JPH0242099A - 普遍的なｔ―細胞エピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ、す
なわち、例えばＤＲＩ、ＯＨ２、ＯＨ４、ＯＨ５、ＤＲ
匈６、ＯＨ７またはＯＨ９などのヒトＭＨＣクラス■分
子類との関連における、多くの異なったヒトおよびマウ
ス主要組織適合遺伝子複合体（ＭＩＩＣ）ハロタイプと
の会合において認識されるエピトープとしての、プラス
モジウムファルシパルム（Ｐ　Ｉａｓｍｏｄ　ｉｕｍｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ　　；　Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
）のサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚ
ｏｉ　ｔｅ；ＣＳ）蛋白質由来のペプチドおよびその誘
導体の使用に関する。更に本発明は、上述のペプチド類
自体、およびそのようなペプチドまたはその誘導体を含
有する免疫原性組成物類に関する。これらの免疫原性組
成物類は、ヒトおよび動物類において、該ホストの該Ｍ
ＩＣハロタイプに関係なく、病原性物質に対する永続性
の免疫応答を誘導するためのワクチン類として使用され
得る。

抗原構造（Ｂ−細胞エピトープ類）の選択された領域を
提示する化学合成ペプチｌ”Ｉｌｆは、天然の分子に給
金する抗体類を誘導し得ることが知られている（Ａｒｎ
ｏｎらの、Ｐｒｏｃ、ＮａＨ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ　６８．１４５０−１４５５　［１９７１Ｆ　）。こ
のようなペプチド類は、宿主中に注射されることができ
、これによって保護的抗体応答が誘導される（Ｓｈｉｎ
ｎｉｃｋらの、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ　、旧ｃｒｏｂｉｏ１．３７．４２５−４４６　
［１９８３］参照）。

しかしながら、多重的クラスＩＩ　ＭＩＣ遺伝子による
個々のエピトープ類に対する応答性の厳密な遺伝子的調
節は、単一的エピトープワクチンの有用性に限界を与え
る。

宿主中で常に免疫応答を誘導するとは限らないエピトー
プの例は、マラリア原虫Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの該
ＣＳ蛋白質中の反復配列Ａｓｎ−Ａｌａ−八５ｎ−Ｐｒ
。

（ＮＡＮＰ）である（Ｅｎｅａらの、５ｃｉｅｎｃｅ、
、２２５．６２８６３０　［１９８４］　；　ｎａｍｅ
らの５ｃｉｅｎｃｅ　２２５．　５９３−５９９［１９
８４］　）。該反復性ペプチドは、寄生動物−特異性免
疫応答を、Ｈ−２ｈハロタイプを保有するようなマウス
においてのみ誘導するものとして見出されたＣＧｏｏｄ
らの、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６４　、　’６５５−
６６０［１９８６］　；　ｄｅｌ　Ｇｕｉｄｉｃｅらの
、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｅ遅、２９５２−２９５５　
［１９８６］　’）。

最近、該ＣＳ蛋白質（ＮＡＮＰ）、の非免疫原性Ｂ−細
胞エピトープが、該Ｃ３蛋白質由来の３２６から３４３
までのアミノ酸残基を有するＴ−細胞エピトープに結合
することによって、高度に免疫原性と成り得ることが示
されている（Ｇｏｏｄらの、５ｃｉｅｎｃｅＺ匝、１０
５９−１０６２　　［１９８７］　）。このＴ−細胞エ
ピトープに対応するアミノ酸配列を含むペプチドが、該
反復性配列（ＮＡＮＰ）ｓを含むペプチドに共有的に結
合された。該連結ペプチド類は、ＢＩＯＢＲおよびＢ１
０゜＾（４Ｒ）マウスにおいて高い抗体力価を誘導した
。

同様に、Ｆｒａｎｃｉｓ　らは、Ｎａｔｕｒｅ　３３０
．１６８−１７０［１９８７］において手足口病ウィル
スペプチドに対する非応答性が、手足ロ病つィルスＢ−
細胞エピトープと、例えばオボアルブミンまたはマツコ
ラクジラミオグロビン由来の外来性ヘルパーＴ−細胞決
定因子との結合によって解消されることを報告している
。Ｇｏｏｄら（［１９８７］　、前出文献）およびＦｒ
ａｎｃｉｓら（前出文献）によって記述されているＴ−
細胞決定因子に対する応答は、Ｉｒ遺伝子（免疫応答遺
伝子類）の制御下にある。このことは、°“適切な゛”
　ＭＨＣハロタイプを有した特定の同系繁殖のマウス系
のみが、使用したＴ−細胞エピトープを認識し得たこと
を意味している。

理想的なワクチンは、すべての個体に病原性物質に対す
る免疫応答を誘導しなければならないため、それはすべ
てのＭＨＣハロタイプにより認識されるＴ−細胞エピト
ープ（頚）を含まなければならない。

アミノ酸配列 １トＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
−八ｌａ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ａｓｎ−５ｅｒ−０１１を有するＣＳ、Ｔ３ペ
プチドが、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとし
て使用され得ることが見出されている。このことは、そ
れが、例えばヒトＭＨＣ分子類ＤＲＩ、ＤＲ２、ＤＲ４
、ＤＲ５、ＤＲｗ　６、ＤＲ７またはＤＲ９との関連に
おける多くの異なったヒトおよびマウスＭＨＣハブロタ
イブとの会合において認識されることを意味する。該Ｃ
Ｓ、Ｔ３ペプチドは、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来の
ＣＳ蛋白質の３７８から３９８までの残基（Ｄａｍｅら
の前出文献）に対応しているが、天然の蛋白質の３８４
および３９８位のシスティン残基に替えて、２個のアラ
ニン残基を含んでいる。従って、該Ｃ３，Ｔ３ペプチド
は、［Δ１　ａ　３８４　＋　３　ａ　９　］−Ｐ、ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ５（３７８−３９８）　とも称
され得る。

更には、該Ｃ３，Ｔ３ペプチドのアミノ酸配列において
僅かな修飾を有するＣ３．Ｔ３ペプチド誘導体類もやは
り１遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとして使用さ
れることが見出された。かくして、普遍的に認識される
Ｔ−細胞エピトープとしての用途をそこなうことなく、
例えばｌまたは２個のアミノ酸を該ペプチドのいずれか
の末端において除去することができる。より多くのアミ
ノ酸が除去されるに従って、該ペプチドは異なったＭＨ
Ｃハブロタイブにより認識される能力をより失なうが、
該ＣＳ、Ｔ３ペプチドのいずれかの末端において２個以
上のアミノ酸が除去された場合にも、該ペプチドは、な
おほとんど全てのＭＨＣハブロタイブにより認識される
。該ペプチドのいずれかの末端において８個より多くの
アミノ酸が除去された場合には、それは、もはやいずれ
のＭＨＣハブロタイブによってもＴ−細胞エピトープと
して認識されない（下記参照）。

普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとしての用途に
影響しないＣＳ、Ｔ　３ペプチドのアミノ酸配列の他の
修飾は、アミノ酸の置換ならびにＣ−末端および／また
はＮ−末端における付加である。

従って、前記Ｃ３，Ｔ３ペプチドまたはその誘導体は、
より大きいポリペプチド、例えば天然Ｃ３蛋白質もしく
はその断片、または外来ペプチド配列、好ましくはマラ
リア寄生虫の他のポリペプチド由来のペプチド配列を含
む融合蛋白質の一部分でありうる。更には、該Ｃ５，Ｔ
　３ペプチドまたはその誘導体のＣ−末端は、アミド化
されていてもよい。

該ペプチドのＮ−またはＣ−末端における修飾の他に、
該Ｃ３，Ｔ３ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列
内部における修飾も可能であり、この修飾は、該ペプチ
ドまたはその誘導体が、なお普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとして使用されることを可能とする。これ
らの修飾は、除去、挿入および／またはアミノ酸の置換
である。このような誘導体の例は、天然のＣＳ−蛋白質
のように３８４および３８９位にシスティン残基を有す
るＣ８−蛋白質の３７８から３９８までの残基を含むペ
プチドである。該修飾の一般的特徴は、それらがペプチ
ドの２次または３次構造を実質的に変化させないことで
ある（ＤｏｏｌｉｔＨｅ、Ｒ，Ｆ、のＴｈｅ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ　、ＩＶ巻、ＮｅｕｒａＬｈ、Ｉｌ、および旧
ＩＩ、Ｒ，Ｌ、　Ｂ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社
、ニューヨーク、１−１１９頁［１９７９］　）。上述
した該誘導体は、該ＭＨＣクラス■分子類に対して、該
Ｃ３，Ｔ　３ペプチドと少なくとも同程度か、好ましく
はより良く結合しなければならない。３８３位のＨｅが
Ｌｅｕに置換されているか、および／または３８７位の
ＧｌｕがＧｌｙに置換されている誘導体は、結合を競合
結合検査により測定した場合に、ＯＨ５およびＤＲｗ　
６の両者に対して本来のＣ５，Ｔ３配列の約ｌ０１００
倍より良く結合することが観察された（Ｋｉｌｇｕｓら
のＰｒｏｃ、ＮａＨ、へｃａｄ、Ｓｃｉ、口、Ｓ、へ５
、旦旦、　１６２９−１６３３［１９８９］　）。

従って、本発明は、アミノ酸配列 Ｒ’−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−５ｅｒ−５ｅｒ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｒ”　　　（１）
（式中、Ｒ１は、Ｈ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ　、　Ｈ４１ｅ−
またはＨ−１およびＲ２は、−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
−ＯＨ１−Ｖａｌ−八５ｎ−ＯＨ１−Ｖａｌ−ＯＨまた
は−ＯＨである） を含有するポリペプチドまたはその誘導体の佇遍的に認
識されるＴ−細胞エピトープとしての使用、該ポリペプ
チド自体、およびこれらのポリペプチド類の製造方法に
関するものである。また、本発明は、このようなポリペ
プチドおよびＢ−細胞エピトープを提示する抗原構造を
有するポリペプチドを含有する免疫原性組成物に関する
。

上述したポリペプチド類の誘導体は、上述したようなア
ミノ酸配列（Ｉ）中に修飾を有するポリペプチド類であ
って、この修飾は、該ポリペプチドの２次または３次構
造を変化させることがなく、従ってこれらのポリペプチ
ドは、数種のＭＩＩＣクラス■分子に対して、なお結合
し、かくして、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ
として使用され得るものである。

本発明において、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトー
プとして使用される好ましいポリペプチド類は、以下の
アミノ酸配列 １ｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌ
ｅ−Ａｌａ−１、ｙｓ−Ｍｅｔ−ＧｌｕＬｙｓ−Ａｌａ
−Ｓｅｒ−−Ｓｅｒ−−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｖａ
ｌ−ＯＨ（ＩＴ） １１−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌ
ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ＧｌｕＬｙｓ−八Ｉａ−
Ｓｅｒ−−Ｓｅｒ−−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−八５ｎ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−０）ＨＩＩＩ） ■−＾ｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
−Ａｌａ−１，ｙｓ−Ｍｅｔ−ＧｌｕＬｙｓ−八１ａ−
Ｓｅｒ−−Ｓｅｒ−Ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＯＨ（ＩＶ） Ｈ−＋１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ
−しｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−ＬｙｓＡｌａ−５ｅｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−八５ｎ−Ｖａｌ−Ｏｆ＋（Ｖ） Ｈ−［１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−ＬｙｓＡｌａ−Ｓｅｒ−−
５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−０
１ＨＶＩ） １トＩｌｅ−Ｇｌｕ−１、ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−ＬｙｓＡｌａ−Ｓｅｒ−
−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｏｆｆ（■） １１−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−＾１
ａ−Ｌｙｓ−門ｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ八１ａ−５ｅｒ−
５ｅｒ−■ａｌ−Ｐｈｅ−八５ｎ−ＶａｌへＶａｔ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｏｌｌ（■） Ｈ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−八ｌａ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−１、ｙｓ−八１ａＳｅｒ−５ｅｒ−
Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−０１ＨＩＸ） １トＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−八Ｉａ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＡｌａＳｅｒ−Ｓｅｒ−−
Ｖａｌ−Ｐｈｅ−八５ｎ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−ＯＨ（Ｘ） １１−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＡｌａＳｅｒ−Ｓｅｒ−
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−八５ｎ−
Ｏｉｌ（ＸＩ） １１−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−１、ｙｓ−ＡｌａＳｅｒ−Ｓｅｒ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−
５ｅｒ−０１ＨＸ　ＩＩ　”）または ト＾ｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−八５ｎＳｅｒ−ＯＨ　　　　　　　　　　　　　
（Ｘ　Ｉ［［）を有するポリペプチド類、あるいは該ア
ミノ酸配列（ＩＩ）ないしくＸＩ［Ｉ）を有するポリペ
プチドの誘導体である。

本発明において普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ
として使用される最適なポリペプチドは、上述したＣＳ
、Ｔ３ペプチドと同じアミノ酸配列Ｘ■を有するポリペ
プチドである。

先に概略を述べたように、Ｔ−細胞エピトープとＢ−細
胞エピトープとの組合せは、Ｔ−ヘルパ／ 一細胞依存性免疫応答を誘導することができる機能的な
単位である。従って、上述したＴ−細胞エピトープは、
宿主に免疫応答を誘導するためにＢ細胞エピトープに会
合していなければならない。

該Ｂ−細胞エピトープは、抗原構造の選択された領域を
提示するペプチド、ハプテンまたは炭水化物のいずれで
あってもよい。このような抗原構造は、ポリペプチドの
一部分であってよく、このポリペプチドは、グリコジル
化されていてもよく、またはされてなくともよい。該ポ
リペプチドは、病原性物質、例えば疾患原因性細菌、ウ
ィルス、カビまたは寄生虫の表面蛋白質であってもよい
。

このような病原性物質の例は、Ｄａｖｉｓ　らの“Ｍｉ
ｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ−”第３版、Ｈａｒｐｅｒ　Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。

本発明の普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとして
使用されるペプチドは、Ｂ−細胞エピトープを提示する
ペプチド、ハプテンまたは炭水化物のいずれかと共有的
に結合され得る。該結合は、普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとして使用されるペプチド上の遊離のカル
ボキシル、アミノまたはヒドロキシル基と、Ｂ−細胞エ
ピトープを提示するペプチド、ハプテンまたは炭水化物
上の対応する基との間のペプチドまたはエステル結合形
成により直接的にあるか、あるいは、通常の二官能性結
合基を介して間接的であってもよい。

このような結合基の形成の形成のために使用される通常
の二官能性結合剤の例は、スルホザク５シニミジル・４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート　（スルホ−
ＳＭＰＢ）　、スルホサクシニミジル（４−イオドアセ
チル）アミノベンゾエート　（スルホ５ＩＡＢ）、Ｎ−
サクシニミジル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエ
−ト（ＳＩＡＢ）、２−イミノチオラン・ＩＩＣＩ（）
ラウド試薬）、ジメチル・ピメリミデート・２　ＨＣＩ
　（ＤＭＰ）、サクシニミジル・４−（ｐ−マレイミド
フェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ　−サクシニミ
ジル・３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＷ）およびｍ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ド・エステル（ＭＢＳ）である。これらのもの、および
その他の二官能性結合試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　、ロックフォード、イリノ
イ、米国から商業的に入手可能である。別法として、グ
ルタルアルデヒド等の０２−７−ジアルカナール類を用
いることもできる（八νｒａｍｅａｓのＴｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍ、　６．４３−５２　［１９６９］　）。

更には、該Ｂ−細胞およびＴ−細胞エピトープは、多重
抗原性ペプチド（ＭＡＰ）の一部分でありうる。このよ
うな阿＾Ｐ類は、Ｐｏ５ｎｅｔｔらのＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６３．１７１９−１７２５　［１９８８
］によって記述されているようにして調製されてもよい
。ＭＡＰの例は、プラスモジウムファルシパルムのＣ３
蛋白質中に存在する反復配列（ＮＡＮＰ）の多量体を含
む多重抗原性ペプチド系（ＭＡＰＳ）Ｂ−細胞エピトー
プ［（ＮＡＮＰ）　３　］　］ａ−Ｌｙｓ？−Ａｃａ−
Ｃｙｓ−Ｎｆｌである　（国際特許出願番号ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ８５１０１４１６　、公開番号−０８６１００９１１
）。このＭＡＰＳは、固相法により合成され得る。２つ
の別個の免疫化の研究において、このＭＡＰＳが破傷風
毒素に対して結合した［Ａｃ−Ｃｙｓ（ＮＡＮＰ）ｚ　
］　ｚｓ　Ｂ−細胞エピトープについて観察されたもの
と比較し得る抗体力価を誘導することが見出された（Ｈ
ｅｒｒ　ｉｎｇ　ｔｏｎらのＮａｔｕｒｅ　３２８．２
５７−２５９　［１９８７］　）　。前述したＭＡＰＳ
　Ｂ−細胞エピトープは、充分特定された均質なペプチ
ドであって、正確な投与を可能とし、高い抗体力価を誘
導するために担体蛋白質（例えば破傷風毒素）との結合
を必要としないこ七から、−この観察は特に重要である
。従って、該ＭＡＰＳ　Ｂ−細胞エピトープの手法は、
（ａ）ペプチド−蛋白質結合の微少異種性（ｍｉｃｒｏ
ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉ　ｔｙ）および（ｂ）結合物の
合成ペプチド部分に対する免疫応答を妨害するであろう
破傷風毒素自体に対する抗体応答を含む蛋白質担体に結
合されたペプチドワクチン類に伴う問題を解決するであ
ろうＣＨｅｒｒｉｎｇｔｏｎらの前出文献）。

従って、該Ｔ−細胞およびＢ−細胞レベルの両者におけ
る長期免疫を有する理想的なワクチンを開発する試みに
おいての更なる改良として、配列Ｉまたはその誘導体の
アミノ酸配列を有するポリペプチドは、上述したＭＡＰ
Ｓ　Ｂ−細胞エピトープと結合されてもよい。例えば、
アミノ酸配列Ｘ■を有するポリペプチド（実施例、化合
物５ａ参照）またはアミノ酸配列Ｘを有するポリペプチ
ド（実施例、化合物７ａ参照）は、ＭＡＰＳ　Ｂ−細胞
エピトープ［（ＮＡＮＰ）ｌ　］　］ａ−Ｌｙｓｔ−Ａ
ｃａ−Ｃｙｓ−ＮＨと結合されてもよい。後者のペプ°
チド／ペプチドワクチンの模式的表示が第１図に示され
ている。上述のペプチド／ペプチドワクチン頻において
、Ｔ−細胞エピトープを提示するペプチドは、Ｂ−細胞
エピトープを提示するペプチドに共有的に結合されてい
る。しかしながら、Ｔ−細胞エピトープを提示するペプ
チドは、Ｂ−細胞エピトープを提示するペプチドに共有
的に結合されている必要はなく、該ペプチド類は、免疫
系の細胞に対して同時的提示をもたらすような方法で会
合していることのみが必要とされる。

該Ｂ−細胞および／またはＴ−細胞エピトープを提示す
るペプチド類は、溶液または好ましくはＭｅｒｒｉｆ　
１ｅｌｄの固相法（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５
．２１４９−２１５４　［１９６３］　）あるいはこの
分野で知られている他のいかなる同等な方法のいずれか
による通常のペプチド合成法によって調製され得る。

固相法は、保護されたアミノ酸を適当な樹脂に結合する
ことによってペプチドのＣ−末端から開始される。出発
材料は、アミノ−保護アミノ酸を、ベンジルエステル結
合を介してクロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチ
ル樹脂に、またはアミド結合を介してベンズヒドリルア
ミン（ＢＨＡ）樹脂、メチルベンズヒドリルアミン（Ｍ
ＢＨＡ）樹脂もしくはベンジルオキシベンジルアルコー
ル樹脂に固定することによって調製され得る。これらの
樹脂は、商業的に入手可能であり、かつそれらの調製お
よび使用は周知である。

本発明において使用し得る、アミノ酸を保護し、また保
護基を除去するための一般的方法は、“ＴｈｅＰｅｐｔ
ｉｄｅｓ　：＾ｎａｌｙｓｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、
Ｂｉｏｌｏｇｙ”第２巻（Ｅ、ＧｒｏｓｓおよびＪ、Ｍ
ｅｉｅｎｈｏｆｅｒ　田、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
　、　ニーニーヨーク、１−２８４頁［１９７９］　）
および八ｔｈｅｒｔｏｒらによる”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ　：八ｎａｌｙｓｉｓ。

５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ　、第９巻、（Ｓ
、ＵｄｅｎｆｒｉｅｄおよびＪ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ
　１３、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニュヨーク［
１９８７］　）に記載されている。保護基は、例えば、
９−フルオルエニルーメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏ
ｃ）、ｔｅｒ　ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）
、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチル（Ｂｕｔ）　、２−
クロロベンジルオキシカルボニル（２ＣＩ−Ｚ）　、ジ
クロロベンジル（口ｃｂ）および３，４−ジメチルベン
ジル（Ｉ）ｍｂ）基を含んでいる。

第１の（Ｃ−末端）アミノ酸から該α−アミノ保護基を
除去した後に、残りの保護されたアミノ酸が所望の順序
で段階的に結合される。該完全ペプチドは、この方法で
合成されてもよい。別法として、後で結合して最終ペプ
チドを生成物を与える小さいペプチドを合成することも
できる。適当な結合方法は、この分野において知られて
おり、１゜３−ジシクロへキシルカルボジイミド／１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ｌｌ０Ｂ　ｔ
）または〇−ペンヅトリアゾリルーＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ“
　−テトラメチルウロニウムヘクサフルオロホスフェー
ト（）ＩＢＴＵ）を使用するＤｏｕｒｔｏｇｌｏｕらの
方法が特に適している。

各々の保護されたアミノ酸またはペプチドは、過剰量を
もって固相反応器に導入され、そして結合は、ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）　　もしくは塩化メチレン（Ｃ
ＩｌｚＣｌｚ）、またはそれらの混合物中の媒体中で行
なわれる。不完全な結合が起きた場合には、次のアミノ
酸の結合に先立って、Ｎα−アミノ保護基を除去する前
に該結合処理が繰り返される。合成の各段階における結
合反応の成功を監視してもよい。合成を監視する好まし
い方法は、ニンヒドリン反応によるものである。該結合
反応および洗浄工程は、自動化装置を用いて行なうこと
ができる。

該樹脂からの該ペプチドの開裂は、ペプチド化学におい
て良く知られている方法を用いて行なわれ得る。例えば
、ｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィドの存在下に
おける０°Ｃ１１時間のフッ化水素（ＩＩＰ）との反応
は、ｐ−クレゾールの存在下における０℃、２時間のフ
ッ化素、またはトリフルオロ酢酸／塩化メチレン／アニ
ソールとの反応に引継がれてもよい。クロロメチル化ま
たはｐベンジルオキシベンジルアルコール樹脂支持体か
らのペプチド類の開裂は、Ｃ−末端にカルボキシル基を
存する最終ペプチドを生成する。ベンズヒドリルアミン
またはメチルベンズヒドリルアミン樹脂からのペプチド
類の開裂は、Ｃ−末端アミド基を有するペプチド類を生
成する。

別法として、９遍的に認識されるＴ−細胞エピトープま
たは付加的にＢ−細胞エピトープを提示するペプチド′
を含んだ結合ペプチドは、組換えＤＮＡ技術の方法を用
いて調製し得る。組換えＤＮＡ技術によってこのような
ペプチドを調製する方法は、この分野においてはよく知
られている。前記ペプチドをコードするＤＮＡ断片は、
この分野でよく知られた方法、例えばホスホトリエステ
ル法（ＮａｒａｎｇらのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、６
８．９０−１０８　［１９７９］　）またはホスホジエ
ステル法ＣＢｒｏｗｎ　らのＭｅ　ｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８．１０９−１５１　　［１９７９
］）によってｉＰｌ製することができ、そしてＭａｎｉ
ａｔｉｓ　らのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ−八
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ”　　、　　
Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｉ、ａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　　［１９Ｂ２］に記載されたようにして発
現ベクター中にクローン化することができる。

本発明において使用されるペプチドは、公知の方法、例
えば分別遠心分離、硫酸アンモニウムを用いた沈澱、脱
塩のための透析（常圧または減圧下）、調製用等電的フ
ォーカシング、調製用ゲル電気泳動、または種々のクロ
マトグラフィー的方法、例えば、ゲル口過、高速液体ク
ロマトブラフイー（ＩＩＰＬｃ）、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィーもしくはアフィニ
ティクロマトグラフィー等により精製され得る。

本発明による普遍的Ｔ−細胞エピトープを提示するペプ
チドおよびＢ−細胞エピトープを提示するペプチドを含
有する免疫性組成物は、製薬学的に許容されるアジュバ
ントを付加的に含有してもよい。前記免疫原性組成物は
、上述したＢ−細胞エピトープを表現する病原性物質に
対して特異的な抗体の形成を誘導するためのワクチンと
して使用することができる。“製薬学的に許容されるア
ジュバントなる用語は、ヒトへの投与のために適した標
準的な組成物または動物へのワクチン接種に使用される
典型的なアジュバントおよび賦形剤（例えば血清アルブ
ミンまたは血漿調製物）のいずれかを意味している。動
物のワクチン接種のために好適なアジュバントは、フロ
イントの完全または不完全アジュバント　（ヒトまたは
家畜への使用には適さない）、アジュバント６５（ビー
ナツツ油、モノオレイン酸マンニドおよびモノステアリ
ン酸アルミニウムを含む）、水酸化アルミニウム、リン
酸アルミニウムおよびみょうばん等の鉱物ゲル、ヘキサ
デシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジ
メチルジオクチルデシルアンモニウムブロマイド、Ｎ、
Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’、Ｎ’　　−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）プロパンジアミン、メトキシヘキシデシ
ルグリセロールおよびプルロン酸ポリオール類等の界面
活性剤、ピラン、硫酸化デキストラン、ポリｔＣ、ポリ
アクリル酸およびカルボボール等のポリアニオン類、ミ
ュラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等
のペプチド類およびアミノ酸類ならびに油のエマルジョ
ンを含むが、これらに限定されるものではない。本発明
のポリペプチドは、リボゾーム類もしくは他のマイクロ
キャリア類中への結合の後、あるいは多Ｐｉ類、他の蛋
白質類もしくは他のポリマー類との結合の後、または、
“Ｉｓｃｏｍｓ（免疫促進複合体類）を形成する（ｌｕ
ｉｌ−八との組合せにおいても投与することが可能であ
る（ＡｌｌｉｓｏｎらのＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ
、９５．１５７−１６８　［１９８６］　；Ｍｏｒｅｉ
ｎらのＮａｔｕｒｅ　３０８．４５７−４６０　［１９
８４］　”）　、更に、普遍的Ｔ−細胞エビトープを提
示するポリペプチドをコードしている遺伝子を発現し得
るワタシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）またはサルモネラ（
ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等の遺伝子的に加工された微生
物は、ワクチン投与系として使用可能である（Ｍａｃｋ
ｅｔｔのＩｍｍｕｎｏ　ｌ　、　Ｌｅ　ｔ　ｔｅｒｓ測
、２４３−２４８　［１９８７］　）。

該免疫原性組成物は、本発明による普遍的Ｔ−細胞エピ
トープ提示ペプチドを、Ｂ−細胞エピトープ提示ペプチ
ドおよび必要に応じて製薬学的に許容されるアジュバン
トと組合せることにより調製される。好ましくは、該免
疫原性組成物は、単位投与量の形態である。ワクチン接
種または医薬として一時または一期間を通じて投与され
る活性物質の量は、治療される対象、投与の方法および
形態、ならびに治療にあたる医師の判断に依存するであ
ろう。しかしながら、効果的な投与量は、本発明の組成
物の約１ｎｇから約１　ｍｇの範囲、好ましくは約１０
０μｇから約５００ｔ１ｇであり、また、これより低い
および高い投与量も有用でありうると認識される。該免
疫原性組成物は、種々の形態であってよい。これらは、
例えば固体、半固体および液体の投与形態を含む。単位
投与量は、好ましくは該免疫原性組成物を０．９％（ｗ
／ｖ）のＮａＣｌ溶液中のサスペンションの形態で収容
した１雌のバイアル中に封入してなる。最も好ましい免
疫原性組成物は、８５０μｇのＡＩ（ＯＨ）ｚ／滅に吸
着された０、　４■／　ｍｌの蛋白質（Ｔ−およびＢ−
細胞エビトープペプチド）およびＬＯＯｕｇ／ｍｌｌの
Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ”（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ）を含
有している。該バイアルは、好ましくは該免疫原性組成
物の正しい使用を知らせる指示書と共に入れ物に包装さ
れる。本発明は、入れ物に、最も好ましくは適切な指示
書と共に包装された免疫原性組成物のこのような単位投
与量にも関連する。更に本発明は、前記免疫原性組成物
を用いたヒトまたは動物の免疫化方法に加え、該免疫原
性組成物またはその単位投与量の製造方法に関する。

該免疫原性組成物の投与形態および経路ならびに注射の
頻度は、すべて、この分野の通常の技術を用いて至適化
されるべき因子である。典型的には、免疫学的に有効な
量の該ワクチンによる最初のワクチン接種は、数週間後
に１回以上の“推進”ワクチン接種に引纜がれ、その真
正の効果は特定の病原性物質に対する抗体の高い力価の
生成にある。

この発明を一般的に記述したが、これは、添付の図面工
ないし６との関連において以下の実施例を参照すること
によってより容易に理解されるであろう。

律−り図、門ＡＰＳ　Ｂ−細胞エピトープ［（Ｎ静Ｐ）
３］＋１Ｌｙｓ７−Ａｃａ−Ｃｙｓ−ＮＴｌｚおよびＴ
−細胞エピトープへｃ−Ｃｙｓ−へｃａ　　［Ａｌａ”
”　３８”Ｊ　　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　　Ｃ５
（３８０−３９６）−Ｎ１３を含むペプチド／ペプチド
ワクチンの模式的表示。Ｎ、　Ａ、　Ｐ、　Ｋは、それ
ぞれアスパラギン、アラニン、プロリンおよびリジンを
示す。

］ユｌ■」ＭＡＰＳ　Ｂ＝細胞エピトープ［（ＮＡＮＰ
）　３　］　］５−Ｌｙｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−ＮＨの
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の模式的表示。

策主口　ＭＡＰＳ　Ｂ−細胞エピトープ［（ＮＡＮＰ）
３　］　］５−Ｌｙｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−ＮＨと普遍
的Ｔ−細胞エピトープＡｃ−Ｃｙｓ−八ｃａ−［Ａｌａ
”４′３”］　　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣＳ　（
３７８−３９８）−ＮＨ□との共有結合の模式的表示。

ｌ上回　ＭＡＰＳ　Ｂ−細胞エピトープ［（ＮＡＮＰ）
３　］　］ｅ−Ｌｙｓ７−Ａｃａ−Ｃｙｓ−ＮＨと普遍
的Ｔ−細胞エピトーブＡｃ−Ｃｙｓ−八ｃａ−［Ａｌａ
３８””］　　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣＳ　（３
８０−３９６）−Ｎ１１□との２，２゛−ジピリジルジ
スルフィドを介しての共有結合の模式的表示。

［（ＮＡＮＰ）ｆｆ−ＣＳ、Ｔ３　　（ロー［テコ）ま
た（まＭＡＰＳＢ−細胞エピトープ［（ＮＡＮＰ）　３
　］　］５−Ｌｙｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−Ｎｔ１に共有
的に結合した普遍的Ｔ−細胞エピトーブ　八ｃ−Ｃｙｓ
−＾ｃａ−［Ａｌａ３１１４．３１１９　］　−ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ５（３７８−３９８）−Ｎ）
＋２　（◆−◆）により免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス
のプラズマ中の抗−（ＮＡＮＰ）　、。抗体の存在につ
いての酵素−結合免疫吸着アッセイ。

星旦口　（ＮＡＮＰ）　３−Ｃ５，Ｔ　３　　（Ｅｌ−
［テコ）またはＭＡＰＳＢ−細胞エピトープ［（ＮＡＮ
Ｐ）　３　］　］ｅ−Ｌｙｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−Ｎｉ
ｌに共有的に結合した普遍的Ｔ−細胞エピトープＡｃ−
Ｃｙｓ−Ａｃａ−［Ａｌａ”””］　−Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ５（３７８−３９８）−ＮＨ
ｚ　（◆−◆）により免疫化したＢＡＬ８／Ｃマウスの
プラズマ中の抗−（ＮＡＮＰ）ｓ。抗体の存在について
の免疫ケイ光アッセイ。

以下の実施例は、単に例示を目的とするものであって、
本発明は、ここに示された特定の実施態様にいかなる方
法においても限定して解釈されるべきではないものと理
解されるべきである。使用した略号は、ペプチド化学に
おいて一般的に用いられるものに従っている（“Ｔｈｅ
　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”　Ｖｏｌ、２゜Ｓ、Ｈｄｅｎｆｒ
ｉｅｎｄおよびＪ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ　ｌｉ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　、ニューヨーク［１９８７］
参照）。

ペプチドＣＳ、Ｔ　３を、塩基反応性Ｎ−フルオルエニ
ルメトキシカルボニルーアミノ酸、七−ブチルに基づく
側鎖保護基およびｐ−ベンジルオキシベンジルアルコー
ルポリスチレン樹脂を用い、ＡｔｈｅｒｔｏｎらのＴｈ
ｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓｊＢｉｏｌｏｇｙ″９巻（Ｓ、ＩＪｄｅｎｆｒ
ｉｅｎｄおよびＪ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄ
ｅｍｆｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　二ｓ−ヨーク［１９８７］
　）により記述されているように固相法により合成した
。

最初の合成は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−（Ｂｕｔ）　−０−
Ｃ１ｌｚＣ６ＨａＯ−ＣＨｚＣｂＨ４−樹脂を用いて手
動振とぅ器中で開始した。

典型的な合成サイクルについてのプロトコールは次のと
おりであった。

パー−Ｊ Ｎ、Ｎ−ジメチルホルム７ミＦ（Ｄ肝）２０′Ａ　ピペ
リジン／ＤＭＰ 口？’ｌＦ ２．５当ｉＦｍｏｃ−アミノ酸／ＩＩＭＦす２．５　当
量　ＨＢＴＵ ＋２．５　　当ＩＮ−エチルシイツブＵピルアミンＭＦ イソブ■ピルアルコー１シ（ｉ−ＰｒＯＨ）詩−… ２Ｘ１分間 １×７分間 ５×１分間 １×９０分間 ３×１分間 ２×１分間 得られた保護されたペプチド樹脂Ｈ−Ａｓρ（ＯＢｕ　
ｔ）−Ｉ　Ｊｅ−Ｇｌｕ　（ＯＢｕ　ｔ）　−Ｌｙｓ　
（Ｂｏｃ）　−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）　−Ｉｌｅ−Ａ　Ｉ
ａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ　（ＯＢｕ　ｔ
）　−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）　−Ａ　Ｉａ−５ｅｔ（Ｂｑ
　ｔ）−３ｅｔ（Ｂｕｔ）−Ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−
Ｖａｌ−Ｖａｔ−八５ｎ−Ｓｅｒ−（Ｂｕｔ）−０−Ｃ
Ｈ２Ｃ６Ｈ４０ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−樹脂を、トリフルオロ
酢酸−塩化メチレン−アニソール（４９：４９：２）を
用いて処理し、遊離のペプチドを得た。該ペプチドを、
ＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂＲｐ１８（１０μ）カラム（Ｍｅ
ｒｃｋ、口ａｒｍｓｔａｄｔ　、　ＦＲＧ）を用いた０
、１％トリフルオロ酢酸−エタノール勾配系における高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した
。

該トリアトリアコンタペプチド（ＮＡＮＰ）　３−Ｃ５
，↑３を、古典的な溶液法と固相ペプチド合成との組合
せによって合成した。該保護されたテトラペプチドＦｍ
ｏｃ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨを以下の
模式図に従って合成した： （本頁以下余白） Ｎα−非保護の上記ペプチド樹脂に対する）ＩＢＴＵ方
法によるＮα−保護テトラペプチドの３回反復シテノ結
合により、保護されたトリアトリアコンタペプチド樹脂
を得た。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／塩化メチレン／
アニソールを用いた処理によって該遊離のペプチドが遊
離された。精製は、上述した勾配系におけるＨＰＬＣに
よって行なった。

該ペプチドは、分析用＋１ＰＬＣにより均質であり、酸
加水分解の後に予期されたアミノ酸組成を示した。

ＣＳ、Ｔ３−　　　　Ｔ−クローン　の８人の志願者（
マラリア感染の経歴のないヨーロッパ人血液提供者ＭＧ
、ＤＰ、ＪＫ、ＢＲ，ＢＨ，ＡＨ，ＳＤおよびＰＥ）か
らの末梢血単核細胞は、標準的なＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　１ｌｅａＨｈ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ　、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）の補
体−媒介微少毒性アッセイ　（Ａｍｏｓ＋Ｄ、Ｂ、の“
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ　、　ＮｒＨ
Ｄ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｔｙｐｉｎｇ
　Ｔｅｃｈ−ｎｉｑｕｅｓ、　　Ｎｆｌ（Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎ　　８０−５４５　　［１９７９コ　、　Ｕ
、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｌ１ｅａＩｔｈ、、Ｅｄ
ｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ　。

Ａｔ１ａｎｔａ　、、Ｇｅｏｒｇｉａ　、、Ｕ、Ｓ、八
、）を使用してＩＩＬＡに分類された。該細胞をペプチ
ドＣ３，Ｔ　３　（１０ｍｇ／ｍ１）により刺激し、Ｉ
Ｌ−２含有培地に展開し、そして既に記述されているよ
うにしてクローン化した（Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ　らの
、Ｅｕｒ、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１７．１８７−１９２
［１９８７］　）。増殖性アッセイにおける該クローン
の抗体反応性および制限特異性を試験するために、クロ
ーン化されたＴ−細胞（２Ｘ１０’）を１０４の照射さ
れた自系またはＤＲ同型接合のＥＢＶ形質形質転換側細
胞ｉｎｇａｇｌｉａらのＥＭＢＯＪ、土、３８１９−３
８２２［１９８５］　）と共に該抗体ＣＳ、Ｔ　３　（
１０ｍｇ／ｍ１）含有または非含有の０．２　ｐｉ！の
完全培地中で３組により共培養した。３Ｈ−チミジンの
同化を７２時間後に測定した。代表クローンの１分間あ
たりのカウント（ｃｐｍ）の平均値により示される結果
を第１表に示した。

（本頁以下余白） 第１表中に示されるように、Ｔ−細胞クローンは、自系
ＥＢＶ−Ｂ細胞上または提供者のＤＲ特異性を有するＤ
Ｒ−同型接合系上にある場合には、Ｃ５，Ｔ３抗原に対
するのと同様によく反応する。従って、少゛くとも７種
の異なったＤＲ分子は、提示のために該Ｃ３，Ｔ３ペプ
チドと会合することができる。該抗ＤＲモノクローナル
抗体２．３１　（ＴｒｕｃｃｏらのＩｍｍｕｎｏｌ。

Ｒｅｖ、４７．２１９−２４２　　［１９７９］）は、
腹水の１／１００希釈として培養物に添加した。

提供者Ｍ　Ｇ　（Ｉ（ＬＡ型［ＩＲ２，９）からは、１
２種のＣＳ。

Ｔ３−特異性クローンが得られ、８種がＤＰ２および４
種がＤＰ９に制限され、ＤＰ（ＯＨ１，４）からは、１
１種のＣＳ、Ｔ３−特異性クローンが分析され、３種が
ＤＰＩ−制限および８種がＤＰ４−制限であり；ＪＫ　
（ＤＲｗｌｌ（５）、　　７　）からは、９種のＣ３，
Ｔ　３−特異性クローンが分析され、それらのすべてが
ＤＰ５に制限され；ＢＲ（ＤＰ４．す６）からは、１０
種のＣＳ、Ｔ３−特異性クローンが試験され、それらの
半数がＯＨ４、および半数がＤＲｗ　６−制限であり、
ＢＨ（ＤＰＩ。

３）からは、１６種の抗原−特異性クローンが得られ、
それらのすべてがＤＰＩに制限され、　Ｓ　Ｄ　（ＯＨ
５，７）からは、１７種のクローンが試験され、それら
の４種がＤＩ？５および１３種がＯＨ７に制限され；そ
して最終的に１３種のＣＳ、Ｔ３−特異性クローンがＰ
Ｅ　（ＯＨ５，ｗ６）から得られ、１３種がＯＨ５−制
限であり、ＤＲｉｎ　６に制限されるものは無かった。

得られたすべてのＣ３，Ｔ３−特異性クローンは、それ
らがＴ−ヘルパー細胞（ＴＨ）であることを示すＣＤ４
”ＣＤ８−であった（ＥｎｇｌｅｍａｎらのＪ、Ｅｘｐ
、Ｍｅｄ、　１５３．１９３−１９８　［１９８１］　
）。

総じて２９８種の抗−Ｃ５，Ｔ３クローンが制限希釈に
より刺激されたＰＢＭＣから誘導された。２９８種のす
べてのＴ−細胞クローンは、Ｃ３，Ｔ３に対して特異的
であり、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳ蛋白質から誘
導された対照ペプチド（ＣＳ蛋白質のアミノ酸残基３２
５３４２）の存在下では増殖しなかった。各Ｃ５，Ｔ３
−特異性Ｔ−細胞クローンのＭＨＣ制限パターンを、Ｔ
細胞増殖応答に対する抗−ＭＩＩＣクラス■モノクロー
ナル抗体（ｍＡｂｓ）の効果を試験することにより評価
した。試験した１８７のクローンの増殖は、単−型ＤＲ
決定因子を認識するモノクローナル抗体Ｅ。

３１により阻害された（第１表）。抗−〇Ｐ　（Ｗａ　
ｔｓｏｎらのＮａｔｕｒｅ　３０４．３５８−３６１　
［１９８３］および抗−〇〇（ＺｉｅｇｌｅｒらのＮａ
ｔｕｒｅ　２７９．２４３−２４４　［１９７９］　）
抗体のいずれもが有効ではなかった。これらの結果は、
該ＤＲ分子がＣ３，Ｔ３−特異性Ｔ−細胞クローンに対
する制限酵素であることを示している。各Ｃ８゜Ｔ３−
特異性Ｔ−クローンのＯＨ制限パターンを、！（ＬＡ−
ＯＨ同型接合提示細胞のパネルの存在下において創生さ
れるＣ３．Ｔ　３ペプチドに対する応答を比較すること
によって評価した（ＢｅｌｌらのＰｒｏｃ、ＮａＨ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８４、６２３４−６２３
８　　［１９８７］　　）。　ＩＩＬＡ−ＯＨ同型接合
提示細胞類は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＣｏＩｌｅｃｔｉｏ
ｎ　ｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
（Ｅ、Ｃ，Ｂ、Ｒ，）　、ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ（ｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｂｌａ
ｓｔｏｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ。

Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｏ　Ｎａｚｉｏｎａｌｅ　ｐｅｒ　ｌ
ａ　Ｒｉｃｅｒｃａ　ｓｕｌ　Ｃａｎｃｒｏ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｌａｂ、、Ｖｉａｌｅ　Ｂｅｎ
ｅｄｅｔｔｏ　ＸＶ、　１０．１６１３２　、Ｇｅｎｏ
ｖａ、　Ｉｔａｌｙから入手することができる。第１表
のデータ作成に用いたＨＬ＾−ＯＨ同型接合提示細胞類
、すなわち、ＤＰＩ同型接合提示細胞Ｅ［）Ｒ、ＯＨ２
同型接合提示細胞ＮＯＬ、　ＤＩ２４同型接合提示細胞
ＢＳＭ、　ＤＲ５同型接合提示細胞ＡＴＨ，ＤＲｗ６同
型接合提示細胞ＡＰＤ、　ＤＲ７同型接合提示細胞ＥＫ
ＲおよびＤＲ９同型接合提示細胞ＤＫＢは、オランダ、
ライデンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌの
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＴｍｍｕｎｏｈａｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ　（Ｅ、ＧｏｕｌｍｙおよびＪ、ｖａｎ　Ｒ
ｏｏａ両博士）から入手した。該細胞類は、２ｍＭのＬ
−グルタミン、１ｍ）’Ｉのピルビン酸ナトリウム、５
×１０−’Ｍのβ−メルカプトエタノール、１％の非必
須アミノ酸（１００％保存溶液：　Ｇｉｂｃｏ）、５０
Ｕ／ｍｆのストレプトマイシンおよび１０％の牛胎児血
清が補充されたＲＰ旧１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｐ
ａ１ｓｌｅｙ、　５ｃｏＨａｎｄ）中にて維持した。該
細胞系は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス−形質転
換Ｂ　（ＥＢＶ−Ｂ）細胞系であり、抗原−提示細胞と
して用いる前に照射（５０００Ｒａｄ）を行なった。

該ＯＨ同型接合提示細胞は、本発明を実施するために必
須ではないことが強調される。これらは、本実施例にお
いて、該ＣＳ、Ｔ３ポリペプチドが実際に普遍的に認識
されるＴ−細胞エピトープであることを示すためにのみ
使用された。

単一のＣＳ、Ｔ　３ペプチドを提示し得るＤＲタイプの
広い範囲の故に、該ペプチドは、１種以上のＴ−細胞エ
ピトープを含むことが推定された。異なったＤＲ分子に
より制限されるＴ−細胞クローンが、該ＣＳ、Ｔ　３配
列上の異なった決定因子を認識するのであるかを測定す
るために、Ｎ−またはＣ−末端のいずれかから１度に１
残基が短縮された一連のペプチド類の存在下において該
Ｔ−細胞クローンの増殖応答を試験した。

第２表に示したアミノ酸配列を有するペプチド類を合成
し、切断し、そして前述のようにしてＩＩＰＬＣにより
精製した。これらのペプチド類は、該Ｃ３゜Ｔ３ペプチ
ドのＮ゛−末端またはＣ−末端のいずれかにおいて１．
２またはそれ以上のアミノ酸が除去されている誘導体で
ある。第１表に示したクローンのＴ−細胞Ｍ　（２ＸＩ
Ｏ’）を、０．１から１００μｇ７ｍ！までの範囲の種
々の濃度の抗原の存在下で、照射された自系ＥＢＶ−８
細胞類（１０’）　　と共に培養した。

１００μｇ／ｍｌにおいて増殖を刺激しなかったいずれ
のペプチドも非−抗原性（−）とみなした。全体長のペ
プチド（３７８−３９８）の存在下において得られる最
大値の５０％までを与えるペプチドを（＋）として示し
、一方、全体長のペプチドＣ５，Ｔ　３　　（３７８３
９８）に匹敵する値を与えるペプチドを（＋＋）により
示しである。各クローンは、同じＤＲ制限を有するＣ５
．Ｔ３−特異性クローンの群（少なくとも４）の代表で
ある。

（来夏以下余白） アミノ酸配列Ｘ１１を有するペプチド３８０−３９８、
アミノ酸配列■を有するペプチド３７８−３９５および
アミノ酸配列ＸＩ［Ｉ、■、■および■を有する長いペ
プチド類を、全ての場合同時に試験した。しかしながら
、短かいペプチド類は、異なるＤＲ分子類に対して制限
されるＣ３．Ｔ３−特異的クローン類に対する異なる認
識パターンを区別し得た。両極端にあるのは、ＤＲ２−
およびＤＲ５−制限されたクローン類である。Ｃ−末端
の端から３９５位のＶａｌ迄の削除およびＮ−末端から
Ａｌａｆｆｅ４迄の削除は、ＤＲ２−制限されたクロー
ン類に対して感知できない効果であった。Ａｌａ３ｅａ
の削除は、いずれの投与試験に於ても認識が〈５０％に
減少した。更に、Ｎ−末端からのＬＶＳ：＋ａｓの除去
またはＣ−末端からのＶａｌ：＋ｑｓの除去は、認識の
完全な喪失をもたらした。

逆に、ＤＲ５−制限クローン類は、Ｎ−末端の端からシ
ＶＳｙｅｌの削除までおよびＣ−末端の端から５ｅｒ３
ｑ。

の削除までに応答することができた。従って、ＤＲ２お
よびＤＲ５に関して刺激する別個のＮ−およびＣ−末端
の截断によって定義される極少の領域は、しＶＳ３ａｓ
−Ｖａｌｚｗｓ残基およびＬＶＳ：＋ａ＋−５ｅｆｑｏ
残基にそれぞれ対応する。第２表は、またＤＲ４に対す
る最少刺激領域が、３８３−３９４残基の間を含み、両
方のＤＲｗ　６およびＤＲ７の両者に対する領域が３８
１−３９３／３９４残基に対応すると同時にＤＲｌ−制
限クローン類が、３８２−３９５（図示されていない）
または３８１３９２のいずれかを認識することを示す。

截断されたペプチド類に対するＤＲ９−制限Ｔ−細胞ク
り−ン類の応答は、更に記述するのに値する。これらの
クローン類（４試験のうちの４つ）に対して、ＬＶＳｚ
ｓ＋の削除が、認識の喪失をもたらし、３８１−３９８
ペプチドは、広範囲の濃度に対して同様に認識されなか
った。しかし、Ｌｙｓ　３Ｂ□およびＴＩｅ＋Ｂ３のな
お一層の除去は、免疫原性の再出現をもたらす。最終的
に、ペプチド３８５−３９８は、すべて非−刺激であっ
た。第２表に示されたデータひとまとめにすると、異な
って重複している決定因子類が、異なったＤＲ分子類と
関連することが分かる。

（ＮＡＮＰ）　−Ｃ３，Ｔ３ペプチドによ　て　　　　
れたマウスに・して心数　る−木 以下の結果は、上記したヒトＴ−細胞に対する優性な部
位が、異なるマウス系に対して応答する抗−（ＮＡＮＰ
）　ｙに対してのベルバー決定因子として作用しうるこ
とを示す。ＣＳ、Ｔ３ペプチドに結合された繰り返しく
ＮＡＮＰ）　３−配列は、７つの異なる同系交配系およ
び両方の抗−ＮＡＮＰ、１に寄与し、抗−スポロゾイト
抗体が測定された。

マウス（１群当り２ひき）を、尾の付は根に於て、不完
全フロイトのアジュバント（ＩＦＡ）中の５０ｇｇの（
ＮＡＮＰ）　３−ＣＳ、Ｔ　３で免疫化させた。８週間
後、マウスに、完全フロイトのアジュバント（ＣＦＡ）
中の２５μｇの免疫原で補助注射を行なった。２および
６週間の間に血漿を取り、抗−（ＮＡＮＰ）　ｓ。抗体
の存在に関してＥＬＩＳＡＣＲ４ｔｅ　Ｔｏｇｎａらの
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７．２９５６−２９６０
　　［１９８６］　）によってそれぞれ試験を行った。

ＥＬＩＳＡ−力価は、０Ｄａｓｓ＞　０．１および〉２
を有する血漿の最終希釈度と生理食塩水が注射されたマ
ウスからの血漿の００４ｓｓとの積の幾何平均である。

ＥＬＩＳＡプレートを被覆するのに使用した抗原は、（
ＮＡＮＰ）ｓｏであった。

第」Ｌ友 マウス種　Ｈ−２抗＝（ＮＡＮＰ）ｓｏ　　　抗−スポ
ゾイト０日　７０−９８日　０日　７０−９８日Ｃ５７
ＢＬ／６　　　ｂ　　＜１５０　　２３４３　　　＜４
０　　　３２０ＢＡＬＢ／ｃ　　　　　　ｄ　　　　＜
１５０　　　　５８６０　　　　　ｄｏ　　　　　＞１
２８０Ｂ１０．ＭＯｌａ　　　　ｆ　　　　ｄ５０　　
　　　９３８　　　　　＜４０　　　　　　　４０Ｃ３
Ｈ，１ｔｅＪ　　　ｋ　　＜１５０　　２３４３　　　
＜４０　　　１６０Ｃ３１１，１］　　　　ｑ　　＜１
５０　　３７０５　　　＜４０　　　３２０ＢＩＯ，Ｒ
ＩＩＩ　　　　ｒ　　　　ｄ５０　　　１４６４７　　
　　　＜４０　　　　　＞１２８０８１０．５Ｏ１ａ　
　　　ｓ　　　　＜１５０　　　　１４８２　　　　　
＜４０　　　　　＞１２８０第３表は、試験された全て
の異なる種が、（ＮＡＮＰ）ｓ。およびスポロゾイトの
両方に対して抗体応答を備えたことを示す。Ｃ５７８Ｌ
／６マウスが、反復領域を包含するＴ−細胞部位を認識
することはすでに知られていた（Ｇｏｏｄら、［１９８
６］　、前出文献；ｄｅｌ　Ｇｕｉｄｉｃｅら、［１９
８６］　、前出文献）。反復領域を認識しない全ての他
の系は、ＣＳ、Ｔ　３決定因子を認識していたに違いな
い。試験された全ての系が一致するという事実は、試験
された多数のヒトＭＨＣ遺伝子産物に加えて多数の異な
るマウスＩａ分子に関してＣＳ、Ｔ３　Ｔ−細胞が認識
されることを示し、従って、更に普遍的に認識されたＴ
−細胞エピトープを提示する。

全ての光学活性なアミノ酸類は、Ｌ−立体配置であり、
薄層クロマトグラフィー、融点測定、核磁気共鳴分析お
よび旋光性を測定することによって純度が検査された。

Ｎα−Ｂｏｃアミノ酸を合成に使用し、更に三官能アミ
ノ酸類を、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣＩＺ）、Ｎα
−Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ＯｃＨｅｘ）、Ｎα−Ｂｏｃ−５
ｅｒ（ＢＺＩ）およびＮα−ＢＯＣ−にＩＬＩ（０８２
１）として保護したＢｏｃ−八５ｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−ＯＢｚｌを、接触的に水素添加させ、更に得ら
れたＢｏｃ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨが
、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって
均質になることが示された。使用された溶媒類および試
薬類は、最高純度であった。カップリング反応は、ヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステルと結合されたアスパ
ラギンを除き、その場に於ける口ＣＣまたは対称的無水
物法により行った。ペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成機・モデル４３０Ａ　（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　　Ｆｏｓｔ
ｅｒ　Ｃ１ｔｙ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、八、）を使用するア
ミノ酸類の継続的なカップリングを用い、メリフィール
ド固相法によりまたは手作業により調製した。

Ｂｏｃ−Ｃｓ（Ｄｍｂ）−ベンズヒト１ルアミンー　　
のＩ−」−。

ベンズヒドリルアミン樹脂の懸ｉＱ液（２４ｇ、　０．
５４ｍ当ｍ／ｇ、１２．９６ｍモル）を、手動振とう機
に留められた反応容器に入れ、順次塩化メチレン（Ｃ１
１□Ｃ１□；４Ｘ２５０ｄ）、１０％のジイソプロピル
エチルアミン（ＤＩＥＡ　；　Ｉ　Ｘ　２５０ｍｆｌ、
１０分）およびジエチルホルムアミド（ＤＭＦ　；　４
　Ｘ　２５０ｉＱ）で洗浄した。この方法を繰り返し、
次いで樹脂を、メタノール（ＭｅＯＨ；２　ｘ　２５０
ｍｅ）　、ＣＨｚＣｌｇ（２Ｘ　２５０ｍＮ）およびジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ　；　４　Ｘ　２５０＋ｙ
ｌりで洗浄した。

ＩＩＭＦ（２００ｍｌ）中のＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｄｍｂ）
−０８（１３，２７ｇ、３８．９ｍモル）の溶液を、添
加し、更に５分間振とうさせた。ＤＩＥＡ（２０，３２
ｍＲ１１１６，６ｍモル）の添加にひき続いて直ちにＤ
ＭＥ（５０ｍｌ）中のベンゾトリアソール−１−イルオ
キシ−トリス　（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサ
フルオロホスフェート（ＢＯＰ　；　１７．２０ｇ、３
８．９ｍモル）の溶液をスラリーに添加し、更に振とう
を１５０分間継続した。樹脂の分別量を移しく１００ｍ
ｇ）　、Ｇ１５ｉｎ試験（Ａｎａｌ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔ
ａ　５８．２４８２４９　［１９７２］　）によってア
フセーした。置換は０．２３ｍ当量当量−樹脂であるこ
とが検出された。全ての樹脂をろ過し、ＤＭＦ（２Ｘ　
２５０ｍｆｆ１）、ＣＨｚＣＩｚ（２Ｘ２５０ｍＮ）で
洗浄し、更にＣｌ１ｚＣ１ｚ　（２５０ｄ）中で２４時
間、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）　（１３，２７ｇ、３
８．９ｍモル）および１゜３−ジシクロへキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ；　８．０２ｇ、３８．２ｍモル）と
再結合させた。Ｇ１５ｉｎ試験を、１００■の樹脂の分
別量に対して繰り返し行ない、更に負荷が、０　、３６
ｍモル／ｇ−樹脂であることが測定された。樹脂を、１
５０ｍｆｆ１のピリジンおよび１５０ｍ１の無水酢酸中
に懸濁させ、１時間振とうさせ、ｃｎｚｃ＋ｚ（２ｘ２
５０ｍｆｆｉ）、ＭｅＯｌｌ（２Ｘ２５０ｄ）　、Ｃ）
ＩｚＣｌｚ（２Ｘ２５０ｄ）で洗浄し、更に真空乾燥さ
せた。

Ｂｏｃ−Ａｃａ−Ｃｓ（Ｄｍｂ−ベンズヒドリルアミン
ーＢｏｃ−Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）−ベンズヒドリルアミン
−樹脂、１　（２０ｇ、７．２ｍモル）を、ＣＨ，ＣＩ
□（２５Ｍ）で洗浄し、２５０ｍＮの５０％ＴＦＡ−Ｃ
ＩＩＺＣＩ　２で１分間脱保護させ、Ｃｌ−１２ｃＩ　
、　（２５０ｄ）で洗浄し、更に２５０ｍ１の５０％Ｔ
ＦＡ−Ｃ１１□Ｃｈで２０分間再び脱保護させた。次い
で樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２（３Ｘ　２５０ｍｌ１）　、Ｍ
ｅＯＨ（２Ｘ　２５０ｄ）およびＣ１１２Ｃ１２（２ｘ
　２５０ｍＲ）で洗浄した。中和反応を、１０％ＤＩＥ
Ａ−ＣＨｚＣＩ　ｚ　（２Ｘ　２５０ｄ）で各５分間、
ＣＨｚＣｈ（２Ｘ　２５０ｍ１）　、ＭｅＯＨ（２Ｘ　
２５０ｍｆ）およびＣＨｚＣｈ（４Ｘ　２５０ｍ１）で
洗浄することによって行なわせた。

次いで、ＣＨ２Ｃｌ２　（２５０ｍｆ）中のＢｏｃ−ア
ミノカプロン酸（Ｂｏｃ−Ａｃａ−ＯＨ）　（０，６６
ｇ、２、Ｂ８ｍモル、０．４０当量）の溶液を添加し、
更に反応溶液を５分間撹拌させた。ジシクロへキシルカ
ルボジイミド（０，５９ｇ。

２、Ｂ８ｍモル、０．４０当量）を添加し、更に混合物
を２時間攪拌した。混合物をろ過し、ＣＩｌ□Ｃｌ２（
２Ｘ１０（１＋＋１）　、ＭｅＯＨ（２Ｘ　１００ｄ）
およびＣＨ２Ｃｈ（２Ｘ１００ｍｆｆ１）で洗浄した。

樹脂の分別量（５０，３ｍｇ）を、加水分解させ（６Ｍ
ＩＩＣＩ／プロピオン酸、１１０°Ｃ２２４時間）、更
にアミノ酸分析は、ｇ樹脂当り０．０８ｍモルのＡｃａ
の置換を示した。化合物１と同様にして、その樹脂をＡ
ｃ２０−ピリジンで“キャップ（ｃａｐｐｅｄ）″させ
た。

Ｂｏｃ−八ｃａ−Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）−ベンズヒドリル
アミン−樹脂、２　（２０ｇ、０．０８ｍ当量／ｇ、　
１．６ｍモル）を、化合物１に対して記した洗浄、脱保
護および中和反応に付した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
−０１ｔ（１，９９ｇ、　５．７６ｍモル、３．６当量
）を、ｃｏ２ｃｈ（２５０ｄ）中に溶解させ、ＩＩＡｃ
ａ−Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）−ＢＩＩＡ−樹脂、２に添加し
、更に縮合剤としてＤＣＣ（１，１８ｇ、５．７６ｍモ
ル、３．６当量）を使用し、固相合成のサイクルに付し
た（２時間）。

分別ｆｆｉ（１００ｍｇ）のＢｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ
）　−Ａｃａ−Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）　−１３ＨＡ−樹脂
、３ａを、加水分解させ、０．０５６ｄ当里Ｌ　ｙ　ｓ
　／ｇ樹脂の置換を示した。固相ペプチド合成を、Ｂｏ
ｃしｙｓ　（Ｂｏｃ）　−Ｏｌｌ　（３、９８ｇ、１１
　、５２ｍモル、３．６当量）およびＤＣＣ（２，３６
ｇ、１１　、５２ｍモル、３．６当量）を用い、前記の
方法に従って継続させた。ペプチド樹脂のアミノ酸分析
は、０．１５ｍ当量Ｌｙｓ／ｇの（Ｌｙｓ）　、、−Ａ
ｃａ−Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）−ＢＨ八−樹脂、３ｂの負荷
を示した。合成を、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−０１Ｈ
７，９６ｇ、２３．０４ｍモル、３．６当量）およびＤ
ＣＣ（４，７５ｇ　、２３．０４ｍモル、３．６当量）
を用い、前記方法に従って継続させた。分別量の樹脂を
、加水分解させ、更にアミノ酸組成は、０．２０ｍ当１
１Ｌｙｓ／ｇ　ｉｉ換の（Ｌｙｓ）　ｔ−Ａｃａ−Ｃｙ
ｓ　（Ｄｍｂ）−ＢＯＡ−樹脂、３ｃを示した。そのペ
プチド樹脂を、真空乾燥させた。最終重量＝２０．１ｇ
。

Ｌｙｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−（Ｄｍｂ）−ＢＩＩＡ樹脂
３Ｃの一部（５，０ｇ。

０．２０ｍ当量のＬｙｓ／ｇ　、１．０ｍ当量のＬｙｓ
　、０．１４３ｍモルのペプチド）を、ＤＭＦ（０，５
％のＤＩＥＡを含存する２５０ｍｆ）中、保護されたテ
トラペプチド、Ｂｏｃ−Ａｓｎ−Ａｌａ−＾５ｎ−Ｐｒ
ｏ−０１１、（１，２８ｇ、　２．５ｍモル、２．５当
量）、およびＢＯＰ試薬（１，１ｇ　、２．５ｍモル、
２．５当星）を用いて固相ペプチド合成のサイクルに付
した。１８時間後、ニンヒドリン試験は、反応が完結し
たことを示した。分別量のペプチド−樹脂を、加水分解
させ（６Ｎ　ＨＣＩ、１５０°Ｃ１２時間）、予期され
たアミノ酸組成：八ｓｐ、　１５．９０（１６）　；　
Ｐｒｏ、　６．９９（８）　；Ａｌａ、　８．５０（８
）；　Ｌｙｓ、　７．００（７）が得られた。樹脂を、
ＴＦＡで脱保護させ、更に上記方法を、Ｂｏｃ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−＾５ｎ−Ｐｒｏ−Ｏ１ｌを用いて第２サイク
ルによって繰り返しく単一カッブリング）、樹脂を加水
分解させ、更にアミノ酸組成は、予期された取り込み：
　Ａｓｐ。

３２．４２（３２）；　Ｐｒｏ、　１５．０７（１６）
；　Ａｌａ、　１６．９２　（１６）；Ｌｙｓ、　７．
２６（７）を示した。ＴＦＡを用いて脱保護させた後、
上記と同様にＢｏｃ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−ＯＨによる最終カップリングは、６．３ｇの［（Ｂｏ
ｃ−Ａｓｎ−＾１ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）＋　］　］ａ−
Ｌｙｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−ＢＨＡ樹脂を与えた。

分別量の加水分解（上記のように）は：　Ａｓｐ、　４
８．００（４８）；　Ｐｒｏ、　２０．３２（２４）；
　Ａｌａ、　２４．９６（２４）；　　Ｌｙｓ。

７．２６（７）を与えた。この材料の一部（６ｇ）を、
０°Ｃで２時間、無水フッ化水素酸（ＨＦ　；　１０％
の１−プロパンチオールを含有する６０成）で開裂させ
た。

このＩＩＦを、０°Ｃで蒸発させ（高真空、ＣａＯトラ
ップ）、更に粗ペプチドおよび樹脂混合物を、ＥｔＯＡ
ｃと共に摩砕し、ＴＦＡ（３Ｘ５０ｍ１）で抽出し、蒸
゛発させ、無水エーテルと共に摩砕し、更に乾燥させる
ことにより１．３ｇの粗ペプチドを得た。

この粗ペプチド（１，３ｇ）を、溶解させ（４０ｄの０
．０２５％のＴＦＡ／Ｈ２０）、ろ過しく０．４５μの
旧Ｉｌｅｘ−ＨＶフィルター）、更にＮｕｃｌｅｏｓｉ
ｌ　Ｃ−１８カラム　（ＩＸ５０ｃｍ）上に負荷させた
。このカラムを、Ａ：Ｈ２Ｏ（０，０２５％のＴＦＡを
含有）およびＢ：ＣＩＩ□ＣＮ（０，０２５％のＴＦＡ
を含有）から成る溶媒系を用い、２時間に於て１０％の
（Ｂ）から２５％の（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離Ｃ
１ｍ１１分）させた。分画を集め（７ｄ）、更に分別量
を分析ＨＰＬＣ（カラム：　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｒ
Ｐ８（５μ）；溶出液：　（Ａ）　０．１ＨのＩＣｌ０
．　（ｐＨ２，５）（Ｂ）ＣＨ３ＣＮｉ勾配：２０分間
で、１５％のＢから５５％のＢ；流速：１ｍＱ／分；保
持時間：９．１分）によって分析した。合された分画（
１０−１８）中に現われた生成物を蒸発させ、更に凍結
乾燥させることによって純粋な［（ＮＡＮＰ）３　］　
１１−に？−＾ｃａ−Ｃｙｓ−ＮＨ，，４を得た。

収量：　１．０６ｇ（６７，３％）その化合物は、分析
ＨＰＬＣによって均質であることを示し、酸加水分解（
６Ｎ１１ｃＩ；１５０″Ｃ；　１時間）の後、予期され
たアミノ酸組成が得られた二へｓｐ、　４５．５（４Ｂ
）；　Ｐｒｏ、　２３、Ｂ（２４）；Ａｌａ、　２３．
６（２４）；　Ｌｙｓ、　７．０（７）　；Ｃｙｓ、　
１．１２（Ｅｌ１ｍａｎ試験；　Ｅｌｌｍａｎ、　Ａｒ
ｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、８２７０−
７７［１９５９］参照）。更に、構造の確認が、マイク
ロシーケンス分析およびＦＡＢマス分光法によって行な
われた二計算価（Ｍ＋２１１）　”：１０．６４４．５
　；実験値：１０．６４２゜ Ｂｏｃ−Ｓｅｔ　（Ｄｍｂ）　−ＢＩＩＡ−樹脂（３，
４ｇ、　　０．３５ｍ当Ｒ／　ｇ樹脂、１．１９ｍモル
）を、手動振とう機に留められた１００ｄの反応容器に
充填し、ペプチド合成を、全部で４サイクル行ない、Ｐ
、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ３（３９４−３９８）−Ｂ
ＩＩＡ−樹脂（３，５ｇ）を得た。１．５ｇ　（０，５
ｍモル）ずつを除去し、更にＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　４３０＾合成器を用い、固相合成の追加
のサイクルに付すことによって２．２ｇの保護された［
＾１ａ３１１４＋　３１＋９コーＰ。

ｆａｌｃｔｐａｒｕｍ　Ｃ３（３７８−３９８）−ＢＩ
ＩＡ−樹脂を得た。０．４ｇずつの保護されたペプチド
を、無水ＨＦ　（化合物４に対するのと同様）を用いて
開裂させ、更に０．２２６ｇの粗［Ａｌａ３８４１３８
９コーＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ３（３７Ｂ−３９
８）ＮＨｚを得た。この粗材料を１０　ｍｌのＨ２Ｏに
溶解させ、ろ過し、　（０，４５μ型ＨＡ　Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅフィルター）、更にＷａｔｅｓ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ。

Ｈ、ｓ、Ａ、から入手可能なＷａｔｅｒｓ　Ｃ−１８カ
ラム（１，９Ｘ３０ｃｍ）に負荷させた。そのカラムを
、（Ａ）水（０，０２５％のＴＦＡを含有）および（Ｂ
）Ｃ１ｈＣＮ（０，０２５％のＴＦＡを含有）から成る
溶媒系を用い、１２０分間で、１０％の（Ｂ）−３５％
の（Ｂ）の直線勾配モードで溶離させた。分画を集め（
１分ごと）、更に分別量を分析＋１ＰＬｃ　（カラム：
　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ−８（１０μ）；溶出液
：（八）　０．１Ｍの１ｌｃ１０４　（ＰＨ２，５）（
Ｂ）ＣＨ：ＩｃＮ　；勾配：２０分間で、２０％のＢか
ら４０％のＢ；流速：１．５ｍ１１分；保持時間：１６
分）によって分析した。合された分画６８と６９中に現
われた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾燥させることに
よってＣＳ、Ｔ３ペプチドのアミノ化された形態の１０
ｍｇ（３，７％の収率）の純粋な［Ａｌａ””　３８９
］　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ５（３７８−３９
８）−Ｎｌ２を得た。その生成物は、分析ＨＰ　Ｌ　Ｃ
によって均質であることを示し、酸加水分解（６ＮのＨ
ＣＬ　；　１５０″Ｃ；２４時間）の後、正確なアミノ
酸組成Ａｓｐ、　２、Ｂ３（３）　；Ｓｅｒ　　２．７
９（３）；　　Ｍｅｔ、　　０．９０（１）　　　；Ｇ
ｌ＋、１、Ｂ９（２）：八Ｉａ。

２．００（２）；（６Ｎ　Ｈ（：［、；１１０℃；７２
時間）：　Ｖａｌ、　２、Ｂ９（３）；Ｉｌｅ、１、Ｂ
７（２）：　Ｐｈｅ、　０．９７（１）；　ｆ、ｙｓ、
　４．１４（４）が得られた。更に、構造の確認が、Ｆ
／ＩＢマス分光法によって行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ
）　”：２３３７．７、実験値：　２３３８．０゜ ０、Ｂｇ（０，１８２ｍモル）ずつの保護された［Ａ１
８３Ｆ＋４”９］　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ３
（３７８−３９８）−ＢＩＩＡ−樹脂（上記参照）を２
サイクルの固相合成に付し、更にアセチル化（５０％の
ＡＣ２０／ピリジン；３０ｚｊ！；１時間）させること
により保３ｉされた八ｃ−Ｃｙｓ−Ａｃａ　［Ａｌａ”
”３８９　コ　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　　Ｃ３（
３７８−３９８）−ＢＩＩＡ−樹月旨（６００ｍｇ）を
得た。無水１１Ｆを用いた処理は、水に溶解された３６
０ｍｇの粗生成物をもたらし、ろ過（実施例５ａに於け
るのと同様）し、更にｐ　−Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８
カラム（１，９Ｘ３０ｃｍ）にかけた。そのカラムを、
（Ａ）　Ｆ１２０（０，０２５％のＴＦＡを含有）およ
び（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ（０，０２５％のＴＦＡを含有）か
ら成る溶媒系を用い、９０分間で、２０％の（Ｂ）−４
０％の（８）の直線勾配のモードで溶離させた。分画を
集め（１分ごと）、更に分別量を分析＋１ＰＬＣ（カラ
ム：　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ−８（５μ）；溶出
液：（八）０．１Ｍの）ｌｃＩ０４　（ｐＨ２，５）　
（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ　；勾配；２０分間で、３０％のＢか
ら５５％のＢ；流速：１ｔｎｉ７分；保持時間：１０分
）によって分析した。合された分画３３−３５中に現わ
れた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾燥させた。収量：
１９■（３，４％の収率）。精製したＡｃ−Ｃｙｓ−Ａ
ｃａ　［Ａ１　ａ　３８４　・”９］　−Ｐ、　ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ３（３７８−３９８）−Ｎ）Ｉｚ＋
５ｂは、分析）ＩＰＬＣによって本質的に均質であるこ
七を示し、更に予期されたアミノ酸組成：　（６Ｎ　１
ｉｃｋ；１１０°Ｃ；２４時間）　：　Ａｓｐ、　２、
Ｂ７（３）；　Ｓｅｒ、　２．７７（３）；　　Ｇｌｕ
。

１．９８（２）；　Ａｌａ、２．０Ｏ（２）；　Ｖａｌ
、　２．０５（２）；ｌｉｅ、　１．６９（２）；Ｍｅ
ｔ、　０．９９（１）；Ｐｈｅ、　１．００（１）；　
　Ｌｙｓ、　４．０７（４）；　Ｃｙｓ、　０、Ｂ６（
Ｅｌ１ｍａｍ試験）が得られた。更に、構造の確認が、
ＦＡＢマス分光法によって行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｉ
Ｉ）”：　２５９６．２　ｉ実験値：　２５９５、Ｂ゜
（ＮＡＮＰ）　　　　　　Ｋ　　Ａｃａ−Ｃ５−ＮＨＡ
ｃ−Ｃ５−Ａｃａ　　　Ａｌａ””Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｃ
ａ　　［八ｌａ　３＋！４°”９］　　−Ｐ、ｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ　　Ｃ５（３７８−３９８）−ＮＨ，，５
ｂ（２，５■；　０、Ｂ２μモル、２当量）および［（
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）　ｘ　］　］ａＬｙ
ｓｔ−Ａｃａ−Ｃｙｓ−Ｎｌｌｚ４、（４，７４ｍｇ；
　０．４１μモル；１当量）を、１　、８　ｍｌの蒸留
水に溶解させ、次いで７．６戒の０．２ＭのＮ１．ＨＣ
Ｏ３（ｐＨ７，８）を添加した。反応混合物を、室温で
２４時間放置し、更に凍結乾燥させた。残渣を、２ｍｌ
の０．０２５％のＴＰＡ／Ｈ２０中に溶解させ、ろ過し
更にＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８カラム（０，４Ｘ　
２５ｃｍ）にがけた。

そのカラムを、（Ａ）水（０，０２５％のＴＦＡを含有
）および（Ｂ）ＣＨｆｆＣＮ（０，０２５％のＴＦＡを
含有）から成る溶媒系を用い、１２０分間で、１０％（
７）　（Ｂ）−４０％（７）　（Ｂ）の直線勾配のモー
ドで溶離させた。分画を集め（１分ごと）、更に分別量
を分析ＨＰＬＣ（カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ
−８（５ｕ）；溶出液：（八）０．１Ｍの１１ＣＩＯ，
（ｐ　Ｈ２，５）（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ；勾配：３Ｏ分間で
、１０％のＢから５５％のＢ；流速：１ｍ１７分；保持
時間：２１分）によって分析した。合された分画４２−
４５中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾燥さ
せることによって１．５　ｍｇ　（２５％の収率）の生
成物６を得た。その生成物は、分析ＨＰＩ、Ｃによって
均質であることを示し、更に酸加水分解（６Ｎ　ＨＣＩ
；　１１０’Ｃ；２４時間）の後、予期されたアミノ酸
組成：Ａｓｐ、５２．０（５１）；　Ｓｅｒ、　３．４
（３）；　Ｇｌｕ、　２．５（２）；　Ａｌａ。

２４．７（２６）；　Ｖａｌ、　２．５（３）；　Ｍｅ
ｔ、　１．０（１）；　Ｉｌｅ、　２．２（２）；　　
Ｐｈｅ、１．Ｈ１）；　Ｌｙｓ、　１１．５（１１）が
得られた。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ベンズヒドリルアミン−樹脂（１，５
ｇ、０．２ｍ当量／ｇ　；　０．３ｍモル）を、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａ合成器を用い
る１６サイクルの固相ペプチド合成に付することによっ
て２．１ｇの保護された［ＡＩａ””８９］　−Ｐ、ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ５（３８０−３９６）−ＢＩＩ
Ａ−樹脂を得た。０．４ｇずつの保護されたペプチド樹
脂を、無水ＨＰ　（化合物４に対するのと同様）を用い
て開裂させ、更に１２１■の粗［Ａｌａ””１′９］　
−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ５（３８０−３９６）
−ＮＨｔを得た。粗生成物（６０ｍｇ）の一部を、０．
０２５％のＴＦＡ／Ｈ，０中に溶解させ、ろ過し、更に
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８カラム（１，ＯＸ５０ｃ
ｍ）にかけた。そのカラムを、（八）水（０，０２５％
のＴＦＡを含有）および（Ｂ）Ｃ１１３ＣＮ（０，０２
５％のＴＦＡを含有）から成る溶媒系を用い、１８０分
間で、１５％の（Ｂ）−３５％の（Ｂ）の直線勾配のモ
ードで溶離させた。分画を集め（１分ごと）、分別量を
分析ＨＰＬＣ（カラム：　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ
−８（５μ）　；溶出液：（＾）　０．１ＨのＨＣｌＯ
４（ｐＨ２，５）（Ｂ）　ＣＨ３ＣＮ　、勾配：２０分
間で、３０％のＢから５５％のＢ；流速：１．Ｏ−／分
；保持時間：８．０分）によって分析した。合された分
画３４−４６中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍
結乾燥させることによって１４■（２０％の収率）の純
粋な［Ａ１ａ１１＋４°３９’］　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐ
ａｒｕｍ　Ｃ３（３８０−３９６）−ＮＨｚ、７ａを得
た。その生成物は、分析ＨＰＬＣによって均質であるこ
とを示し、更に酸加水分解（６ＮＩＣ１゜１１０″Ｃ；
７２時間）の後、正確なアミノ酸組成：　Ａｓｐ。

０．９５　（１）；　Ｓｅｒ、　１、Ｂ８（２）；　Ｇ
ｌｕ、　２．００（２）；　Ａｌａ、　２゜００（２）
　；　Ｍｅｔ、　０．９３（１）；　（６Ｎ　ＨＣＩ；
　１１０°Ｃ；７２時間）：　Ｖａｌ、　２．９Ｈ３）
；　Ｉｌｅ、　０．９７（１）；　Ｐｈｅ、　１．１７
（１）；Ｌｙｓ、　４．１０　（４）が得られた。更に
、構造の確認が、マイクロシーケンス分析およびＦＡＢ
マス分光法によって行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ）”　
：　１９０８．３　；実験値？　１９０８．０゜ 化合物１に於けるのと同様にして調製したＢｏｃ−Ｖａ
ｌ−ｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ−樹脂（２０ｇ　
；　０．５ｍモル／ｇ　；　１０ｍモル）を、Ｋｒａｆ
ｔ　５ｈａｋｅｒに留めた１１の反応容器に充填し、更
に固相ペプチド合成を全部で１９サイクル行なうことに
よって＾ｃ−Ｃｙｓ−Ａｃａ−［Ａｌａ””門９］　−
Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ３（３８０−３９６）−
ＢＨＡ−樹脂（４４，９ｇ）を得た。一部の保護された
ペプチド樹脂（５ｇ；１．１１ｍモル）を、無水旺（化
合物４に対するのと同様）で処理し、更に２．２１ｇの
粗生成物を得た。

粗生成物の一部（１，１ｇ）を、４０ｍｆｌの０．０２
５％のＴＦＡ／Ｈ，０に溶解させ、ろ過し、更にＮｕｃ
ｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８カラム（２，２Ｘ２５ｃｍ）に
かけた。そのカラムを、（八）Ｈ，０（０，０２５％の
ＴＦＡを含有）および（Ｂ）ＣＨ３Ｎ（０，０２５％の
ＴＦＡを含有）から成る溶媒系を用い、１２０分間で、
１０％の（Ｂ）−３５％の（Ｂ）の直線勾配のモードで
溶離させた。分画を集め（１分ごと）、更に、分別量を
分析ＨＰＬＣ（カラム：　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ
−８（５μ）；溶出液：　（Ａ）　０．１Ｍ０ＨＣ１Ｏ
ｎ　（ＰＨ２，５）（Ｂ）ＣＨ：ＩＣＮ、勾配：２０分
間で、３０％のＢから５５％のＢ；流速：１．Ｏｒｄ／
分；保持時間：１０分）によって分析した。合された分
画６５−７２中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍
結乾燥させることによって１４４Ｂ（９，９％の収率）
の生成物を得た。精製されたＡｃ−Ｃｙｓ−八ｃａ　　
［Ａｌａ”’°”９］　　−Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
　　　Ｃ３（３８０３９６）−Ｎｌ！□、７ｂは、分析
ＨＰＬＣによって均質であることを示し、更に酸加水分
解（６Ｎ　ＨＣＩ；　１５０’Ｃ；　　１時間）の後、
予期されたアミノ酸組成：　Ａｓｐ、　１．０９（１）
；　Ｓｅｒ、　１．９０（２）；　Ｇｌｕ、　１．９８
（２）；　Ａｌａ、　２．００（２）　；　Ｍｅｔ、　
０．９３（１）：　Ｐｈｅ、　０．９５（１）。（６Ｎ
　ＨＣＩ　。

１１０°Ｃ；７２時間）：　Ｖａｌ、　２．７６（３）
；　Ｉｌｅ、　１．０４（１）；Ｌｙｓ、　４．３５（
４）；　Ｃｙｓ、　１．１０（Ｅｌ１ｍａｎ試験）が得
られた。更に、構造の確認が、ＦＡＢマス分光法によっ
て行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ）”　：２１６６．６　
；実験値＝２１６７．０゜ 八ｃ−Ｃ５（Ｓ−ｒｉｄ　　１）−Ａｃａ　　　Ａｌａ
”’°”９　−Ｐ、ｆａｌｃｉ−２，２”−ジピリジル
ジスルフィド（１０，８ｍｇ　、　４９ｇモル、１．６
４当ｆｆ１）　ヲ）リフルオロエタノールｍｌ、４％の
ＡｃＯＨを含有）に溶解させ、トリ２ルオロエタノール
Ｃ１４ｍＱ、４％のＡｃＯＨを含有）中の胱Ｃｙｓ−Ａ
ｃａ−　　　［Ａｌａ”’°２８９コ　ーＰ．ｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ　　ＣＳ（３８０−３９６）−Ｎｉｌ□，
　７　ｂ（７８■、２９、ＢＨモル、１当量）の混合溶
液に添加した。その混合物を、１時間攪拌し、蒸発させ
、更に残渣を無水エーテルで摩砕し、更に乾燥させた。

収量：　７３．３ｍｇ（９９．９％の収率）。

生成物は、分析ＨＰＬＣ　（カラム：　Ｎｕｃｌｅｏｓ
ｉｌ　Ｃ−１８（５μ）；溶出液：　（Ａ））１２０（
０．０２５％のＴＦＡを含有）、（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ（０
．０２５％のＴＦＡを含有）：勾配：２０分間に於て１
５％Ｂないし４０％Ｂおよび４０％Ｂに於て１５分間保
持した；流速：１．４ｍＲ１分；保持時間：２３分）に
よって本質的に均質であることを示した。

酸加水分解（６ＮのＩＣ１．　７２時間）の後、アミノ
酸分析は、予期した組成：八ｓｐ．　１．０７；　Ｓｅ
ｒ．　２．０５；Ｇｌｕ，　２．１３；　Ａｌａ．　２
．０３；　Ｖａｌ，　１、Ｂ７；　Ｍｅｔ，　０．９４
：ｒｌｅ、　０．９２；　Ｐｈｅ、　０．９２：　Ｌｙ
ｓ、　３．９４：　Ａｃａ、　０．９８を与えた。Ｅｌ
１ｍａｎ試験はシステイニル・フルフィジル基の不存在
を示した。’Ｉｔ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、構造
と一致し、更にピリジル部分：６７．２２（ＩＨ，ｄ）
。

δ７．３２（２１ｆ、ｍ）およびδ７、Ｂ３（ＬＨ，ｍ
）。Ｕ、Ｖ、λｍａｘ（５０％ＴＦＥ／ＨｚＯ）２８０
ｎｍ　（ｅ　３７８０）の存在を示した。

八ｃ−Ｃｙｓ（Ｓ−ピリジル）−Ａｃａ　　［ＡＩａ”
”［１９］−Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｃ３（３８０−３９６）−ＮＨ
ｚ、　　８　（５３，４ｍｇ　、２０．４μモル、２．
３５当ｆｆ１）をトリフルオロエタノール（４、Ｂｍｎ
）中に溶解させ、更に０．２ＭのＮＨ４）ＩＣＯ　（１
２ｍｌ、ｐＨ８．７）を添加した。蒸留ＨｚＯ　（７．
２ｍｊり中の［（Ａｓｎ−Ａｌａ−＾ｓｎ−Ｐｒｏ）：
＋　］　］ｓーＬｙｓ７ーＡｃａーＣｙｓーＮＨｚ＋４
（１００．４ｍｇ、８．６９μモル、１当量）を、該混
合溶液に添加し、反応混合物を、２５°Ｃで２時間攪拌
し、更に凍結乾燥させた。残渣を、１０　ｍｌの０．０
２％のＴＦＡ／Ｈ２０に溶解させ、ろ過し、更にＮｕｃ
ｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８カラム（２．２　Ｘ　２５ｃｍ
）にかけた。カラムを、（Δ）■２０（０．０２５％の
ＴＦＡを含有）および（Ｂ）ＣＩｌ□ＣＮ（０．０２５
％のＴＦＡを含有）する溶媒系を用いて、１００分間で
、１０％の（Ｂ）−４０％の（Ｂ）の直線勾配のモード
で溶離（９ｄ／分）させた。分画を集め（１分ごと）、
分別量をＨＰＬＣによって分析した（カラム：　Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂｐｐ−８（５μ）；溶出液：　０．　Ｉ
　Ｍ　ＨＣｌＯ４（ｐＨ　２．５）　（Ｂ）Ｃ１１３Ｃ
Ｎ；勾配：３０分間で、１０％のＢから５５％のＢ；流
速：１ｍｆｌ／分；保持時間：　１９．７分）。ためら
れた分割３６　−　３４中に現われた生成物を蒸発させ
、更に凍結乾燥させることによって９２ｍｇ　（７４．
５の収率）の生成物が得られた。その生成物は、分析Ｉ
ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって均質であることを示し、更に酸
加水分解（６Ｎ　ＩＩｃＩ；　１１０°Ｃ；７２時間）
の後、予期されたアミノ酸組成：＾ｓｐ，　５１．３０
（４９）：　Ｓｅｒ．　１．９９（２）；　Ｇｌｕ。

２、０７（２）；　Ｐｒｏ，　２５．１３（２４）；　
Ａｌａ，　２６．００（２６）；　Ｖａ！。

２、４０（３）；　Ｍｅｔ，　０．９６（１）；　ｒｌ
ｅ．　１．０４（１）；　Ｐｈｅ．　１。

０３（１）　；　Ｌｙｓ，　１１．３５（１１）が得ら
れた。Ｅｌ１ｍａｎ試験は、シ　スティンＳＨ基の存在
を確認した。加えて、ジチオスレイトールによる減圧条
件下の処理は、出発材料の［（Ａｓｎ−Ａｌａ−八ｓｎ
−Ｐｒｏ）＋］　ａ−Ｌｙｓｔ−　ＡｃａＣｙｓ−ＮＩ
Ｉｚ＋　４＋　およびＡｃ−Ｃｙｓ−八ｃ　ａ−［　Ａ
　１　ａｆｆ　ｌ＋４　２　８　９　］Ｐ．ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ　ＣＳ（３８０−３９６）−ＮＨｚ，　７　
ｂを与えた。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを（１群当り５ひき）を、４０μｇ
の（ＮＡＮＰ）　３−ＣＳ．Ｔ３（Ｅｌ−口）または完
全フロイトのアジュバント（ＣＦＡ）中、ＭＡＰＳ　Ｂ
−細胞エビトーブ　［（ＮＡＮＰ）３　　］　　］Ｉｌ
ーＬｙｓ７ーＡｃａ−ＣｙｓＮｔ（ｚ　　（◆−禰ト）
に共有結合されたアミノ酸配列ＸＩ［Ｉ　（ＣＳ．Ｔ３
ペプチド）を有するアミノ化された形態のポリペプチド
から成る化合物６を用いて腹腔内的に免疫化させた。４
週間後、補助注射（ＣＦＡ中、４０μｇの免疫原）を与
えた。血漿を、図に示された様に毎週取り、抗−（ＮＡ
ＮＰ）　ｓ。抗体の存在について酵素−結合免疫吸収検
定によって試験しく第５図）、更にスポロゾイト類に対
する抗体について間接免疫ケイ光によって試験した（第
６図）。化合物６によって高められた抗血清類の力価は
、所定のスポロゾイト類に対する間接免疫吸収検定によ
って測定したと同様にして、（ＮＡＮＰ）　３−ＣＳ．
Ｔ　３によって誘発されたものに比べて４倍高く、従っ
て、普遍的なＴ−細胞エピトープに応答するポリペプチ
ドと前記したＭＡＰＳ　８−細胞との組み合せが、Ｂ−
細胞エピトープが線状ペプチド（ＮＡＮｒ’）　：ｌで
ある場合よりも強い免疫応答をもたらすことを意味する
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のペプチド／ペプチドワクチンの一例
を示す模式図、第２Ａ図及び第２Ｂ図は、本発明のワク
チン合成の一例としての固相ペプチド合成を示す模式図
、第３図は、Ｂ−細胞エピトープとＴ−細胞エピトープ
との間の結合形成の一例を示す模式図、第４図は、Ｂ−
細胞エピトープとＴ−細胞エピトープとの間の２，２゛
−ジピリジルジスルフィドを用いた結合形成の一例を示
す模式図、第５図は、酵素−結合免疫吸着アッセイの結
果を示すグラフ、第６図は、免疫ケイ光アッセイの結果
を示すグラフである。 ↓ 第２Ｂ図 Ｈ−Ｌｙｓ 第４図 ［（ＮＡＮＰ）３Ｊａ−に７−ＡＣａ−Ｃ）’５−ＮＨ
ｚ第６図 ［（ＮＡＮＰ）３］　ｓ−に７−Ａｃａ（ｙｓ−ＮＨ２
Ｈ Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｃａ−［ＡＩＡＦｙ″”８９］−Ｐ、
ｆａｊｃ、（３７Ｂ−３９８）−ＮＨ４ＳＨ ｂ 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとしてのア
   ミノ酸配列 【遺伝子配列があります】（ I ） 式中、Ｒ＾１は、Ｈ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ、Ｈ−Ｉｌｅまた
   はＨ−を示し、およびＲ＾２は、−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓ
   ｅｒ−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＯＨ、−Ｖａｌ−ＯＨ
   または−ＯＨを示す、を包含するポリペプチドまたはそ
   の誘導体の使用。 ２、請求項１に定義したアミノ酸配列を有するポリペプ
   チドの請求項１記載の使用。 ３、Ｒ＾１が、Ｈ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が
   、−ＯＨを示す請求項１または２に定義したポリペプチ
   ドの使用。 ４、Ｒ＾１が、Ｈ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が
   、−Ｖａｌ−ＯＨを示す請求項１または２に定義したポ
   リペプチドの使用。 ５、Ｒ＾１が、Ｈ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が
   、−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＯＨを示す請求項１または２に定
   義したポリペプチドの使用。 ６、Ｒ＾１が、Ｈ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が、−ＯＨ
   を示す請求項１または２に定義したポリペプチドの使用
   。 ７、Ｒ＾１が、Ｈ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が、−Ｖａ
   ｌ−ＯＨを示す請求項１または２に定義したポリペプチ
   ドの使用。 ８、Ｒ＾１が、Ｈ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が、−Ｖａ
   ｌ−Ａｓｎ−ＯＨを示す請求項１または２に定義したポ
   リペプチドの使用。 ９、Ｒ＾１が、Ｈ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２が、−Ｖａ
   ｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ＯＨを示す請求項１または２に定
   義したポリペプチドの使用。 １０、Ｒ＾１が、Ｈ−を示し、Ｒ＾２が、−ＯＨを示す
   請求項１または２に定義したポリペプチドの使用。 １１、Ｒ＾１が、Ｈ−を示し、Ｒ＾２が、−Ｖａｌ−Ｏ
   Ｈを示す請求項１または２に定義したポリペプチドの使
   用。 １２、Ｒ＾１が、Ｈ−を示し、Ｒ＾２が、−Ｖａｌ−Ａ
   ｓｎ−ＯＨを示す請求項１または２に定義したポリペプ
   チドの使用。 １３、Ｒ＾１が、Ｈ−を示し、Ｒ＾２が、−Ｖａｌ−Ａ
   ｓｎ−Ｓｅｒ−ＯＨを示す請求項１または２に定義した
   ポリペプチドの使用。 １４、Ｒ＾１が、Ｈ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−を示し、Ｒ＾２
   が、−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ＯＨを示す請求項１ま
   たは２に定義したポリペプチドの使用。 １５、請求項１ないし１３のいずれかの一つに定義した
   ポリペプチド。 １６、Ｂ−細胞エピトープを提示する抗原構造と会合し
   た請求項１ないし１４のいずれかの一つに定義したポリ
   ペプチド。 １７、Ｂ−細胞エピトープを提示する抗原構造が、多重
   抗原ペプチドである請求項１６に記載のポリペプチド。 １８、多重抗原ペプチドが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａ
   ｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳ蛋白質中に存在する反復配列Ｎ
   ＡＮＰの多量体を包含する請求項１７に記載のポリペプ
   チド。 １９、▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項１８に記載のポリペプチド。 ２０、▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項１８に記載のポリペプチド。 ２１、普遍的なＴ−細胞エピトープとしての請求項１５
   ないし２０のいずれかの一つに記載のポリペプチド。 ２２、通常のペプチド合成法を使用することを特徴とす
   る請求項１５ないし２１のいずれかの一つに記載のポリ
   ペプチドの製造方法。 ２３、固相合成法を使用することを特徴とする請求項２
   ２に記載の製造方法。 ２４、請求項１５ないし２１のいずれかの一つに記載の
   ポリペプチドおよびＢ−細胞エピトープを提示する抗原
   構造を有するポリペプチドを包含する免疫抗原性組成物
   。 ２５、請求項２２または２３に記載の方法によって製造
   した請求項１５ないし２１のいずれかの一つに記載のポ
   リペプチド。