero Aβ (20-42) de tipo selvagem com relação ao reconhecimento de epítopos de globulômetro in vivo. O último provou reverter os déficits cognitivos em uma tarefa de reconhecimento de objeto.

EXEMPLO 6: DETERMINAÇÃO DE REAÇÃO CRUZADA COM PF-4 EM PLASMA DE MACACO CINOMOLGO VIA SANDUICHE DE ELISA ALINHADO EXEMPLO 6A: reatividade cruzada a PF-4 DE POLICLONAL RATO ANTICORPOS PURIFICADOS POR AFINIDADE VIA CONTAS DE SEFAROSE

[0398]Materiais: F96 Cert. Maxisorp NUNC-lmuno placa cat. no. 439454 Anticorpos de ligação em experimento: i)anticorpos policlonais purificados por afinidade via contas de sefarose a partir de amostras de plasma de rato após imunização com diferentes oligômeros de muteína Aβ truncados a partir do exemplo 5B-1 ii)oferecidos no comércio referência anticorpo anti-PF4: anticorpo anti-HPF4 monoclonal (Abeam cat. no.: ab49735) Tampão de revestimento: 100 mM de carbonato de hidrogênio sódico; pH 9.6 Reagente de bloqueio para ELISA; Roche Diagnostics GmbH cat. no.: 11 12589 Tampão PBST: 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0,05% de Tween 20; pH 7.4 PBST + 0,5% de tampão BSA: 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; 0,05% de Tween 20; pH 7.4 + 0,5% de BSA; Serva cat. no.11926 Plasma de cinomolgo: grupo de plasma EDTA de cinomolgo a partir de 13 diferentes doadores; armazenado a -30°C Inibidor de Tripsina: Sigma cat. no.T7902 Anticorpo de alinhamento: IgG anti-rato (Fc específico; produzido em cabra; Sigma cat. no.: M3534; 2.3 mg/mL; armazenado a -20°C Anticorpo de Detecção: anticorpo pRAb-HPF4 anti-PF-4 de coelho policlonal; 0,5 mg/mL; Abeam cat. no.ab9561 Reagente de Marcação: conjugado anti-coelho-POD; Jackson imunoRese- arch Ltd. cat. no.: 11 1-036-045 Solução de coloração: 42 mM de TMB (Roche Diagnostics GmbH cat. no.: 92817060) em DMSO; 3% H202 em água; 100 mM de acetato de sódio, pH 4.9 Solução de parada: 2 M de ácido sulfônico

[0399]Preparação de reagentes:

[0400]Anticorpo de alinhamento: o anticorpo de alinhamento foi diluído a 10 μg mL em tampão de revestimento.

[0401]Solução de bloqueio: o reagente de bloqueio foi dissolvido em 100 mL de água para preparar a solução de estoque de bloqueio e alíquotas de 10 mL foram armazenadas a -20°C. Solução de estoque de bloqueio de 3 mL foi diluída com 27 mL de água para cada placa para bloquear.

[0402]Cada anticorpo de ligação foi diluído com PBST + 0,5% de BSA tampão to 3,16 μg mL (solução de estoque). Séries de diluições de cada preparação anticorpo de policlonal purificado por afinidade foram preparadas como a seguir:

[0403]5 mL de Plasma de cinomolgo foram centrifugados por 10 min a 10000 g. 4,5 mL do sobrenadante foi removido e diluído com 40,5ml PBST + 0,5 % de BSA (= 1:10 diluição). Então 450 μL 10 mg/mL inibidor de tripsina em H2O foram adicionadas. Após a incubação por 10 min a temperatura ambiente a amostra foi filtrada através de um filtro de 0,22 μm (Millipore cat. no. SLGS0250S).

[0404]Reagente de marcação:

[0405]Anti-coelho-POD conjugado liofilizado foi reconstituído em 0,5 mL de água. 500 μL de glicerol foi adicionadaoe alíquotas de 100 μL foram armazenadas a 20°C para uso adicional. O reagente de marcação concentrado foi diluído em tampão PBST. O fator de diluição foi 1:5000. O reagente foi usado imediatamente.

[0406]Ajuste da placa de Ligação a Anticorpo. Os números indicam concentrações finais de anticorpo de ligação em ng/mL. Cada concentração de cada anticorpo de ligação foi rodad em duplicata.

[0407]Procedimento: 1 . 100 μL da solução de anticorpo de alinhamento por cavidade foram aplicados e incubada durante a noite a 6°C. 2 .A solução de anticorpo foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 3 .265 μL de solução de bloqueio por cavidade foram adicionados e incubados 2 h a temperatura ambiente. 4 .A solução de bloqueio foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 5 .Após a preparação da série de diluições de cada anticorpo de ligação, 100 μL por cavidade das referidas diluições de anticorpos foram aplicados na placa. A placa foi incubada 2 h a temperatura ambiente. 6 .A solução de anticorpos foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 7 . 100 μL de diluição 1:10 de plasma de cinomolgo por cavidade foram adicio-nadas e incubadas 2 h a temperatura ambiente. 8 .A solução de plasma foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 9 .100 μL de solução de anticorpo principal por cavidade foram adicionados e incubados 1 h a temperatura ambiente. 10.A solução de anticorpo principal foi descartada e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 11.200 μL de reagente de marcação por cavidade foram adicionados e incubados 1 h a temperatura ambiente. 12.A reagente de marcação foi descartado e as cavidades foram lavadas três vezes com 250 μL de tampão PBST. 13.100 μL de solução TMB foram adicionados a cada cavidade. 14.A cor da placa foi monitorada durante o desenvolvimento (5 - 15 min a temperatura ambiente) e a reação foi terminada por adicionar 50 μL de solução de parada /cavidade quando uma cor apropriada tiver se desenvolvido. 15.A absorção a 450 nm foi medida.

[0408]Análise dos dados:

[0409]As concentrações de anticorpo de ligação (valores X) foram log-trans- formadas usando a equação: X = log(X). Os dados foram traçados usando os valores de X log-transformados no Eixo x expresso como as quantidades de anticorpo (expressos em ng/mL). O valor de OD(450nm) da respectiva matriz de PBST na fileira H foi subtraído a partir dos valores da séries de diluições de anticorpo policlonal de rato de cada coluna na fileira A - G. Os valores de OD(450 nm) corrigidos de fundo resultantes foram traçados no Eixo y. A concentração das curvas de efeito foi calculada a partir dos referidos pontos de dados por adaptação de curva usando uma regressão não linear "equação logística de quatro parâmetros" com um método de adaptação "quadrados mínimos (ordinário) (que iguala o método de adaptação " resposta de dose sigmoidal (inclinação variável)") usando o pacote de software de análise de dados GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.). a adaptação da curva foi realizada com o único propósito de visualização de dados mas não como base para qualquer cálculo adicional, isto é, o cálculo da área sob a curva. A área sob a curva (AUC, ou área de pico total) foi determinada com base em dados adaptados de não curva, os valores X de log-transformados e os valores de OD(450 nm) na faixa medida (diluições plasmáticas finais a partir de 3,16 ng/mL a 3160 ng/mL). Os ajustes de cálculos a seguir foram usados dentro do pacote de software de análise de dados

[0410]GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.): - A linha basal foi ajustada para Y = 0,0. - Altura mínima do pico: Ignorar picos que são menos do que 10% da distância a partir de mínimo para máximo Y. - Direção do Pico: Por definição, todos os picos devem ur acima da linha basal.

[0411]Para cada anticorpo individual um fator de discriminação PF4 foi calculado usando o anticorpo anti-HPF4 oferecido no comércio (Abeam cat. no.: ab49735) como uma referência de anticorpo para PF4 reconhecimento, em que

[0412]Os Resultados do exemplo 6A são mostrados nas Tabelas 4A, 4B e 4C. Tabela 4A-C: AUC (ou área de pico total) calculada a partir dos dados de log- ransformado

EXEMPLO 6B: REATIVIDADE CRUZADA A PF-4 DE ANTICORPOS POLICLONAIS DE RATO PURIFICADOS POR AFINIDADE VIA DINACONTAS MAGNÉTICAS

[0413]Osmateriais e preparação de reagentes correspondem aos no exemplo 6A, exceto no que se refere a:

[0414]Anticorpos de ligação em experimento: - anticorpos policlonais purificados por afinidade via dinacontas ativadas a partir de amostras de plasma de rato após imunização com diferentes oligômeros de muteína Aβ truncados a partir do exemplo 5B-2 - anticorpos anti-PF4 de referência oferecidos no comércio: anticorpo anti- HPF4 monoclonal (Abeam cat. no.: ab49735)

[0415]As amostras obtidas em exemplo 5B-2 após purificação por afinidade de plasma de rato via dinacontas magnéticas tiveram uma pré-diluição de 1:100. A referida solução de estoque de plasma purificado por afinidade foi usada aqui para uma série de diluições adicionais. Séries de diluições de cada preparação de anticorpo policlonal purificada por afinidade foram preparadas como a seguir:

[0416]Plasma de cinomolgo e reagente de marcação foram preparados como no exemplo 6A.

[0417]Placa de ajuste de anticorpo de ligação. Os números indicam diluições de anticorpos de ligação. Cada concentração de cada anticorpo de ligação foi rodada em duplicata.

[0418]O procedimento corresponde àquele do exemplo 6A.

[0419]Análise de dados:

[0420]Os fatores de diluição do anticorpo de ligação (valores X) foram log- transformados usando a equação: X = log(X). Os dados foram traçados usando os valores X log-transformados no Eixo x expresso como diluição de plasma (1:X). O valor de OD(450nm) da respectiva matriz PBST foi subtraído a partir dos valores das séries de diluições de plasma de cada coluna. Os valores de OD(450 nm) corrigidos de fundo resultantes foram traçados no Eixo y. As curvas de efeito de diluição foram calculadas a partir dos referidos pontos de dados por adaptação de curva usando uma regressão não-linear "equação logística de quatro parâmetros" com um método de adaptação de "quadrados mínimos (ordinários)" (que iguala o método de adaptação "resposta de dose sigmoidal (inclinação variável)") usando o pacote de software de análise de dados GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.). A adaptação da curva foi realizada pelo único fim de visualização de dados mas não como base para qualquer cálculo adicional, isto é, a área sob um cálculo de curva. A área sob a curva (AUC, ou área de pico total) foi determinada com base em dados adaptados de não curva, os valores de log-transformado e os valores de OD(450 nm) na faixa medida (fatores de diluição de plasma final a partir de 1:100 a 1:12500). Os ajustes de cálculo a seguir foram usados dentro do pacote de software de análise de dados

[0421]GraphPadPrism (Version 5.03; GraphPad Software Inc.): - A linha basal foi ajustada em Y = 0,0. - Altura mínima do pico: Ignorar picos que são menos do que 10% da distância a partir de mínimo a máximo Y. -Direção do Pico: Por definição, todos os picos devem ir acima da linha basal.

REFERÊNCIA EXEMPLO 1

[0422]Aβ (1-40) monômero (0,1 % de NaOH)

[0423]1 mg Aβ (1-40) (Bachem Inc., cat. no. H-1194) foi dissolvido em 232,6 μL 0,1 % de NaOH em H2O (recém preparado) ( = 4,3 mg/mL = 1 nmol/1 μL) e imediatamente agitada for 30 sec. a temperatura ambiente para se obter a solução clara. A amostra foi armazenada a -20 °C para uso adicional.

REFERÊNCIA EXEMPLO 2

[0424]Monômero Aβ (1-42) (0,1 % de NaOH)

[0425]1 mg Aβ (1-42) (Bachem Inc., cat. no. H-1368) foi dissolvida em 222.2 μL 0,1 % de NaOH em H2O (recém preparado) ( = 4.5 mg/mL = 1 nmol/1 μL) e imediatamente agitada for 30 sec. a temperatura ambiente para se obter a solução clara. A amostra foi armazenada a -20 °C para uso adicional.

REFERÊNCIA EXEMPLO 3

[0426]Globulômero Aβ (1-42)

[0427]O peptídeo sintético Aβ (1-42) (H-1368, Bachem, Bubendorf, Switzerland) foi suspenso em 100% 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) a 6 mg/mL e incubado para a completa solubilização sob agitação a 37°C por 1,5 h. O HFIP age como um rompedor de ligação de hidrogênio e é usado para eliminar as desigualdades estruturais pré-existentes no peptídeo Aβ. HFIP foi removido por evaporação em a SpeedVac e Aβ (1-42) resuspenso a uma concentração de 5 mM em sulfóxido de dimetila e sonicada por 20 s. A HFIP-pré-treated Aβ (1-42) foi diluída em salina tamponada a fosfato (PBS) (20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4) a 400 μM e 1/10 volume 2 % dodecil sulfato de sódio (SDS) (em H20) adicionada (concentração final de 0,2 % de SDS). Uma incubação por 6 h a 37°C resultou no 16/20 kDa globulômero Aβ (1-42) intermediário. O 38/48 kDa globulômero Aβ (1-42) foi gerado por uma diluição adicional com três volumes de H2O e incubação por 18 h a 37°C. Após centrifugação a 3000 g por 20 min a amostra foi concentrada por ultrafiltragem (30- kDa cut-off), dialisada contra 5 mM de NaH2PO4, 35 mM de NaCI, pH 7.4, centrifugado a 10,000 g por 10 min e o sobrenadante que compreende o 38/48 kDa globulômero Aβ (142) retirado.

REFERÊNCIA EXEMPLO 4

[0428]Globulômero Aβ (12-42)

[0429]2 mL do globulômero Aβ (1-42) da preparação de referência exemplo 3 foram misturados com 38 mL de tampão (5 mM de fosfato de sódio, 35 mM de cloreto de sódio, pH 7.4) e 150 μL de a 1 mg/mL GluC endoproteinase (Roche) em água. A mistura de reação foi agitada por 6 h a RT e 150 μL adicional de 1 mg/mL GluC endoproteinase (Roche) em água foi subsequentemente adicionada. A mistura de reação foi agitada a RT por outras 16 h, seguido por adição de 8 μL de 5 M de uma solução de DIFP. A mistura de reação foi concentrada a aproximadamente 1 mL via um tubo de 15 mL 30 kDa Centriprep. O concentrado foi misturado com 9 mL de tampão (5 mM de fosfato de sódio, 35 mM de cloreto de sódio, pH 7.4) e mais uma vez concentrado a 1 mL. O concentrado foi dialisado a 6°C contra 1 L de tampão (5 mM de fosfato de sódio, 35 mM de NaCI) em um tubo de diálise por 16 h. O dialisado foi ajustado a um teor de SDS de 0,1 % com uma solução de SDS 1 % de resistência em água. A amostra foi centrifugada a 10,000 g por 10 min e o sobrenadante de globulômero Aβ (12-42) foi retirado.

REFERÊNCIA EXEMPLO 5

[0430]Globulômero Aβ (20-42)

[0431]1,59 mL da preparação de globulômero Aβ (1-42) do exemplo de referência 3 foram misturados com 38 mL de tampão (50 mM MES/NaOH, pH 7.4) e 200 μL de uma solução de 1 mg/mL de termolisina (Roche) em água. A mistura de reação foi agitada a RT por 20 h. Então 80 μL de uma solução de 100 mM de EDTA, pH 7.4, em água foi adicionado e a mistura foi adicionalmente ajustada a um teor de SDS de 0,01 % com 400 μL de uma solução de SDS de 1 % de resistência SDS solução. A mistura de reação foi concentrada para aproximadamente 1 mL via um tubo de 15 mL 30 kDa Centriprep. O concentrado foi misturado com 9 mL de tampão (50 mM MES/NaOH, 0,02 % de SDS, pH 7.4) e mais uma vez concentrado a 1 mL. O concentrado foi dialisado a 6°C contra 1 L de tampão (5 mM de fosfato de sódio, 35 mM de NaCI) em um tubo de diálise por 16 h. O dialisado foi ajustado a um teor de SDS de 0,1 % com uma solução de SDS de 2 % de resistência em água. A amostra foi centrifugada a 10,000 g por 10 min e o sobrenadante de globulômero Aβ (20-42) foi retirado.

REFERÊNCIA EXEMPLO 6

[0432]Fibrilas Aβ

[0433]1 mg Aβ (1-42) (Bachem Inc. Catalog Nr.: H-1368) foi dissolvido em 500 μL aquoso de 0,1 % de NH4OH (tubo Eppendorff) e a amostra foi agitada por 1 min a temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 5 min a 10,000 x g e o sobrenadante foi retirado. 100 μL da referida solução recém preparada de Aβ (1-42) foram neutralizados com 300 μL 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI, pH 7.4. O pH foi ajustado a pH 7.4 com 1 % de HCI. A amostra foi incubada por 24 h a 37°C e centrifugada (10 min a 10,000 g). O sobrenadante foi descartado e um grânulo de fibrila lavado duas vezes com 400 μL 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4 e então finalmente resuspenso com 400 μL de 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI, pH 7.4 por centrifugação por 1 min.

REFERÊNCIA EXEMPLO 7

[0434]sAPPα

[0435]Fornecido pela Sigma (cat. no. S9564; 25 μg em 20 mM de NaH2PO4; 140 mM de NaCI; pH 7.4). The sAPPα foi diluído com 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCI, pH 7.4, 0,2 mg/mL de BSA to 0,1 mg/mL (= 1 pmol/μL).

Claims

1. Produto imunogênico CARACTERIZADO pelo fato de que é um oligômero de muteína Aβ truncado para induzir uma resposta imune contra amiloidose, o qual compreende uma forma truncada no N-terminal de um oligômero de muteína Aβ, que é obtenível por digestão proteolítica limitada de um oligômero de muteína Aβ não trun-cado, cujo oligômero de muteína Aβ não truncado compreende uma pluralidade de sequências de aminoácidos, derivadas da sequência Aβ de acordo com a SEQ ID NO: 1 por uma ou duas substituições de aminoácidos: (1) em que: - o mutante único contém uma única mutação na posição F20, A21, E22, D23, V24, G25 ou S26, e - o mutante duplo contém duas mutações nas posições (F20/E22), (E22/G25), (E22/S26) ou (G25/S26), em que os substituintes são selecionados dentre os seguintes significados: e 11) é reativo com anticorpo monoclonal 4D10 obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405, em que o anticorpo monoclonal preferivelmente se liga ao produto com uma KD de 1x10- 6 M ou maior de afinidade.

2. Produto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende substituições de aminoácidos selecionadas dentre: - o mutante único E22A, E22F, E22V, D23A, D23K, G25A, G25V,G25T, S26A e S26L, e - o mutante duplo é selecionado dentre (F20G,E22A), (E22A,G25A), (E22A,S26A) e (G25A,S26A).

3. Produto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é capaz de suscitar um antissoro policlonal, em que o antissoro policlonal tem uma afinidade a um globulômero Aβ que é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo me-nos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes, e mais preferivelmente pelo menos 100000 vezes maior do que a afinidade do antissoro a pelo menos uma forma Aβ selecionada a partir do grupo que consiste em Aβ(1-42) monomérica, Aβ(1-40) monomérica, Aβ(1-42) fibrilomérica e Aβ(1-40) fibrilomérica; em que o globulômero Aβ é preferivelmente selecionado a partir de globulô- mero Aβ (1-42), globulômero Aβ (12-42) e globulômero Aβ (20-42).

4. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é capaz de suscitar um antissoro policlonal, em que o antissoro policlonal tem uma afinidade a um globulômero Aβ (20-42) que é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivel-mente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes e ainda mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes, por exemplo, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 5000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10000 vezes, por exemplo, pelo menos 20000 vezes, pelo menos 30000 ou pelo menos 50000 vezes e mais preferivelmente pelo menos 100000 vezes maior do que a afinidade do antissoro a pelo menos um globulômero Aβ selecionado a partir do grupo que consiste em globulômero Aβ (1-42) e globulômero Aβ (12-42).

5. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é adicionalmente definido por uma ou mais das seguintes características: (a) pelo menos parte da referida sequência de aminoácidos forma uma alça, preferivelmente uma alça de β-hairpin; (b) as porções de sequência de aminoácidos do produto que correspondem a F19F20A21 (SEQ ID NO: 8) e A30I31I32 (SEQ ID NO: 9) são em orientação antiparalela; (c) parte da sequência de aminoácidos forma uma alça que compreende uma sequência selecionada dentre V24G25S26N27 (SEQ ID NO: 10) e D23V24G25S26N27K28 (SEQ ID NO: 11).

6. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é um oligômero que compreende de 2 a 48 das referidas sequências de aminoácidos Aβ.

7. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é obtenível por um processo que compreende as seguintes etapas: (a) dissolver um peptídeo Aβ mutado que compreende a referida sequência de aminoácidos Aβ em um solvente; (b) adicionar um agente anfipático à solução do peptídeo Aβ mutado; e (c) incubar a mistura resultante para formar o oligômero; e (d) clivar de modo proteolítico o oligômero.

8. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é adicionalmente definido por uma ou mais das seguintes características: (a) uma primeira sequência de aminoácidos LA34MA35VA36GA37GA38 (SEQ ID NO: 5) está em orientação paralela a uma segunda sequência de aminoácidos LB34MB35VB36GB37GB38 (SEQ ID NO: 5), em que a distância entre prótons para pelo menos um par de átomos selecionado a partir do grupo que consiste em MA35(NH)- VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)-LB34(CδH3), MA35(NH)-VB36(CYH3) é preferivel-mente 1,8 a 6,5 Angstroms; (b) uma primeira sequência de aminoácidos GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 (SEQ ID NO: 6) está em orientação paralela a uma segunda sequência de aminoáci- dos GB33LB34MB35VB36GB37GB38VB39 (SEQ ID NO: 6), em que a distância entre prótons para pelo menos um par de átomos selecionado a partir do grupo que consiste em GA33(NH)-GB34(NH), MA35(NH)-VB36(NH), GA37(NH)-GB38(NH), LA34(NH)-LB34(CδH3), MA35(NH)-VB36(CYH3), GA38(NH)-VB39(CYH3) e VA39(NH)-VB39(CYH3) é preferivelmente 1,8 a 6,5 Angstroms; (c) o produto compreende uma folha β paralela intermolecular entre duas se-quências de aminoácidos Aβ, em que a folha β paralela intermolecular preferivelmente compreende uma primeira sequência de aminoácidos GA33LA34MA35VA36GA37GA38VA39 (SEQ ID NO: 7) e uma segunda sequência de aminoácidos GB33LB34MB35VB36GB37GB38VB39 (SEQ ID NO: 7), e em que preferivelmente os pares de átomos GA33(CO)-LB34(N), LB34(CO)-MA35(N), MA35(CO)-VB36(N), VB36(CO)-GA37(N) e GB37(CO)-GA38(N) estão em uma distância de 3,3 ± 0,5 A, CO indica a estrutura do átomo de oxigênio, os ângulos phi (Φ) dos resíduos variam de -180 a -30 e os ângulos psi (Φ) dos resíduos variam de aproximadamente 60 a 180 ou de aproximadamente - 180 a -150.

9. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de aminoácidos Aβ mutada é idên-tica a uma porção (X-Y) de uma sequência de aminoácidos mutada selecionada do grupo que consiste em: D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 15), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21F22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 16), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21V22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 17), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21L22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 18), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22K23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 19), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22L23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 20), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21E22D23V24V25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 21), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19G20A21A22D23V24G25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 23), D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24A25S26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 29), e D1A2E3F4R5H6D7S8G9Y10E11V12H13H14Q15K16L17V18F19F20A21A22D23V24G25A26 N27K28G29A30I31I32G33L34M35V36G37G38V39V40I41A42T43 (SEQ ID NO: 30), com X sendo selecionado do grupo que consiste nos números 4..18, ou 12..18, ou é 18; e com Y sendo selecionado do grupo que consiste nos números 33..43, 33..42, 33..41, ou 33..40; ou um derivado reticulado do mesmo, em que pelo menos 2 resíduos não contíguos da sequência de aminoácidos estão covalentemente ligados um ao outro.

10. Produto, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que (X-Y) é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em (142), (4-42), (12-42) ou (18-42).

11. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no diagnóstico de uma amiloidose.

12. Produto, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a amiloidose é Doença de Alzheimer ou Síndrome de Down.

13. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um produto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a composição é preferencialmente uma vacina e, opcionalmente, compreende um excipiente farma- ceuticamente aceitável, por exemplo, um adjuvante tal como o Adjuvante Completo de Freund (CFA) ou um adjuvante que compreende um sal de alumínio.

14. Uso de um produto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir uma amiloidose em um indivíduo, em que o produto é prefe-rencialmente para imunização ativa.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a amiloidose é Doença de Alzheimer ou Síndrome de Down.